TY - JOUR A1 - Rohmer, Carina A1 - Dobritz, Ronja A1 - Tuncbilek-Dere, Dilek A1 - Lehmann, Esther A1 - Gerlach, David A1 - George, Shilpa Elizabeth A1 - Bae, Taeok A1 - Nieselt, Kay A1 - Wolz, Christiane T1 - Influence of Staphylococcus aureus strain background on Sa3int phage life cycle switches JF - Viruses N2 - Staphylococcus aureus asymptomatically colonizes the nasal cavity of mammals, but it is also a leading cause of life-threatening infections. Most human nasal isolates carry Sa3 phages, which integrate into the bacterial hlb gene encoding a sphingomyelinase. The virulence factor-encoding genes carried by the Sa3-phages are highly human-specific, and most animal strains are Sa3 negative. Thus, both insertion and excision of the prophage could potentially confer a fitness advantage to S. aureus. Here, we analyzed the phage life cycle of two Sa3 phages, Φ13 and ΦN315, in different phage-cured S. aureus strains. Based on phage transfer experiments, strains could be classified into low (8325-4, SH1000, and USA300c) and high (MW2c and Newman-c) transfer strains. High-transfer strains promoted the replication of phages, whereas phage adsorption, integration, excision, or recA transcription was not significantly different between strains. RNASeq analyses of replication-deficient lysogens revealed no strain-specific differences in the CI/Mor regulatory switch. However, lytic genes were significantly upregulated in the high transfer strain MW2c Φ13 compared to strain 8325-4 Φ13. By transcriptional start site prediction, new promoter regions within the lytic modules were identified, which are likely targeted by specific host factors. Such host-phage interaction probably accounts for the strain-specific differences in phage replication and transfer frequency. Thus, the genetic makeup of the host strains may determine the rate of phage mobilization, a feature that might impact the speed at which certain strains can achieve host adaptation. KW - phage KW - virulence KW - induction KW - gene regulation KW - Staphylococcus KW - hemolysin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-297209 SN - 1999-4915 VL - 14 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Jarick, Marcel T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und -Proteinphosphatase Stp von \(Staphylococcus\) \(aureus\) T1 - Molecular and functional characterization of the serine/threonine protein kinase Stk and Protein phosphatase Stp of \(Staphylococcus\) \(aureus\) N2 - Staphylococcus aureus ist ein Kommensale, der die menschliche Haut und Schleimhaut der Nase und des Rachens besiedelt. Der Keim verursacht aufgrund zahlreicher Virulenzfaktoren leichte aber auch schwere Infektionen wie Pneumonie, Endokarditis oder Sepsis. Die Behandlung von S. aureus-Infektionen gestaltet sich heutzutage schwierig, da der Keim Resistenzen gegen verschiedenste Antibiotika ausgebildet hat. Zur Bekämpfung dieser Resistenzen werden neue Antibiotika benötigt, die u.a. mit der Zellphysiologie und der Zellwandwandsynthese der Bakterien interferieren. Die Zellphysiologie und Zellwandsynthese wird abhängig von der Wachstumsphase und Umwelt-einflüssen in den Bakterien streng reguliert. Neben den Zweikomponentensystemen sind Serin/Threonin-Proteinkinasen und -Phosphatasen wesentliche Sensoren und Regulatoren der Bakterien. Durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung bewirken diese beiden Systeme eine Hemmung oder Aktivierung der entsprechenden Zielproteine. Dadurch kann sich die Bakterienzelle an innere und äußere Reize anpassen. In dieser Arbeit wurde die konservierte Serin/Threonin-Proteinkinase Stk und die Serin/Threonin-Phosphatase Stp von S. aureus untersucht. Die beiden Proteine Stk und Stp haben einen großen Einfluss auf die Signalweiterleitung, den zentralen Metabolismus, die Stressantwort, die Antibiotikaresistenz und die Virulenz von S. aureus. Im ersten Teil dieser Arbeit wird dargelegt, dass Stk und Stp in der bakteriellen Membran lokalisiert sind, dort miteinander interagieren und antagonistisch Zielproteine phosphorylieren bzw. dephospho-rylieren. Die Deletion der Phosphatase Stp bewirkt, dass zahlreiche Proteine in der Zelle permanent phosphoryliert und daher vermutlich nur noch eingeschränkt funktionstüchtig sind. Die ausbleibende Dephosphorylierung der Proteine in der stp-Mutante hat einen dramatischen Effekt auf die Zellwand-synthese und die Virulenz von S. aureus. So hat die stp-Mutante eine verdickte Zellwand und ist weniger virulent als die stk-Mutante und der Wildtypstamm. Im Rahmen dieser Arbeit wird erstmals eine Erklärung präsentiert, die die strukturellen Besonderheiten von Stk und deren Auswirkung auf die Zellwandsynthese zusammenführt: In der stp-Mutante akkumulieren Zellwandvorläufer in der Zelle, da vermutlich die entsprechenden Zellwandsyntheseproteine durch Stk-vermittelte Phosphorylierung gehemmt werden. Die Proteine FemXAB nehmen eine zentrale Rolle in der Zellwandsynthese ein, indem sie die Pentaglycin-Interpeptidbrücke des Zellwandvorläufers Pentaglycin-Lipid II syntheti-sieren. Stk wird durch die Bindung seiner extrazellulären Domänen an Pentaglycin-Lipid II aktiviert. In der vorliegenden Arbeit konnte FemX als in vitro Substrat von Stk und Stp identifiziert werden. Die permanente Phosphorylierung von FemX in der stp-Mutante führt zur verminderten Synthese der Pentaglycin-Brücken am Lipid II und infolgedessen zum Einbau von unvollständigen Muropeptiden in den neuen Peptidoglycanstrang. Diese strukturelle Veränderung führt zur Verdickung der Zellwand und folglich zur verminderten Empfindlichkeit gegenüber der Glycyl-Glycinpeptidase Lysostaphin. Neben FemX interagiert Stk mit weiteren Zellwandsyntheseproteinen wie FemAB und einigen Zellteilungsproteinen. