TY - THES A1 - Hell, Dennis T1 - Development of self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system of anti-inflammatory biologicals T1 - Entwicklung von selbstregulierenden Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anti-inflammatorischen Biologikals N2 - The current treatment strategies for diseases are assessed on the basis of diagnosed phenotypic changes due to an accumulation of asymptomatic events in physiological processes. Since a diagnosis can only be established at advanced stages of the disease, mainly due to insufficient early detection possibilities of physiological disorders, doctors are forced to treat diseases rather than prevent them. Therefore, it is desirable to link future therapeutic interventions to the early detection of physiological changes. So-called sensor-effector systems are designed to recognise disease-specific biomarkers and coordinate the production and delivery of therapeutic factors in an autonomous and automated manner. Such approaches and their development are being researched and promoted by the discipline of synthetic biology, among others. Against this background, this paper focuses on the in vitro design of cytokine-neutralizing sensor-effector cells designed for the potential treatment of recurrent autoimmune diseases, especially rheumatoid arthritis. The precise control of inducible gene expression was successfully generated in human cells. At first, a NF-κB-dependent promoter was developed, based on HIV-1 derived DNA-binding motives. The activation of this triggerable promoter was investigated using several inducers including the physiologically important NF-κB inducers tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1 beta (IL-1β). The activation strength of the NF-κB-triggered promoter was doubled by integrating a non-coding RNA. The latter combined expressed RNA structures, which mimic DNA by double stranded RNAs and have been demonstrated to bind to p50 or p65 by previous publications. The sensitivity was investigated for TNFα and IL-1β. The detection limit and the EC50 values were in in the lower picomolar range. Besides the sensitivity, the reversibility and dynamic of the inducible system were characterized. Hereby a close correlation between pulse times and expression profile was shown. The optimized NF-κB-dependent promoter was then coupled to established TNFα- and IL-1-blocking biologicals to develop sensor-effector systems with anti-inflammatory activity, and thus potential use against autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. The biologicals were differentiated between ligand-blocking and receptor-blocking biologicals and different variants were selected: Adalimumab, etanercept and anakinra. The non-coding RNA improved again the activation strength of NF-κB-dependent expressed biologicals, indicating its universal benefit. Furthermore, it was shown that the TNFα-induced expression of NF-κB-regulated TNFα-blocking biologics led to an extracellular negative feedback loop. Interestingly, the integration of the non-coding RNA and this negative feedback loop has increased the dynamics and reversibility of the NF-κB-regulated gene expression. The controllability of drug release can also be extended by the use of inhibitors of classical NF-κB signalling such as TPCA-1. The efficacy of the expressed biologicals was detected through neutralization of the cytokines using different experiments. For future in vivo trials, first alginate encapsulations of the cells were performed. Furthermore, the activation of NF-κB-dependent promoter was demonstrated using co-cultures with human plasma samples or using synovial liquids. With this generated sensor-effector system we have developed self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system for anit-inflammatory biologics. N2 - Die derzeitig üblichen Behandlungsstrategien von Krankheiten werden auf Basis diagnostizierter phänotypischer Veränderungen erhoben, die auf eine Ansammlung asymptomatischer Ereignisse in physiologischen Vorgängen zurückzuführen sind. Da die Feststellung einer Diagnose bislang erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien, vor allem aufgrund unzureichender Früherkennungsmöglichkeiten von physiologischen Störungen, erfolgen kann, sehen sich Ärzte gezwungen, Krankheiten vornehmlich zu behandeln anstatt ihnen vorzubeugen. Daher ist es erstrebenswert, wenn zukünftige therapeutische Interventionen bereits an die Früherkennung von physiologischen Veränderungen gekoppelt werden könnten. Sogenannte Sensor-Effektor Systeme sollen krankheitsspezifische Biomarker erkennen und die Produktion und Bereitstellung von therapeutischen Faktoren in einer selbstständigen und automatisierten Art und Weise koordinieren. Solche Ansätze und deren Entwicklung werden unter anderem durch die Disziplin der synthetischen Biologie erforscht und vorangetrieben. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich vor diesem Hintergrund auf das in vitro Design von Zytokin-neutralisierenden Sensor-Effektor Zellen, die für die potentielle Behandlung wiederkehrender Autoimmunerkrankungen, insbesondere der rheumatoiden Arthritis, konstruiert wurden. Die gezielte Ansteuerung zur induzierbaren Genexpression konnte in humanen Zellen erfolgreich generiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein NF-κB abhängiger Promoter zur induzierbaren Genexpression auf der Grundlage von HIV-1 abgleitenden DNA-Bindemotiven entwickelt. Die Aktivierbarkeit dieses Promoters wurde durch verschiedene Induktoren, insbesondere auch durch die physiologisch wichtigen NF-κB Aktivatoren Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Interleukin 1 beta (IL-1β) überprüft. Die Aktivierungsstärke des NF-κB abhängigen Promoters wurde durch die Integration einer nicht-kodierenden RNA verdoppelt. Diese RNA kombiniert Strukturelemente, die im RNA-Doppelstrang DNA-Strukturen imitieren, und für die in Vorarbeiten die Bindung an p50 oder p65 nachgewiesen werden konnten. Für TNFα und IL-1β lagen das Detektionslimit und die EC50 Werte der NF-κB getriggerten Genexpression im unteren pikomolaren Bereich. Neben der Sensitivität wurde das induzierbare System bezüglich seiner Reversibilität und Dynamik charakterisiert. Dabei konnte eine enge Korrelation zwischen Pulszeiten und Expressionsmustern aufgezeigt werden. Ferner wurde der NF-κB abhängige Promoter an etablierte TNFα- und IL-1-blockierende Biologicals gekoppelt, um Sensor-Effektor Systeme mit anti-entzündlicher Aktivität zu erhalten, die potentiell zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, eingesetzt werden könnten. Bei den Biologicals wurde zwischen Ligand-blockierenden und Rezeptor-blockierenden Biologicals differenziert und unterschiedliche Varianten ausgewählt: Adalimumab, Etanercept und Anakinra. Erneut verbesserte die