TY - THES A1 - Sprügel [verh. Kappenberger], Lisa Melanie T1 - Pilzantigene als spezifische T-Zellaktivatoren bei der chronischen Rhinosinusitis T1 - Stimulation of t-cells from Patients with chronic rhinosinusitis by fungal antigens N2 - Die chronische Rhinosinusitis (CRS) ist eine entzündliche Erkrankung der Nase und Nasennebenhöhlen mit einem Bestehen von Symptomen über zwölf Wochen im Jahr. In Europa sind über 10% der erwachsenen Bevölkerung von ihr betroffen und leiden unter einer stark verminderten Lebensqualität. Nach dem Phänotyp lassen sich zwei Formen unterscheiden: die chronische Rhinosinusitis mit Polypen (CRScNP) und ohne Polypen (CRSsNP). Meist wird unter europäischen Probanden bei der CRScNP eine hauptsächlich eosinophile Th2- vermittelte und bei der CRSsNP ein gemischtes Profil aus Th1/Th17/Th2-vermittelter Entzündung beschrieben. Doch dies erfasst nicht die Vielfalt dieser Erkrankung. Erst kürzlich konnten Endotypen, basierend auf der Zytokinsekretion, identifiziert werden, die auf ein multifaktorielles Geschehen schließen lassen. Nachdem im Nasensekret von über 90% der CRS Patienten Pilze nachgewiesen werden konnten erscheint es wichtig, deren Rolle in der Pathogenese der CRS zu ergründen. Besonders interessant sind dabei Aspergillus fumigatus und Candida albicans. Als opportunistische Pilze könnten sie im Rahmen der CRS in der Lage sein bei einigen Endotypen durch eine verstärkte Aktivierung von Immunzellen die lokale Entzündungsreaktion aufrecht zu erhalten. Es wurden lokale und periphere CD4+ und CD8+ T-Zellen von Patienten mit CRScNP, CRSsNP und einer gesunden Kontrollgruppe isoliert. Eine Kultivierung mit den Antigenen von C. albicans und A. fumigatus erfolgte in einer Konzentration von 1 µg/ml über 6 Tage. Im Anschluss daran wurden die Zellen für das Durchflusszytometer angefärbt und ihre Aktivität über die Ki67+ Expression gemessen. In den Überständen der Kultivierung wurde durch das Durchflusszytometer mittels Multiplexassay die produzierten Zytokinkonzentrationen der Zellen bestimmt. In dieser Arbeit konnte eine Stimulierung der lokalen und peripheren T-Zellen durch die beiden Antigene gezeigt werden... N2 - The chronic rhinosinusitis (CRS) is an inflammatory desease with an incidence of over 10 % among the European population. There are two phenotypes – the chronic rhinosinusitis with polyps (CRScNP) and the chronic rhinosinusitis without polyps (CRSsNP). In Europe the CRScNP is usually regarded as a Th2- driven eosinophilic inflammation and the CRSsNP as a mixed Th1/Th17 driven inflammation. In recent years several endotypes (based on their cytokine production) have been identified, which suggest that there are many factors influencing the development of the desease. There can be found fungi In the nasal secret of over 90 % of the patients with CRS – do some of them play a role in the pathophysiology of the desease? In this study peripheral (PBMC) and local (tissue) CD4+ and CD8+ T-cells from patients with CRScNP and CRSsNP as well as from an healthy control group were cultivated with the antigens of Aspergillus fumigatus and Candida albicans. After six days the cells were separated from their supernatant and their activation was analysed by the marker Ki-67 by flow cytometry. Using a Th1,Th2,Th17 assay the concentration of 13 cytokines was measured in the supernatant. This paper shows the positive stimulation of local T-cells by the antigens Candida albicans and Aspergillus fumigatus. The cytokine production couldn’t significantly be raised by C. albicans. After the cultivation with A. fumigatus the production of IL-17a, IL-5 and IL-4 from the CD4+ t-cells of patients with CRScNP was significantly increased. Additionally there were groups of patients who reacted more than others, so there must be suspected, that some subgroups of the phenotype CRScNP show a higher response to A. fumigatus than others. More experiments are needed to explore whether A. fumigatus could act as an superantigen in some subgroups of the CRScNP. With the results of this and further experiments there may be found additional treatments for patients with CRScNP. KW - Pilze KW - T-Lymphozyt KW - Rhinosinusitis KW - Chronische Rhinosinusitis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237120 ER - TY - THES A1 - Fischer, Jonas Maria T1 - Phänotyp und Funktion von Follikulären Helfer Zell-ähnlichen T-Zellen im entzündeten Gelenk von Patientinnen und Patienten mit Juveniler Idiopathischer Arthritis T1 - Phenotype and Function of Follicular Helper Cell-like T Cells in the inflamed Joint of Patients with Antinuclear Antibody-positive Juvenile Idiopathic Arthritis N2 - Innerhalb der Juvenilen Idiopathischen Arthritis (JIA) bilden Patienten mit Antinukleären Antikörpern (ANA) Subgruppen-übergreifend eine klinisch homogene Erkrankungsgruppe. Ob diesen klinischen Gemeinsamkeiten jedoch auch eine einheitliche Pathogenese zugrunde liegt, ist bisher unbekannt. Sogenannte periphere T-Helferzellen (TPH) spielen im Kontext zahlreicher Autoimmunerkrankungen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung autoreaktiver B-Zellen. Ziel dieser Arbeit war daher die phänotypische und funktionelle Analyse von PD-1hiCXCR5-CD4+ TPH-Zellen, sowie deren Verteilung in der Synovialflüssigkeit von Patienten unterschiedlicher Subgruppen der JIA. Hierzu wurden Phänotyp und Zytokinprofil von PD-1hiCD4+ T-Zellen durchflusszytometrisch analysiert. Der funktionelle Einfluss von PD-1hiCD4+ T-Zellen auf die B-Zell-Differenzierung wurde mittels in vitro Kokulturen FACS-sortierter TPH-Zellen der Synovialflüssigkeit untersucht. IL-21- und IL-17-produzierende T-Gedächtniszellen der Synovialflüssigkeit zeigten eine negative Korrelation zueinander. Die IL-21-Produktion ging besonders von PD-1hiCXCR5-HLA-DR+CD4+ T-Zellen aus, welche besonders in den Gelenken ANA-positiver JIA-Patienten akkumulierten. Diese Population zeigte phänotypische Ähnlichkeit mit TPH-Zellen und leistete in vitro effiziente B-Zell-Hilfe zu Plasmazelldifferenzierung und Immunglobulinsekretion, induzierte jedoch zudem einen CD21lo/-CD11c+T-bet+ Phänotyp in B-Zellen. Passend hierzu bestand auch ex vivo eine signifikante Korrelation zwischen TPH und CD21lo/-CD11c+T-bet+ doppelt-negativen B-Zellen (BDN). Es konnte also die Expansion einer spezifischen T-Zellpopulation mit phänotypischen und funktionellen Charakteristika von TPH-Zellen beobachtet und deren funktioneller Zusammenhang mit CD21lo/-CD11c+T-bet+ BDN in der Synovialflüssigkeit von JIA-Patienten aufgezeigt werden. Dies könnte die Autoimmunantwort auf ubiquitäre Autoantigene innerhalb betroffener Gelenke ANA-positiver JIA-Patienten widerspiegeln. N2 - Within Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA), patients with antinuclear antibodies (ANA) form a clinically homogeneous group across different subgroups. However, it is currently unknown whether ANA-positive patients