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass Stk das Vorkommen seines extrazellulären Liganden Lipid II detektiert und dementsprechend die Zellwandsynthese über FemX reguliert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde anhand verschiedener Omics-Techniken die stk-, stp- und stk/stp-Mutante im Vergleich zum S. aureus NewmanHG Wildtyp charakterisiert. Dabei zeigten sich teilweise große Unterschiede zwischen der stp-Mutante und den anderen Stämmen. Mit diesen Unter-suchungen konnten Ergebnisse aus anderen Studien bestätigt und mit weiteren Daten untermauert werden. So lässt sich die verminderte Virulenz der stp-Mutante mit der reduzierten Expression und Sekretion von Toxinen wie Hämolysinen und Leukozidinen erklären. Dies führt zu einer verminderten Hämolyse von Erythrozyten und einer verminderten Immunantwort gegen diese Toxine im Infektions-versuch. Stk und Stp phosphorylieren bzw. dephosphorylieren Transkriptionsfaktoren und Antwort-regulatoren von Zweikomponentensystemen, was zu der veränderten Expression und Sekretion der Virulenzfaktoren führt. Die Analyse der Mutanten offenbart, dass Stk ein negativer und Stp ein positiver Regulator der Virulenz in S. aureus ist. Außerdem regulieren Stk und Stp zentrale Aspekte des Metabolismus in S. aureus. So ist die Konzentration an Nukleotidtriphosphaten in der stp-Mutante reduziert, was auf eine verminderte Expression der Gene der Pyrimidinsynthese zurückzuführen ist. Anhand dieser Ergebnisse wird deutlich, dass Stk und Stp wesentliche Aspekte der Zellphysiologie wie die Zellwandsynthese, den zentralen Metabolismus und die Virulenz von S. aureus regulieren. N2 - Staphylococcus aureus is a commensal that inhabits the human skin and mucosa. S. aureus causes a large variety of nosocomial and community-acquired infections. Nowadays, it is difficult to treat S. aureus infections because this bacterium has acquired resistance to multiple drugs. Therefore, there is a need for new antimicrobial drugs against S. aureus. The most promising strategy to combat antibiotic resistance is to find novel antibiotics which interfere with the cell physiology and cell wall synthesis pathway. The cell physiology and cell wall synthesis is tightly regulated depending on the bacterial growth phase and environmental influences. In addition to the two-component systems, serine/threonine protein kinases are essential sensors and regulators of bacteria. By phosphorylation and dephosphorylation, these systems cause inhibition or activation of the corresponding target proteins. This allows the bacterial cell to adapt to internal and external stimuli. In this work, the conserved serine/threonine protein kinase Stk and the phosphatase Stp in S. aureus were investigated. The two proteins Stk and Stp influence signal transduction, central metabolism, stress response, antibiotic resistance and virulence of S. aureus. In the first part of this work it is shown that Stk and Stp are localized in the bacterial membrane, where they interact with each other and phosphorylate or dephosphorylate target proteins antagonistically. The deletion of the phosphatase Stp leads to numerous proteins in the cell being permanently phosphorylated, which renders them partially unfunctional. The lack of protein dephosphorylation in the stp mutant has a dramatic effect on cell wall synthesis and virulence of S. aureus. Thus, the stp mutant has a thickened cell wall and is less virulent than the stk mutant and the wild-type strain. This work brings together the structural characteristics of Stk and their effect on cell wall synthesis for the first time. In the stp mutant, cell wall precursors accumulate in the cell, presumably because the corresponding cell wall synthesis proteins are inhibited by Stk-mediated phosphorylation. The proteins FemXAB play a key role in cell wall synthesis by synthesizing the pentaglycine interpeptide bridge of the final cell wall precursor pentaglycine lipid II. The pentaglycine lipid II is bound by the extracellular domains of Stk, thereby activating Stk. In the present work, FemX was identified as an in vitro substrate of Stk and Stp. The permanent phosphorylation of FemX in the stp mutant leads to inhibited synthesis of the pentaglycine bridges on the lipid II and consequently to the incorporation of incomplete muropeptides into the new peptidoglycan strand. This structural change leads to thickening of the cell wall and consequently reduced sensitivity to the glycyl-glycine peptidase lysostaphin. In addition to FemX, Stk interacts with other cell wall synthesis proteins such as FemAB and some cell division proteins. These results illustrate that Stk detects the presence of its extracellular ligand lipid II. This leads to an inhibition of FemX and a downregulation of the cell wall synthesis pathway. In the second part of this work, the stk, stp and stk/stp mutants were characterized by different omics- techniques in comparison to the S. aureus NewmanHG wild-type. There were some major differences between the stp mutant and the other strains. With these investigations, results from other studies were confirmed and substantiated with further data. Thus, the reduced virulence of the stp mutant can be explained by the reduced expression and secretion of toxins such as hemolysins and leukocidines. This leads to a reduced hemolysis of erythrocytes and a reduced immune response to these toxins in the infection experiment. Stk and Stp phosphorylate or dephosphorylate transcription factors and response regulators of two-component systems resulting in altered expression and secretion of virulence factors. Analysis of the mutants reveals that Stk is a negative and Stp is a positive regulator of virulence in S. aureus. In addition, Stk and Stp regulate central aspects of S. aureus metabolism. Thus, the concentration of nucleotide triphosphates in the stp mutant is reduced, which is due to a reduced expression of the genes of pyrimidine synthesis. From these results it becomes clear that Stk and Stp regulate essential aspects of cell physiology such as cell wall synthesis, central and virulence in S. aureus. This study of the function of Stk and Stp contributes significantly to the understanding of regulatory processes by phosphorylation in the bacterial cell. KW - Kinase KW - Phosphatase KW - Stk KW - Stp KW - Staphylococcus KW - Zellwand KW - FemX Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176542 ER - TY - THES A1 - Oesterreich, Babett T1 - Preclinical development of an immunotherapy against antibiotic-resistant Staphylococcus aureus T1 - Präklinische Entwicklung einer Immuntherapie zur Behandlung Antibiotika-resistenter Staphylococcus aureus N2 - The Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus is the leading cause of nosocomial infections. In particular, diseases caused by methicillin-resistant S. aureus (MRSA) are associated with higher morbidity, mortality and medical costs due to showing resistance to several classes of established antibiotics and their ability to develop resistance mechanisms against new antibiotics rapidly. Therefore, strategies based on immunotherapy approaches have the potential to close the gap for an efficient treatment of MRSA. In this thesis, a humanized antibody specific for the immunodominant staphylococcal antigen A (IsaA) was generated and thoroughly characterized as potential candidate for an antibody