TY - JOUR A1 - Nietzer, Sarah A1 - Baur, Florentin A1 - Sieber, Stefan A1 - Hansmann, Jan A1 - Schwarz, Thomas A1 - Stoffer, Carolin A1 - Häfner, Heide A1 - Gasser, Martin A1 - Waaga-Gasser, Ana Maria A1 - Walles, Heike A1 - Dandekar, Gudrun T1 - Mimicking metastases including tumor stroma: a new technique to generate a three-dimensional colorectal cancer model based on a biological decellularized intestinal scaffold JF - Tissue Engineering Part C-Methods N2 - Tumor models based on cancer cell lines cultured two-dimensionally (2D) on plastic lack histological complexity and functionality compared to the native microenvironment. Xenogenic mouse tumor models display higher complexity but often do not predict human drug responses accurately due to species-specific differences. We present here a three-dimensional (3D) in vitro colon cancer model based on a biological scaffold derived from decellularized porcine jejunum (small intestine submucosa+mucosa, SISmuc). Two different cell lines were used in monoculture or in coculture with primary fibroblasts. After 14 days of culture, we demonstrated a close contact of human Caco2 colon cancer cells with the preserved basement membrane on an ultrastructural level as well as morphological characteristics of a well-differentiated epithelium. To generate a tissue-engineered tumor model, we chose human SW480 colon cancer cells, a reportedly malignant cell line. Malignant characteristics were confirmed in 2D cell culture: SW480 cells showed higher vimentin and lower E-cadherin expression than Caco2 cells. In contrast to Caco2, SW480 cells displayed cancerous characteristics such as delocalized E-cadherin and nuclear location of beta-catenin in a subset of cells. One central drawback of 2D cultures-especially in consideration of drug testing-is their artificially high proliferation. In our 3D tissue-engineered tumor model, both cell lines showed decreased numbers of proliferating cells, thus correlating more precisely with observations of primary colon cancer in all stages (UICC I-IV). Moreover, vimentin decreased in SW480 colon cancer cells, indicating a mesenchymal to epithelial transition process, attributed to metastasis formation. Only SW480 cells cocultured with fibroblasts induced the formation of tumor-like aggregates surrounded by fibroblasts, whereas in Caco2 cocultures, a separate Caco2 cell layer was formed separated from the fibroblast compartment beneath. To foster tissue generation, a bioreactor was constructed for dynamic culture approaches. This induced a close tissue-like association of cultured tumor cells with fibroblasts reflecting tumor biopsies. Therapy with 5-fluorouracil (5-FU) was effective only in 3D coculture. In conclusion, our 3D tumor model reflects human tissue-related tumor characteristics, including lower tumor cell proliferation. It is now available for drug testing in metastatic context-especially for substances targeting tumor-stroma interactions. KW - Multicenter randomized-trial KW - Carcinoma cells KW - Tissue KW - Fluorouracil KW - Matrix KW - 1st-line treatment KW - Beta-catenin KW - Invasion KW - 5-Fluorouracil KW - Fibroblasts Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188202 VL - 22 IS - 7 ER - TY - THES A1 - Schulze, Markus T1 - Role of Chronophin for glioma cell migration and invasion T1 - Die Rolle von Chronophin für die Migration und Invasion von Gliomzellen N2 - Abstract Glioblastomas, primary brain tumors, represent a tumor entity with a dismal prognosis and a median survival of only about one year. Invasion into the healthy brain parenchyma contributes substantially to the malignancy of this type of brain tumor. Therefore, a better understanding of the mechanisms promoting the invasive behavior of these brain tumors is needed to identify new therapeutic targets. Cofilin, an actin regulatory protein, has been shown to be an important regulator of the invasive behavior of tumor cells in other types of cancer and the actin cytoskeleton is involved in the formation of a variety of cellular structures important for cell migration and invasion. Cofilin is regulated by phosphorylation on a single residue, serine 3. The aim of this thesis was to examine the role of the cofilin regulatory phosphatase chronophin for glioma cell migration and invasion. First, it was established that chronophin depletion in the cell line GBM6840 leads to an increase in the ratio of phosphorylated cofilin to total cofilin. Higher chronophin levels were correlated with a decrease in F-actin