zusätzliche Integration der nicht-kodierenden RNA die Aktivierungsstärke der NF-κB abhängig exprimierten Biologicals, das die universelle Nutzbarkeit des hier entwickelten optimierten NF-κB-Promoters unterstreicht. Ferner wurde gezeigt, dass die TNFα-induzierte Expression von NF-κB-regulierten TNFα-blockierenden Biologika zu einem extrazellulären negativen Feedback Loop führte. Interessanterweise hat die Integration der nicht-kodierender RNA und dieser negative Feedback Loop die Dynamik und Reversibilität der NF-κB-regulierten Genexpression erhöht. Die Kontrollierbarkeit der Wirkstoffabgabe kann zudem durch den Einsatz von Inhibitoren der klassischen NF-κB-Signalisierung wie z.B. TPCA-1 erweitert werden. Die Wirksamkeit der exprimierten Biologicals wurde durch Neutralisation der Zytokine in verschiedenen Experimenten nachgewiesen. Für zukünftige in vivo Versuche konnten erste Alginat-Verkapselungen der Zellen durchgeführt werden. Die Aktivierbarkeit des NF-κB abhängigen Promoters wurde ferner durch Ko-Kultivierung mit humanen Plasmaproben und Synovialflüssigkeiten nachgewiesen. Mit diesem generierten Sensor-Effektor-System haben wir selbstregulierende Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anit-inflammatorischen Biologikals entwickelt. KW - cell therapy KW - synthetic biology KW - designer cell KW - suppressor cells KW - closed-loop systems KW - autoimmune disease KW - rheumatoid arthritis KW - gene network KW - adalimumab KW - enbrel KW - etanercept KW - anakinra KW - Biologika KW - Autoaggressionskrankheit KW - Cytokine KW - in vitro Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175381 ER - TY - THES A1 - Werner, Christian T1 - Effect of autoantibodies targeting amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 on synaptic transmission of GABAergic neurons T1 - Einfluss von Autoantikörpern gegen Amphiphysin oder Glutamatdecarboxylase 65 auf synaptische Transmission GABAerger Neurone N2 - The number of newly detected autoantibodies (AB) targeting synaptic proteins in neurological disorders of the central nervous system (CNS) is steadily increasing. Direct interactions of AB with their target antigens have been shown in first studies but the exact pathomecha-nisms for most of the already discovered AB are still unclear. The present study investigates pathophysiological mechanisms of AB-fractions that are associated with the enigmatic CNS disease Stiff person syndrome (SPS) and target the synaptically located proteins amphiphysin or glutamate decarboxylase 65 (GAD65). In the first part of the project, effects of AB to the presynaptic endocytic protein amphiphysin were investigated. Ultrastructural investigations of spinal cord presynaptic boutons in an es-tablished in-vivo passive-transfer model after intrathecal application of human anti-amphiphysin AB showed a defect of endocytosis. This defect was apparent at high synaptic activity and was characterized by reduction of the synaptic vesicle pool, clathrin coated vesi-cles (CCVs), and endosome like structures (ELS) in comparison to controls. Molecular inves-tigation of presynaptic boutons in cultured murine hippocampal neurons with dSTORM microscopy after pretreatment with AB to amphiphysin revealed that marker proteins involved in vesicle exocytosis (synaptobrevin 2 and synaptobrevin 7) had an altered expression in GA-BAergic presynapses. Endophilin, a direct binding partner of amphiphysin also displayed a disturbed expression pattern. Together, these results point towards an anti-amphiphysin AB-induced defective organization in GABAergic synapses and a presumably compensatory rearrangement of proteins responsible for CME. In the second part, functional consequences of SPS patient derived IgG fractions containing AB to GAD65, the rate limiting enzyme for GABA synthesis, were investigated by patch clamp electrophysiology and immunohistology. GABAergic neurotransmission at low and high activity as well as short term plasticity appeared normal but miniature synaptic potentials showed an enhanced frequency with constant amplitudes. SPS patient IgG after preabsorption of GAD65-AB using recombinant GAD65 still showed specific synaptic binding to neu-rons and brain slices supporting the hypothesis that additional, not yet characterized AB are present in patient IgG responsible for the exclusive effect on frequency of miniature potentials. In conclusion, the present thesis uncovered basal pathophysiological mechanisms underlying paraneoplastic SPS induced by AB to amphiphysin leading to disturbed presynaptic architec-ture. In idiopathic SPS, the hypothesis of a direct pathophysiological role of AB to GAD65 was not supported and additional IgG AB are suspected to induce distinct synaptic malfunction. N2 - Die Anzahl neu charakterisierter Autoantikörper (AAK) gegen synaptische Proteine bei Er-krankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist stetig wachsend. Direkte Interaktionen der AAK mit ihren Zielantigenen konnten in ersten Studien belegt werden, jedoch besteht weiterhin Unklarheit über die exakten zugrunde liegenden Pathomechanismen. In der vorliegenden Arbeit wurden pathophysiologische Mechanismen von AAK gegen die synaptisch lokalisierten Proteine Amphiphysin und Glutamatdecarboxylase 65 (GAD65) untersucht, die mit der ZNS Erkrankung Stiff Person Syndrom (SPS) assoziiert sind. Im ersten Projektteil wurden die Effekte von AAK gegen das Endozytoseprotein Amphiphysin analysiert: in einem etablierten in-vivo Tiermodell konnten nach intrathekalem passiven Transfer von AAK gegen Amphiphysin ultrastrukturelle Untersuchungen von präsynaptischen Terminalen im Rückenmark eine Störung der Endozytose aufzeigen. Dieser Defekt, der bei hoher synaptischer Aktivität eintrat, war durch eine Verminderung synaptischen Vesikelpools, Clathrin-ummantelter Vesikel und endosomähnlicher Strukturen charakterisiert. Molekulare Untersuchungen präsynaptischer Terminale kultivierter hippokampaler Zellkulturen mit dSTORM Mikroskopie zeigten, dass an der Exozytose beteiligte synaptische Vesikelproteine (Synaptobrevin 2 und Synaptobrevin 7) ein verändertes Expressionsmuster innerhalb GA-BAerger Synapsen aufweisen. Die Expression von Endophilin, einem direkten Bindungs-partner von Amphiphysin, war ebenso verändert. Zusammengefasst weisen diese Ergebnis-se auf einen Organisationsdefekt GABAerger Synapsen hin, die durch anti-Amphiphysin AAK induziert sind und eine kompensatorische Umverteilung von Endozytoseproteinen vermuten lassen. Im zweiten Teil der Arbeit wurden die funktionellen Effekte von SPS AAK gegen GAD65, dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym der GABA-Synthese, mittels Patch-Clamp Mes-sungen und Immunhistologie untersucht. Die GABAerge synaptische Übertragung bei niedri-ger als auch hoher synaptischer Aktivität sowie die