based therapy. A murine monoclonal antibody was selected for humanization based on its binding characteristics and the ability of efficient staphylococcal killing in mouse infection models. The murine antibody was humanized by CDR grafting and mouse and humanized scFv as well as scFv-Fc fragments were constructed for comparative binding studies to analyse the successful humanization. After these studies, the full antibody with the complete Fc region was constructed as isotype IgG1, IgG2 and IgG4, respectively to assess effector functions, including antibody-dependent killing of S. aureus. The biological activity of the humanized antibody designated hUK-66 was analysed in vitro with purified human PMNs and whole blood samples taken from healthy donors and patients at high risk of S. aureus infections, such as those with diabetes, end-stage renal disease, or artery occlusive disease (AOD). Results of the in vitro studies show, that hUK-66 was effective in antibody-dependent killing of S. aureus in blood from both healthy controls and patients vulnerable to S. aureus infections. Moreover, the biological activity of hUK-66 and hUK-66 combined with a humanized anti-alpha-toxin antibody (hUK-tox) was investigated in vivo using a mouse pneumonia model. The in vivo results revealed the therapeutic efficacy of hUK-66 and the antibody combination of hUK-66 and hUK-tox to prevent staphylococcal induced pneumonia in a prophylactic set up. Based on the experimental data, hUK-66 represents a promising candidate for an antibody-based therapy against antibiotic resistant MRSA. N2 - Staphylococcus aureus ist ein bedeutender nosokomialer Erreger, der eine Vielzahl von Infektionen im Menschen verursacht. Besonders Krankheiten, die durch Methicillin resistente S. aureus (MRSA) verursacht werden, sind mit einer erhöhten Morbidität, einer höheren Sterblichkeitsrate und hohen medizinischen Kosten verbunden. Seine besondere medizinische Bedeutung erlangte S. aureus durch die Ausbildung von Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika und seiner Fähigkeit auch gegen neu entwickelte Antibiotika schnell Resistenzmechanismen auszubilden. Aus diesem Grund, ist die Entwicklung von neuen Therapieansätzen von besonderer Bedeutung, um die entstandene Lücke für eine effektive MRSA-Therapie zu schließen. In dieser Arbeit wurde ein humanisierter monoklonaler Antikörper entwickelt und charakterisiert, der spezifisch an das „immunodominant staphylococcal antigen A“ (IsaA) bindet. Dieser Antiköper wurde auf Grund seiner Eigenschaft, in einem Mausmodell effektiv S. aureus abzutöten, als vielversprechender Kandidat für eine Antikörper-Therapie ausgewählt. Der murine Vorläuferantikörper wurde mittels „CDR grafting“ humanisiert und durch die Generierung von humanisierten und murinen scFv und scFv-Fc Fragmenten, die in vergleichenden Bindungsstudien getestet wurden, konnte der Erfolg der Humanisierung beurteilt werden. Im Anschluss wurde der vollständige Antikörper mit vollständig funktionaler Fc-Region in den Isotypen IgG1, IgG2 und IgG4 hergestellt. Die Funktionalität des humanisierten Antikörpers wurde in vitro mittels aufgereinigter PMNs und Blutproben von gesunden Spendern und Patienten bestimmt, die ein hohes Risiko für S. aureus Infektionen besitzen wie Diabetiker, Dialyse-Patienten und Patienten mit arterieller Verschlusskrankheit. Die Ergebnisse der in vitro-Studien zeigen, dass der anti-IsaA-Antikörper hUK-66 nicht nur S. aureus effektiv in Blutproben von gesunden Spendern abtötet, sondern auch in Blutproben von Patienten mit erhöhter Anfälligkeit für S. aureus Infektionen. Darüber hinaus wurde die biologische Aktivität des humanisierten Antikörpers gegen IsaA als Monotherapie und in Kombination mit einem humanisierten anti-alpha-Toxin-Antikörper (hUK-tox) in vivo in einem Maus Pneumonie Modell untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die prophylaktische Verabreichung von hUK-66 sowie die Kombination von hUK-66 und hUK-tox, die Bildung einer Staphylokokken-induzierten Pneumonie mit Todesfolge signifikant senkt. KW - Staphylococcus KW - Immunotherapy Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123237 ER - TY - JOUR A1 - Löhr, Mario A1 - Molcanyi, Marek A1 - Poggenborg, Jörg A1 - Spuentrup, Elmar A1 - Runge, Matthias A1 - Röhn, Gabriele A1 - Härtig, Wolfgang A1 - Hescheler, Jürgen A1 - Hampl, Jürgen A. T1 - Intracerebral Administration of Heat-Inactivated Staphylococcus Epidermidis Enhances Oncolysis and Prolongs Survival in a 9L Orthotopic Gliosarcoma Model JF - Cellular Physiology and Biochemistry N2 - Background/Aims: The association between postoperative infection and prolonged survival in high-grade glioma is still a matter of debate. Previously we demonstrated that the intracerebral (i.c.) injection of heat-inactivated staphylococcal epitopes (HISE) resulted in a well-defined infux of immunocompetent cells across the blood-brain barrier. The present study investigated the potential antitumoral effect of HISE-immunostimulation in an experimental glioma model. Methods: Wistar rats were intracerebrally implanted with 9L gliosarcoma cells (n=6), 9L cells mixed with HISE (n=12), or phosphate buffered saline (n=4). Tumor growth was measured by serial magnetic resonance imaging (MRI). After death due to the tumor burden, the brains were histopathologically assessed for inflammation and oncolysis. A toxicity assay was performed to quantify potential impairment of HISE on tumor cell growth in vitro. Results: Animals treated by HISE showed a significant increase in average survival and even complete regression of an already established mass in one case. Naïve 9L gliosarcomas failed to recruit significant numbers of systemic immune cells. In contrast, concomitant intracerebral HISE inoculation lead to a oncolysis and a distinct peri- and intratumoral infiltration of macrophages, CD8 and CD4 co-expressing T-lymphocytes in two thirds of the tumor-bearing animals. The toxicity screening showed HISE-mediated oncolysis to be ineffective ex vivo. Conclusion: This study describes a novel approach for combatting malignant glioma using inactivated staphylococci as potent immunomodulators. Our results provide an outline for investigating the strategic potential of bacteria as emerging future therapeutics. KW - Glioblastoma KW - Immunotherapy KW - Oncolysis KW - Staphylococcus KW - Immunostimulatory adjuvant Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-96754 ER - TY - THES A1 - Tischer, Maximilian T1 - Bisquartäre Bisnaphthalimide - Neue Wirkstoffe gegen Infektionskrankheiten