TY  - THES
A1  - Englert, Nils
T1  - Die Rolle der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase in der Lungenfibrose der Maus
T1  - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in murine lung fibrosis
N2  - Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) stellt eine chronische Krankheit mit einer schlechten Prognose dar. Die Erkrankung zeichnet sich durch ein dysfunktionales Alveolarepithel, die Formation von α-smooth muscle actin (α-SMA)-positiven Myofibroblasten, eine starke Kollagendeposition sowie eine fehlgeleitete Inflammation aus. In der Vermittlung dieser pro-fibrotischen Effekte spielt das Zytokin transforming growth factor β (TGF-β) eine Schlüsselrolle. Aufgrund des tödlichen Verlaufs der IPF und der limitierten Therapieoptionen ist die Entdeckung neuer Behandlungsansätze erforderlich.
Der NO/cGMP-Signalweg ist in der Modulation grundlegender physiologischer Vorgänge wie der Blutdruckregulation und der Peristaltik involviert. Hierbei spielt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) als NO-Rezeptor eine fundamentale Rolle. In der Lunge wird die NO-GC in glatten Muskelzellen und Perizyten exprimiert. Während das Enzym in glatten Muskelzellen die Relaxation der glatten Muskulatur vermittelt, reguliert die NO-GC in Perizyten die Angiogenese, die Kapillardurchlässigkeit und den Blutfluss. Neben den physiologischen Aufgaben wurden anti-fibrotische sowie anti-inflammatorische Effekte der NO-GC in Herz, Leber, Niere und Haut beschrieben.
Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit die NO-GC auf eine anti-fibrotische und anti-inflammatorische Bedeutung in der Lungenfibrose der Maus überprüft. Hierzu wurden Wildtyp- (WT) und globale NO-GC-Knockout-Mäuse (GCKO) untersucht. Die Fibrose wurde durch einmalige, orotracheale Bleomycin-Gabe induziert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Tag 7 und 21) untersucht. Unbehandelte (Tag 0) Tiere dienten als Kontrolle. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die NO-GC auf eine anti-fibrotische Wirkung untersucht. Mittels Immunfluoreszenz wurde das Verhalten der α-SMA-positiven Myofibroblasten in den platelet-derived growth factor receptor β (PDGFRβ)-positiven fibrotischen Regionen untersucht. Der Kollagengehalt wurde mithilfe eines Hydroxyprolin-Kollagenassays ermittelt. Die untersuchten Fibrose-Kriterien waren in beiden Genotypen an Tag 21 stärker ausgeprägt als an Tag 7. An Tag 21 konnten im GCKO mehr α-SMA-positive Myofibroblasten, ausgeprägtere PDGFRβ-positive fibrotische Areale und ein höherer Kollagengehalt als im WT festgestellt werden. Zudem zeigten die GCKO-Tiere ein schlechteres Überleben als WT-Mäuse. Diese Ergebnisse wiesen auf eine überschießende fibrotische Antwort im GCKO und somit auf eine anti-fibrotische Wirkung der NO-GC in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. Dass an Tag 21 die Fibrose im GCKO stärker ausfiel als im WT, konnte mit dem signifikant höheren TGF-β-Gehalt in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) im GCKO erklärt werden. Das Fehlen der NO-GC im GCKO könnte zu einem Wegfall der Inhibierung der TGF-β-vermittelten, pro-fibrotischen Effekte durch die NO-GC führen. Weitere Studien sind erforderlich, um die Hypothese zu belegen und zugrundeliegende Mechanismen aufzuklären.
Die de novo Entstehung von Myofibroblasten, die maßgeblich an der Kollagensynthese beteiligt sind, stellt ein entscheidendes Fibrose-Merkmal dar. Umso bedeutender ist die Identifikation zweier Myofibroblasten-Subtypen, die sich in Lokalisation, NO-GC-Expression und Herkunft unterscheiden: (1) interstitielle, NO-GC-positive Myofibroblasten, die von Perizyten abstammen und Kollagen Typ I produzieren, und (2) intra-alveoläre, NO-GC-negative Myofibroblasten, deren Ursprung noch nicht abschließend geklärt ist. Die Anwesenheit beider Myofibroblasten-Typen konnte zu beiden untersuchten Zeitpunkten nach Bleomycin-Gabe bestätigt werden. Die NO-GC-Expression der Alveolarwand-ständigen Myofibroblasten, deren Abstammung von NO-GC-positiven Perizyten sowie deren dauerhafte Präsenz sprechen für eine relevante Rolle der NO-GC in der murinen Lungenfibrose. In weiteren Untersuchungen müssen die exakten Funktionen und spezifische Marker der Myofibroblasten-Subtypen identifiziert werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die NO-GC auf anti-inflammatorische Effekte in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Mittels HE-Färbung und Immunfluoreszenz wurden lymphozytäre Infiltrate an Tag 21 im GCKO festgestellt, was auf einen modulatorischen Einfluss der NO-GC auf das Immunsystem hindeutete. An Tag 21 wurden in der BALF von GCKO-Tieren signifikant mehr Gesamtimmunzellen, Lymphozyten und neutrophile Granulozyten als im WT gezählt, was auf eine starke Einwanderung von Immunzellen und somit auf eine ausgeprägte Entzündung in GCKO-Lungen hinwies. Folglich könnte die NO-GC eine anti-inflammatorische Rolle über die Regulation der Immigration von Immunzellen in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose spielen. In der Literatur werden pro- und anti-fibrotische Effekte der Immunzellen in der murinen Lungenfibrose diskutiert. Durch Korrelationsanalysen wurde ein positiver Zusammenhang zwischen der Gesamtimmunzellzahl und der TGF-β-Konzentration an Tag 21 festgestellt. In verschiedenen Studien wurde ein pro-fibrotischer Einfluss der Immunzellen über die Aktivierung/Sekretion von TGF-β beschrieben. Die Abwesenheit der NO-GC im GCKO könnte also über die verstärkte Immigration von Immunzellen in einem erhöhten TGF-β-Gehalt resultieren und so zu einer überschießenden fibrotischen Reaktion an Tag 21 führen. Auf welche Weise die NO-GC die Einwanderung der Immunzellen in der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose beeinflusst, muss in weiteren Studien untersucht werden. Zusammenfassend deuten die Daten dieser Arbeit auf eine anti-inflammatorische und anti-fibrotische Rolle der NO-GC in der Lungenfibrose der Maus hin.
N2  - Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a chronic disease with poor prognosis. The illness is characterized by a dysfunctional alveolar epithelium, formation of α-smooth muscle actin (α-SMA)-positive myofibroblasts, exuberant deposition of collagen, and a dysregulated inflammation. The cytokine transforming growth factor β (TGF-β) is a key player in mediating these pro-fibrotic effects. Due to the fatal course and the limited therapeutic options, new therapeutic approaches must be researched.
NO/cGMP signaling modulates fundamental physiological processes like the regulation of blood pressure and peristalsis. Here, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a decisive role as the receptor for NO. In the lung, smooth muscle cells and pericytes express NO-GC. Whereas the enzyme in smooth muscle cells mediates relaxation of smooth muscle, NO-GC in pericytes regulates angiogenesis, capillary permeability, and blood flow. Beside physiological tasks, anti-fibrotic and anti-inflammatory effects of NO-GC have been demonstrated in heart, liver, and skin.
Therefore, as part of this work, NO-GC was tested for an anti-fibrotic and anti-inflammatory role in murine lung fibrosis. For this purpose, wild type (WT) and global NO-GC knockout mice (GCKO) were used. Fibrosis was induced by a single orotracheal dose of bleomycin and investigated at different time points (day 7 and 21). Untreated (day 0) animals served as controls. In the first part of this work, immunofluorescence was used to study the performance of α-SMA-positive myofibroblasts in platelet-derived growth factor receptor β (PDGFRβ)-positive fibrotic regions. Hydroxyproline assay was performed to quantify the collagen content. In both genotypes, the fibrosis criteria examined were more pronounced at day 21 than at day 7. At day 21, more α-SMA-positive myofibroblasts, more pronounced PDGFRβ-positive fibrotic areas and a higher collagen content could be detected in the GCKO compared to the WT. In addition, GCKO animals showed poorer survival than WT mice. These results indicated an exaggerated fibrotic response in the GCKO and, thus, an anti-fibrotic effect of NO-GC in bleomycin-induced lung fibrosis. At day 21, a significantly higher TGF-β content in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) was determined in GCKO compared to WT. Thus, the more pronounced fibrosis in GCKO compared to WT could be explained at day 21. Consequently, the absence of NO-GC in GCKO could lead to an omission of the inhibition of TGF-β-mediated pro-fibrotic effects by NO-GC. Further studies are required to confirm this hypothesis and to clarify the underlying mechanisms.