also share a common pathogenesis. Peripheral T helper cells (TPH) play a crucial role in the activation of autoreactive B cells in the context of numerous autoimmune diseases. Therefore, the aim of this study was the phenotypic and functional analysis of PD-1hiCXCR5-CD4+ TPH cells, as well as their distribution in the synovial fluid of patients from different JIA subgroups. For this purpose, the phenotype and cytokine profile of PD-1hiCD4+ T cells were analyzed using flow cytometry. The functional influence of PD-1hiCD4+ T cells on B cell differentiation was examined using in vitro co-cultures of FACS-sorted TPH cells from the synovial fluid. IL-21 and IL-17 producing T memory cells in the synovial fluid showed a negative correlation with each other. IL-21 production primarily originated from PD-1hiCXCR5-HLA-DR+CD4+ T cells, which particularly accumulated in the joints of ANA-positive JIA patients. This population exhibited phenotypic similarity to TPH cells and efficiently provided B cell help in in vitro experiments for plasma cell differentiation and immunoglobulin secretion, but also induced a CD21lo/-CD11c+T-bet+ phenotype in B cells. Correspondingly, there was a significant ex vivo correlation between TPH and CD21lo/-CD11c+T-bet+ double-negative B cells (BDN). Thus, an expansion of a specific T cell population with phenotypic and functional characteristics of TPH cells was observed, and their functional association with CD21lo/-CD11c+T-bet+ BDN in the synovial fluid of JIA patients was demonstrated. This could reflect the autoimmune response to ubiquitous autoantigens within the affected joints of ANA-positive JIA patients. KW - Rheumatologie KW - Juvenile chronische Arthritis KW - Helferzelle KW - T-Lymphozyt KW - Antinukleärer Antikörper KW - Periphere T-Helferzellen KW - PD-1 KW - TPH KW - CD21lo B-Zellen KW - peripheral T helper cells KW - CD21lo B cells KW - antinuclear antibodies KW - memory T cells Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-363022 ER - TY - THES A1 - Groh, Janos Michael T1 - Pathogenic impact of immune cells in mouse models of neuronal ceroid lipofuscinosis T1 - Pathogener Einfluss von Immunzellen in Mausmodellen der Neuronalen Ceroid Lipofuszinose N2 - The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are fatal neurodegenerative disorders in which the visual system is affected in early stages of disease. A typical accompanying feature is neuroinflammation, the pathogenic impact of which is presently unknown. In this study, the role of inflammatory cells in the pathogenesis was investigated in Palmitoyl-protein thioesterase 1-deficient (Ppt1-/-) and Ceroidlipofuscinosis, neuronal 3-deficient (Cln3-/-) mice, models of the infantile and juvenile forms of NCL, respectively. Focusing predominantly on the visual system, an infiltration of CD8+ cytotoxic Tlymphocytes and an activation of microglia/macrophage-like cells was observed early in disease. To analyze the pathogenic impact of lymphocytes, Ppt1-/- mice were crossbred with mice lacking lymphocytes (Rag1-/-) and axonal transport, perturbation and neuronal survival were scored. Lack of lymphocytes led to a significant amelioration of neuronal disease and reconstitution experiments revealed a crucial role of CD8+ cytotoxic T-lymphocytes. Lack of lymphocytes also caused an improved clinical phenotype and extended longevity. To investigate the impact of microglia/macrophage-like cells, Ppt1-/- and Cln3-/- mice were crossbred with mice lacking sialoadhesin (Sn-/-), a monocyte lineage-restricted cell adhesion molecule important for interactions between macrophage-like cells and lymphocytes. Similar to the lack of lymphocytes, absence of sialoadhesin significantly ameliorated the disease in Ppt1-/- and Cln3-/- mice. Taken together, both T-lymphocytes and microglia/macrophage-like cells were identified as pathogenic mediators in two distinct forms of fatal inherited neurodegenerative storage disorders. These studies expand the concept of secondary inflammation as a common pathomechanistic feature in some neurological diseases and provide novel insights that may be crucial for developing treatment strategies for different forms of NCL. N2 - Die Neuronalen Ceroid Lipofuszinosen (NCL) sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, bei denen das visuelle System frühzeitig im Krankheitsverlauf betroffen ist. Eine typische Begleiterscheinung sind Entzündungsreaktionen, deren pathogenetischer Einfluss bisher ungeklärt ist. In dieser Studie wurde die Rolle von Entzündungszellen bei der Pathogenese in Palmitoyl-protein thioestease 1-defizienten (Ppt1-/-) und Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 3-defizienten (Cln3-/-) Mäusen untersucht, den jeweiligen Modellen der Infantilen und Juvenilen Formen der NCL. Mit besonderem Augenmerk auf das visuelle System wurde früh in der Krankheit ein Aufkommen von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten und eine Aktivierung von Mikroglia/Makrophagen-ähnlichen Zellen beobachtet. Um den pathogenetischen Einfluss der Lymphozyten zu klären, wurden Ppt1-/- Mäuse mit Mäusen verkreuzt, welche keine Lymphozyten besitzen (Rag1-/-). An den generierten Doppelmutanten wurden axonaler Transport, axonale Schädigung und neuronales Überleben bestimmt. Die Abwesenheit von Lymphozyten führte zu einer signifikanten Abmilderung der neuronalen Schädigung und Rekonstitutions-Experimente zeigten, dass CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Die Abwesenheit dieser Lymphozyten führte außerdem zu einem abgemilderten klinischen Phänotyp und einem verlängerten Überleben. Um den Einfluss von Mikroglia/Makrophagen zu untersuchen wurden Ppt1-/- und Cln3-/- Mäuse mit Sialoadhesin-defizienten Mäusen (Sn-/-) verkreuzt. Sn ist ein Monozyten-spezifisches Zelladhäsionsmolekül, das wichtig für Interaktionen zwischen Makrophagen-ähnlichen Zellen und Lymphozyten ist. Ähnlich wie die Abwesenheit von Lymphozyten führte die Abwesenheit von Sialoadhesin zu einer signifikanten Abmilderung der Krankheit in Ppt1-/- und Cln3-/- Mäusen. Zusammengefasst wurden sowohl T-Lymphozyten als auch Mikroglia/Makrophagenähnliche Zellen als pathogenetische Mediatoren in zwei verschiedenen Formen von tödlich verlaufenden erblichen neurodegenerativen Speicherkrankheiten identifiziert. Diese Untersuchungen erweitern das Konzept der sekundären Entzündungsreaktion als verbreitete pathomechanistische Erscheinung in einigen neurologischen Erkrankungen und liefern neue Perspektiven für die Entwicklung von Behandlungsstrategien für verschiedene Formen der NCL. KW - Nervendegeneration KW - Maus KW - Entzündung KW - T-Lymphozyt KW - Neuronale Ceroid Lipofuszinose KW - Neuroinflammation KW - Neurodegeneration KW - axonaler Schaden KW - T-Lymphozyten KW - neuronal ceroid lipofuscinosis KW - neuroinflammation KW - neurodegeneration KW - axonal damage KW - T-lymphocytes Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77684 ER - TY - THES A1 - Visan, Ion Lucian T1 - P0 specific T-cell repertoire in wild-type and P0 deficient mice N2 - Zusammenfassung Das Myelinprotein P0 stellt eine zentrale Komponente für die Stabilität und Funktionalität der Myelinscheiden des peripheren Nervensystems dar. Mutationen des P0-Proteins führen zu verschiedenen, schwer behindernden peripheren Neuropathien wie der Charcot-Marie-Tooth- oder der Dejerine-Sotas-Erkrankung. Wir haben das Tiermodell der P0-Knock-Out-Mäuse verwendet, um im Vergleich zu den C57BL/6-Wildtyp-Tieren Selektionsmechanismen des P0-spezifischen T-Zell-Repertoires zu untersuchen. Dazu wurde eine Reihe von überlappenden 20-mer-Peptiden benutzt, die die gesamte Aminosäuresequenz von P0 abdeckten. Mit Hilfe dieser Peptide wurde ein sog. „Epitop-Mapping“ der H2-Ab-restringierten T-Zell-Antwort durchgeführt. Auf diese Weise konnte das P0-Peptid 5 (Aminosäure 41-60) in der extrazellulären P0-Domäne als immunogene Determinante identifiziert werden. Dieses immunogene Peptid wurde dann für Untersuchungen der Toleranzmechanismen verwendet und zeigte, dass in P0-Knock-Out-Mäusen ein hochreaktives P0-spezifisches T-Zell-Repertoire vorliegt, während es in Wildtyp-Tieren inaktiviert ist und so Selbsttoleranz erzeugt wird. Die Toleranzerzeugung in Wildtyp- und heterozygoten P0 +/- Mäusen hängt nicht von der Gen-Dosis ab. P0 ist ein gewebespezifisches Antigen, dessen Expression normalerweise auf myelinisierende Schwann-Zellen beschränkt ist. Die klassischen Vorstellungen zu Toleranzmechanismen gegenüber gewebsspezifischen Antigenen schrieben diese vor allem peripheren Immunmechanismen zu. Durch den erstmaligen Nachweis von intrathymischer Expression gewebsspezifischer Antigene wie P0 konnten wir bestätigen, dass für P0 offensichtlich die Expression deutlich weiter verbreitet ist, insbesondere auch auf Thymus-Stroma-Zellen. Unter Verwendung von Knochenmarkschimären haben wir weitere Untersuchungen durchgeführt, wie Knochenmarks-abstammende Zellen im Vergleich zu nicht-hämatopoetischen Zellen Toleranz gegenüber P0 erzeugen können. Unsere Befunde zeigen, dass Knochenmarks-abhängige Zellen nicht ausreichen, um völlige Toleranz zu erzeugen. Zusätzlich wurde eine P0-Expression auf anderen Geweben wie dem Thymus benötigt, um komplette Toleranz zu erhalten. Wir identifizierten ein kryptisches P0-Peptid 8 und zwei subdominante P0-Peptide 1 und 3. Während das Peptid 8 sowohl in Wildtyp- als auch Knock-Out-Mäusen erkannt wurde, wurden die Peptide 1 und 3 in Wildtyp-Mäusen nicht als Immunogen erkannt. Die genannten Peptide wurden verwendet, um eine experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) zu erzeugen. Mit keinem der experimentellen Ansätze konnten wir klinische Zeichen einer EAN generieren, allerdings mit dem Peptid 3 doch Entzündung im peripheren Nerven beobachten. Es werden zukünftig weitere Untersuchungen benötigt, um P0-spezifische T-Zell-Linien zu etablieren und so mit höherer Effizienz eine EAN zu erzeugen. Unsere Untersuchungen sprechen dafür, dass bei gentherapeutischen Ansätzen bei erblichen Neuropathien vorsichtig und schrittweise vorgegangen werden muss, da mit sekundärer Autoimmunität und damit Inflammation im peripheren Nerven zu rechnen ist. N2 - Summary Myelin protein zero (P0) is a key myelin component in maintaining the integrity and functionality of the peripheral nervous system. Mutated variants are the cause for several disabilitating peripheral neuropathies such as Charcot-Marie-Tooth disease or Dejerine –Sotas syndrome. Using P0 knockout mice - a mouse model for these diseases - together with their wt counterparts on C57BL/6 background we studied the shaping of the T-cell repertoire specific for P0 in the presence and in the absence of this protein during the ontogeny of T-cells. Our approach was to use a series of overlapping 20-mer peptides covering the entire amino acid sequence of P0. This series of P0 peptides was employed for epitope mapping of the H2-Ab restricted T cell response. Thus, P0 peptide 5 (P0 41-60) in the extracellular domain of P0 was identified as the main immunogenic peptide. The immunogenic peptide containing the core immunodominant determinant in the P0 sequence was employed in studies of tolerance, revealing a highly reactive P0 specific T-cell repertoire in P0 ko mice while in wt mice the high avidity repertoire was inactivated in order to ensure self tolerance. In wild type and heterozygous P0 mice tolerance is not dependent on gene dosage. P0 is a tissue specific antigen whose expression is limited to myelinating Schwann cells. The classical view on tolerance to tissue specific antigens attributed this role to peripheral mechanisms. Driven by the finding that intrathymic expression of tissue-specific antigens is a common occurrence, we confirmed that “promiscuous” expression on thymic stroma holds true also for myelin P0. In addition, using bone marrow chimeras we investigated the capacity of bone marrow derived cells versus nonhematopoietic cells to induce tolerance towards P0. Our findings show that bone marrow derived cells although tolerogenic to some degree are not sufficient to mediate complete tolerance. P0 expression on cells with origin other than bone marrow showed to be sufficient and necessary to induce sound tolerance. We identified one cryptic (P0 peptide 8) and two subdominant epitopes (P0 petides 1, and 3). P0 peptide 8 was reactive in both wt and P0 ko mice. Peptides 1 and 3 were immunogenic in P0 ko but not in wt mice. Several P0 peptides including the immunogenic peptide 5 were involved in direct and adoptive transfer EAN studies. None of them induced clinical signs of EAN. Immunization with P0 peptide 3 did induce inflammation of the peripheral nerves reflected by the infiltration of macrophages and CD3 positive cells. More studies involving highly P0 specific T-cell lines are needed to characterize the P0 induced EAN. Our findings may have direct implications for secondary autoimmunity and inflammation in peripheral nerves developing after correcting the P0 genetic defect by gene therapy in aforementioned diseases. KW - Myelin KW - Genmutation KW - T-Lymphozyt KW - autoimmunität KW - T-zell epitope KW - T-zell repertoir KW - toleranz KW - MPZ (P0) KW - autoimmunity KW - T-cell epitope KW - T-cell repertoire KW - tolerance KW - MPZ (P0) Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5734 ER - TY - THES A1 - Wellner, Stefan Friedrich T1 - Oberflächenphänotypisierung und funktionelle Analyse von T Zellen des peripheren Blutes bei Kindern mit Diabetes mellitus Typ 1 T1 - Surface Phenotype and Functional Analysis of Peripheral Blood T Cells in Children with Type 1 Diabetes Mellitus N2 - Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM) ist eine Autoimmunerkrankung, welche durch die progrediente Schä¬digung der βZellen der Pankreas mit dadurch