synaptische Kurzzeitplastizität wurden durch die IgG Fraktionen mit GAD65-AAK nicht beeinträchtigt. Die Frequenz von GABAergen Miniaturpotentialen war jedoch bei ansonsten gleichbleibender Amplitude erhöht. SPS-Patienten-IgG zeigte allerdings auch nach Präabsorbtion von GAD65-AAK mit Hilfe von rekombinanten GAD65 eine spezifische Anfärbung neuronaler Synapsen, was die Hypothese von weiteren, funktionell wirksamen, aber noch nicht identifizierten AAK im Patienten-IgG unterstützt. Zusammenfassend konnten in der vorliegenden Arbeit grundlegende pathophysiologische Mechanismen aufgezeigt werden, wie pathogene Antikörper gegen Amphiphysin die Struktur präsynaptischer Boutons beeinträchtigen können. Im Falle des idiopathischen SPS konnte keine unterstützenden Befunde für die Hypothese einer direkten pathophysiologischen Rolle von GAD65 AAK erhoben werden. Nach den vorliegenden Ergebnissen wird das Vorhandensein weiterer, derzeit noch nicht beschriebener IgG AAK postuliert, die die synaptische Fehlfunktion erklären können. KW - Autoaggressionskrankheit KW - Zentralnervensystem KW - Stiff person syndrome KW - autoimmunity KW - glutamate decarboxylase 65 KW - amphiphysin KW - Synapse KW - Glutamat-Decarboxylase KW - Autoimmunität KW - Endocytose Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105648 ER - TY - THES A1 - Dietz, Lena T1 - Die Rolle von NFATc1 und NFATc2 bei der Immunpathogenese von Experimenteller Autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), dem Tiermodell der Multiplen Sklerose T1 - The role of NFTAc1 and NFATc2 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model of multiple sclerosis N2 - Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit, welche durch Infiltration autoreaktiver Immunzellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) gekennzeichnet ist. Hierbei gelten insbesondere Th1- und Th17-Zellen als wichtige Mediatoren der ZNS-Entzündungsreaktion. Beide T-Helfer-Zellarten können durch regulatorische T-Zellen (Tregs) in ihrer Funktion supprimiert werden. NFAT(Nuclear Factors of Activated T cells)-Transkriptionsfaktoren werden nach TCR-Antigen-Stimulation induziert und regeln – als pleiotrope Transkriptionsfaktoren – viele funktionelle Prozesse in T-Zellen. Um die Rolle dieser Faktoren bei der Immunpathogenese von MS zu analysieren, wurden unterschiedliche NFAT-defiziente Mausstämme auf den Krankheitsverlauf des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der einzelne Verlust von NFATc1 und NFATc2 in CD4+ T-Zellen als auch das Fehlen einer spezifischen C-terminalen Proteinmodifikation von NFATc1, die SUMOylierung, sich abmildernd auswirkten. Der verminderte klinische Ausgang der EAE beruhte allerdings je nach knock-out auf unterschiedlichen Mechanismen. Im Fall des T-Zell-spezifischen Verlustes von NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ Mäuse), erwies sich die EAE aufgrund einer stark eingeschränkten Aktivierung und Effektorzellentwicklung von CD4+ T-Zellen als vermindert. Dies konnte durch eine reduzierte Produktion an pathogenen Effektorzytokinen, wie IFNγ, IL-17A, GM-CSF sowie IL-22 und weniger an IL-17A+ IFNγ+ Doppelproduzenten im ZNS gezeigt werden. Der Verlust von NFATc2 resultierte in einer starken Th2-Antwort im ZNS von Nfatc2-/- EAE-Mäusen einhergehend mit protektiven IL-4- und IL-10-Produzenten. Interessanterweise konnten auch mehr nicht-pathogene Th17-Zellen nachgewiesen werden. Nfatc1/CΔSUMO CD4+ T-Zellen sezernierten sowohl nach in vitro als auch nach in vivo Stimulation erhöhte Mengen von IL-2. In vitro Kulturen von Th1- und Th17-Zellen wiesen neben dieser erhöhten IL-2-Sekretion eine verminderte Produktion von IFNγ und IL-17A auf. In Übereinstimmung mit diesen in vitro Befunden zeigte sich auch in der EAE ein reduziertes Krankheitsbild mit weniger Th1- und Th17-Zellen, dafür aber eine IL-2-geförderte Erhöhung der Treg-Population. Anhand der Erkenntnis, dass NFAT-Faktoren die (Auto)-Immunreaktion entscheidend beeinflussen, könnte die Inhibition einzelner NFAT-Faktoren ein neues Ziel für eine MS-Therapie darstellen. N2 - Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory autoimmune disease affecting the central nervous system (CNS). T helper cells, in particular Th1 and Th17 cells, are important mediators of this progress and are antagonized by regulatory T cells (Tregs). Members of the transcription factor family “Nuclear Factors of Activated T cells” (NFAT) are induced in response to TCR stimulation and act as pleiotropic regulators of T cell function. To investigate the role of single NFAT factors in the pathophysiology of MS we used several NFAT deficient mice in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model of the human disease. We could show that not only the deficiency of NFATc1 or NFATc2, but also the absence of the C-terminal (specific) SUMOylation of NFATc1 reduces the clinical severity of EAE. Regardless of a comparable influence on the disease, the reasons are distinct. In case of T cell specific loss of NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ mice) the clinical score was diminished due to impaired effector functions of CD4+ T cells lacking all NFATc1 isoforms. This was demonstrated by lower levels of pathogenic effector cytokines producing CD4+ T cells, such as IFNγ, IL-17A, GM-CSF, IL-22 producers as well as IL-17A+ IFNγ+ double producers in the CNS of Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ mice compared to wild type siblings. Also the course of EAE in Nfatc2-/- mice was found to be ameliorated. The deficiency of NFATc2 resulted in a striking defect of CD4+ T cells in producing IFN-γ, but an enhanced immune responses with Th2-like characteristics. CD4+ T-cells in the ZNS of Nfatc2-/- EAE-diseased mice showed a profound production of protective IL-4 and IL-10 lymphokines. Interestingly, also more non-pathogenic IL-17A producers were found. CD4+ T cells from Nfatc1/CΔSUMO mice produce significantly more IL-2 in vitro and in vivo, whereas cultured Th1 and Th17 cells express less IFNγ and IL-17A, respectively. Consistently, the MOG35-55-induced EAE in Nfatc1/CΔSUMO mice revealed an ameliorated clinical disease severity compared to wild type controls with a robust IL-2-driven increase in Tregs and a reduction in effector T helper cells producing lymphokines. In summary, we could show that individual NFAT factors and their modifications play a distinct role in the pathogenesis of MS. Therefore, targeting or modulating specific NFAT factors could be a therapeutic approach to inhibit undesired NFAT functions in the respective human disease context of MS. KW - Immunologie KW - Autoaggressionskrankheit KW - NFAT in EAE KW - Immunbiologie KW - Transkriptionsfaktor KW - Autoimmunkrankheit Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94569 ER - TY - THES A1 - Sandwick, Sarah