De novo formation of myofibroblasts, which are substantially involved in collagen synthesis, constitutes an essential fibrotic feature. Therefore, the identification of two myofibroblast subtypes, which differ in localization, expression of NO-GC and origin, is even more crucial: (1) interstitial, NO-GC-positive myofibroblasts, which derive from pericytes and produce collagen type I, and (2) intra-alveolar, NO-GC-negative myofibroblasts, whose lineage has not been finally clarified yet. Appearance of both types of myofibroblasts could be observed at both assessed time points after bleomycin treatment. NO-GC expression of intra-alveolar myofibroblasts, their descent from pericytes and permanent presence indicate a relevant role of NO-GC in murine lung fibrosis. In further studies, exact function and specific marker of myofibroblast subtypes need to be identified.
In the second part of this work, NO-GC was investigated for anti-inflammatory effects in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Using HE staining and immunofluorescence, lymphocytic infiltrates were detected in GCKO at day 21, indicating a modulatory influence of NO-GC on the immune system. At day 21, significantly more total immune cells, lymphocytes and neutrophils were counted in the BALF of GCKO animals than in the WT. This suggests a strong immigration of immune cells and, thus, a pronounced inflammation in GCKO lungs. Consequently, NO-GC could play an anti-inflammatory role via regulation of immune cell immigration in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Pro- and anti-fibrotic effects of immune cells in murine pulmonary fibrosis are discussed in the literature. Performing correlation analyses, a positive correlation was found between total immune cell count and TGF-β concentration at day 21. Several studies, have described a pro-fibrotic influence of immune cells via activation/secretion of TGF-β. Thus, the absence of NO-GC in GCKO could result in elevated TGF-β levels via increased immune cell immigration, leading to an exaggerated fibrotic response at day 21. The way in which NO-GC influences immune cell immigration in bleomycin-induced pulmonary fibrosis needs to be investigated in further studies. In conclusion, the data of this work suggest an anti-inflammatory and anti-fibrotic role of NO-GC in murine pulmonary fibrosis.
KW  - Lunge
KW  - Fibrose
KW  - NO-GC
KW  - TGF-β
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Maus
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348054
ER  - 
TY  - THES
A1  - Aue, Annemarie
T1  - Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Lungenfibrose in der Maus
T1  - Localization and importance of NO-sensitive guanylyl cyclase in a murine model of lung fibrosis
N2  - Die im Rahmen dieser Arbeit behandelten Fragestellungen vermitteln neue Kenntnisse über die Pathogenese der Lungenfibrose auf zellulärer Ebene. Bei der Lungenfibrose handelt es sich um eine chronische Erkrankung, die durch eine initiale Inflammation und das Auftreten von Myofibroblasten gekennzeichnet ist. Die Myofibroblasten führen zu einer vermehrten Produktion von EZM, was in einer Zerstörung der Lungenarchitektur, Narbenbildung und folglich einem verminderten Gasaustausch resultiert. Eine modulatorische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) bei der Entwicklung der Lungenfibrose wird vermutet, dennoch sind die Effektorzellen in der Lunge noch nicht bekannt. 
Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit die Lokalisation des NO-Rezeptors, der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), in der Lunge untersucht. Dazu wurden Knockout-Mäuse generiert, bei denen die NO-GC global (GCKO) oder Perizyten-spezifisch (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO) deletiert ist. Zudem wurden tdTomato-Reportermäuse verwendet, die das Fluoreszenzprotein unter Kontrolle eines spezifischen Reporters exprimieren (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). In der Lunge sind Perizyten der NO-GC-exprimierende Zelltyp. Durch Immunhistochemie konnten zudem zwei verschiedene Subpopulationen von NO-GC-exprimierenden Perizyten identifiziert werden: Eine große Population an SMMHC/PDGFRβ-positiven Perizyten und eine kleine Population an NG2/PDGFRβ-positiven Perizyten. 
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der NO-GC während der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Bleomycin führt zu einer fibrotischen Antwort in allen Genotypen, was durch ein erhöhtes Lungengewicht und einen erhöhten Kollagengehalt deutlich wird. Der Schweregrad der Lungenverletzung ist in NO-GC-defizienten Mäusen größer als in Anwesenheit der NO-GC. Dies deutet auf eine Rolle der NO-GC bei der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. 
Während der Entstehung der Lungenfibrose kommt es zur Bildung von Myofibroblasten, die als die Schlüsselzellen der Wundheilung und fibrotischer Prozesse bezeichnet werden. Diese Zellen kommen unter physiologischen Bedingungen kaum vor und ihre Herkunft ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Da Perizyten als mögliche Vorläuferzellen betrachtet werden, wurde Lineage Tracing von Perizyten durchgeführt. Erstmals wurden zwei verschiedene Myofibroblasten-Subtypen durch die Expression von NO-GC unterschieden: (1) NO-GC-positive Myofibroblasten, die in der Alveolarwand lokalisiert sind und von Perizyten abstammen und (2) NO-GC-negative Myofibroblasten, die sich innerhalb der Alveolen befinden, deren Ursprung jedoch nicht Perizyten sind. Diese Myofibroblasten zeigen jedoch eine de novo-Synthese von PDGFRβ. Durch Lineage Tracing-Versuche sowie immunhistochemische Analysen können Perizyten, Endothelzellen und Fibrozyten als Vorläuferzellen ausgeschlossen werden. Die Ursprungszelle der intra-alveolären Myofibroblasten ist somit bislang nicht identifiziert. 
Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle der an der Lungenfibrose beteiligten Zelltypen näher untersucht. Dazu wurde die Auflösung der reversiblen Bleomycin-induzierten Lungenschäden betrachtet. Der Verlust der beiden Myofibroblasten-Subtypen weist darauf hin, dass sie zwar die Effektorzellen der Wundheilungsreaktion, jedoch nicht an der Entstehung der chronisch manifesten Fibrose beteiligt sind. Perizyten proliferieren in Folge der Gabe von Bleomycin und sind vermehrt im Lungenparenchym auch nach Auflösung der Bleomycin-induzierten Lungenverletzung vorzufinden. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass es sich hierbei um die Effektorzellen der chronisch manifesten Lungenfibrose handelt, die durch eine Verdickung der Alveolarwand gekennzeichnet ist. Um die zellulären Mechanismen der Lungenfibrose umfassend aufzuklären, müssen weitere Untersuchungen an irreversiblen Fibrosemodellen folgen, die auch die chronischen Charakteristiken der Erkrankung berücksichtigen.
N2  - This project provides new insights into the pathogenesis of pulmonary fibrosis on the cellular level. Pulmonary fibrosis is a chronic disease characterized by signs of inflammation and the appearance of myofibroblasts that are responsible for excessive production of extracellular matrix (ECM). This leads to destroyed lung architecture, scar formation and reduced gas exchange. A modulatory role of nitric oxide (NO) in the development of pulmonary fibrosis has been proposed. However, the effector cells in the lung are remain elusive. 
The first part of the thesis focused on the localization of NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) in lung. Pericytes are the major NO-GC-expressing cell type in lung. Knock-out mice were generated lacking NO-GC globally (GCKO) as well as pericyte-specific GCKO mice (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO). In addition, reporter mice were used that express tdTomato following cre-mediated recombination (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). Immunohistochemical analysis shows the existence of two subpopulations of pericytes expressing NO-GC in lung: SMMHC/PDGFRβ-positive pericytes and a smaller subpopulation of NG2/PDGFRβ-positive pericytes.
In the second part of the thesis, the role of NO-GC during bleomycin-induced lung injury was investigated. Bleomycin led to a fibrotic response in all genotypes as seen by an increase of lung weight and collagen content. Severity of lung injury in NO-GC-deficient mice was greater compared to wild type (WT) mice following instillation of bleomycin. These results indicate a possible role of NO-GC during bleomycin-induced lung injury. 