resultierendem absolutem Insulin¬mangel gekennzeichnet ist. Obwohl sich eine Vielzahl an Studien in den ver¬gangenen Jahrzehnten den zellulären Grundlagen dieser Erkrankung ge¬widmet hat, fehlt bis dato ein geeigneter kausaler Therapieansatz, sodass nach wie vor lediglich die eher symptomatisch orientierte Insulin-Substitution im Vor-dergrund steht. Die hier vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der genauen Charakterisierung von Immunzellen – insbesondere Lymphozyten – aus dem peripheren Blut er¬krankter Kinder mit dem Ziel, Verschiebungen im Phänotyp dieser Zellen aufzudecken, um potenzielle Ansatzpunkte zur weiteren Forschung und Therapiefindung zu finden. Hierfür wurde die Durchflusszytometrie genutzt, um den genauen Phänotyp der Lymphozyten zu untersuchen und Veränderungen im Oberflächenmarker-Expressionsmuster einzelner spezifischer Subpopulati¬onen zuweisen zu können. In erster Linie wurden hierbei zwei Zellpopulationen identifiziert, welche bei erkrankten Kindern deutlich vermehrt im peripheren Blut vorkommen, als bei gesunden Vergleichspersonen. Die Erste dieser Populationen sind CCR6-exprimierende CD4+ Zellen. Dies ist interessant, da CCR6 in verschiedenen früheren Studien mit Autoim¬munität in Verbindung gebracht wurde. In der weiteren Analyse zeigte sich, dass eine erhöhte IFNγ-Produktion in der vermutlich selben Zellpopulation vorlag, die auch CCR6 verstärkt exprimierte (Gedächtnis-T-Zellen vom Typ CD4+CD45RO+CCR7+CD28+), während kein Anhalt auf eine geänderte IL 17-Produktion gesehen wer¬den konnte. Die zweite in unserer Studie bei T1DM deutlich vermehrte Zellpopulation sind CXCR3-exprimierende CD8+ Zellen. Hierbei handelte es sich in erster Linie um Zellen, welche auch CCR7 exprimierten. In der hier vorliegenden Studie wurde die T1DM-Gruppe außerdem aufgeteilt nach der Krankheitsdauer (recent onset T1DM RO und long-standing T1DM LS), um im Krankheitsverlauf entstehende Veränderungen erkennen zu können. Es konnten jedoch insgesamt keine klaren derartigen Veränderungen festgestellt werden, was allerdings möglicherweise auch an einer zu geringen überblickten Zeitspanne liegen könnte (geringe durchschnittliche und maximale Krankheitsdauer). Aufgrund unserer Ergebnisse kann spekuliert werden, dass es sich bei den prozentuell vermehrt auftre¬tenden CCR6+ Zellen um IFNγ-produzierende Zellen handelt. Dies würde neueren Erkenntnissen von anderen Studien entsprechen, welche nicht – wie zuvor vermu¬tet wurde – Th17 Zellen, sondern nicht-klassische Th1 Zellen als pathogene Population diskutieren. Ein quantitativer Mangel an Treg als Ursache der ge¬steigerten IFNγ-Produktion erscheint nach unseren Ergebnissen unwahrscheinlich, da wir erhöhte Mengen CD25+CD127 /dim Zellen bei T1DM nachweisen konnten. Die beobachtete Koexpression von CXCR3 und CCR7 ist interessant vor dem Hintergrund, dass CXCR3-Überexpression im Pankreas in einer früheren Studie mit T1DM in Verbindung gebracht wurde, jedoch eine CXCR3-Blockade bisher keinen geeigneten therapeutischen Ansatz lieferte. Zunächst kann hier aber nur eine Assoziation beschrieben werden, wobei ein kausaler Zusammenhang in geeigneten Studiendesigns überprüft werden müsste. Eine genauere Betrachtung der CD8+CCR7+CXCR3+ Zellen könnte nach unserer Ansicht interessante neue Aspekte und potenzielle Therapieansätze offenlegen. Insbesondere scheint die Untersuchung CCR7-vermittelter Migration dieser Zel¬len einen geeigneten Studienansatz darzustellen. Ebenso verweisen unsere Er-gebnisse erneut auf eine pathogene Rolle CCR6-exprimierender Zellen, welche in kommenden Studien näher beleuchtet werden sollte. N2 - T1DM displays an autoimmune disease characterized by a progressive destruction of pancreatic β cells, with subsequent absolute lack of Insulin. Despite a high number of studies dedicated to the investigation of the cellular background of the disease throughout the last decades, still no appropriate causal therapy exists, thus leaving the symptomatic approach of Insulin substitution the main therapeutic approach. This study focused on a more precise characterization of immune cells – especially lymphocytes – derived from peripheral blood of children with T1DM, with the aim of uncovering phenotypical changes in these cells and potentially revealing new therapeutic targets. Flow cytometry was used in order to define cell phenotype more accurately and allocate changes in the expression profile of cell surface markers of lymphocyte subpopulations more specifically than in early studies. Two cell populations were significantly increased in the peripheral blood of diseased children compared to healthy controls. First, CCR6-expressing CD4+ cells were increased, which is of interest considering earlier studies that showed a connection of this chemokine receptor to autoimmunity. Furthermore, functional investigations showed an increased IFNγ production as well, presumably derived from the CCR6 overexpressing CD4+CD45RO+CCR7+CD28+ memory T cells, whereas there was no difference in the production of IL 17. The second cell population found to be increased were CXCR3-expressing CD8+ cells, which also express CCR7. Additionally, this study separated T1DM into two groups according to disease duration (recent onset T1DM RO and long-standing T1DM LS) in order to evaluated changes throughout disease progression. However, no such change could be found, possibly resulting from rather short disease duration of long-standing T1DM in our cohort. Our findings concerning the CCR6 and INFγ expression would be in accordance to other studies, showing a potential pathogenic role of non-classic Th1 cells but not primarily of Th17 cells, as formerly suspected. A quantitative lack of Treg as a cause for the increased IFNγ production seems unlikely according to the results of our study, as there were higher proportions of CD25+CD127–/dim cells. The co-expression of CXCR3 and CCR7 is interesting regarding earlier studies that could not find positive effects of a CXCR3 blockade in T1DM, despite an evident overexpression of CXCR3 on T cells in the pancreas. Taken together, our results suggest increased numbers of IFNγ producing CD4+ CCR6+CD45RO+CCR7+CD28+ cells and of CD8+CXCR3+CCR7+ cells in T1DM and thus a potential pathogenic importance of these two populations. However, the present results describe associations rather than causality, thus causal contribution of chemokine receptor expression to etiopathogenesis of T1DM has to be confirmed in appropriate study designs. A more extensive investigation of CD8+CCR7+CXCR3+ cells could potentially reveal interesting etiopathogenical aspects and targets for new therapeutic approaches. Especially the investigation of CCR7-mediated migration of these cells seems to be a promising field of study. In addition, this study again points to the potentially pathogenic role of CCR6-expressing cells, which ought to be