TY  - THES
A1  - Nordblom, Noah Frieder
T1  - Synthese und Evaluation von Gephyrinsonden für hochauflösende Mikroskopieverfahren
T1  - Synthesis and Evaluation of Super Resolution Compatible Gephyrin Probes
N2  - This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay.
N2  - Neuentwickelte, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind prinzipiell geeignet, molekulare Mechanismen und zelluläre Vorgänge im niedrigen Nanometerbereich aufzulösen. Die maximal erreichbare Auflösung wird unter anderem von der eingesetzten Fluoreszenzmarkierung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich die Synthese neuartiger, funktioneller, fluoreszierender Proben und evaluiere deren Eigenschaft Gephyrin, einen universalen Marker der neuronalen inhibitorischen Postsynapse, zu visualisieren. Hierzu wurden Peptide mittels Festphasenpeptidsyntese hergestellt und mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert, die für hochauflösende Mikroskopieverfahren geeignet sind. Der Syntheseerfolg und die Reinheit der Stoffe wurde mittels massenspektrometrischer und chromatographischer Methoden bestimmt. In einem Hochdurchsatzverfahren wurden die Proben in einem zellulären Kontext untersucht, spezifisch Gephyrin zu markieren. In einem semi-automatisierten, parallelen Verfahren wurden drei ausgewählte Proben synthetisiert und deren Kolokalisation mit dem fluoreszierenden Zielprotein in transfizierten HEK-Zellen untersucht. Aus dieser Arbeit ist NN1DC hervorgegangen, eine peptidische Sonde zur Visualisierung von Gephyrin. Diese Probe weist verbesserte Färbeeigenschaften wie eine höhere Spezifität und Sensitivität, verglichen mit bisher bekannten peptidischen Gephyrinsonden, auf. Darüber hinaus kann NN1DA als hochaffiner Binder von Gephyrin zur Entwicklung neuer gephyrinbindender Moleküle in einem high-througput Verfahren genutzt werden.
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Peptidsynthese
KW  - Gephyrin
KW  - Inhibitorische Synapse
KW  - Fluorescence microscopy
KW  - Solid-phase peptide synthesis
KW  - Affinity probe
KW  - Inhibitory synapse
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302300
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heil, Hannah Sophie
T1  - Sharpening super-resolution by single molecule localization microscopy in front of a tuned mirror
T1  - Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie vor einem abgestimmten Spiegel zur Auflösungsverbesserung
N2  - The „Resolution Revolution" in fluorescence microscopy over the last decade has given rise to a variety of techniques that allow imaging beyond the diffraction limit with a resolution power down into the nanometer range. With this, the field of so-called super-resolution microscopy was born. It allows to visualize cellular architecture at a molecular level and thereby achieve a resolution level that had been previously only accessible by electron microscopy approaches.
One of these promising techniques is single molecule localization microscopy (SMLM) in its most varied forms such as direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) which are based on the temporal separation of the emission of individual fluorophores. Localization analysis of the subsequently taken images of single emitters eventually allows to reconstruct an image containing super-resolution information down to typically 20 nm in a cellular setting. The key point here is the localization precision, which mainly depends on the image contrast generated the by the individual fluorophore’s emission. Thus, measures to enhance the signal intensity or reduce the signal background allow to increase the image resolution achieved by dSTORM. In my thesis, this is achieved by simply adding a reflective metal-dielectric nano-coating to the microscopy coverslip that serves as a tunable nano-mirror.
I have demonstrated that such metal-dielectric coatings provide higher photon yield at lower background and thus substantially improve SMLM performance by a significantly increased localization precision, and thus ultimately higher image resolution. The strength of this approach is that ─ except for the coated cover glass ─ no specialized setup is required. The biocompatible metal-dielectric nano-coatings are fabricated directly on microscopy coverslips and have a simple three-ply design permitting straightforward implementation into a conventional fluorescence microscope. The introduced improved lateral resolution with such mirror-enhanced STORM (meSTORM) not only allows to exceed Widefield and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM performance, but also offers the possibility to measure in a simplified setup as it does not require a special TIRF objective lens.
The resolution improvement achieved with meSTORM is both spectrally and spatially tunable and thus allows for dual-color approaches on the one hand, and selectively highlighting region above the cover glass on the other hand, as demonstrated here.