The development of pulmonary fibrosis is characterized by the formation of myofibroblasts that are known to be key players of wound healing and fibrotic processes. These cells do not occur under physiological conditions and their origin is still under debate. Lineage tracing of pericytes showed that NO-GC-expression allows to differentiate interstitial from intra-alveolar myofibroblasts: (1) NO-GC-positive, pericyte-derived myofibroblasts located in the alveolar wall and (2) NO-GC-negative, intra-alveolar myofibroblasts that are not derived from pericytes but, surprisingly, show de novo-expression of PDGFRβ after injury.
The precursor cell type of intra-alveolar myofibroblasts is not identified yet. Pericytes, endothelial cells and fibrocytes do not transdifferentiate into myofibroblasts. 
Investigation of different cell types during resolution of lung fibrosis showed the disappearance of both types of myofibroblast. NO-GC-expressing pericytes that proliferate following administration of bleomycin are still present in an increased number. These results implicate a major role of myofibroblasts during wound healing responses but pericytes could be the effectors of chronic and manifest pulmonary fibrosis that is characterized by thickening of the alveolar wall. For a further understanding of the cellular mechanisms during pulmonary fibrosis investigations on irreversible models of fibrosis need to be performed.
KW  - Lungenfibrose
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Myofibroblast
KW  - Perizyt
KW  - NO-sensitive Guanylyl-Cyclase
KW  - Bleomycin
KW  - Pulmonary fibrosis
KW  - NO-sensitive guanylyl cyclase
KW  - myofibroblast
KW  - pericyte
KW  - bleomycin
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176710
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schwiering, Fabian
T1  - Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Leberfibrose in der Maus
T1  - Localization and importance of NO-sensitive guanylyl cyclase in liver fibrosis of the mouse
N2  - Mittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer übermäßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen führen kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiemöglichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung bei verschiedenen Organfibrosen kommt. Deshalb wird vermutet, dass die NO-GC eine modulatorische Rolle bei der Entwicklung einer Organfibrose einnimmt. Die Effektorzellen sind bisher unbekannt.

Im ersten Teil dieser Arbeit sollten die Effektorzellen der Lunge in vitro untersucht werden. Da bekannt ist, dass in der Lunge Perizyten NO-GC exprimieren, wurde ein Protokoll etabliert, das es ermöglichte, Perizyten spezifisch aus der Lunge zu isolieren und in Kultur zu bringen. Durch den Einsatz von verschiedenen Markern wurden im Anschluss diese isolierten Perizyten weiter charakterisiert. Zum einen konnte festgestellt werden, dass die NO-GC in diesen isolierten Zellen exprimiert wird. Zum anderen stellte sich heraus, dass die Perizyten auch durch einen Marker (SM/MHC) identifiziert werden können, der eigentlich als VSMC-Marker gilt. Diese Daten waren analog zu den In-vivo-Daten von Aue et al. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob diese NO-GC- exprimierenden Perizyten in Kultur zu Myofibroblasten differenziert werden können. Dies gelang jedoch nicht durch Stimulation mit TGF-β1.

Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, in welchen Zellen in der Leber die NO-GC exprimiert wird. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die NO-GC in der Leber in den HSC exprimiert wird. Da bekannt ist, dass die NO-GC Einfluss auf die Organfibrose nimmt, sollte die NO-GC-Expression in der Leberfibrose untersucht werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass es zu einer gesteigerten NO-GC-Expression in der CCl4-induzierten Leberfibrose kommt. Diese war vor allem in den Myofibroblasten lokalisiert – den Zellen, die wahrscheinlich für den übermäßigen Einbau der EZM sorgen. Um den Einfluss der NO-GC auf die Leberfibrose genau- er zu untersuchen, wurde die Fibrose zwischen WT- und GCKO-Tieren verglichen. Dabei konnte beobachtet werden, dass es in den GCKO-Tieren zu einer stärkeren Fibrose als in WT-Tieren kam, die sich durch eine vermehrte Einlagerung von Kollagen und einer erhöhten Expression von TGF-β1 auszeichnete. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die NO-GC eine wahrschein- lich protektive Rolle in der Leberfibrose einnimmt.

Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HSC in der Leberfibrose genauer untersucht. Dabei konnte zum ersten mal festgestellt werden, dass sich die HSC in Subpopulation unter- teilen lassen. Durch den Einsatz von Reportermäusen, bei denen unter dem SM/MHC- oder PDGFRβ-Promotor das Flurophor tdTomato exprimiert wurde, ließen sich die HSC in 3 Subpo- pulationen einteilen: (1) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato−; (2) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato+ und (3) SM/MHC-Tomato+ und PDGFRβ-Tomato−. Durch Lineage-Tracing- Versuche konnte den beschriebenen Subpopulationen Aufgaben in der Leberfibrose und in deren Auflösung zugeordnet werden. Die Subpopulation 1 ist in der gesunden Leber hauptsächlich in den Zonen 2 und 3 des Leberazinus lokalisiert. In der Fibrose wandern diese Zellen zu den fibrotischen Regionen und differenzieren dort zu Myofibroblasten. In der Auflösung der Fibrose verschwinden diese Zellen durch Apoptose aus der Leber. Die HSC-Subpopulation 2 befindet sich in der gesunden Leber in der Zone 1 des Leberazinus. Auch in und nach Auflösung der Leberfibrose verweilen diese Zellen dort. Zwar befindet sich die HSC-Subpopulation 3 in der ge- sunden Leber ebenfalls nur in Zone 1 des Leberazinus, jedoch wandern die Zellen in der Fibrose in die Zone 2 und 3 und ersetzen dort die HSC-Subpopulation 1, die in die fibrotische Region gewandert ist. Nach Auflösung der Leberfibrose hat die HSC-Subpopulation 3 die Population 1 vollständig ersetzt.

Nach Identifizierung der HSC-Subpopulationen stellte sich die Frage, ob ein spezifischer Aus- schnitt der NO-GC zu einer veränderten Leberfibrose führt im Vergleich zum WT. Dazu wurde unter dem SM/MHC- und PDGFRβ-Promotor die NO-GC deletiert und die Fibrose in diesen Knockouts untersucht. Während bei der Deletion der NO-GC unter dem PDGFRβ-Promotor kein Unterschied im Vergleich zum WT gesehen werden konnte, ließ sich beim SM/MHC-GCKO Unterschiede feststellen. Durch den Ausschnitt der NO-GC in den Zellen der HSC-Subpopulation 3 kam es zu einer verringerten Expression von PPARγ in der gesunden Leber. Da PPARγ als Gegenspieler von TGF-β1 fungiert, konnte eine erhöhte TGF-β1-Expression in der gesunden und fibrotischen Leber des SM/MHC-GCKO im Vergleich zum WT-Tier gesehen werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die NO-GC über die Steuerung des PPARγ ihren protektiven Effekt auf die Leberfibrose ausübt.
N2  - By means of the questions addressed in this work, new insights were gained on the role of NO-GC in the pathogenesis of lung and liver fibrosis. As a result of fibrosis in the lungs and liver, there is an excessive accumulation of EZM, which can lead to organ failure. So far, there are only a few treatment options available for the treatment of organ fibrosis. However, it has recently been shown that the use of NO-GC-stimulators/activators can improve/heal diverse organ fibrosis. Therefore, NO-GC is thought to play a modulatory role in the development of organ fibrosis, however, effector cells are still not known.

In the first part of this work, the effector cells of the lung were examined in vitro. Since it is known that NO-GC in the lung is expressed in pericytes, a protocol was established that allowed to specifically isolate pericytes from the lung and bring them into culture. By using different markers, these isolated pericytes were further characterized. Furthermore, NO-GC-expression was detected in these isolated cells. In addition, pericytes can also be marked by a marker (SM/MHC), which is actually known as a VSMC-marker. These data were analogous to the in vivo data of Aue et al.. Although, it was investigated whether these NO-GC-expressing pericytes differentiated into myofibroblasts in culture. This was not been achieved by stimulation with TGF-β1.