T1 - Bisquaternary Bisnaphthalimides - new active compounds against infectious diseases N2 - Die vorliegende Arbeit, die im Rahmen des SFB 630 „Erkennung, Gewinnung und funktiona-le Analyse von Wirkstoffen gegen Infektionskrankheiten“ erstellt worden ist, beschäftigt sich mit der Entwicklung und Synthese der bisquartären Bisnaphthalimide und deren antimikro-biellen Eigenschaften, speziell gegen Erreger tropischer Infektionskrankheiten, wie Plasmo-dien und Trypanosomen aber auch Bakterien wie Staphylococcus aureus. Erste Testungen einer kleinen Bibliothek verschiedener mono- und bisquartärer Phthal- und Naphthalimide im SFB 630 offenbarten deren antimikrobielles Potenzial. Daher war es das Hauptziel dieser Arbeit, durch systematische Variation der verschiedenen Strukturbestandteile diese Bibliothek zu erweitern. Dazu mussten zuerst die entsprechenden Naphthalin-1,8-dicarbonsäure-Anhydride hergestellt werden. Im nächsten Schritt wurden diese mit einem N,N-Dimethylaminopropylamin-Derivat zum Imid kondensiert und abschließend mit einem Alkyl-Linker zur bisquartären Verbindung alkyliert. So konnte die Bibliothek um 25 Verbin-dungen erweitert werden. Dabei umfassten die Variationen die Alkylkettenlänge zwischen den quartären Stickstoffen mit 3–14 Methylen-Einheiten, das aromatische Substitutionsmuster mit Amino- bzw. Nitrogruppen und symmetrische, wie asymmetrische Bisnaphthalimide. Durch anschließende antimikrobielle Testung und qualitativen Vergleich der ermittelten IC50-Werte konnten verschiedene strukturelle Merkmale der Bisnaphthalimide identifiziert werden, die einen positiven Einfluss auf die Aktivität gegen den untersuchten Mikroorganismus haben. N2 - The present work focuses on the design and synthesis of bisquaternary bisnaphthalimides and their antimicrobial properties, esp. against causative agents of tropical infectious diseases like Plasmodia or Trypanosoma but also bacteria like Staphylococcus aureus. The work was sup-ported by the SFB 630 “Recognition, Preparation and functional Analysis of Agents against Infectious Diseases”. First tests of a small compound library, consisting of several mono- and bisquaternary phthal- and naphthalimides, revealed their antimicrobial potential. Hence, it was the primary purpose of this work to broaden this library through systematical structural variations. Therefor the corresponding naphthalic anhydrides had to be synthesized. In the next step the anhydrides were condensed to the corresponding imide by reaction with an N,N-dimethylaminopropyl-amine derivative. The obtained naphthaimides were finally alkylated by means of α,ω-dihaloalkane to give the bisquaternary compound. The so achieved variations included the length of the alkyl-chain linker (C3–C14), the aromatic substitution pattern (nitro- and amino groups) and, symmetrical as well as unsymmetrical bisnaphthalimides. Subsequently, these compounds were tested against the aforementioned microorganisms. By comparing of the determined IC50-values several structural characteristics could be identified which are important to the antimicrobial activity. KW - Ammoniumverbindungen KW - Infektionskrankheit KW - Antibiotikum KW - Malaria KW - Staphylococcus KW - Schlafkrankheit KW - Naphthalimide KW - ammonium compounds KW - infectious disease KW - antibiotic KW - malaria Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78527 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Katrin T1 - Untersuchung zum in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA-Stämme T1 - In vitro Analysis of the Growth Rate of selected MRSA-Clones N2 - In dieser Arbeit wurde das in vitro Wachstumsverhalten ausgesuchter MRSA in Konkurrenz zu Bakterien der Standortflora unter Optimalbedingungen und unter Mangelbedingungen getestet. Es lässt sich für alle getesteten MRSA-Stämme zusammenfassend sagen, dass ihre klinische Prävalenz nicht mit dem Wachstum in vitro korreliert, d.h. das häufige Spa-Typen nicht besser unter unseren Versuchbedingungen gewachsen sind als seltene. In vitro konnte kein verdrängendes Wachstum des Methicillin sensiblen S. aureus gegenüber den resistenten Stämme beobachtet werden. Vielmehr gelingt es den MRSA-Stämmen, ein Wachstumsgemisch zu ihrem Vorteil zu beeinflussen, indem sie die getesteten anderen Mikroorganismen (S. epidermidis, S. cerivisiae) im Wachstum hemmen, mit Ausnahme von E. faecium. Die Arbeit beleuchtet die Schwierigkeiten der Identifizierung von probiotischen Arten zur Verdrängung eines MRSA. In Zukunft sollte vielleicht an der Optimierung von in vitro Systemen gearbeitet werden (in vitro Organkulturen) oder Tiermodelle verwendet werden. Den Transmissionsunterschieden und der Tenazität sind weiterhin Aufmerksamkeit zu widmen. Wie in der Literatur beschrieben ist es zum Verständnis des Wachstumsverhal-tens der resistenten Stämme wichtig zu wissen, auf welchen molekularbiologischen Grundlagen die Resistenz beruht, da eine einzelne Site-Mutation zusätzliche Resistenzen bedeuten und einen eventuellen Wachstumsnachteil wieder ausgleichen kann. Im Klinikalltag scheinen sich die MRSA-Stämme auszubreiten, die den Wachstumsnachteil bereits ausgeglichen haben, beziehungsweise deren Methicillinresistenz keinen Wachstumsnachteil bedeutet. N2 - The competitive in vitro growth of selected MRSA-Clones in comparison to bacteria from the human skin and probiotic bacteria respectively are evaluated in this study. There was no proof of in vitro growth advantage for the common MRSA-Clones in comparison to the uncommonly found MRSA-Clones in clinical samples. This concludes that there must be a different reason for the spreading of the commonly found MRSA-Clones other than the growth rate. The competitive growth analysis with bacteria of the human skin (S. epidermidis, Methicillin susceptible S. aureus), E. faecium and probiotic bacteria (S. cerivisiae) showed, that none of the tested bacteria could decrease the growth rate of the MRSA-Clones in clinical relevant concentrations. Methicillin resistence shows a growth rate decrease for some MRSA-clones as described in the literature. By contrast, the results of this study reveal, that the clinical acquired MRSA-clones must have somehow compensated for the growth disadvantage. KW - MRSA KW - Staphylococcus KW - Fitness KW - MSSA KW - Wachstumsverhalten KW - MRSA KW - MSSA KW - Competitive Growth KW - Bacterial Fitness Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55570 ER - TY - THES A1 - Hennig, Susanne T1 - Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256 Transposase T1 - Modulation