examined further in upcoming studies. KW - T-Lymphozyt KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Diabetes mellitus Typ 1 KW - T Helfer Zelle KW - CD4+ T Zelle KW - CD4+ T Lymphocyte KW - Zytotoxische T Zelle KW - CD8+ T Zelle KW - Cytotoxic T Lymphocyte KW - Th17 Zelle KW - Th17 cell KW - Treg Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217539 ER - TY - THES A1 - Strack, Johanna T1 - Morphologische Studie zur altersabhängigen Expression von Autoimmunregulator AIRE im gesunden und entzündlich veränderten Thymus T1 - Morphologic study about the expression of autoimmunregulator AIRE in healthy and inflamed thymus N2 - Die Entdeckung der Autoimmunkrankheit APECED führte zur Entdeckung des verantwortlichen Gens AIRE (autoimmune regulator), das einen Einblick in die Verhinderung oder Entstehung von Autoreaktivität im Thymus bietet. Durch Aktivierung des AIRE-Gens und Expression des AIRE-Proteins werden organspezifische Selbstantigene in medullären Thymusepithelzellen exprimiert und entweder direkt oder nach Transfer auf dendritsche Zellen unreifen T-Zellen präsentiert. Durch Elimination autoreaktiver Zellen entsteht Toleranz gegenüber den körpereigenen Geweben. Da das Immunsystem bei steigendem Alter tiefgreifende Veränderungen erfährt, die zum Teil durch die Thymusinvolution bedingt sind, ist es von Interesse, den Verlauf von AIRE über verschiedene Altersstufen hinweg zu untersuchen. Zielsetzungen dieser Arbeit waren daher die quantitative und räumliche Untersuchung der AIRE+ -Zellen im Alter und im Kontext einer prototypischen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Myasthenia gravis. Diese Fragestellungen wurden bei Normalthymi, entzündlich veränderten Thymi mit assoziierter Myasthenie und an B1-Thymomen untersucht. Als Ergebnis konnte erarbeitet werden, dass der Gehalt an AIRE+ -Zellen mit dem Alter abnimmt, wobei bis in die neunte Lebensdekade noch AIRE+ -Zellen vorhanden waren. Der Gehalt an AIRE+ Zellen stellte sich als stärker mit dem Lebensalter korreliert dar als beispielsweise die Thymusfläche. AIRE scheint damit ein mit der Thymusinvolution eng assoziiertes Gen zu sein. Es fand sich eine hochsignifikante Co-Lokalisation von AIRE+ Zellen und Hassall-Körperchen, die besonders durch die Untersuchungen von Typ B1 Thymomen mit und ohne Hassall-Körperchen bestätigt werden konnte. In Übereinstimmung mit aktuellen Forschungsergebnissen in Mausmodellen fand sich kein Zusammenhang zwischen der Anzahl oder der räumlichen Anordnung regulatorischer T-Zellen und AIRE+ -Zellen. Myoidzellen nahmen mit zunehmendem Alter ebenfalls ab. Ihre Rolle in der Entstehung der Myasthenie ist bei Patienten mit early und late onset wahrscheinlich unterschiedlich; die abnehmende Zahl an Myoidzellen stellt möglicherweise vor allem bei Patienten mit late onset einen Risikofaktor dar. N2 - Research about Autoimmunregulator AIRE, the defective gene in patients with the autoimmune disease APECED, helps us to understand better mechanisms of building up tolerance against peripheral tissue antigens in the thymus. AIRE regulates transcription of peripheral tissue antigens on medullary thymic epithelial cells. It plays either by presentation on the medullary epithelial cells or by cross-presentation through dendritic cells an important role in the induction of central tolerance through negative selection of autoreactive T-cells. As qualitative and quantitative changes in the immune system of the elderly are known it is of interest to look at the expression of AIRE in different ages and in an organotyp autoimmune disease, Myasthenia gravis, which is histologically characterized by inflamed thymus (thymitis). We examined immunohistochemical thymic staininigs of patients from the age of 1 year to the age of 86 years. The histological workup was as followed: The specimens were fixed with 10%buffered, neutral formalin, embedded in paraffin and stained with a Zymed Kit and hemalaun. The monoclonal antibodies used were against AIRE (1:1000), Desmin (1:4000, DAKO), CD 45 RA (1:100, DAKO), FoxP3 (1:50), Donkey anti mouse Cy5 (blau, 1:100, Jackson Immuno research), Donkey anti rabbit Cy3 (rot, 1:100, Jackson Immuno research) Our results are as followed: 1. We found a decrease of AIRE in age with maintenance of singular Aire positive cells even in 90 year old patients. Number of Aire positive cells and age were closely correlated, even more than thymic space and age. 2. Next we found a strong correlation between the expression of AIRE positive cells and Hassal’s corpuscules which was confirmed in a B1 tumor model. In comparison of normal thymic specimens with thymitis, there was a stronger correlation of close expression of AIRE positive cells and Hassal’s corpuscules in normal thymus than in thymitis. 3. There was no correlation of number and close expression of regulatory T cells and AIRE. 4. The number of myoid cells decreased in age. We suppose a different pathogenesis of Myasthenia gravis of early and of late onset. KW - Thymus KW - Autoaggressionskrankheit KW - T-Lymphozyt KW - autoimmunregulator KW - APECED KW - negative selection KW - regulatory T cells Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48017 ER - TY - THES A1 - Patra, Amiya Kumar T1 - Modulation of the NFAT signaling pathway by protein kinase B (PKB) ; a perspective study in the context of thymocyte development and T cell function N2 - To analyze the role of protein kinase B(PKB)on developmental and functional aspects of T cells, we have generated transgenic mouse lines expressing a constitutively active form of PKB (myrPKB) in early stages of T cell development.Peripheral CD4+ T cells from PKB tg mice are hyperreactive, more efficient in producing th1 and th2 cytokines and show faster and CD28 co-stimulation independent cell cycle progression.Interestingly PKB tg T cells are resistant to CsA treatment in proliferation and cytokine production.Further analysis show PKB tg CD4+ T cells have a drastically reduced nuclear translocation of NFAT proteins and this is due to a direct interaction between PKB and NFAT. To study whether the negative regulatiopn of NFATs by PKB affects T cell development, we analyzed double tg mice expressing both, a constitutively active version of calcineurin (dCam) and myrPKB. dCam tg mice have a severe block in thymocyte development at the DN3 stage.But in the dCam/PKB double tg mice this developmental block is significantly rescued.This rescue of thymocyte development by PKB is due to the expression of RAG1 and subsequent TCRb chain expression. CsA treatment of neonatal thymic lobes from dCam mice restores normal thymocyte development, indicating involvement of NFATs in the severe block in dCam thymocyte development.Confocal studies clearly established that compared to dCam DN cells there is a significant reduction in the nuclear levels of NFATc1 and NFATc3 in dCam/PKB cells.Downregulation