In the second part of this work, it was investigated in which cells in of the liver NO-GC is expressed. In vivo it could be shown that NO-GC is expressed in HSC of the liver. Since it is known that the NO-GC has an influence on organ fibrosis, NO-GC-expression in liver fibrosis was investigated. It was found that there is an increased NO-GC-expression in CCl4-induced liver fibrosis. Expression was mainly found in myofibroblasts - the cells likely responsible for production of EZM. To further investigate the influence of NO-GC on liver fibrosis, fibrosis between WT and GCKO animals was compared. It could be observed that there was a stronger fibrosis in GCKO-animals than in WT-animals, as seen by an increased accumulation of collagen and an increased expression of TGF-β1. This demonstrated that NO-GC plays a likely protective role in liver fibrosis.

In the third part of this work, the role of HSC in liver fibrosis was examined in more detail. For the first time, it was found that HSC can be subdivided into subpopulations. Reporter mice expressing the tdTomato fluorophore under the SM/MHC- or PDGFRβ-promoter allowed the subdivision of the HSC into 3 subpopulations: (1) SM/MHC-Tomato − and PDGFRβ-Tomato −; (2) SM/MHC- Tomato − and PDGFRβ-Tomato+ and (3) SM/MHC-Tomato + and PDGFRβ-Tomato −. HSC lineage tracing-experiments showed that these subpopulations have different roles during liver fibrosis and the resolution. In the healthy liver subpopulation, 1 is mainly located in zones 2 and 3 of the liver acinus. In fibrosis, these cells migrate to the fibrotic regions and differentiate into myofibroblasts. In the dissolution phase of fibrosis, these cells disappear by apoptosis. Under physiological conditions, HSC-subpopulation 2 are located to zone 1 of the liver acinus. Even in and after the dissolution of liver fibrosis these cells persist. HSC-subpopulation 3 in the healthy liver is also only in zone 1 of the liver acinus. In fibrosis these cells migrate to zone 2 and 3 were they replace HSC-subpopulation 1 that has migrated into the fibrotic region. After dissolving of liver fibrosis, subgroup 3 has completely replaced population 1.

After identifying the HSC-subpopulation, the question was whether a specific section of the NO-GC leads to altered liver fibrosis compared to WT.  For this purpose, NO-GC was deleted under SM/MHC- and PDGFRβ-promoter and fibrosis was investigated in these knockouts. While there was no difference in the deletion of NO-GC under the PDGFRβ-promoter compared to WT, SM/MHC-GCKO showed different results. The excision of NO-GC in the cells of HSC- subpopulation 3 resulted in a decreased expression of PPARγ in the healthy liver. Since PPARγ acts as an antagonist of the TGF-β1-pathway, increased TGF-β1-expression in SM/MHC-GCKO was seen in the healthy and fibrotic liver compared to WT-liver. These results suggest that NO-GC has a protective effect on liver fibrosis by the control of PPARγ.
KW  - Leberfibrose
KW  - Kupffer-Sternzelle
KW  - Stickstoffmonoxid
KW  - Immunohistologie
KW  - Guanylatcyclase
KW  - CCl4-induzierte Leberfibrose
KW  - Perizyten
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-186520
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dünnes, Sarah
T1  - Einfluss der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase auf den cGMP/cAMP-Crosstalk und die Steifigkeit der murinen Aorta
T1  - Influence of NO-sensitive guanylyl-cyclase on cGMP/cAMP crosstalk and the stiffness of the murine aorta
N2  - Die NO/cGMP-vermittelte Signalkaskade ist im vaskulären System entscheidend an der Regulation des Blutdrucks beteiligt. Innerhalb der Kaskade nimmt die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) eine Schlüsselfunktion als wichtigster Rezeptor für das Signalmolekül Stickstoffmonoxids (NO) ein. NO wird endogen von verschiedenen Isoformen der NO Synthase produziert. Die Bindung von NO an die NO GC führt zur Produktion des sekundären Botenstoffs cyclisches Guanosinmonophosphat (cGMP). Dieser Botenstoff aktiviert verschiedene Effektor-Moleküle und bewirkt letztlich eine Relaxation der glatten Muskulatur. Ein weiterer sekundärer Botenstoff, das Signalmolekül cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), ist ebenfalls an der Regulation des Tonus der glatten Muskulatur und dadurch an der Blutdruckregulation beteiligt. Unterschiedliche Phosphodiesterasen (PDE) bauen die sekundären Botenstoffe ab und beenden dadurch die Signalkaskaden. Die PDE3 spielt hierbei eine besondere Rolle, da sie eine gemischte Substratspezifität besitzt. Um den Einfluss der NO-GC auf das kardiovaskuläre System zu untersuchen, wurden NO-GC Knockout(KO)-Mäuse mit globaler (GCKO) oder Glattmuskel-spezifischer (SMC-GCKO) Deletion der NO-GC generiert.

Um das Zusammenspiel von cAMP und cGMP näher zu beleuchten, wurde im ersten Teil dieser Arbeit die PDE3 genauer untersucht. Im Gefäßsystem wird lediglich die PDE3A und nicht die PDE3B exprimiert. Die Aorten von GCKO- und SMC-GCKO-Tieren reagieren sensitiver auf PDE3A-Blockade als die Kontroll-Tiere. Auch die akute Blockade der NO-GC führt zu diesem Sensitivitätseffekt. Die PDE3A ist in Folge der NO-GC-Deletion sowohl in ihrer Expression, als auch ihrer Aktivität um die Hälfte reduziert. Dies dient vermutlich kompensatorisch dazu, das cAMP-Signal weitgehend zu erhalten und so eine cAMP-induzierte Relaxation der Gefäße zu gewährleisten. Ohne Rückkopplung zwischen den beiden Signalwegen käme es vermutlich zu weiteren negativen Konsequenzen für das Herz-Kreislaufsystem. Diese Daten weisen auf eine direkte Regulation der PDE3 in glatten Muskelzellen durch die NO/cGMP-Signalkaskade und einen PDE3-vermittelten cAMP/cGMP-Crosstalk hin. Der genaue Mechanismus dieser Expressionsregulation ist noch unklar. Denkbar wäre eine cGMP-vermittelte Transkriptionsregulation oder eine Modulation der Translation der PDE3A.

Der Verlust der NO-GC führt in GCKO- und SMC-GCKO-Mäusen zu einem erhöhten systolischen Blutdruck von ~30 mmHg. Bei der Entwicklung der arteriellen Hypertonie könnte eine erhöhte Aortensteifigkeit beteiligt sein, die im zweiten Teil dieser Arbeit näher untersucht wurde. In GCKO-Mäusen ist die aortale Steifigkeit und daraus resultierend die Pulswellengeschwindigkeit (PWV) deutlich erhöht. Die Steigerung der PWV wird in den GCKO-Tieren zusätzlich durch den verminderten Aorten-Durchmesser bedingt. Außerdem weisen die Aorten dieser Tiere eine veränderte Wandstruktur auf, die zu einer Verminderung der aortalen Windkesselfunktion führt. Diese Veränderungen könnten die Blutdruckerhöhung in GCKO-Mäusen erklären. In SMC-GCKO-Tieren tritt keine dieser Gefäß-Modifikationen auf. Eine Aortensteifigkeit als mögliche Ursache für den erhöhten systolischen Blutdruck in den SMC-GCKO-Tieren kann somit ausgeschlossen werden. Zur Aufklärung müssen weitere Versuche zum Aufbau der Gefäßwände und zur Bestimmung des peripheren Widerstands gemacht werden. Auch der Einfluss anderer Zelltypen, wie z.B. Perizyten oder Fibroblasten, auf die Blutdruckregulation sollte untersucht werden.
N2  - The NO/cGMP-mediated signaling cascade is crucially involved in the regulation of blood pressure. Within the cascade, NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) plays a key role as the most important receptor for the signaling molecule nitric oxide (NO).
NO is endogenously produced by three different isoforms of NO synthase. Binding of NO to NO-GC stimulates the production of the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP). cGMP, in turn, activates various effector molecules, finally leading to smooth muscle relaxation. Another second messenger, the signalling molecule cyclic adenosine monophosphate (cAMP), also participates in the regulation of smooth muscle tone and is thus also involved in the regulation of blood pressure. Phosphodiesterases (PDE) degrade cyclic nucleotides thereby ending their signalling. In order to investigate the effect of NO-GC on the cardiovascular system, mice with global (GCKO) or smooth muscle-specific (SMC-GCKO) deletion of NO-GC have been generated.