of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and functional characterization of IS256 transposase N2 - Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue ökologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der Fähigkeit, Biofilme auf abiotischen Oberflächen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilität. Ein markantes Beispiel für genotypische Variabilität ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und präzise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON“ Mechanismus der Phasenvariation, die präzise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabhängigen Prozess vollständig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Präzise Exzision war hingegen abhängig von der Integrität der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte präzise Exzision Transposase-unabhängig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision für die vollständige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verkürzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war präzise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verkürzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der präzisen Exzision ca. dreifach erhöht. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionshäufigkeit im Ungleichgewicht stehen. Während der Durchführung der Experimente zur präzisen Exzision aus icaC wurden nach mehrtägiger Passage häufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Phänotyp als der Wildtyp auf. Anstelle von fädiger extrazellulärer Substanz wie beim Wildtyp wurde verstärkt eine polymorphe, aus globulären Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 % NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollständig, während es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 % Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich stärkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erhöhten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis über einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verfügt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung führen kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro näher charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog überexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erhöhte Affinität zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verkürzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Domäne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminosäuren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA überprüft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen führten zu einer stark abgeschwächten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsvermögens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdomäne eines Elements der IS256-Familie näher beschrieben. N2 - During the past decades, Staphylococci, especially Staphylococcus aureus and the coagulase-negative Staphylococcus epidermidis, have been established as a predominant cause of nosocomial infections. This remarkable adaptation to a new ecological niche by S. epidermidis is due to three main factors: (i) the ability to colonize abiotic surfaces as biofilms, (ii) the acquisition of multiple resistances to antibiotics and (iii) a high genotypic and phenotypic variability. A prominent example of genotypic and phenotypic variability is phase variation in biofilm formation caused by insertion and excision of the insertion sequence IS256 within the ica operon. In the first part of this thesis, the mechanism of “OFF-ON” transition, caused by precise excision of IS256 from the ica operon, was studied. It was demonstrated that IS256 including the duplicated 8 bp target site is excised completely from the chromosome in a transposase-independent manner, neither accompanied by chromosomal rearrangements nor new insertions. However, precise excision depended on the integrity of the target site duplications. Even after insertion of IS256 onto a plasmid (spc::IS256) transposase-independent precise excision was detected. The probability of this event was calculated to be 1x10-11 per cell generation. After shortage of the microhomology between the 8 bp target site duplications to 6 bp or less, precise excision was not detectable any longer. Deletion of the transposase gene, leading to a 160 bp IS256 fragment still harbouring complete inverted repeats and flanked by intact target site duplications, enhanced the probability of precise excision about threefold. These observations support the hypothesis that precise excision is caused by the illegitimate recombination process of replicational slippage. Furthermore, the data indicate an imbalance between insertion and excision of IS256 within the phase variation process. When studying precise excision from icaC, strong biofilm producing variants still carrying the icaC::IS256 insertion were isolated frequently after several days of passaging. Such biofilm-positive, PIA-negative variants showed a phenotype different from the wild type as displayed by Atomic force microscopy. Instead of a fibrous extracellular substance as in the wild type, the variants produced a polymorphous matrix formed by more or less globular substructures. In contrast to the wild type growing in a polysaccharide-mediated biofilm, the alternative biofilm´s extracellular matrix consisted of proteins. Regulation of proteinaceous biofilm formation differed compared to PIA-dependent biofilm. Addition of 4 % sodium chloride abolished proteinaceous biofilm formation completely, while it induced biofilm formation in the wild type. Addition of 3 % ethanol caused a considerably stronger induction of biofilm formation compared to the wild type. The transcript level of accumulation associated protein, aap, was enhanced in comparison to the wild type; an observation that was also confirmed at the protein level. Taken together, these data indicate that S. epidermidis is capable of switching to an alternative mode of biofilm formation, thus possibly modulating the previously described phase variation by IS256 insertion and excision. In the third part of this thesis, specific binding of IS256 transposase was characterized in vitro. To this end, IS256 transposase was overexpressed heterologously and purified using an N-terminal calmodulin binding tag (CBP). In electrophoretic mobility shift assays (EMSA) CBP-transposase bound to IRL and IRR containing DNA fragments specifically, albeit with slightly higher affinity to IRR. Binding of CBP-transposase to the inverted repeats within circle junction DNA as well as unspecific end binding could be