T1 - Suppression of Experimental Autoimmune-Encephalomyelitis by Myeloid-Derived Suppressor Cells T1 - Suppression der Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis durch Myeloide Suppressorzellen N2 - Autoimmune diseases, unwanted overshooting immune responses against self antigens, are due to an imbalance in immunity and tolerance. Although negatively impacting cancer prognosis, myeloid derived suppressor cells (MDSC), with their potent suppressive capabilities, might be applicable in a more beneficial light when applied in to autoimmunity. As previous shown MDSC have protective roles in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) (Zhu et al., 2007), the established inducible mouse model for the autoimmune disease multiple sclerosis (MS). This decrease in disease severity indicates in vitro generated immature myeloid cells (IMC) from bone marrow (BM) as precursors of MDSC are promising candidates for cellular therapy. Important to any cellular therapy by adoptive transfer, the major questions regarding IMC efficacy was addressed within the thesis. This thesis attempts to elucidate how IMC operate in EAE. This thesis defines the factors within the autoimmune microenvironment that lead to the activation of MDSC, where IMC home once delivered in vivo, and the protective mechanisms BMIMC employ. To emulate BM cells when they first enter circulation through the blood, IMC were injected intravenously (i.v.). IMC are protective with no regard to the various routes delivered (i.v., i.p.). They protect to a lesser extent when pre-activated before injection. IMC suppress by causing a delay and/or by decreasing the severity of the disease via a mechanism yet determined. To understand the migration pattern of IMC after i.v. injection, in vivo kinetics experiments employing bioluminescence imaging were performed. This techinique allows for whole in vivo mouse imaging daily, allowing the tracking of cell migration over days within a single mouse. During steady-state, BMIMC circulate and appear to accumulate in the spleen by day 4 after injection, whereas they alternatively home to inflammatory sites (immunization site), draining lymph nodes, and the spleen within mice with low grade EAE. Visualization of CMDiI-labelled BMIMC by fluorescence microscopy could locate IMC injected cells outside the white pulp, as they were colocalizing in the regions stained with CD169 or outside, but not within the follicles of spleens on day 4. Consistant with these findings, the attempt to analyze the phenotype of these cells by flow cytometry was problematic as these cells seem to adhere strongly to collagen also indicating the cells are located in the collagenous area of the marginal zone and the red pulp.To determine factors influencing MDSC activation, we utilized different stimuli through a high throughput method detecting release of nitric oxide (NO). Extracts from yeast, fungi, and bacteria were observed to activate MDSC to produce nitric oxide. Surprisingly, material mimicking viral DNA (CpG) and RNA (poly I:C), and several self glycolipids, could not activate the MDSC to produce NO. Upon attempts to understand synergistic effects between microbial pathogens and host cytokines, IFNg was determined to boost the signal of pathogen stimuli, whereas IL17, another cytokine which causes pathology during EAE, and IFNb, a drug used in therapy to treat MS, did not cause any additional effects. Activation of MDSC was determined by the microbial pathogens components LPS, curdlan, and zymosan, to induce upregulation of B7H1 on the cell surface. MDSC did not increase any co-stimulatory markers, such as CD40, CD80, CD86, CD70, or the co-inhibitory marker, PDL2. On day 1 after EAE induction, endogenous MDSC populations when stimulated showed an increase in B7H1 expression and a downregulation of CD80. After further analysis, these cells were concluded to be mostly granulocytic cells (Ly6G+). As the B7H1 ligand PD1 is upregulated in chronic diseases and correlates to an exhausted phenotype, the PD1 : B7H1 interaction was a good candidate for the mechanism our cells may employ for their suppressive capacity. To investigate this interaction, fixed BM-IMC deficient in B7H1 were incubated with restimulated memory T cells. IMC deficient in B7H1 resulted in a significant loss of T cell suppression, as compared to the wildtype control BMIMC. To assess this interaction in vivo, we injected wildtype (WT) and B7H1-/- IMC into mice followed by induction of EAE to assess whether B7H1 mediated this suppression. The lack of B7H1 did not alter their suppressive capacity under these conditions, contrary to other findings which have described this interaction to be important in their suppressive capacity when administered post EAE induction (Ioannou et al., 2012). Interestingly, EAE mice pre-treated with IMC had similar amounts of cytokine production in the CNS after restimulation. Spleens from IMC injected mice had increased amounts of Arg-1 suggesting suppression is via oxidation or recruitment by soluble mediators may lead to this protection. We speculate this may inhibit T cell reactivation in the CNS. N2 - Autoimmunerkrankungen, unerwünschte, überschießende Immunantworten gegen Selbstantigene, resultieren aus einem Ungleichgewicht von Immunität und Toleranz. Obwohl sie einen negativen Einfluss auf Tumorerkrankungen haben, könnten Myeloide Suppressorzellen (MDSC) durch ihre potenten immunsuppressiven Eigenschaften, in einem besseren Licht bei Anwendung gegen Autoimmunerkrankungen erscheinen. Wie zuvor gezeigt, können MDSC eine protektive Rolle bei der Experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) entfalten, dem etablierten induzierbaren Mausmodel für die Autoimmunerkrankung Multiple Sklerose (MS). Die Verminderung der Erkrankungssymptome deutet darauf hin, dass in vitro aus Knochenmark generierte unreife myeloide Zellen (IMC) als Vorläufer von MDSC viel versprechende Kandidaten für eine Zelltherapie darstellen. Da für jede Art der Zelltherapie die Effektivität der transferierten Zellen eine entscheidende Rolle spielt, sollte in dieser Arbeit die Funktionalität von IMC untersucht werden. Diese Dissertation erarbeitet wie IMC bei der EAE funktionieren. Die Arbeit versucht die Faktoren innerhalb der AutoimmunMikroumgebung zu definieren, welche zur MDSC Aktivierung führen, wohin applizierte IMC in vivo wandern und welche protektiven Mechanismen IMC anwenden. Um nachzubilden, wie BM Zellen bei ihrem Eintritt in das Blut sich in der Zirkulation verhalten, wurden IMC intravenös injiziert. Die injizierten gemischten IMC verhielten sich protektiv, unabhängig von der Art der Injektion (iv, ip). Sie sind jedoch weniger protektiv, wenn sie voraktiviert injiziert wurden. IMC supprimieren auf eine Weise, dass sie eine Verzögerung