To shed light into the interplay of cAMP and cGMP, PDE3 was studied in the first part of this thesis. PDE3 plays a special role in cGMP/cAMP crosstalk based on its mixed substrate specificity. From the two PDE3 isoenzymes (PDE3A and PDE3B), only PDE3A is expressed in the aorta. The aortas of GCKO- and SMC-GCKO animals are more sensitive to PDE3A inhibition than those from control animals. The acute blockade of NO-GC using ODQ also leads to this sensitivity effect. As a result of NO-GC deletion, PDE3A expression and activity are reduced by approx. 50%. This is probably a compensatory response in order to maintain functional cAMP signalling and to guarantee cAMP-induced relaxation of blood vessels. These results indicate a direct regulation of PDE3A in smooth muscle cells by the NO/cGMP-signalling cascade and a PDE3-mediated cAMP/cGMP crosstalk. The exact mechanism how NO-GC/cGMP regulates PDE3A expression remains unclear; conceivable options are a cGMP-mediated regulation of transcription or a modulation of PDE3A translation.
Loss of NO-GC in GCKO and SMC-GCKO mice leads to an elevated systolic blood pressure by around 30 mmHg. In the second part of this thesis, stiffness of aortae from these KO animals was examined. In GCKO mice, the pulse wave velocity (PWV) was significantly faster than in control animals indicating an increased aortic stiffness. The increase in PWV in GCKO animals is likely to be explained by a reduced aortic diameter. Even though elastin and collagen content were unchanged, the aortas of these animals have an altered wall structure. SMC-GCKO animals show neither an increase in PWV nor morphological changes of the aorta. Thus, an increased aortic stiffness can be excluded as cause for the elevated systolic blood pressure in GCKO animals.
KW  - Knock-Out <Molekulargenetik>
KW  - Maus
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Cyclo-GMP
KW  - Aorta
KW  - Guanylyl-Cyclase
KW  - Cyclo-AMP
KW  - Stickstoffmonoxid
KW  - Phosphodiesterase 3
KW  - Pulswellengeschwindigkeit
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141479
ER  - 
TY  - THES
A1  - Werner, Lennart
T1  - Einfluss der pharmakologischen Langzeittherapie mit dem sGC-Aktivator Ataciguat auf die Endotheliale Dysfunktion und Thrombozytenaktivierung bei Herzinsuffizienz
T1  - Influence of pharmacological treatment with the sGC-activator Ataciguat on endothelial dysfunction and platelet activation in heart failure
N2  - Die vorliegende Studie befasst sich mit der medikamentösen Langzeittherapie der Endotheldysfunktion im Rahmen der klinisch manifesten Herzinsuffizienz nach
Myokardinfarkt mit dem sGC-Aktivator Ataciguat.
Im Rahmen der chronischen Herzinsuffizienz nach abgelaufenem Myokardinfarkt kommt es als Folge der eingeschränkten linksventrikulären Funktion und der verminderten Schubspannung am Gefäßendothel zur Endotheldysfunktion. Die Vasodynamik gerät aus dem Gleichgewicht und führt zur erniedrigten Bioverfügbarkeit von NO, zur verminderten Expression des NO-synthetisierenden Enzyms (eNOS) und zur
Entkopplung der eNOS. Dieses als „eNOS-uncoupling“ bekannte Phänomen führt zur vermehrten Bildung von reaktiven Sauerstoffradikalen, welche den oxidativen Stress auf das beschädigte Endothel erhöhen. Die reaktiven Sauerstoffradikale oxidieren zusätzlich in den glatten Muskelzellen die lösliche Guanylatzyklase und reduzieren somit die Vasodilatation.
Verschiedene neurohumerale Systeme beeinflussen das Gleichgewicht zwischen vasodilatativen und vasokonstriktiven Substanzen am Endothel und somit die
Endothelfunktion. Diese neurohumeralen Systeme spielen wichtige Rollen in der aktuellen medikamentösen Therapie der chronischen Herzinsuffizienz und bieten zahlreiche verschiedene Therapieoptionen.
Ein relativ neuartiger Therapieansatz beinhaltet die medikamentöse Therapie mit sogenannten sGC-Aktivatoren, einer Wirkstoffklasse, die durch direkte Interaktion
mit der löslichen Guanylatzyklase sowohl die Bildung von Sauerstoffradikalen verringert, als auch die NO-Sensibilität am Gefäßendothel verbessert. Hierzu gehört
auch das in dieser Studie untersuchte Ataciguat.
Neben den direkten, „endothel-abhängigen“ Effekten am Gefäßendothel beeinflußt Ataciguat über die sogenannten „endothel-unabhängigen Effekte“ die Funktion der Blutplättchen, welche im Rahmen der Herzinsuffizienz durch die verminderte Bioverfügbarkeit von NO eine vermehrte Aktivierung und Adhäsion erfahren. Die
Folge sind erhöhte Risiken für thrombembolische Ereignisse und die Formation artherosklerotischer Läsionen. Ataciguat vermindert diese Risiken.
Mit den Ergebnissen dieser Studie konnten sowohl die endothel-abhängigen als auch die endothel-unabhängigen Effekte der medikamentösen Langzeittherapie mit
Ataciguat im experimentellen Modell der chronischen Herzinsuffizienz nach Myokardinfarkt bestätigt werden.
N2  - Chronic pharmacologic sGC-activation with Ataciguat in an experimental setting of congestive heart failure (CHF) after myocardial infarction (MI) improves vascular function and reduces platelet activation. Direct sGC-activation shows both endothelium-dependend and endothelium-independend effects by normalising endothelial function, improving NO-sensitivity and lowering platelet activation
KW  - Endothel
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Herzinfarkt
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Endotheldysfunktion
KW  - Ataciguat
KW  - eNOS
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104176
ER  - 
TY  - THES
A1  - Börner, Sebastian
T1  - Die endothelialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) sind an der akuten Regulation des arteriellen Blutdrucks und des Blutvolumens beteiligt
T1  - The endothelial effects of the atrial natriuretic peptide (ANP) are involved in the acute regulation of blood pressure and blood volume
N2  - Mit dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ANP über die Aktivierung der endothelialen Guanylyl Cyklase A (GC-A) akut die Permeabilität für Albumin an postkapillären Venolen stimuliert. Durch diesen Mechanismus ist ANP neben der chronischen auch an der akuten Reduktion des Plasmavolumens und des systolischen arteriellen Blutdrucks beteiligt. Aufgrund der wichtigen extrarenalen endothelialen Effekte stellt ANP das einzige hypovolämische Hormon im Organismus dar und ist somit ein bedeutender physiologischer Regulator der transvaskulären Volumenhomöostase. Jedoch sind diese Effekte deutlich von denen der vasoaktiven Substanzen, wie z. B. Histamin oder Thrombin und anderer diuretisch wirkender Substanzen, wie z. B. Schleifendiuretika, abzugrenzen. Vermutlich wird der permeabilitätssteigernde Effekt von ANP durch die beobachtete gesteigerte PKG- und PKA-abhängige Phosphorylierung von VASP vermittelt, wodurch möglicherweise die parazelluläre Permeabilität selektiv für Albumin gesteigert wird. Den gegenregulatorischen Mechanismus zur endothelialen GC-A stellt der NPR-C dar. Durch diesen erfolgt eine verminderte PKA- und PKG-abhängige Phosphorylierung von VASP, was durch die ANP-Infusion an EC GC-A KO Mäusen beobachtet wurde und zu einer Reduktion der physiologischen Permeabilität für Albumin an den postkapillären Venolen führen könnte. Somit wird wahrscheinlich durch diesen Mechanismus das Plasmavolumen, aber nicht der systolische arterielle Blutdruck in vivo gesteigert und eine übersteigerte Reaktion der GC-A verhindert. Aufgrund der enormen Bedeutung des ANP/GC-A Systems für die Modulation der endothelialen Permeabilität und die akuten sowie chronischen Regulation des Plasmavolumens und arteriellen Blutdrucks besitzt es bei Dysfunktion eine bedeutende klinische Relevanz. Denn durch eine verminderte Sekretion von ANP oder der Dysfunktion des endothelialen GC-A-Rezeptors, durch verschiedene Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) oder Desensitisierung, kann dieses System an der Entstehung der essentiellen Hypertonie oder der Hypervolämie bzw. Hypernatriämie bei herzinsuffizienten Patienten beteiligt sein.