of nuclear NFAT levels by myrPKB thus seems to be an essential parameter in dCam cells to proceed with normal differentiation. In summary, the data from PKB tg peripheral CD4+ T cells and dCam/PKB double tg thymocytes clearly establish PKB as an important modulator of T cell development and function and PKB as a novel negative regulator of NFAT activation. KW - T-Lymphozyt KW - Aktivierung KW - Proteinkinase B KW - T cell development KW - PKB KW - NFAT KW - TCRb KW - RAG1 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13315 ER - TY - THES A1 - Dennstädt, Fabio Stefan T1 - Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro T1 - Modulation of CD4+ human Treg and Tconv cells by inhibition of the acid sphingomyelinase in vitro N2 - Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt. N2 - By catalyzing the transformation of sphingomyeline into ceramide and phosphocholine, the acid sphingomyelinase (ASM) plays a central role in the metabolism of sphingolipids and is tightly regulated. Therefore it takes essential influence upon different cellular mechanisms like signal transduction, endo-/exocytosis and cell activation. Accordingly complex is the importance of the ASM in different diseases like atherosclerosis, depression or neoplastic diseases. The acid sphingomyelinase also greatly influences the signal mediation of T cells within the adaptive immune system. Based on previous research about the pharmacological and genetic inhibition of the ASM in mice we investigated, which impact an inhibition of this enzyme in human cell cultures may have on the populations of regulatory and conventional T cells. Therefore we mostly used the two selective serotonin reuptake inhibitors sertraline and citalopram. These two antidepressive drugs detach the ASM from the lysosomal membrane and thereby inhibit the enzyme. Here we show, that these two substances efficiently inhibit the ASM mice T cells as well as human T cells. Cultivating immune cells of mice together with the inhibitors led to an essential increase in the frequency of regulatory T cells. Various cell culture experiments with human PBMCs showed that under certain circumstances an increase in regulatory T cells is also possible in the human, most likely due to the involvement of the ASM in the CD3/CD28 signal pathway. Experimental approaches using � CD3-antibodies showed an increase in Treg cells in a fraction of the tested individuals. External addition of C6-ceramide led to a decrease in the frequency of regulatory T cells. In addition to that, we were able to observe diverse effects regarding the expression of CD25, CD69 and CTLA-4 in Treg and Tconv cells in the presence of the ASM-inhibitors. We were also able to confirm that the pharmacological inhibition of the acid sphingomyelinase has an impact on the effector functions of T cells. While there was no effect on cell proliferation, we observed a decreased secretion of the cytokines IFN-gamma, TNF, IL-5 and IL-10. Alltogether these results indicate that inhibitors of the acid sphingomyelinase might have positive effects in pathologies of overshooting or dysregulated activity of the immune system. Immunomodulatory effects after inhibition of the ASM might also explain observations of an influence of antidepressants on the immune system that have been described in the literature. Overall the importance of the acid sphingomyelinase within the regulation of the adaptive immune system is a new field of research with many open questions. Therefore further clinical and experimental research is needed to clarify, which impact this enzyme has on immune cells and how this impact might be used therapeutically. KW - T-Lymphozyt KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Serotonin-Reuptake-Hemmer KW - Sphingolipide KW - Sphingomyelinphosphodiesterase KW - Saure Sphingomyelinase KW - ASM-Inhibition KW - Regulatorische T-Zellen KW - Serotonin-Wiederaufnahmehemmer KW - Sphingolipidstoffwechsel KW - Ceramid KW - Sphingomyelin KW - Sertralin KW - Citalopram Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205420 ER - TY - THES A1 - Li, Jian-Qiang T1 - Modulating the expression of enzymes of isoprenoid synthesis: effects on Vgamma9Vdelta2 T cell activation and tumor cell growth T1 - Modulation der Expression von Enzymen der Isoprenoidsynthese: Effekte auf die Vgamma9Vdelta2 T Zellaktivierung und das Tumorzellwachstum N2 - This study focuses on phosphoantigen specific Vg9Vd2 T cells which only exist in human and non-human primates. This population accounts for 1%-5% of peripheral blood T-lymphocytes but their frequency can rise to 50% of total blood T cells upon infection. Vg9Vd2 T cells can be activated by nonpeptide compounds with critical phosphate moieties which are termed as phosphoantigens. These include isopentenyl pyrophosphate (IPP), a key compound of isoprenoid synthesis in all organisms, and (E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), a direct precursor of IPP in DOXP pathway which only exist in eubacteria, plants, apicomplexaen parasites. Its activity as phosphoantigen is at least 1000 fold higher than that of IPP. However, direct structural evidence of phosphoantigen binding to the TCR is missing so far. Moreover, Vg9Vd2 T cells have potent anti-tumor activity e.g. against the B-cell lymphoma Daudi, whose Vg9Vd2 T cell activating properties have been suggested to result from sensing of abnormal intracellular IPP levels by the Vg9Vd2 TCR or Vg9Vd2 TCR binding to other postulated ligands such as an ectopically expressed F1-ATPase or UL-16 binding protein 4 (ULBP4). Aminobisphosphonates and alkymines were hypothesized to activate Vg9Vd2 T cells indirectly by inhibiting the IPP consuming enzyme farnysyl pyrophosphates synthesis (FPPS) although off target effects of these drugs or a direct interaction with the Vg9Vd2 TCR could not be excluded. This thesis presents new approaches for the mechanistic analysis of Vg9Vd2 T cell activation. By employing retroviral transduction of FPPS specific shRNA, it shows that specific shRNA reduces expression of FPPS and is sufficient to convert hematopoietic and non-hematopoietic tumor cell lines into Vg9Vd2 T cell activators. FPPS knockdown cells activated Vg9Vd2 T cells as measured by increased levels of CD69 and CD107a, kill of FPPS knockdown cells and induction of IFN-γ secretion. The IPP-synthesis-inhibiting drug mevastatin reduced Vg9Vd2 T cell activation by FPPS knockdown cells or aminobisphosphonate treated cells but not activation by the phosphoantigen bromohydrin pyrophosphate (BrHPP). A reduced growth of the FPPS knockdown cells has not been observed which is different to what has been reported for aminobisphosphonate treated cells. Finally, the human B-cell lymphoma RAJI has been transduced with Tetracyclin-inducible FPPS specific shRNA and proven to gain and loose the capacity to activate Vg9Vd2 TCR transductants