Beyond lateral resolution enhancement, the clear-cut profile of the highlighted region provides additional access to the axial dimension. As shown in my thesis, this allows for example to assess the three-dimensional architecture of the intracellular microtubule network by translating the local localization uncertainty to a relative axial position. Even beyond meSTORM, a wide range of membrane or surface imaging applications may benefit from the selective highlighting and fluorescence enhancing provided by the metal-dielectric nano-coatings. This includes for example, among others, live-cell Fluorescence Correlation Spectroscopy and Fluorescence Resonance Energy Transfer studies as recently demonstrated.
N2  - Die „Auflösungsrevolution" in der Fluoreszenzmikroskopie hat während des letzten Jahrzehnts eine Vielzahl von Techniken hervorgebracht, die es ermöglichen, das Beugungslimit zu überschreiten und eine Bildauflösung bis in den Nanometerbereich zu erreichen. Die Entwicklung der sogenannten superhochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es die zelluläre Architektur auf molekularer Ebene zu visualisieren und erreicht damit ein Auflösungsvermögen, wie es bisher nur mit elektronenmikroskopischen Ansätzen möglich war.
Der Begriff Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie fasst zum Beispiel eine Vielzahl der unterschiedlichsten Ansätze zusammen. Wie zum Beispiel auch die direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) basieren diese auf der zeitlichen Trennung der Emission einzelner Fluorophore. Die Lokalisierungsanalyse der so aufgenommenen Bilder von einzelnen Emittern ermöglicht schließlich die Rekonstruktion eines superhochaufgelösten Bildes, das eine Auflösung von typischerweise 20 nm in einer zellularen Umgebung erreicht. Der entscheidende Punkt ist hierbei die Lokalisierungsgenauigkeit, die hauptsächlich vom Bildkontrast abhängt. Eine Erhöhung der Signalintensität oder Reduzierung des Signalhintergrunds ermöglichen es daher, die mit dSTORM erzielte Bildauflösung zu erhöhen. In meiner Dissertation wird dies durch eine einfache reflektierende metalldielektrische Nanobeschichtung auf dem Mikroskop-Deckglas erreicht, das so als abstimmbarer Nanospiegel dient.
Ich zeige in dieser Arbeit, dass solche metalldielektrischen Beschichtungen eine höhere Photonenausbeute bei niedrigerem Hintergrund liefern und somit die SMLM-Leistung durch eine signifikant erhöhte Lokalisierungsgenauigkeit und damit letztendlich einer höheren Bildauflösung wesentlich verbessern. Die Stärke dieses Ansatzes besteht darin, dass mit Ausnahme des beschichteten Deckglases keine spezielle Anpassung des experimentellen Aufbaus erforderlich ist. Die biokompatiblen metallisch-dielektrischen Nanobeschichtungen mit einem einfachen dreischichtigen Design werden direkt auf Mikroskop-Deckgläsern hergestellt, was eine direkte Implementierung in ein herkömmliches Fluoreszenzmikroskop ermöglicht. Die mit diesem spiegelverstärkten STORM (meSTORM) eingeführte verbesserte laterale Auflösung ermöglicht es nicht nur, die Bildauflösung von Weitfeld und Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) dSTORM zu übertreffen, sondern bietet auch die Möglichkeit, in einem vereinfachten Aufbau zu messen, da kein spezielles TIRF-Objektiv erforderlich ist. Die mit meSTORM erzielte Auflösungsverbesserung ist sowohl spektral als auch räumlich abstimmbar und ermöglicht so einerseits zweifarbige Bildgebung und andererseits eine gezielte Hervorhebung eines bestimmten Bereichs über dem Deckglas.
Über die Verbesserung der lateralen Auflösung hinaus bietet das klare Profil des Verstärkungseffekts zusätzliche Information über die axiale Position. Wie in meiner Dissertation gezeigt, kann damit beispielsweise die dreidimensionale Architektur des intrazellulären Mikrotubuli-Netzwerks aufgelöst werden, indem die lokale Lokalisierungsunsicherheit in eine relative axiale Position übersetzt wird. Über meSTORM hinaus kann die selektive Hervorhebung und Fluoreszenzverstärkung durch die metalldielektrischen Nanobeschichtungen für eine Vielzahl von Membran- oder Oberflächenabbildungsanwendungen von Vorteil sein. Dies umfasst unter anderem Anwendungen wie die Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie in lebenden Zellen und Fluoreszenzresonanz-energietransfer, wie bereits kürzlich gezeigt wurde.