N2  - Atrial natriuretic peptide (ANP) regulates arterial blood pressure and volume. Its guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor is expressed in vascular endothelium and mediates increases in cGMP, but the functional relevance is controversial. Notably, mice with endothelial-restricted GC-A deletion [EC GC-A knockout (KO) mice] exhibit significant chronic hypervolemic hypertension. The present study aimed to characterize the endothelial effects of ANP and their relevance for the acute regulation of intravascular fluid volume. We studied the effect of ANP on microvascular permeability to fluorescein isothiocyanate-labeled albumin (BSA) using intravital microscopy on mouse dorsal skinfold chambers. Local superfusion of ANP (100 nM) increased microvascular fluorescein isothiocyanate-BSA extravasation in control but notECGC-AKO mice. Intravenous infusion of synthetic ANP (500 ng/kg min) caused immediate increases in hematocrit in control mice, indicating intravascular volume contraction. In EC GC-A KO mice, the hematocrit responses were not only abolished but even reversed. Furthermore, acute vascular volume expansion, which caused release of endogenous cardiac ANP, did not affect resting central venous pressure of control mice but rapidly and significantly increased central venous pressure of EC GC-A KO mice. In cultured lung endothelial cells, ANP provoked cGMP-dependent protein kinase I-mediated phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein. We conclude that ANP, via GC-A, enhances microvascular endothelial macromolecule permeability in vivo. This effect might be mediated by cGMP-dependent protein kinase I-dependent phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein. Modulation of transcapillary protein and fluid transport may represent one of the most important hypovolemic actions of ANP. (Endocrinology 149: 4193–4199, 2008)
KW  - Atriales natriuretisches Hormon
KW  - Cyclo-GMP
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Blutdruck
KW  - Volumenregulation
KW  - ANP
KW  - cGMP
KW  - GC-A
KW  - NPR-A
KW  - NPR-C
KW  - ANP
KW  - cGMP
KW  - GC-A
KW  - NPR-A
KW  - NPR-C
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85351
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TY  - THES
A1  - Motschenbacher, Stephanie
T1  - Einfluss einer Kombinationstherapie aus dem ACE-Hemmer Ramipril und dem Aktivator der löslichen Guanylatzyklase Ataciguat auf das kardiale Remodeling nach experimentellem Myokardinfarkt
T1  - Influence of the ACE-inhibitor Ramipril and the soluble guanylyl cyclase activator Ataciguat on cardiac remodeling as a combination therapy after experimental myocardial infarction
N2  - Die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC) durch Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zentraler Mechanismus im NO/sGC/cGMP-Signalweg. Beim Syndrom der chronischen Herzinsuffizienz ist die Signalübertragung durch NO jedoch gestört. Daher untersuchten wir die Effekte des NO-unabhängigen sGC-Aktivators Ataciguat-Natrium (vormals HMR1766) auf Hämodynamik und linksventrikuläres Remodeling in der Postinfarktphase bei Ratten, alleine und in Kombination mit dem ACE-Hemmer Ramipril. 10 Tage nach experimentellem Myokardinfarkt wurden die Tiere für 9 Wochen über eine Sonde entweder mit Placebo, Ataciguat (10 mg/kg, zweimal täglich), Ramipril (1 mg/kg/Tag) oder einer Kombination aus beidem gefüttert. Die Infarktgröße war in allen Gruppen vergleichbar. Die Monotherapie mit Ataciguat bzw. Ramipril verbesserte die linksventrikuläre Funktion und führte zu einem geringeren Anstieg des linksventrikulären Füllungsdruckes (LVEDP) und –volumens (LVEDV) im Vergleich zu Placebo. Die Kombinationstherapie war den Monotherapien überlegen. Weiterhin konnten sowohl die Ventrikelkontraktilität (LV dP/dtmax/IP), als auch -relaxationsfähigkeit (LV dP/dtmin) verbessert werden und die Lungenflüssigkeit sowie die rechtsventrikuläre Hypertrophie signifikant durch die Monotherapien, bzw. noch weiter durch die Kombination gesenkt werden. Die in der Placebo-Gruppe erhöhten Werte für Myozytenquerschnitt und interstitielle Fibrose waren in der Ramipril- und Ataciguat-Gruppe signifikant und in der Kombination noch weiter vermindert. Zusätzlich konnte auch der Superoxidanionenspiegel im kardialen Gewebe am besten durch die Kombinationstherapie gesenkt werden. Dabei zeigte sich eine Beeinflussung der NADPH-Oxidase-Untereinheit gp91phox und des mitochondrialen Enzyms UCP3. Eine Langzeitbehandlung mit Ataciguat verbesserte also die linksventrikuläre Dysfunktion und das kardiale Remodeling bei Ratten nach Myokardinfarkt in vergleichbarem Ausmaß wie die Therapie mit Ramipril. Die Kombination aus Ataciguat und ACE-Hemmer war jedoch wesentlich effektiver. Folglich stellt die sGC-Aktivierung einen vielversprechenden Therapieansatz zur Prävention von kardialem Remodeling und Herzinsuffizienz nach Herzinfarkt dar.
N2  - Impairment of nitric oxide (NO) signaling contributes to progression of heart failure. Activation of soluble guanylate cyclase (sGC) by NO is the key event in NO/sGC/cyclicGMP signaling. In this work, the effects of the NO independent sGC activator Ataciguat alone and in combination with the angiotensin-converting enzyme (ACE) inhibitor ramipril, on hemodynamics and cardiac remodeling in rats after extensive myocardial infarction (MI) were investigated.
KW  - Herzinfarkt
KW  - Ratte
KW  - Oxidativer Stress
KW  - ACE-Hemmer
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Cyclo-GMP
KW  - Ataciguat
KW  - Ramipril
KW  - Remodeling
KW  - Myokardinfarkt
KW  - ROS
KW  - Superoxidanionen
KW  - gp91phox
KW  - NOX
KW  - eNOS
KW  - cardiac remodeling
KW  - myocardial infarction
KW  - sGC
KW  - oxidative stress
KW  - Ataciguat
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74288
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klaiber, Michael
T1  - Bedeutung der cGMP-abhängigen Protein Kinase I für die kardialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids
T1  - The role of the cGMP-dependent protein kinase I on cardiac effects of the atrial natriuretic peptide
N2  - In diesem Projektteil charakterisierten wir mittels vergleichenden Analysen an Mäusen mit konditioneller, herzspezifischer Deletion der GC-A (CM GC-A KO; (Holtwick et al., 2003; Kilic et al., 2005 und 2007)) und Kontrolltieren die zellulären Mechanismen, welche bei Dysfunktion des ANP/GC-A-Systems die Entwicklung von Herzhypertrophie begünstigen. Wir untersuchten, ob/wie ANP die kardialen Effekte von -adrenerger versus Ang II/AT1 (Gs versus Gq-mediierter) Stimulation beeinflusst. Zunächst kombinierten wir an isolierten adulten murinen Kardiomyozyten elektrophysiologische Messungen der L-Typ Ca2+ Ströme (LTCS, mittels voltage-clamp Messungen in Kooperation mit Herrn Dr. M. Kruse und Herrn Prof. O. Pongs am Zentrum für Molekulare Neurobiologie, Universität Hamburg), fluorometrische Messungen der intrazellulären Calcium-Transienten (mittels Indo-1 AM) und Messungen der Kontraktilität (Zellverkürzung, mittels edge detection). Diese ex vivo Untersuchungen zeigten, dass Isoproterenol (ISO) und Ang II die LTCS, [Ca2+]i und Kontraktilität isolierter adulter Myozyten stimulieren. Interessanterweise hemmt ANP/GC-A die Effekte von Ang II, nicht aber die Effekte von ISO. Um der Bedeutung dieser Interaktion zwischen ANP und Ang II für die Entwicklung einer pathologischen Herzhypertrophie ...