upon doxycylin provision or removal. Another approach for the analysis of Vg9Vd2 T cell activation is Vg9Vd2 TCR transduced mouse cell lines with specificity for phosphoantigens. In contrast to the previously used Vg9Vd2 TCR transduced Jurkat cells, these cells do not present phosphoantigens, and are therefore specially suited for analysis of phosphoantigen presentation. The response of the new TCR transductants to presumed Vg9Vd2 TCR ligands/activators such as phosphoantigens, aminobisphosphonates or FPPS knockdown cells, depended strongly on the expression of a rat/mouse CD28 molecule by the transductants and its ligation by the (CD80) counter receptor on the ligand-presenting cell. The response is likely to reflect recognition of cognate Vg9Vd2 TCR antigens since mutations in the TCR-δ chain CDR2 and 3 abolished this response but activation by TCR or CD3 specific antibodies. A major difference between TCR transductants and primary gd T cells, was the lacking response of TCR transductants to Daudi or IPP. In addition their sensitivity to other soluble phosphoantigens was about 100 fold weaker than that of primary cells, stimulation of both cell type to CD80 expressing FPPS knock down or aminobisphosphonates was similar. Finally, the transductants have also been used to analyze effects of over-expression or knockdown of enzymes of isoprenoid synthesis such as 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reductase or HMGR), mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase (MVD), isopentenyl pyrophosphate isomerase (IDI), geranyl-geranyl pyrophosphate synthase (GGPPS) but no clear effects have been found. In conclusion, this thesis supports the concept of Vg9Vd2 T cells being sensors of a dysregulated isoprenoid metabolism and established new tools to study ligand recognition and TCR mediated activation of this T cell population. These tools will be most useful to address following questions: 1) How does the dysregulation of isoprenoid metabolism affect tumor growth? 2) What is the correlation between the modulation of IPP levels and the Vg9Vd2 TCR binding or expression of other postulated ligands? 3) Are there any mevalonate pathway enzymes other than FPPS and HMGR, which play an important role in Vg9Vd2 T cells activation? 4) What is/are the putative phosphoantigen-presenting molecule(s)? N2 - Die vorliegende Arbeit widmet sich den phosphoantigenspezifischen Vg9Vd2 T Zellen, die nur im Menschen und nicht-humanen Primaten zu finden ist. Diese Population stellt 1-5% der peripheren Blut T-Zellen aber ihre Frequenz kann bei Infektionen auf bis zu 50% steigen. Vg9Vd2 T Zellen können durch nicht Peptid-Moleküle aktiviert werden, die sich durch eine essentielle Phosphatkomponente auszeichnen. Hierzu gehören das Isopentenyl-pyrophosphat (IPP), ein Schlüsselmolekül der Isoprenoidsynthese aller Organismen, sowie das bezüglich seiner gd T zellaktivierenden Eigenschaften mehr als 1000fach stärkere (E)-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl-pyrophosphat (HMBPP), dass der direkte Vorläufer des IPP im DOXP Stoffwechselweg ist, der nur bei Eubakterien, Pflanzen und apikomplexen Bakterien zu finden ist. Direkte strukturelle Belege für die Bindung von Phosphoantigenen an den gd TCR stehen jedoch aus. Darüber hinaus besitzen Vg9Vd2 T Zellen eine direkte gegen Tumoren wie das B-Zelllymphom Daudi gerichtete Aktivität, für deren Erklärung ein „Erspüren“ eines abnormal erhöhten intrazellulären IPP Spiegels durch den Vg9Vd2 TCR oder Bindung des Vg9Vd2 TCR an Liganden, wie einer ectopisch exprimierten F1-ATPase oder des UL-16 bindenden Proteins 4 (ULBP4) herangezogen wurde. Die Vg9Vd2 T Zell Aktivierung durch Aminobisphosphonate und Alkylamine wurde hingegen auf die Inhibition des IPP verbrauchenden Enzyms Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) zurückgeführt, obgleich Wirkungen auf andere Moleküle oder eine direkte Bindung an den TCR nicht ausgeschlossen werden konnten. Die vorgelegte Dissertationsschrift beschreibt neue Ansätze der Analyse der Mechanismen der Vg9Vd2 T Zell Aktivierung. Sie zeigt, dass eine mittels retroviraler Transduktion von shRNA erzielte Reduktion der FPPS Expression ausreicht, um hematopoietische und nicht-hematopoietische Tumorzellen zu Vg9Vd2 T Zellaktivatoren zu machen. Die FPPS knockdown zellvermittelte Aktivierung der Vg9Vd2 T Zellen zeigte sich in erhöhter Expression von CD69, CD107a, Zytotoxizität gegen FPPS knockdown Zellen und Induktion der IFNg Sekretion. Die, die IPP-Synthese inhibierende Substanz Mevastatin, reduzierte die Vg9Vd2 T Zellaktivierung durch FPPS knockdown Zellen oder Aminobisphosphonat behandelte Zellen, aber nicht die Aktivierung durch das Phosphoantigen Bromhydrin Pyrophosphat. Ein vermindertes Wachstum der FPPS knockdown Zellen wurde nicht nachgewiesen was im Gegensatz zur Literatur über Aminobisphosphonat behandelte Zellen steht. Weiterhin wurde ein Tetracyclin-induzierbares FPPS spezifische shRNA kodierendes lentivirales Konstrukt in humane B-Zelllymphom Raji Zellen transduziert, die anschließlich die durch Zugabe bzw. Entfernung von doxycyclin gesteuerte Fähigkeit erhielten, Vg9Vd2 T Zellen zu aktivieren. Ein anderer Ansatz zur Analyse der Vg9Vd2 T-zellvermittelten Aktivierung war die Entwicklung phosphoantigenspezifischer Vg9Vd2 TCR transduzierter Mauszelllinien. Diese Zellen unterscheiden sich von den bisher benutzten humanen Vg9Vd2 TCR transduzierten Jurkat Zellen dadurch, dass sie keine Phosphoantigene präsentieren, und sind daher für Analyse der Phosphoantigenpräsentation besonders geeignet. Die Antwort der neuen TCR Transduktanten auf wahrscheinliche Vg9Vd2 TCR Zellliganden bzw. Vg9Vd2 T-Zellaktivatoren wie Phosphoantigene, Aminobisphosphonate oder FPPS knockdown Zellen hing im hohen Maße von der Expression eines Ratten/Maus CD28 Moleküls auf den Transduktanten und dessen Bindung an den (CD80) Gegenrezeptor auf der antigenpräsentierenden Zelle ab. Höchstwahrscheinlich reflektiert die Antwort auf eine spezifische Antigenerkennung, da Mutationen in den CDR2 und 3 der TCRd Kette die Antwort verschwinden ließen, aber keine Effekte auf die Stimulation durch CD3 oder TCR spezifische Antikörper hatten. Ein gravierender Unterschied der TCR-Transduktanten zu primären gd T Zellen lag auch darin, dass die TCR Transduktanten weder durch Daudi Zellen noch durch IPP stimuliert wurden und ihre Empfindlichkeit gegenüber löslichen Phosphoantigenen ungefähr 1000fach geringer als bei primären Vg9Vd2 T-Zellen war, während sich die Antwort der beiden Zelltypen auf FPPS knockdown oder Aminobisphosphonate-behandelte Zellen ähnelten. Schließlich wurden die Transduktanten verwendet, um Effekte der Überexpression oder des knockdown von Enzymen der Isoprenoidsynthese wie 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl-CoA reductase (HMG-CoA reduktase or HMGR), Mevalonat-5-Pyrophosphat decarboxylase (MVD), Isopentenyl Pyrophosphat Isomerase (IDI), Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase (GGPPS) zu analysieren, wobei keine eindeutigen Effekte beobachtet wurden. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die vorgelegte Arbeit die Vorstellung von Vg9Vd2 TCR Zellen als Sensoren eines entgleisten Isoprenoidstoffwechsel unterstützt und neue Werkzeuge zur Analyse der Ligandenerkennung und TCR vermittelten Aktivierung dieser Zellpopulation vorstellt. Diese Werkzeuge sollten bei der Beantwortung folgender Fragen helfen: 1) Wie beeinflusst die Fehlregulation des Isoprenoidstoffwechesle das Tumorwachstum. 2) Welche Korrelation besteht zwischen der Modulation der IPP Spiegel und der Vg9Vd2 TCR vermittelten Aktivierung bzw. der Expression anderer vorgeschlagener Vg9Vd2 Liganden. 3) Gibt es Enzyme außer der FPPS und der HMG-CoA Reduktase, die eine wichtige Rolle bei der Vg9Vd2 T-Zellaktivierung spielen und schließlich 4) Welche(s) Molekül(e) präsentiert bzw. präsentieren Phosphoantigene ? KW - Primaten KW - T-Lymphozyt KW - Tumorwachstum KW - Isoprenoide KW - Synthese KW - Vg9Vd2 T Zellaktivierung KW - Isoprenoidsynthese KW - Farnesylpyrophosphatsynthase (FPPS) KW - Aminobisphosphonat KW - Isopentenyl-pyrophosphat (IPP) KW - Vg9Vd2 T cell KW - Isoprenoid Synthesis KW - Farnesyl Pyrophosphate Synthase KW - Aminobisphosphonate KW - Isopentenyl pyrophosphate (IPP) Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46388 ER - TY - THES A1 - Scheller, Lukas T1 - Migrationsfördernde Faktoren im intestinalen T-Zell-Homing während der akuten Graft-versus-Host Erkrankung T1 - Migration-promoting factors in the intestinal T-cell homing during acute graft-versus-host disease N2 - Die akute Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), insbesondere die Darm GvHD, stellt weiterhin eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität nach allogener SZT dar. Aktivierte, alloreaktive Spender T-Zellen infiltrieren dabei über die Blutbahn die intestinale Lamina Propria. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass neben der vaskulären Migration ein Teil der Spender T-Zellen auch direkt aus den PP in die angrenzende Lamina Propria migrieren. Um Faktoren, die diese direkte Migration fördern, zu untersuchen und die direkt migrierenden T-Zellen genauer zu charakterisieren, verwendeten wir ein MHC-inkompatibles Mausmodell zur Induktion einer akuten GvHD. Durch RNA Sequenzierung und Massenspektrometrie lasermikrodissezierter Darmschleimhautproben konnte eine starke Expression der Chemokine CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 und CCL5 während der akuten intestinalen GvHD aufgezeigt werden. Neben CCL4 und XCL1 wiesen verschiedene Faktoren der T-Zellaktivierung, wie CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, sowie Faktoren der zytoskelettalen Reorganisation, wie Dock2, Coro1α und Parvin-γ, eine vermehrte Expression insbesondere nahe der PP auf. Die Expression der migrationsfördernden Faktoren Coro1α und Parvin-γ in Spender T-Zellen nahe der PP konnte anschließend mittels histologischen Immunfluoreszenzfärbungen bestätigt werden. Durchflusszytometrische Analysen konnten weiterhin eine vermehrte Expression von CCR5, CCR9 und Intgerin α4β7 auf den vornehmlich Tbet+ Spender T-Zellen nahe der PP nachweisen. Funktionelle in vitro Migrationsversuche zeigten abschließend, dass in vivo aktivierte Spender T-Zellen eine gerichtete Migration in Richtung auf CXCL11 und zu späterem Zeitpunkt auch auf CCL4 vollziehen können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung zahlreicher Chemokine für das sequenzielle T-Zell-Homing während der akuten intestinalen GvHD. Neben der insbesondere durch Faktoren der zytosekeletalen Reorganisation vermittelten amoeboiden Migration kann auch eine mesenchymale Fortbewegung über Faktoren wie CCR5, CCR9 und Integrin α4β7 die direkte Migration der T-Zellen fördern. Den direkt migrierenden vornehmlich TH1 polarisierten Zellen folgen weitere, CD27 und Integrin αLβ2 exprimierende, zytotoxische T-Zellen aus der Blutbahn. Die direkt migrierenden Zellen könnten als Initiator und Potentiator der intestinalen T-Zell Infiltration wirken und müssen für zukünftige therapeutische Strategien nicht nur der Darm GvHD, sondern der intestinalen Inflammation im Allgemeinen mitberücksichtigt werden. N2 - Acute graft-verus-host disease (GvHD), especially intestinal GvHD, remains one of the main causes of mortality and morbidity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. In this process activated alloreactive donor T cells infiltrate the intestinal lamina propria via the bloodstream. Our group could recently show that besides the vascular migration route some donor T cells migrate directly from the Peyer’s patches into the adjacent lamina propria. To investigate factors that could promote such a direct migration, and to characterize these direct migrating T cells we applied a major mismatch mouse model to induce acute GvHD. Using RNA sequencing and mass spectrometry of lasermicrodissected lamina propria samples, we detected a strong upregulation of the chemokines CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 and CCL5 during acute intestinal GvHD. Alongside CCL4 and XCL1, several factors of T cell activation, such as CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, as well as factors of cytoskeletal reorganization, such as Dock2, Coro1α und Parvin-γ, showed higher expression near the Peyer’s patches. Subsequently, we validated the expression of Coro1α and Parvin-γ on donor T cells near the Peyer’s patches with histological immunofluorescence stainings. Flow cytometry analysis further revealed high expression of CCR5, CCR9 and Intgerin α4β7 on the predominantly Tbet+ donor T cells near the Peyer’s patches. Conclusively, in vitro migration assays showed that in vivo activated donor T cells can directly migrate towards CXCL11 and subsequently also towards CCL4. The present study shows the relevance of several chemokines for the sequential T-cell homing during acute intestinal GvHD. Besides the amoeboid migration mode, which is particularly driven by cytoskeletal reorganization, a mesenchymal movement using factors, such as CCR5, CCR9 and Integrin α4β7, can promote the direct migration of donor T cells. The directly migrating cells, which are predominantly of a TH1 phenotype, are followed by cytotoxic T cells, expressing CD27 and Integrin αLβ2 (LFA-1), from the systemic circulation. Thus, these directly migrating cells may act like an initiator and potentiator for the intestinal T cell infiltration and must be considered for new therapeutic strategies not only of GvHD but of intestinal inflammation in general KW - T-Lymphozyt KW - Graft-versus-host-disease KW - Zellmigration KW - Peyersche Plaques KW - T-Zellmigration KW - Transplantat-Wirt-Reaktion Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292909 ER -