KW  - Fluoreszenz
KW  - Einzelmolekülmikroskopie
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Nanofabrikation
KW  - Nanofabrication
KW  - Super-resolution microsopy
KW  - Superhochauflösende Mikroskopie
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204329
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmithausen, Patrick Alexander Gerhard
T1  - Three-dimensional fluorescence image analysis of megakaryocytes and vascular structures in intact bone
T1  - Dreidimensionale Fluoreszenzbildanalyse von Megakaryozyten und Gefäßstrukturen in intaktem Knochen
N2  - The thesis provides insights in reconstruction and analysis pipelines for processing of
three-dimensional cell and vessel images of megakaryopoiesis in intact murine bone.
The images were captured in a Light Sheet Fluorescence Microscope. The work
presented here is part of Collaborative Research Centre (CRC) 688 (project B07) of
the University of Würzburg, performed at the Rudolf-Virchow Center. Despite ongoing
research within the field of megakaryopoiesis, its spatio-temporal pattern of
megakaryopoiesis is largely unknown. Deeper insight to this field is highly desirable to
promote development of new therapeutic strategies for conditions related to
thrombocytopathy as well as thrombocytopenia. The current concept of
megakaryopoiesis is largely based on data from cryosectioning or in vitro studies
indicating the existence of spatial niches within the bone marrow where specific stages
of megakaryopoiesis take place. Since classic imaging of bone sections is typically
limited to selective two-dimensional views and prone to cutting artefacts, imaging of
intact murine bone is highly desired. However, this has its own challenges to meet,
particularly in image reconstruction. Here, I worked on processing pipelines to account
for irregular specimen staining or attenuation as well as the extreme heterogeneity of
megakaryocyte morphology. Specific challenges for imaging and image reconstruction
are tackled and solution strategies as well as remaining limitations are presented and
discussed. Fortunately, modern image processing and segmentation strongly benefits
from continuous advances in hardware as well as software-development. This thesis
exemplifies how a combined effort in biomedicine, computer vision, data processing
and image technology leads to deeper understanding of megakaryopoiesis. Tailored
imaging pipelines significantly helped elucidating that the large megakaryocytes are
broadly distributed throughout the bone marrow facing a surprisingly dense vessel
network. No evidence was found for spatial niches in the bone marrow, eventually
resulting in a revised model of megakaryopoiesis.
N2  - Im Rahmen dieses Dissertationsvorhabens wurden Segmentierungs- und
Auswertepipelines dreidimensionaler Bilder von Zellen und Gefäßen im intakten
Mausknochen erarbeitet. Die Bilder entstanden durch Fluoreszenzaufnahmen eines
Lichtblattmikroskops. Das Dissertationsvorhaben war Teil des
Sonderforschungsbereichs 688 (Teilprojekts B07) der Universität Würzburg und es
wurde am Rudolf-Virchow-Zentrum durchgeführt. Trotz einer Vielzahl aktueller
Forschungsprojekte auf dem Gebiet der Megakaryopoese sind Erkenntnisse über
deren räumlich-zeitliche Zusammenhänge größtenteils unbekannt. Neuere
wissenschaftliche Erkenntnisse auf diesem Gebiet wären insbesondere hilfreich für die
Weiterentwicklung von Behandlungsstrategien für Patienten, die an
Thrombozytopenien oder Thrombozytopathien leiden. Das aktuell vorherrschende
Modell zur Erklärung der Megakaryopoese geht von der Existenz räumlicher Nischen
im Knochenmark aus, in denen sich die einzelnen Schritte der Megakaryopoese
vollziehen. Dieses Modell basiert hauptsächlich auf Auswertungen von
Gefrierschnitten sowie in-vitro Experimenten. Da die klassische Bildgebung von
Knochenschnitten nur auf eine bestimmte Anzahl zweidimensionaler Schnitte begrenzt
ist und deren Qualität unter Schnittartefakten leidet, ist die Bildgebung des intakten
Knochens von besonderem Interesse. Dennoch führt dies zu neuen
Herausforderungen im Bereich der Bilddatenauswertung. Im vorliegenden
Dissertationsvorhaben beschäftige ich mich in diesem Bereich mit der Erarbeitung von
Auswerteprotokollen, welche beispielsweise den Einfluss unregelmäßiger Färbungen
oder Signalabschwächungen sowie die extreme Heterogenität der
Megakaryozytenmorphologie berücksichtigen. Spezifische Herausforderungen für die
Bildgebung und Bildrekonstruktion werden in Angriff genommen und
Lösungsstrategien sowie verbleibende Einschränkungen werden vorgestellt und
diskutiert. Erfreulicherweise profitieren insbesondere die moderne Bildbearbeitung
sowie die Objekterkennung in großem Ausmaß von fortlaufenden Entwicklungen aus
dem Hard- sowie Softwarebereich. Dieses Dissertationsvorhaben zeigt auf
exemplarische Art und Weise auf, wie gemeinsame Forschungsanstrengungen im
Bereich der Biomedizin, des Maschinellen Sehens, der Datenverarbeitung sowie der
Bildtechnologie zu einem tieferen Verständnis der Megakaryopoese führen. Die
maßgeschneiderten Pipelines zur Bilddatenauswertung stützten letztlich die These,
dass größere Megakaryozyten im Knochenmark breit verteilt sind und von einem überraschend dichten Gefäßnetz umgeben sind. Beweise für die Existenz räumlicher
Nischen im Knochenmark konnten nicht gefunden warden. Dieses führte schließlich
zur Vorstellung eines überarbeiteten Modells der Megakaryopoese.