confirmed by Atomic force microscopy. Deletions within the sequence of the right or left inverted repeat revealed that CBP-transposase binds to the inner part of the inverted repeats. EMSA experiments with truncated transposase derivatives suggested a DNA binding motif within the N-terminal domain of the transposase. The identified protein region (amino acid 100 – 130) consists of two a-helices separated by a short turn, displaying typical features of a helix-turn-helix motif. Six conserved amino acid residues within this putative motif were exchanged by point mutations and the effect of the mutation was tested in EMSA. Exchange of L103 and L127 against the helix-breaking amino acid proline had no detectable effect on DNA binding. However, exchange Y111A, G114W, T117A and R118A strongly reduced or completely abolished DNA binding. This is the first description of a DNA binding domain of a member of the IS256 family. KW - Staphylococcus epidermis KW - Biofilm KW - Insertionselement KW - Staphylococcus KW - Biofilm KW - IS256 KW - Transposase KW - Phasenvariation KW - Staphylococcus KW - biofilm KW - IS256 KW - transposase KW - phase variation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20984 ER - TY - THES A1 - Kränzler, Hans-Marcus T1 - Untersuchungen zur Regulation der Biofilmbildung bei Staphylokokken T1 - Investigation of the regultion of the Staphylococcal Biofilmformation N2 - Staphylokokken sind in erster Linie Saprophyten, welche die Haut und Schleimhäute des Menschen besiedeln und dort eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht der gesunden Mikroflora spielen. Gleichzeitig haben sie sich aber auch zu den häufigsten Verursachern nosokomialer Infektionen entwickelt. Vor allem S. aureus und S. epidermidis verursachen Erkrankungen, die von leichten Haut- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonien, Sepsis oder Endokarditis reichen. Infektionen durch S. epidermidis treten dabei meist in Verbindung mit Fremdkörpern wie Kathetersystemen, künstlichen Gelenken und Herzklappen auf. In diesem Zusammenhang scheint vor allem die Fähigkeit, einen Biofilm auf diesen Fremdkörpern bilden zu können eine große Rolle für die Pathogenese zu spielen. Die Therapie von Staphylokokken-Infektionen wird zunehmend durch die ausgeprägte Antibiotikaresistenz dieser Erreger erschwert, die sich mittlerweile auch auf Reserveantibiotika wie Daptomycin, Synercid® (Quinupristin/Dalfopristin) oder Linezolid erstreckt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des Streptogramin-Antibiotikums Synercid® die Biofilmbildung in S. epidermidis induzieren. Darüber hinaus mehren sich die Hinweise auch bei anderen Bakterien, dass geringe Antibiotika-Konzentrationen, wie sie in natürlichen Habitaten wie zum Beispiel im Boden vorkommen, wichtige Signale bei der Kommunikation von Bakterien untereinander darstellen und möglicherweise eine Funktion bei der Modulation des Metabolismus im Kampf um Nährstoffe ausüben. In dieser Promotionsarbeit sollte daher exemplarisch, mit Hilfe der erst seit kurzem zur Verfügung stehenden DNA-Mikroarray-Technik, der Effekt von subinhibitorischen Synercid®-Konzentrationen auf die globale Genexpression von S. epidermidis und S. aureus analysiert werden. Dabei stand vor allem die Wirkung auf die Biofilmbildung und die Identifikation neuer, an der Biofilmbildung beteiligter Komponenten im Mittelpunkt. Die Ergebnisse zeigen, dass subinhibitorische Synercid®-Konzentrationen bei S. aureus, im Gegensatz zu S. epidermidis, zu einer reduzierten Biofilmbildung führen. Bei beiden Arten ist jedoch die unterschiedliche Biofilmbildung durch eine ausgeprägte Veränderung der allgemeinen Genexpression begleitet. Vor allem war eine starke Induktion von Genen zu beobachten, die für Proteine des Translationsapparates kodieren. Außerdem waren Gene des Nukleotid-Stoffwechsels, der Aminosäure-Synthese und des Kohlenstoff-Metabolismus unterschiedlich reguliert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von HPLC-Analysen sowohl bei S. epidermidis als auch bei S. aureus eine reduzierte Konzentration des Signalmoleküls Guanosin-3-5-bisphosphat (ppGpp) festgestellt werden. ppGpp spielt vor allem bei der Kontrolle und Anpassung des Stoffwechsels an Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel das Nährstoffangebot, eine wichtige Rolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der ribosomalen Proteine durch Synercid® die reduzierte ppGpp-Konzentration bedingt, was zum einen zur verstärkten Bildung ribosomaler Proteine führt und zum anderen den Zellstoffwechsel in einer Weise beeinflusst, der eine vermehrte extrazelluläre Polysaccharid-Synthese und damit Biofilmbildung ermöglicht. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die unterschiedliche Beeinflussung der Biofilmbildung bei S. epidermidis und S. aureus sehr wahrscheinlich durch verschiedene Regulationswege des ica-Operons und/oder unterschiedliche katabolische Fähigkeiten bedingt werden. Die Ergebnisse belegen weiterhin, dass die Wirkung von Antibiotika weit über deren bekannte inhibitorische Effekte hinausgeht und vor allem den Stoffwechsel der Bakterien dramatisch beeinflußt. Die Konsequenzen dieser Befunde sowohl für das Verständinis von mikrobiologischen Konsortien in Ökosystemen als auch für die Anwendung von Antibiotika in der Medizin sind noch nicht abzusehen, bieten jedoch eine interessante Grundlage für weitere experimentelle Arbeiten. N2 - Staphylococci are common inhabitants of the human skin and mucosal membranes, as well as the most prevalent causes of nosocomial infections. The infections mainly caused by S. aureus and S. epidermidis range from mild skin infections to life-threatening infections, like pneumonia, bacteremia or endocarditis. Especially S. epidermidis is the primary pathogen involved in medical device associated infections. In this context, the ability to form a biofilm seems to be crucial. The prevalent antibiotic resistances of Staphylococci poses an increasing challenge to medicine in recent years. The remaining effective antibiotics to treat staphylococci infections are last resort antibiotics, such as daptomycine, Synercid® and linezolid. However, staphylococci isolates with intermediate and high resistances towards these antibiotics have already been reported. There are several lines of evidence that, beside their killing activity, antibiotics have a modulating effect on the metabolism of bacteria when applied in low concentrations. Hence, the impact of this natural compounds on bacteria have to be analysed in more detail in order to provide