und/oder Verminderung der Erkrankungssymptome bewirken, wobei die dafür zugrunde liegenden Mechanismen noch nicht definiert sind. Um die Wanderungsmuster der BMIMC nach iv Injektion zu verstehen, wurden in vivo Kinetikexperimente mittels der Biolumineszenz-Darstellung durchgeführt. Diese Technik erlaubt eine tägliche Betrachtung der gesamten lebenden Maus, so dass die Zell-Wanderungsmuster über Tage in derselben Maus aufgezeichnet werden können. Unter homöostatischen Bedingungen zirkulieren IMC bis sie nach 4 Tagen in der Milz akkumulieren, wogegen sie alternativ zu Entzündungsherden wandern (Immunisierungssstelle), in Lymphknoten und Milz in Mäusen mit milden EAE Symptomen. Deren Lokalisierung konnte durch Fluoreszenzmikroskopie von CMDiI-markierten IMC in der roten Pulpa der Milz an Tag 4 lokalisiert werden. In Übereinstimmung mit diesem Befund, waren durchflusszytometrische Phänotyp-Analysen problematisch, da die Zellen fest an Kollagenfasern gebunden schienen, was als weiterer Hinweis auf ihre Kollagenbindung dienen kann. Um Faktoren zur Aktivierung zu bestimmen, wurden verschiedene MDSC Stimuli benutzt und deren Freisetzung von Stickstoffmonoxid (NO) mittels einer Hochdurchsatzmethode bestimmt. Es konnte nachgewiesen werden, dass Extrakte aus Hefen, Pilzen und Bakterien MDSC aktivieren und zur NO Produktion führen. Überraschenderweise konnten DNS (CpG) oder RNS-Bestandteile (Poly I:C) mit viralen Charakteristika oder verschiedenen Selbst-Glykolipide keine NO Freisetzung hervorrufen. Darüber hinaus konnte für das Zytokin IFNg eine wichtige verstärkende Rolle gezeigt werden, wobei ein anderes bei der EAE-Pathogenese beteiligte beteiligtes Zytokin, IL17, und auch IFNb, eine Substanz zur Therapie der MS, keinerlei Effekte zeigten. Untersuchungen nach MDSC-Aktivierung mit den mikrobiellen Komponenten LPS, Curdlan und Zymosan zeigten eine Hochregulation des B7H1 Moleküls auf der Zelloberfläche. Andere kostimulatorische Marker, wie CD40, CD80, CD86, CD70 oder der inhibitorische Marker PDL2 nahmen nicht zu. Einen Tag nach EAE-Induktion exprimierten auch die endogene MDSC Populationen nach Stimulation eine erhöhte B7H1 und eine erniedrigte CD80 Expression. Nach weiterer Analyse konnten diese Zellen überwiegend als granulozytär (Ly6G+) eingestuft werden. Da der B7H1-Ligand PD1 bei chronischen Erkrankungen hochreguliert wird, und mit einem verbrauchten Phänotyp korreliert, sollte die PD1:B7H1 Interaktion als guter Kandidat für den Suppressionsmechanismus untersucht werden. Fixierte B7H1-defiziente IMC wurden auf ihre Suppressorfunktion auf Gedächtnis-T-Zellen getestet. B7H1-defiziente IMC zeigten eine signifikant niedrigere Suppression, im Vergleich zu Wildtyp IMC. Um diese Interaktion in vivo zu untersuchen, wurden Wildtyp oder B7H1defiziente IMC in Mäuse injiziert und danach EAE induziert um auch hier eine B7H1-vermittelte Suppression nachzuweisen. Die Abwesenheit von B7H1 veränderte jedoch die suppressiven Eigenschaften unter diesen Bedingungen nicht, im Gegensatz zu anderen beschriebenen Befunden bei denen eine wichtige suppresive Rolle bei Injektion nach EAE-Induktion beschrieben wurde. Interessanterweise zeigten Mäuse, welche mit BMIMC vorbehandelt wurden, eine vergleichbare Zytokinfreisetzung im ZNS nach Restimulation. Milzen zeigten nach IMC Injektion auch erhöhte Mengen Arg-1 könnte dies auf eine Suppression durch oxidative Mediatoren hindeuten. Man kann also annehmen, dass so eine Reaktivierung der T Zellen im ZNS verhindert wird. KW - Encephalomyelitis KW - Autoaggressionskrankheit KW - Suppressorzelle KW - Myeloblast KW - Experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis KW - Myeloide Suppressorzellen KW - myeloid derived suppressor cells KW - experimental autoimmune encephalomyelitis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72690 ER - TY - THES A1 - Strack, Johanna T1 - Morphologische Studie zur altersabhängigen Expression von Autoimmunregulator AIRE im gesunden und entzündlich veränderten Thymus T1 - Morphologic study about the expression of autoimmunregulator AIRE in healthy and inflamed thymus N2 - Die Entdeckung der Autoimmunkrankheit APECED führte zur Entdeckung des verantwortlichen Gens AIRE (autoimmune regulator), das einen Einblick in die Verhinderung oder Entstehung von Autoreaktivität im Thymus bietet. Durch Aktivierung des AIRE-Gens und Expression des AIRE-Proteins werden organspezifische Selbstantigene in medullären Thymusepithelzellen exprimiert und entweder direkt oder nach Transfer auf dendritsche Zellen unreifen T-Zellen präsentiert. Durch Elimination autoreaktiver Zellen entsteht Toleranz gegenüber den körpereigenen Geweben. Da das Immunsystem bei steigendem Alter tiefgreifende Veränderungen erfährt, die zum Teil durch die Thymusinvolution bedingt sind, ist es von Interesse, den Verlauf von AIRE über verschiedene Altersstufen hinweg zu untersuchen. Zielsetzungen dieser Arbeit waren daher die quantitative und räumliche Untersuchung der AIRE+ -Zellen im Alter und im Kontext einer prototypischen organspezifischen Autoimmunerkrankung, der Myasthenia gravis. Diese Fragestellungen wurden bei Normalthymi, entzündlich veränderten Thymi mit assoziierter Myasthenie und an B1-Thymomen untersucht. Als Ergebnis konnte erarbeitet werden, dass der Gehalt an AIRE+ -Zellen mit dem Alter abnimmt, wobei bis in die neunte Lebensdekade noch AIRE+ -Zellen vorhanden waren. Der Gehalt an AIRE+ Zellen stellte sich als stärker mit dem Lebensalter korreliert dar als beispielsweise die Thymusfläche. AIRE scheint damit ein mit der Thymusinvolution eng assoziiertes Gen zu sein. Es fand sich eine hochsignifikante Co-Lokalisation von AIRE+ Zellen und Hassall-Körperchen, die besonders durch die Untersuchungen von Typ B1 Thymomen mit und ohne Hassall-Körperchen bestätigt werden konnte. In Übereinstimmung mit aktuellen Forschungsergebnissen in Mausmodellen fand sich kein Zusammenhang zwischen der Anzahl oder der räumlichen Anordnung regulatorischer T-Zellen und AIRE+ -Zellen. Myoidzellen nahmen mit zunehmendem Alter ebenfalls ab. Ihre Rolle in der Entstehung der Myasthenie ist bei Patienten mit early und late onset wahrscheinlich unterschiedlich; die abnehmende Zahl an Myoidzellen stellt möglicherweise vor allem bei Patienten mit late onset einen Risikofaktor dar. N2 - Research about Autoimmunregulator AIRE, the defective gene in patients with the autoimmune disease APECED, helps us to understand better mechanisms of building up tolerance against peripheral tissue antigens in the thymus. AIRE regulates transcription of peripheral tissue antigens on medullary thymic epithelial cells. It plays either by presentation on the medullary epithelial cells or by cross-presentation through dendritic cells an important role in the induction of central tolerance through negative selection of autoreactive T-cells. As