KW  - Megakaryozytopoese
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Megakaryozyt
KW  - Lichtscheibenmikroskopie
KW  - Bildverarbeitung
KW  - lightsheet microscopy
KW  - megakaryopoiesis
KW  - fluorescence microscopy
KW  - intact bone imaging
KW  - object segmentation
KW  - Lichtblattmikroskopie
KW  - Bildbearbeitung
KW  - Megakaryopoese
KW  - Bildgebung intakten Knochens
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178541
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schreiber, Benjamin
T1  - Selective and enhanced fluorescence by biocompatible nanocoatings to monitor G-protein-coupled receptor dynamics
T1  - Selektive und verstärkte Fluoreszenz durch biokompatible Nanobeschichtungen zur Untersuchung von G-protein-gekoppelten Rezeptoren und ihrer Dynamik
N2  - Fluorescence microscopy has become one of the most important techniques for the imaging of biological cells and tissue, since the technique allows for selective labeling with fluorescent molecules and is highly suitable for low-light applications down to the single molecule regime. The methodological requirements are well-defined for studying membrane receptors within a highly localized nanometer-thin membrane. For example, G-protein-coupled receptors (GPCRs) are an extensively studied class of membrane receptors that represent one of the most important pharmaceutical targets. Ligand binding and GPCR activation dynamics are suspected to take place at the millisecond scale and may even be far faster. Thus, techniques that are fast, selective, and live-cell compatible are required to monitor GPCR dynamics. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) and total internal reflection fluorescence microscopy (TIRF-M) are methods of choice to monitor the dynamics of GPCRs selectively within the cell membrane. 
Despite the remarkable success of these modalities, there are limitations. Most importantly, inhomogeneous illumination can induce imaging artifacts, rendering spectroscopic evaluation difficult. Background signal due to scattering processes or imperfect labeling can hamper the signal-to-noise, thus limiting image contrast and acquisition speed. Careful consideration of the internal physiology is required for FRET sensor design, so that ligand binding and cell compatibility are well-preserved despite the fluorescence labeling procedures. This limitation of labeling positions leads to very low signal changes in FRET-based GPCR analysis. In addition, microscopy of these systems becomes even more challenging in single molecule or low-light applications where the accuracy and temporal resolution may become dramatically low. Fluorescent labels should therefore be brighter, protected from photobleaching, and as small as possible to avoid interference with the binding kinetics. The development of new fluorescent molecules and labeling methods is an ongoing process. However, a complete characterization of new labels and sensors takes time. So far, the perfect dye system for GPCR studies has not been found, even though there is high demand. 
Thus, this thesis explores and applies a different approach based on improved illumination schemes for TIRF-M as well as metal-coated coverslips to enhance fluorescence and FRET efficiency. First, it is demonstrated that a 360° illumination scheme reduces typical TIRF artifacts and produces a much more homogenously illuminated field of view. Second, membrane imaging and FRET spectroscopy are improved by metal coatings that are used to modulate the fluorescent properties of common fluorescent dyes. Computer simulation methods are used to understand the underlying photophysics and to design the coatings. Third, this thesis explores the operational regime and limitations of plasmonic approaches with high sectioning capabilities. The findings are summarized by three publications that are presented in the results section of this work. In addition, the theory of fluorescence and FRET is explained, with particular attention to its emission modulations in the vicinity of metal-dielectric layers. Details of the instrumentation, computer simulations, and cell culture are described in the method section. The work concludes with a discussion of the findings within the framework of recent technological developments as well as perspectives and suggestions for future approaches complete the presented work.