insights into their mode of action and how bacteria respond to these compounds. Former studies showed, that biofilm formation of staphylococci is influenced by environmental factors, such as temperature, osmolytic stress and the availability of glucose or oxygen, as well as by subinhibitory concentrations of antibiotics. In this context it was shown, that low concentrations of tetracycline, erythromycine and Synercid® induce biofilm formation of S. epidermidis. The aim of this study was to investigate the effect of subinhibitory concentrations of Synercid® on biofilm formation and global gene expression of S. epidermidis and S. aureus. For this purpose DNA microarrays were used to identify and characterise the mechanisms by which Synercid® alters biofilm formation. Furthermore, this studies should lead to the identification of new factors involved in biofilm formation of staphylococci. The data presented here, demonstrate that subinhibitory concentrations of Synercid® reduce biofilm formation in S. aureus, while inducing it in S. epidermidis. The altered biofilm formation is accompanied by a strong impact on the overall gene expression of both species. Especially the expression of genes encoding proteins of the translational apparatus were increased. In addition, genes encoding proteins of the nucleotide metabolism, amino acid biosynthesis and carbohydrate utilisation were affected. Furthermore, HPLC analyses revealed a decreased concentration of the small nucleotide signal molecule guanosine-3-5-bisphosphate (ppGpp) in S. aureus and S. epidermidis under the influence of Synercid®. ppGpp is involved in the control and adaptation of cellular metabolism to changing growth conditions. We hypothesise that the reduced concentrations of ppGpp is due to the inactivation of ribosomal proteins, as a result of Synercid® binding, and mediates on the one hand the increased production of proteins of the translation apparatus and on the other hand effects the cellular metabolism in a way that enable the cells to produce more extracellular polysaccharides resulting finally in an enhanced biofilm formation. In summary, the data presented here show that the differential effect of Synercid® on biofilm formation of S. epidermidis and S. aureus is most likely due to a differential regulation of the ica operon and/or different catabolic abilities. Moreover the data suggest that the effect of antibiotics is more than the sole interaction with a target structure, but influence gene expression and metabolism of bacteria more globally. The consequences of these findings for the comprehension of the interplay in microbial communities as well as for the clinical use of antibiotics is far from being understood. However, the results of this work might provide an interesting basis for future experimental work elucidating these interferences. KW - Staphylococcus KW - Biofilm KW - Genexpression KW - Staphylokokken KW - Biofilmbildung KW - Quinupristin/Dalfopristin KW - subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen KW - Staphylococcus KW - biofilmformation KW - Quinupristin/Dalfopristin KW - subinhibitory antibiotikkonzentrations Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18784 ER - TY - THES A1 - Rachid, Shwan T1 - Molecular investigation of the influence of environmental factors and subinhibitory antibiotic concentrations on the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis T1 - Molekulare Untersuchungen zum Einfluß von Umweltfaktoren und subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen auf die Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis N2 - Biofilm production is an important step in the pathogenesis of S. epidermidis polymer-associated infections and depends on the expression of the icaADBC operon leading to the synthesis of a polysaccharide intercellular adhesin (PIA). The PIA represents a sugar polymer consisting of ß-1,6 linked N-acetyl glucosaminoglycans and mediates the intercellular adherence of the bacteria to each other and the accumulation of a multilayered biofilm. Epidemiological and experimental studies strongly suggest that PIA-production and subsequently biofilm formation contributes significantly to the virulence of specific S. epidermidis strains. This work aimed on the investigation of external factors regulating the ica expression in S. epidermidis. For this purpose, a reporter gene fusion between the ica promoter and the beta-galactosidase gene lacZ from E. coli was constructed and integrated into the chromosome of an ica positive S. epidermidis clinical isolate. The reporter gene fusion was used to investigate the influence of external factors and of sub-MICs of different antibiotics on the ica expression. It was shown that the S. epidermidis biofilm formation is growth phase dependent with a maximum expression in the late logarithmic and early stationary growth phase. The optimal expression was recorded at 42 °C at a neutral pH ranging from 7.0 to 7.5. The glucose content of the medium was found to be essential for biofilm formation, since concentrations of 1.5 to 2 per cent glucose induced the ica expression. In addition, external stress factors as high osmolarity (mediated by 3 to 5 per cent sodium chloride), and sub-lethal concentrations of detergents, ethanol, hydrogene peroxide, and urea significantly enhanced the biofilm production. Subinhibitory concentrations of tetracyline, the semisynthetic streptogramin quinupristin/dalfopristin and the streptogramin growth promoter virginiamycin were found to enhance the ica expression 8 to 11-fold, respectively, whereas penicillin, oxacillin, gentamicin, clindamycin, vancomycin, teicoplanin, ofloxacin, and chloramphenicol had no effects. A weak induction was recorded for sub-MICs of erythromycin. Both quinupristin/ dalfopristin and tetracyline exhibited a strong postexposure effect on the S. epidermidis ica expression, respectively, even when the substances were immediately removed from the growth medium. The results were confirmed by Northern blot analysis of the ica transcription and quantitative analysis of biofilm formation in a colorimetric assay. Expression of the icaprom::lacZ reporter gene plasmid in Bacillus subtilis and S. epidermidis revealed that the ica induction by sub-MICs of streptogramins and tetracycline might depend on unidentified regulatory elements which are specific for the staphylococcal cell. In contrast, the activation by external stress signals seems to be mediated by factors which are present both in Staphylococci and in Bacillus subtilis. Construction