qualitative and quantitative changes in the immune system of the elderly are known it is of interest to look at the expression of AIRE in different ages and in an organotyp autoimmune disease, Myasthenia gravis, which is histologically characterized by inflamed thymus (thymitis). We examined immunohistochemical thymic staininigs of patients from the age of 1 year to the age of 86 years. The histological workup was as followed: The specimens were fixed with 10%buffered, neutral formalin, embedded in paraffin and stained with a Zymed Kit and hemalaun. The monoclonal antibodies used were against AIRE (1:1000), Desmin (1:4000, DAKO), CD 45 RA (1:100, DAKO), FoxP3 (1:50), Donkey anti mouse Cy5 (blau, 1:100, Jackson Immuno research), Donkey anti rabbit Cy3 (rot, 1:100, Jackson Immuno research) Our results are as followed: 1. We found a decrease of AIRE in age with maintenance of singular Aire positive cells even in 90 year old patients. Number of Aire positive cells and age were closely correlated, even more than thymic space and age. 2. Next we found a strong correlation between the expression of AIRE positive cells and Hassal’s corpuscules which was confirmed in a B1 tumor model. In comparison of normal thymic specimens with thymitis, there was a stronger correlation of close expression of AIRE positive cells and Hassal’s corpuscules in normal thymus than in thymitis. 3. There was no correlation of number and close expression of regulatory T cells and AIRE. 4. The number of myoid cells decreased in age. We suppose a different pathogenesis of Myasthenia gravis of early and of late onset. KW - Thymus KW - Autoaggressionskrankheit KW - T-Lymphozyt KW - autoimmunregulator KW - APECED KW - negative selection KW - regulatory T cells Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48017 ER - TY - THES A1 - Schreiber, Peter Werner T1 - Genexpressionsanalyse zur Histogenese epithelialer Thymustumoren am Beispiel des Autoimmun-Regulators AIRE T1 - Gene expression analysis about histogenesis of epithelial thymic tumors in the example of the autoimmune regulator AIRE N2 - Eine grundlegende Aufgabe unseres Immunsystems ist der Schutz unseres Organismus durch die Abwehr von Erregern. Im Zentrum jeder Immunantwort liegt die Unterscheidung zwischen dem „Selbst“ (der Erkennung körpereigener Antigene) und dem „Nicht-Selbst“ (der Erkennung körperfremder Antigene). Ein wichtiger Faktor in der Aufrechterhaltung der zentralen Toleranz ist das AIRE-Protein. In der Thymusmedulla, dem Ort der stärksten AIRE-Expression, erfolgt die sog. negative Selektion der heranreifenden autoreaktiven T-Zellen. Es wird angenommen, dass AIRE durch Regulation der Präsentation von Selbst-Antigenen in mTECs und DCs die Thymozyten auf Autoreaktivität kontrolliert und potentielle Auslöser einer Autoimmunkrankheit eliminiert. Thymome sind epitheliale Tumoren des Thymus, die häufig mit Autoimmunphänomenen, insbesondere paraneoplastischer Myasthenia gravis, einhergehen. Da bei Thymomen meist ein vollständiger Verlust von AIRE sowohl auf Transkriptions- als auch Proteinebene vorliegt, lag es nahe, einen Zusammenhang mit dem Auftreten Thymom-assoziierter Autoimmunerkrankungen zu vermuten. Thymome wurden initial in einer histogenetischen Klassifikation aufgrund morphologischer Kriterien in „medulläre“ und „corticale“ Typen unterteilt. Dieses Konzept sollte in der vorgelegten Arbeit überprüft werden. Durch Kombination verschiedener Gen-Expressions-Datensätze wurden „medulläre Thymusgene“ identifiziert und in 3 Gruppen (Gene ohne Beeinflussung durch AIRE bzw. Gene mit positiver bzw. negativer Regulation durch AIRE) unterteilt. Unter den hier identifizierten, durch AIRE positiv regulierten Genen fanden sich zahlreiche Gene mit potentieller Bedeutung für die Immunregulation bzw. die Entstehung experimenteller und humaner Autoimmunerkrankungen. Eine Analyse verschiedener Thymom-Subtypen ergab weder eine erkennbare „AIRE-Verlust-Signatur“ noch eine medulläre Gensignatur in den „medullären“ Typ A Thymomen. Die erhobenen Befunde wären aber mit einem Stammzellmodell der Thymomentstehung vereinbar, nach dem die unterschiedlichen Thymom-Subtypen aus unterschiedlich determinierten Stamm- oder Progenitorzellen mit verschiedenen Reifungsblockaden hervorgehen könnten. KW - Thymuskrankheit KW - T-Lymphozyt KW - Autoaggressionskrankheit KW - Differentielle Genexpression KW - AIRE KW - Autoimmunregulator KW - AIRE KW - autoimmune regulator Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37463 ER - TY - THES A1 - Seitz, Sabine T1 - Identifikation und Charakterisierung von autoreaktiven humanen T-Zell-Rezeptor Molekülen T1 - Identification and characterisation of autoreactive human T cell receptor molecules N2 - Die Multiple Sklerose und die entzündlichen Muskelerkrankungen Polymyositis und Einschlusskörperchenmyositis sind Autoimmunerkrankungen, in denen T-Lymphozyten in das Gehirn bzw. den Muskel eindringen und dort körpereigenes Gewebe zerstören. Die Pathogenese dieser Krankheiten ist bis jetzt noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die ins Zielgewebe eingedrungenen autoaggressiven T-Lymphozyten aus gefrorenem Biopsiegewebe zu isolieren, ihren ab-T-Zell-Rezeptor zu analysieren und diesen rekombinant zu exprimieren. Folgeversuche mit den TZR-Transfektanten sollten erste Hinweise auf ein mögliches Antigen liefern. Um autoaggressive T-Zellen von irrelevanten zu unterscheiden, konzentrierten wir uns auf Zellen, die zum einen im Zielgewebe klonal expandiert vorlagen, zum anderen einen direkten morphologischen Kontakt mit der Zielzelle aufwiesen. Wir untersuchten das T-Zell-Repertoire verschiedener Patienten auf klonal expandierte Populationen durch CDR3-Spektratyping und isolierten positiv gefärbte Kandidatenzellen durch Lasermikrodissektion aus dem Gewebe. Anschließend wurden die T-Zell-Rezeptoren mit einer speziellen, im Rahmen der Arbeit entwickelten Einzelzell-Muliplex-RT-PCR analysiert. Bisher war es nicht möglich, die a- und b-Kette desselben T-Zell-Rezeptors aus Biopsiematerial zu identifizieren. Dies lag an der geringen Anzahl verfügbarer anti-a-Ketten-Antikörper sowie an der wesentlich höheren Variabilität der a-Ketten-Gene. Aus dem Biopsiegewebe eines Patienten isolierten wir 23 ab-TZR-Pärchen, welche alle die identische expandierte TZR-b-Kette zeigten. 