N2  - The cardiac hormone atrial natriuretic peptide (ANP) is critically involved in the maintenance of arterial blood pressure and blood volume homeostasis. In addition to this endocrine actions, ANP exerts local, cardiac effects which counteract pathological cardiac hypertrophy and interstitial fibrosis. These diverse cellular actions of ANP are mediatied by the cGMP forming guanylyl cyclase (GC) receptor, GC-A. In cardiomyocytes, ANP/GC-A/cGMP signalling prevents pathological [Ca2+]i increases and thereby counteracts pathological hypertrophy. However the downstream signalling pathways mediating this effect are unclear. The present thesis characterized the third and downstream intracellular messengers mediating the cardiac antihypertrophic effects of ANP, with a special focus on the role of cGMP-dependent protein kinase I (cGKI). In addition, we investigated whether and how desensitization of the GC-A receptor alters the cardiac effects of ANP. ...
KW  - Atriales natriuretisches Hormon
KW  - Guanylatcyclase
KW  - ANP
KW  - GC-A
KW  - PKG I
KW  - ANP
KW  - GC-A
KW  - PKG I
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69990
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TY  - THES
A1  - Looser, Jens
T1  - Funktionelle Analyse der Photoaktivierten Adenylatzyklase (PAC) aus Euglena gracilis
T1  - Functional analysis of Euglena gracilis photoactivated adenylyl cyclase (PAC)
N2  - Die Photoaktivierte Adenylatzyklase PAC ist in E. gracilis an der Phototaxis beteiligt und besteht aus den zwei unterschiedlich großen Proteinen PACalpha und PACbeta. Beide besitzen jeweils zwei FAD bindende (BLUF) Domänen F1 und F2 sowie zwei Zyklasedomänen C1 und C2. An den Zyklasedomänen findet die Umsetzung von ATP in cAMP statt und die BLUF-Domänen werden für die Lichtaktivierung benötigt. Für diese Arbeit wurde PAC und Mutanten davon heterolog in Oocyten von Xenopus laevis exprimiert. PAC besitzt bereits im Dunkeln Adenylatzyklaseaktivität, die durch Belichtung erhöht werden kann. Die Zunahme der Aktivität erfolgt mit einer Zeitkonstante von unter 100 ms, die Abnahme nach der Belichtung hat eine Zeitkonstante im Bereich von 10ms. Das für die katalytische Umsetzung in allen Klasse III Nukleotidzyklasen benötigte Dimer zweier Zyklasedomänen ist in PAC das Dimer aus C1 und C2. Durch Messungen mit PAC-Mutanten, bei denen jeweils eine Zyklasedomäne defekt war, konnte gezeigt werden, dass diese Dimerisierung in PACalpha intermolekular auftritt. Ebenso wurde gezeigt, dass ein solches Dimer aus Zyklasedomänen von PACalpha und PACbeta bestehen kann. Der Austausch der Zyklasedomänen von PACalpha durch Zyklasedomänen der Guanylatzyklasen GCY35 und GCY36 aus C. elegans führte zu einem Verlust der Zyklaseaktivität. Die Proteine wurden aber zumindest teilweise korrekt gefaltet, was durch Dimerbildung mit Knockoutmutanten von PAC in Koexpressionsexperimenten gezeigt werden konnte. Die Fusionsproteine aus PACalpha und den CNG-Kanälen CNGA2 und OLF führten in Oocyten zu einer deutlich geringeren Leitwertänderung als eine Expression der Einzelproteine. Sowohl bei einer N-terminalen Fusion des Kanals an PAC als auch bei der C-terminalen Fusion war es jeweils der Kanal, der im Fusionsprotein stark gehemmt war. Eine Deletion des C-Terminus von PACalpha führte zu einem nicht funktionsfähigen Protein, das auch in Koexpression mit PAC-Knockoutmutanten keine messbare Adenylatzyklaseaktivität zeigte. Wurde die F2-Domäne deletiert, so verlor PAC ebenfalls seine Zyklaseaktivität vollständig. Die C1-Domäne war aber korrekt gefaltet, was durch eine Koexpression mit PAC-Mutanten gezeigt werden konnte, die in einer ihrer Zyklasedomänen defekt waren. Beide Chimären aus PACalpha und PACbeta besaßen Adenylatzyklaseaktivität. Diese war bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACalpha deutlich höher als bei der Chimäre mit dem C-terminalen Teil von PACbeta, was darauf hindeutet, dass im C-terminalen Teil von PAC der Grund für den Aktivitätsunterschied zwischen PACalpha und PACbeta liegt. Für die Veränderung der Substratspezifität von einer Adenylat- zu einer Guanylatzyklase waren Mutationen an mindestens drei Aminosäuren erforderlich. Die ebenfalls hergestellten Einzel- und Doppelmutanten verhielten sich wie der Wildtyp oder hatten eine deutlich eingeschränkte Adenylatzyklaseaktivität. Bei der Tripelmutante PACalpha K250E T319G S329Y war Guanylatzyklaseaktivität nachweisbar, die aber geringer war als die noch vorhandene Adenylatzyklaseaktivität. Die Quadrupelmutante PACalpha K250E D317K T319G S329Y zeigte ebenfalls lichtinduzierbare Adenylatzyklaseaktivität, die ca. 0,3% der Aktivität der Wildtyp-PACalpha entsprach. Die Guanylatzyklaseaktivität dieser Mutante war ca. dreifach höher als deren Adenylatzyklaseaktivität. Somit konnte gezeigt werden, dass sich durch die Mutation weniger einzelner Aminosäuren die Substratspezifität von PAC von ATP nach GTP verschieben lässt.
N2  - The photoactivated adenylyl cyclase PAC is involved in phototaxis in E. gracilis. It consists of two subunits of different size which are called PACalpha and PACbeta. Both of them harbour two FAD-binding domains (F1, F2) and two cyclase domains (C1, C2). PAC and mutants of PAC have been heterologously expressed in Oocytes of Xenopus laevis. Already in darkness PAC shows a basal level of adenylyl cyclase activity, which can be increased by illumination. The increase in cyclase activity occurs with a time constant lower than 100 ms, whereas the decrease after illumination has a time constant around 10 ms. The dimer of two cyclase domains, which is necessary for catalytic conversion in all class III cyclases, is formed of C1 and C2 in PAC. In electrophysiological experiments with PAC mutants which were defective in either of the cyclase domains it has been shown, that this dimer in PACalpha occurs intermolecularly. Furthermore it has been shown, that this dimer can occur between PACalpha and PACbeta. Mutants of PACalpha where the cyclase domains have been substituted by the cyclase domains of the guanylyl cyclases GCY35 and GCY36 from C. elegans lost their ability to produce cAMP. However coexpression experiments with PAC knockout mutants indicated correct translation of the substitution mutants. Expression of fusion proteins of PACalpha with the CNG channels CNGA2 and OLF showed less light-inducable conductance changes than the expression of the single protein. In both the N-terminal and C-terminal fusion of the channel to PACalpha it was the channel which was the most affected part of the fusion protein. Deletion of the C-terminus of PACalpha results in a non-functional protein, which in coexpression with PACalpha knockout mutants shows no measurable cyclase activity. When deleting the F2-domain, PACalpha also loses its cyclase activity completely. However, the C1-domain was transcribed correctly, which could be shown by coexpression with a C1-knockout mutant. Both PACalpha-PACbeta chimeras showed adenylyl cyclase activity. Whereas the activity in the chimera with the C-terminal part of PACbeta showed little cyclase activity, the chimera possessing the C-terminal part of PACalpha showed adenylyl cyclase acitvity, which was comparable to the wildtype of PACalpha. This indicates that the part of PAC which is responsible for the difference in cyclase activity between PACalpha and PACbeta must be present in the C-terminal half of PAC. For altering PAC’s substrate specificity it was necessary to mutate at least three amino acids. The single and double mutants of PACalpha which were generated resulted in wildtypelike behaviour or reduced adenylyl cyclase activity. The triple mutant PACalpha K250E T319G S329Y showed guanylyl cyclase activity which was lower than its remaining adenylyl cyclase activity. The quadruple mutant PACalpha K250E D317K T319G S329Y also showed adenylyl cyclase activity, which was about 0.3% of the activity in PACalpha wildtype. The guanylyl cyclase activity of this mutant was about threefold higher than its adenylyl cyclase activity. Thus, it could be shown, that by mutating few single amino acids the substrate specificity of PACalpha was shifted from ATP to GTP.