and analysis of an agr-mutant in a biofilm-forming S. epidermidis strain excluded the possibility that the Agr-quorum-sensing system significantly contributes to the ica expression in the stationary growth phase. However, clear evidence was provided that in S. aureus the ica transcription depends on the expression of the alternative transcription factor sigmaB, which represents a global regulator of the stress response in S. aureus as well as in B. subtilis. For this purpose, a sigB knockout mutant had been constructed in a biofilm-forming S. aureus. This mutant showed a markedly decrease of the ica transcription and biofilm-production, whereas a complement strain carrying the sigB gene on an expression vector completely restored the biofilm-forming phenotype of the S. aureus wild type. Southern blot analysis indicated that the the sigB gene is also present in S. epidermidis and Northern analyses of the sigB and the ica transcription revealed that both genes are activated under identical conditions (i. e. in the stationary growth phase and by external stress factors) suggesting a similar regulatory pathway as in S. aureus. However, since neither in S. aureus nor in S. epidermidis the ica promoter has obvious similiarities to known SigB-dependent promotoer sequences it is tempting to speculate that the ica activation is not directely mediated by SigB, but might be indirectely controlled by other SigB-dependent regulatory elements which remain to be elucidated. N2 - Die Ausbildung von Biofilmen ist ein wichtiger Schritt in der Pathogenense von Polymer-assoziierten Infektionen durch S. epidermidis. Sie hängt von der Expression des icaADBC-Operons ab, das die Syntheseenzyme für die Produktion eines extrazellulären Polysaccharids (PIA) kodiert. PIA steht für Polysaccharid-Interzelluläres-Adhäsin. Diese Substanz stellt ein beta-1,6 verknüpftes N-Acetyl-Glukosaminoglycan dar, das den Bakterien extrazellulär aufliegt, die Adhärenz der Zellen untereinander vermittelt und so die Akkumulation eines Biofilms wesentlich fördert. Epidemiologische und experimentelle Studien haben gezeigt, daß die PIA-Produktion und damit die Biofilmbildung wesentlich zur Virulenz bestimmter S. epidermidis Stämme beiträgt. Die vorliegende Arbeit zielte auf die Untersuchung äußerer Faktoren ab, die die PIA-Expression in S. epidermidis regulieren. Dazu wurde eine Genfusion zwischen dem ica-Promotor und dem beta-Galaktosidasegen aus E. coli hergestellt und stabil in das Chromosom eines ica-positiven S. epidermidis Klinikisolates integriert. Das Reportergenkonstrukt wurde benutzt, um den Einfluß verschiedener Umweltfaktoren und die Wirkung subinhibitorischer Antibiotikadosen auf die Expression des ica-Operons zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, daß die ica-Expression wachstumsphasenabhängig ist und ihr Maximum in der späten logarhitmischen und frühen stationären Phase erreicht. Die optimale Expressionstemperatur liegt bei 42 °C und einem neutralen pH-Wert in einem Bereich zwischen 7,0 und 7,5. Die Biofilmbildung hängt stark vom Glukosegehalt des Wachstumsmediums ab. So wurde gezeigt, daß 1,5 bis 2 Prozent im Kulturmedium die ica-Expression in der logarhitmischen Phase induzieren. Externe Stressfaktoren wie erhöhte Osmolarität durch 3 bis 5 Prozent NaCl oder sublethale Dosen von Detergenzien, Äthanol, Wasserstoffperoxid und Harnstoff begünstigen ebenfalls die ica-Expression und damit die Biofilmbildung. Subinhibitorische Dosen von Tetrazyklin, des Streptogramingemisches Quinupristin/Dalfopristin (Synercid?) sowie des Streptogramin-Leistungsförderers Virginiamycin führten zu einer Erhöhung der ica-Expression um das 8 bis 11-fache. Eine kurzzeitige Exposition der Bakterien zu hohen Konzentrationen dieser Antibiotika führte ebenfalls zu einer langanhaltenden Induktion der Biofilmexpression, auch wenn die Stoffe aus dem Wachstumsmedium sofort wieder entfernt worden waren. Andere Antibiotika wie Penicillin, Oxacillin, Gentamicin, Clindamycin, Vancomycin, Teicoplanin und Chloramphenicol zeigten keinerlei Effekt auf die ica-Expression. Eine schwache Induktion wurde dagegen für Erythromycin verzeichnet. Die Daten wurden durch Northernblotanalysen der ica–Transkription und durch einen quantitativen Biofilmassay in Polystyrol-Mikrotiterplatten bestätigt. Die Propagierung des Reportergenkonstruktes als Plasmid sowohl in einem B. subtili- Hintergrund als auch in einem ica-negativen S. epidermidis-Stamm ergab, daß die Induktion des ica-Operons durch niedrige Tetrazyklin- oder Streptograminkonzentrationen möglicherweise von spezifischen Regulatoren abhängt, die nur in Staphylokokken vorkommen. Im Gegensatz dazu ist die Induktion durch externe Sressfaktoren sowohl in B. subtilis als auch in S. epidermidis möglich. Durch die Herstellung und Untersuchung einer agr-Mutante in einem Biofilm-bildenden S. epidermidis-Stamm konnte ausgeschlossen werden, daß das Agr-Quorum-Sensing-System einen wesentlichen Einfluß auf die ica-Expression in der stationären Phase ausübt. Dagegen wurde klar gezeigt, daß die ica-Transkription in S. aureus von der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB abhängt, der einen globalen Regulator für die Stressantwort in Staphylokokken und in B. subtilis darstellt. Zu diesem Zweck war eine sigB-Deletionsmutante in einem Biofilm-bildenden S. aureus-Stamm hergestellt worden. Diese Mutante zeigte eine deutlich verminderte ica Transkription und Biofilmbildung. Dagegen wies die Komplementante, die das sigB-Gen auf einem Expressionsvektor trug, wieder alle Merkmale des Biofilm-bildenden S. aureus Wildtyps auf. Southernblot-Analysen zeigten, daß das sigB-Gen auch in S. epidermidis nachweisbar ist und unter denselben Bedingungen (d. h. in der stationären Phase und durch externen Stress) wie das ica Gen transkribiert wird. Das läßt vermuten, daß die Regulation des ica-Operons in S. epidermidis ähnlich abläuft wie in S. aureus und durch SigB beeinflußt wird. Da jedoch weder in S. aureus noch in S. epidermidis der ica-Promotor Ähnlichkeiten zu den bekannten SigB-abhängigen Promotor-Strukturen aufweist, ist anzunehemen, daß dieses Operon nicht direkt durch diesen alternativen Transkriptionsfaktor kontrolliert wird. Wahrscheinlich existieren noch weitere regulatorische Elemente, die hieran beteiligt sind und die noch zu identifizieren sind. KW - Staphylococcus epidermidis KW - Biofilm KW - Umweltfaktor KW - Antibiotikum KW - Staphylococcus KW - epidermidis KW - Biofilm KW - Staphylococcus KW - epidermidis KW - Biofilm Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1882 ER -