20 der 23 Zellen wiesen eine identische a-Kette auf. Die Dominanz des TZR ist ein Hinweis auf die pathogene Relevanz dieses T-Zell-Klons. Die anderen drei Zellen zeigten drei unterschiedliche funktionelle a-Ketten. Aus der Biopsie eines zweiten Patienten isolierten wir zwei weitere ab-TZR-Pärchen. Die vier Rezeptoren des ersten Patienten wurden in einer T-Zell Hybridom Zellinie exprimiert. Vorläufige Versuche, ein mögliches Antigen zu detektieren, zeigten, dass es sich wahrscheinlich weder um ein muskelspezifisches Antigen noch um ein ubiquitär exprimiertes Selbst-Antigen handelt. Die hier beschriebene Methode der Isolierung und Analyse von autoaggressiven T-Lymphozyten kann man nicht nur zur Untersuchung des TZR-ab-Repertoires von Myositis- oder MS-Patienten einsetzen. Sie ist ebenfalls geeignet, andere Autoimmunerkrankungen sowie Tumor- oder Infektionserkrankungen zu untersuchen. N2 - Multiple sclerosis and the inflammatory muscle diseases polymyositis and inclusion body myositis are autoimmune diseases. T cells invade and destroy brain tissue or muscle fibers, respectively. The pathogenesis of these diseases is still unknown. The aim of this thesis was to isolate tissue invading autoaggressive T-lymphocytes from frozen biopsy specimens, to analyse their T cell receptor a-and b-chains and to express the receptors in a recombinant expression system. This may provide a tool to search for possible antigens. To distinguish pathogenic from irrelevant bystander cells we used two criteria: the clonal expansion in the target tissue triggered by antigen induced proliferation and the direct morphological contact with a target cell. We analysed the T cell repertoire of different patients by CDR3-spectratyping to find clonal expanded populations and isolated immunohistochemically stained candidate cells by laser microdissection. Then we identified coexpressed pairs of a- and b-chains by a newly developed multiplex PCR protocol. The detection of matching a- and b-chains in histological sections has not been achieved until now. The a-chain analysis has been a great problem because of the paucity of available a-chain antibodies and the great variability of the a-chain genes. From the tissue of one patient we isolated 23 ab-T cell receptor pairs which expressed the same expanded T cell receptor b-chain. 20 of these 23 a-chains were identical, suggesting a pathogenic relevance of this T cell clone. The a-chains of the three other T cells were different. We characterized two further clones from another patient. The receptors from the first patient were expressed in a T hybridoma cell line. Initial studies to identify possible antigens revealed that the T cell receptors did not recognize a muscle specific antigen nor a widely expressed self-antigen. This method for the analysis and reconstruction of tissue-infiltrating ab-T cells can be applied to many other autoimmune diseases as well as tumors or infectious diseases. KW - Autoaggressionskrankheit KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - Autoimmunerkrankungen KW - T-Zell-Rezeptor KW - Laser-Mikrodissektion KW - Einzelzell-PCR KW - Antigensuche KW - autoimmune diseases KW - T cell receptor KW - laser microdissection KW - single cell PCR KW - antigensearch Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22511 ER - TY - THES A1 - Hoffacker, Viola Josefa Maria T1 - Abnormes Mikromilieu und gestörte Thymopoese in Thymomen als Grundlage der Autoimmunisierung im peripheren Immunsystem T1 - Abnormal micromilieu factors and altered thymopoiesis inside thymomas are the basis for autoimmune reactions in the periphery N2 - Thymome sind die einzigen Tumoren, die reife T-Zellen aus unreifen Vorläuferzellen generieren, wobei die unreifen Thymozytenpopulationen in Thymomen im Vergleich zum Thymus abnorm vermehrt und die reifen Populationen vermindert sind. Zusätzlich weist das Thymomgewebe im Vergleich zum Thymus weniger B-Zellen und Effektor-T-Zellen auf. Bisher ist unbekannt, welche Faktoren die veränderte intratumoröse Zusammensetzung der Zellpopulationen bedingen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Mikromilieufaktoren in Thymomen mit möglichen Auswirkungen auf die intratumoröse Thymopoese zu identifizieren und deren Einfluß auf das periphere Immunsystem zu untersuchen. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde nach Ursachen für die abnorme Thymozytenreifung und die Generierung autoreaktiver T-Zellen in Thymomen gesucht. Als potentielles Autoantigen, das die positive Selektion in Thymomen beeinflussen könnte, wurde das in Thymomen exprimierte Protein p153 als Neurofilament mittleren Molekulargewichtes (NF-M) identifiziert. Mittels T-Zell-Proliferationstests konnte gezeigt werden, daß intratumoröse T-Zellen von Thymompatienten mit Myasthenia gravis (MG) nach Stimulation mit dem mittleren Fragment dieses Proteins (NF-M-B) signifikant höhere Antworten aufwiesen als Thymozyten von Thymitispatienten oder Thymompatienten ohne MG. NF-M-B-reaktive T-Zellen waren charakteristisch für die paraneoplastische MG, wohingegen T-Zell-Antworten gegen ein Azetylcholinrezeptor (AChR)-Fragment bei allen MG-Patienten (Thymitis und Thymom) erhöht waren. Diese Ergebnisse geben einen Hinweis darauf, daß intratumoröses NF-M eine autoantigene Determinante speziell für die paraneoplastische MG darstellt. Das Mikromilieu von Thymomen wurde außerdem mittels cDNA-Arrays und RT-PCR analysiert. Als differentiell exprimierte Gene sind besonders das "Heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) und der "B-cell growth factor 1" (BCGF 1) hervorzuheben. Die Expression von HB-GAM zeigte sowohl eine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp (kortikal > gemischt / medullär) als auch vom MG-Status der Patienten (MG+ > MG-).Umgekehrt wurde für den Faktor BCGF 1 eine signifikante Erhöhung in Thymomen ohne MG gefunden und keine Abhängigkeit vom histologischen Thymomtyp. Die Expression des Chemokins "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) war ebenfalls mit dem MG (+)-Status von Thymompatienten signifikant assoziiert. Diese Befunde machen eine Beteiligung von HB-GAM, BCGF 1 und I-TAC an der Pathogenese der paraneoplastischen MG wahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Chemokins "Thymus-expressed chemokine" (TECK) weder durch den histologischen Thymomtyp noch durch den MG-Status der Patienten beeinflußt. TECK ist vermutlich auch in Thymomen dafür verantwortlich, daß unreife Thymozyten nicht ins Blut gelangen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von FACS-Analysen und T-Zell-Proliferationsassays der Einfluß von Thymomen auf das periphere Immunsystem untersucht. Es zeigte sich, daß die veränderte Thymopoese und autoreaktive T-Zell-Funktion in Thymomen mit immunologischen Veränderungen im Blut korreliert waren. Der Anteil zirkulierender CD45RA+ CD8+ T-Zellen war bei Thymompatienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, in Übereinstimmung mit einer intratumorösen T-Zell-Reifung, die in Richtung der CD8+-Linie verschoben war. Auf funktioneller Ebene war die intratumorös nachweisbare, thymomtypische T-Zell-Autoreaktivität gegen NF-M-B und alpha-AChR (301-398) gleichermaßen im Thymom und Blut zu finden. Diese funktionellen Studien unterstützen die Hypothese, daß die in Thymomen stattfindende Thymopoese