N2  - Die Fluoreszenzmikroskopie ist zu einer der wichtigsten Techniken für die Bildgebung biologischer Zellen und Gewebe geworden, da die Technik eine selektive Markierung mit fluoreszierenden Molekülen ermöglicht und sich hervorragend für Anwendungen bei schwachem Licht bis hin zum Einzelmolekül-Regime eignet. Die methodischen Anforderungen sind gut definiert, um Membranrezeptoren innerhalb einer stark lokalisierten nanometerdünnen Membran zu untersuchen. Zum Beispiel sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) eine ausführlich untersuchte Klasse von Membranrezeptoren, weil diese wichtige pharmazeutische Ziele darstellen. Es wird vermutet, dass die Ligandenbindungs- und GPCR-Aktivierungsdynamiken im Millisekundenbereich stattfinden und sogar viel schneller sein können. Daher sind Techniken erforderlich, die schnell, selektiv und lebend-Zell kompatibel sind, um die GPCR-Dynamik zu aufzunehmen. Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) und internale Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRF-M) sind Methoden der Wahl, um die Dynamik von GPCRs selektiv innerhalb der Zellmembran zu untersuchen.
Trotz des bemerkenswerten Erfolgs dieser Modalitäten gibt es Einschränkungen. Am wichtigsten ist, dass eine inhomogene Beleuchtung Artefakte erzeugen kann, welche die spektroskopische Auswertung erschweren. Hintergrundsignale aufgrund von Streuprozessen oder unvollständiger Markierung können das Signal-Rausch-Verhältnis beeinträchtigen und somit den Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit begrenzen. Eine sorgfältige Berücksichtigung der internen Physiologie ist für das Design der FRET-Sensoren ist erforderlich, so dass die Ligandenbindung und die Zellkompatibilität trotz der Fluoreszenzmarkierungsverfahren nicht gestört werden. Diese Einschränkung der Markierungspositionen führt zu sehr geringen Signalkontrast in der FRET-basierten GPCR-Analyse. Darüber hinaus wird die Mikroskopie dieser Systeme bei Einzelmolekül- oder Schwachlichtanwendungen, bei denen die Genauigkeit und die zeitliche Auflösung dramatisch niedrig werden können, noch schwieriger. Fluoreszierende Marker sollten daher heller, vor Photobleichung geschützt und so klein wie möglich sein, um Störungen mit der Rezeptorkinetik zu vermeiden. Die Entwicklung neuer fluoreszierender Moleküle und Markierungsmethoden ist ein fortlaufender Prozess. Eine vollständige Charakterisierung neuer Marker und Sensoren benötigt jedoch Zeit. Bis jetzt wurde das perfekte Farbstoffsystem für GPCR-Studien noch nicht gefunden, auch wenn es eine hohe Nachfrage dafür gibt.
Daher wird ein anderer Ansatz auf der Grundlage verbesserter Beleuchtungsschemata für TIRF-M sowie metallbeschichtete Deckgläser zur Verbesserung der Fluoreszenz- und FRET-Effizienz untersucht. Zunächst wird gezeigt, dass ein 360 ° Beleuchtung typische TIRF-Artefakte reduziert und ein wesentlich homogeneres Bildausleuchtung erzeugt. Zweitens wurde durch die Modulation der Fluoreszenzeigenschaften gängiger Fluoreszenzfarbstoffe die Membranbildgebung und FRET-Spektroskopie verbessert. Computersimulationsmethoden werden verwendet, um die zugrundeliegende Photophysik zu verstehen und zielgerichtet Beschichtungen zu entwerfen. Drittens wurden das operationelle Regime und die Grenzen von plasmonischen Ansätzen mit noch höheren Signalselektiverung untersucht. Die Ergebnisse sind in drei Publikationen zusammengefasst, die im Ergebnisteil dieser Arbeit vorgestellt werden. Darüber hinaus wird die Theorie der Fluoreszenz und des FRET unter besonderer Berücksichtigung ihrer Emissionsmodulationen in der Nähe von Metall-Dielektrikum-Schichten erläutert. Details der Instrumentierung, Computersimulationen und Zellkultur werden im Abschnitt Methoden beschrieben. Die Arbeit schließt mit einer Diskussion der Ergebnisse im Rahmen der jüngsten technologischen Entwicklungen sowie mit Perspektiven und Vorschlägen für zukünftige Ansätze, die die vorliegende Arbeit abrunden.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Fluorescence
KW  - Microscopy
KW  - Plasmonic
KW  - Fluorescence Resonance Energy Transfer
KW  - G Protein-Coupled Receptors
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Fluorescence Microscopy
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173923
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