KW  - Euglena gracilis
KW  - Glatter Krallenfrosch
KW  - Adenylatcyclase
KW  - Guanylatcyclase
KW  - BLUF
KW  - PAC
KW  - photoaktiviert
KW  - BLUF
KW  - PAC
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48283
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eder, Elisabeth Christiane
T1  - Die Wirkung von Sildenafil auf das kardiovaskuläre System in zwei murinen Modellen der Myokardhypertrophie
T1  - Effects of Sildenafil on the cardiovascular system, investigated in two murine models of left ventricular hypertrophy
N2  - Myokardhypertrophie stellt einen Adaptationsmechanismus des Herzens an erhöhte Belastungen wie chronische arterielle Hypertonie, Myokardinfarkt, Koronare Herzkrankheit, Myokarditis und Kardiomyopathien dar. Sowohl biomechanische als auch neurohumorale Stimuli führen auf einer Reihe von Signalwegen zur Myokardhypertrophie, die als Größenzunahme postmitotischer Kardiomyozyten definiert ist. Zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat ist ein ubiquitärer intrazellulärer Signalträger, der im kardiovaskulären System auf mindestens drei bekannten Wegen aus Guanosintriphosphat durch Abspaltung von Pyrophosphat synthetisiert wird. Die Synthese erfolgt unter anderem durch Aktivierung der partikulären, membranständigen Guanylylzyklase A durch Atriales Natriuretisches Peptid oder „B-Typ“ Natriuretisches Peptid und der Guanylyzyklase B, durch „C-Typ“ Natriuretisches Peptid. Des Weiteren wird über neuronale, endotheliale, oder induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase Stickstoffmonoxid synthetisiert, welches die lösliche, vorwiegend zytosolisch lokalisierte Guanylyzyklase aktiviert, die wiederum aus Guanosintriphosphat zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat synthetisiert. Das intrazelluläre zyklische 3´5´-Guanosinmonophosphat lässt sich durch Behandlung mit Sildenafilcitrat, einem unter dem Markennamen Viagra® zur Therapie der Erektilen Dysfunktion und Revatio® zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie zugelassenem Pharmakon, erhöhen. Sildenafil hemmt die Phosphodiesterase 5A, ein unter anderem in Lunge, Kardiomyozyten, Kleinhirn und glatter Muskulatur vorkommendes Isoenzym. In der vorliegenden Dissertation wurden die kardialen Effekte des Phosphodiesterase 5-Inhibitors Sildenafil an zwei Mausmodellen mit funktionell gut kompensierter Herzhypertrophie getestet. Die mittlere Tagesdosis betrug 150 (Studie 1) bzw. 240 (Studie 2) mg/kg Körpergewicht Sildenafil, in Anlehnung an publizierte Studien mit Nagern (Takimoto et al., 2005b). Diese Dosis wurde oral über vier (Studie 1) bzw. neun Wochen (Studie 2) zugeführt. Die mittlere Plasmakonzentration von Sildenafil lag mit 60 nM weit über dessen IC 50 (3,5 nM) zur Hemmung der PDE 5 in vitro. Studie 1 In der ersten Studie wurde die Nachlast des Herzens mittels operativer transverser Aortenkonstriktion um ca. 25 - 35 mmHg über vier Wochen erhöht. Vergleichbare Anstiege des systolischen Blutdrucks werden in Patienten mit ausgeprägter essenzieller arterieller Hypertonie gemessen. Nekropsie, echokardiographische, histologische und morphometrische Untersuchungen zeigten übereinstimmend die Entwicklung einer konzentrischen Herzhypertrophie ohne interstitielle Fibrose. Echokardiographische Bestimmungen der linksventrikulären Funktion zeigten einen leichten Anstieg der Ejektionsfraktion bei unveränderter fraktioneller Verkürzung der Wand des linken Ventrikels. Proteinchemische Analysen an linksventrikulären Gewebeproben zeigen die Aktivierung von Signalwegen der Herzypertrophie, insbesondere der Mitogen-Aktivierten Protein Kinase ERK 1 / 2. Zusammengenommen belegen diese morphologischen, funktionellen und biochemischen Analysen, dass durch die moderate operative Aortenstenose die Entwicklung einer ausgeprägten, aber funktionell gut kompensierten Linksherzhypertrophie induziert wurde. Die Entwicklung dieser Herzhypertrophie wurde durch Sildenafil nicht verhindert. Im Gegenteil, es zeigte sich unter der Gabe des Pharmakons sogar eine leichte Tendenz zur funktionellen Verschlechterung des linken Ventrikels, mit leicht reduzierter Ejektionsfraktion und gesteigertem Lungenfeuchtgewicht. Auch die kardiale Aktivierung des Hypertrophiesignalweges MAPK / ERK wurde durch Sildenafil nicht beeinflusst. Studie 2 In der zweiten Studie wurden die Effekte von Sildenafil an einem monogenetischen Mausmodell mit globaler Deletion der Guanylylzyklase-A (GC-A -/-), dem Rezeptor für Atriales natriuretisches Peptid, getestet. Wie zuvor in publizierten Studien gezeigt wurde, haben GC-A -/- Mäuse eine chronische arterielle Hypertonie, mit Anstiegen des systolischen Blutdrucks um 20 - 25 mmHg. Nekropsie, Echokardiographie, Histologie und Morphometrie ergaben übereinstimmend, dass diese arterielle Hypertonie von einer ausgeprägten globalen, funktionell gut kompensierten Herzhypertrophie mit leichter interstitieller Fibrose begleitet wurde. Unter der neunwöchigen Behandlung mit Sildenafil kam es zu einem signifikanten aber inkomplettem Rückgang der systemischen arteriellen Hypertonie (um ca 8 - 10 mmHg). Trotz dieser hypotensiven Effekte wurden die Rechts- und Linksherzhypertrophie und die kardiale Fibrose der GC-A -/- Tiere durch Sildenafil nicht beeinflusst. Dagegen zeigte sich auch hier mittels Echokardiographie eine leichte Verschlechterung der linksventrikulären Funktion unter Sildenafil, mit Abnahmen der Ejektionsfraktion und der fraktionellen Verkürzung des linken Ventrikels sowie einer Zunahme des endsystolischen Kammerdurchmessers. Zusammenfassend wurden die in der Literatur beschriebenen protektiven, kardialen antihypertrophen Effekte von Sildenafil in der vorliegenden experimentellen Dissertation nicht bestätigt.
N2  - Synthesis of cGMP in cardiomyocytes is stimulated by natriuretic peptides via GC-A signalling as well as nitric oxide (NO) via soluble guanylyl cyclase (sGC). Different studies in vitro / in vivo have demonstrated that cGMP can inhibit myocardial hypertrophic responses. In particular, genetic ablation of the ANP/GC-A or NO/sGC systems in mice led to exacerbated cardiac hypertrophy in response to pressure overload. Conversely, inhibition of cGMP catabolism with the PDE5 inhibitor sildenafil prevented and even reversed pathological cardiac hypertrophy after aortic banding [1]. The present ongoing study was originally designed to elucidate whether the antihypertrophic effects of PDE5 inhibition are linked to the formation of cGMP by either the NP/GC-A or the NO/sGC system. We subjected male C57Bl/6 mice (8 weeks of age, Charles River) to constriction of the transverse aorta (TAC) for 4 weeks. They were concurrently treated with the PDE5 inhibitor sildenafil (100 mg/kg/d) or vehicle mixed in solid food (n=7 per group).Furthermore, mice with genetic ablation of the GC-A receptor were treated with Sildenafil or Placebo. The studies demonstrate that Sildenafil does not exhibit direct antihypertrophic effects, but does exhibit indirect effects on left ventricular myocardium. Furthermore, Sildenafil is supposed to amplify the cGMP that is generated via ANP/GC-A system.
KW  - Linksherzhypertrophie
KW  - Sildenafil
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Blutdruck
KW  - Cyclo-GMP
KW  - Transverse Aortenkonstriktion
KW  - Sildenafil
KW  - Left Ventricular Hypertrophy
KW  - Guanylatzklase-A
KW  - cGMP
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54515
ER  -