das periphere T-Zell-Repertoire verändert. Hinsichtlich des Importes von T-Zellen aus der Peripherie in das Thymom ergaben die funktionellen Assays dagegen, daß T-Zellen, die auf ein fremdes Antigen (Tetanus Toxoid) reagierten, nur innerhalb zirkulierender T-Zellen, nicht aber innerhalb intratumoröser Thymozyten nachweisbar waren. Ebenso fanden sich erhöhte autoreaktive T-Zell-Antworten gegen andere Fragmente des NF-M-Proteins (NF-M-A und NF-M-C) sowie für ein Fragment der delta-Untereinheit des AChR nur im Blut von Thymompatienten. Diese Befunde sprechen dafür, daß die Migration von Effektor-T-Zellen aus der Peripherie ins Thymom vermindert ist. Während die Mechanismen für diese gestörte T-Zell-Rezirkulation ins Thymom ungeklärt sind, bestand eine Korrelation zwischen der Expression des B-Zell-spezifischen Chemokins BLC (B-Lymphocyte chemoattractant) und der Anzahl der B-Zellen, die immunhistochemisch in den entsprechenden Geweben dargestellt wurden. Dieser Befund kann auf eine Rolle von BLC bei der Migration reifer B-Zellen in Thymus- bzw. Thymomgewebe hinweisen. Zusammenfassend konnten im Rahmen der vorliegenden Arbeit Mikromilieufaktoren benannt werden, die von potentieller pathogenetischer Relevanz für die gestörte, nicht-tolerogene Thymopoese innerhalb von Thymomen sind. Zweitens konnte eindeutig gezeigt werden, daß die intratumoröse Thymopoese das periphere Immunsystem beeinflußt und bei MG-assoziierten Thymomen in Richtung auf ein höheres autoreaktives Potential verändert N2 - Thymomas are the only tumors that generate mature T cells from immature precursors. In particular, the precursor subsets are increased inside thymomas while the mature T-cell subsets are decreased compared with normal thymus. Moreover, the number of B cells and effector T-cells are diminished in thymomas. It is unknown, which kind of intratumorous factors are responsible for the abnormal thymopoiesis and abnormal thymocyte subset composition in these tumors. The aim of this study was therefore to investigate micromilieu factors inside thymomas which have an impact on the abnormal thymopoiesis and on the extrathymic immune system. In the first part of the study, the molecular basis of the abnormal thymopoiesis and the generation of autoreactive T cells inside thymomas were investigated. It was shown, that the previously described thymoma protein p153 and the midsize-neurofilament (NF-M) are the same molecule. This potential autoantigen could have an impact on the generation of autoreactive T cells by influencing the positive selection inside thymomas. Using T-cell proliferation assays, intratumorous T cells showed significantly increased responses to one fragment of this protein (NF-M-B) in thymoma patients with myasthenia gravis (MG), in contrast to MG patients with thymitis or thymoma patients without MG. NF-M-B reactive T cells were characteristic for paraneoplastic MG while anti-AChR responses were increased in MG patients in general. These results offer further evidence that intratumurous NF-M is an autoantigenic determinant in paraneoplastic MG. Further investigations concerning the micromilieu inside thymomas were performed, using cDNA array technology and RT-PCR analysis. Among the differentially expressed genes were "heparin-binding growth-associated molecule" (HB-GAM) and the "B-cell growth factor" (BCGF 1). The expression of HB-GAM depended on the histological thymoma subtype (cortical > mixed/medullar) and on the MG association of the thymomas (MG+ > MG-). By contrast, BCGF 1 was significantly increased in thymomas of patients without MG, irrespective of the histological thymoma subtype. Furthermore, there was a significant association between the expression of the chemokine "Interferon-inducible T cell alpha chemoattractant" (I-TAC) and the occurrence of MG. These results could be a hint at an influence of HB-GAM, BCGF 1 or I-TAC on the pathogenesis of MG. By contrast, expression of the chemokine "thymus-expressed chemokine" (TECK) was normal irrespective of the histological thymoma subtype and the MG association. Therefore, this chemokine probably acts as a "thymocyte retention factor" inside thymomas as previously described for non-neoplastic thymus. In the second part of this work, the impact of thymomas on the peripheral immune system was investigated, using FACS analysis and T-cell proliferation assays. The results showed, that abnormal thympoiesis and autoreactive T-cell function in thymomas correspond with immunologic alterations in the blood. Specifically, the proportion of circulating CD45RA+ CD8+ T cells was significantly increased in patients with thymoma compared with normal controls, in accordance with intratumorous T-cell development that is abnormally skewed toward the CD8+ phenotype. On the functional level, the intratumous thymoma-specific T-cell responses to NF-M-B and alpha-AChR (301-398) were equally distributed between thymomas and blood. These functional studies support the hypothesis that thymopoiesis occurring within thymomas alters the peripheral T-cell repertoire. Concerning T-cell import from the periphery into thymomas, the functional studies demonstrate that T-cell responses to foreign antigen (ie, tetanus toxoid) were seen only among circulating T cells and not among thymoma-derived T cells. Moreover, increased autoreactive T-cell responses towards other fragments of the NF-M protein (NF-M-A, NF-M-C) or toward a fragment of the AChR d-subunit could be detected only in the blood of thymoma patients. These results demonstrate a diminished migration of effector T-cells from the periphery into thymomas. While the mechanisms for this altered T-cell recirculation are still unknown, the results of this study could show a correlation between the expression of the B-cell chemokine "B-lymphocyte chemoattractant" (BLC) and the number of B cells as determined by immunohistochemistry. This is a hint at a role of BLC in the migration of mature B cells into thymus or thymoma tissue. In summary, the present study could identify micromilieu factors with potential relevance for the pathogenesis of the disturbed, non-tolerogenic thympoiesis occurring inside thymomas. Furthermore, it could be shown unequivocally that intratumorous thymopoiesis has an impact on the peripheral immune system of virtually all thymoma patients but contributes to its increased autoreactive potential specifically in thymoma patients with myasthenia gravis. KW - Thymom KW - T-Lymphozyt KW - Reifung KW - Autoaggressionskrankheit KW - Myasthenia gravi KW - Thymom KW - Thymus KW - Myasthenia gravis KW - T-Zell-Reifung KW - Thymopoese KW - Autoimmunerkrankung KW - thymoma KW - thymus KW - myasthenia gravis KW - t-cell maturation KW - thymopoiesis KW - autoimmune disease Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1413 ER -