in the cell lines GBM6840 and U87 as measured in an actin spin down assay and in a flow cytometry based assay. Furthermore, it was shown that knockdown of chronophin in two different cell lines, GBM6840 and DBTRG-05-MG, strongly increased their invasiveness in vitro. Expression of human chronophin in the cell line U87 decreased its invasiveness substantially. There was no difference in cell proliferation between GBM6840 and DBTRG-05-MG cells expressing a chronophin targeting shRNA or a control shRNA and U87 cells transfected with an empty vector or a human chronophin encoding plasmid. The increase in invasiveness after chronophin depletion could be correlated with an increase in directionality in cell migration under 2D culture conditions in the cell lines U87 and GBM6840. Moreover, treatment with the ROCK inhibitor Y-27632 decreased directionality in GBM6840 cells under 2D culture conditions and reduced the invasiveness of GBM6840 chronophin shRNA cells back to control levels. Expression of a non-phosphorylatable cofilin mutant, the S3A mutant, was able to reduce invasiveness and to reduce directionality under 2D culture conditions back to control levels in GBM6840 chronophin shRNA cells. This provides important evidence for the involvement of cofilin phosphoregulation in the phenotypes described above. In vivo, when injected into NOD-SCID mice, chronophin depleted cells showed a dramatic growth reduction as compared to control and rescue cells. Transciptomic characterization of GBM6840 cells by microarray analysis and subsequent comparison of the data with microarray profiles of normal brain tissues and different glioma entities identified two specifically chronophin regulated transcripts potentially involved in tumor progression and invasion, MXI1 and EDIL3. Moreover, c-myc was identified as a significantly altered transcription factor after chronophin deregulation based on the number of c-myc target molecules in the microarray dataset. MXI1 is a potential negative regulator of c-myc dependent transcription, and was strongly downregulated after chronophin knockdown in GBM6840. In line with this, the activity of a c-myc reporter plasmid was increased after chronophin depletion in GBM6840 and reduced after chronophin expression in U87 cells. However, the protein level of the c-myc protein was reduced after chronophin depletion in GBM6840. Finally, anaylsis of the expression of proteases known to be important for glioblastoma pathogenesis revealed no major changes in protease expression between chronophin depleted and control cells. Therefore, a comprehensive analysis of chronophin in the context of glioma pathogenesis has been performed in this thesis. It has been shown that chronophin depletion strongly enhanced invasiveness of glioma cells and that it induced transcriptomic changes potentially involved in tumor progression. The proteins regulating cofilin phosphorylation are therefore valuable therapeutic targets for anti-invasive therapy in glioblastomas. Inhibitors for kinases upstream of cofilin, e.g. LIMKs and ROCKs, are available, and might be promising agents for anti-invasive therapy. N2 - Zusammenfassung Glioblastome sind primäre Gehirntumore, die eine besonders schlechte Prognose besitzen und bei denen die mediane Überlebenszeit nur ca. ein Jahr beträgt. Zur Malignität dieses Tumortyps trägt entscheidend das Eindringen der Tumorzellen in das gesunde Hirnparenchym bei. Daher ist es notwendig die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, um neue therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren. Cofilin, ein Protein das das Aktinzytoskellet reguliert, ist in anderen Krebsarten als wichtiger Regulator des invasiven Verhaltens von Zellen bekannt und das Aktinzytoskellet ist an der Bildung einer Vielzahl von zellulären Strukturen beteiligt, die wichtig für die Zellmigration und –invasion sind. Cofilin wird über die Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure, des Serin 3, reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Cofilin regulatorischen Phosphatase Chronophin für Zellmigration und -invasion zu untersuchen. Zuerst konnte gezeigt werden, dass eine Chronophin Depletion in der Zelllinie GBM6840 zu einer Zunahme des Anteils von P-Cofilin am Gesamtcofilin führt. Ebenso war ein hohes Chronophin Level in den Zelllinien GBM6840 und U87 mit einer Abnahme des F-Actin Levels korreliert, was in einem Aktin spin down Assay als auch mittels Durchflusszytrometrie gemessen werden konnte. Es konnte weiter gezeigt werden, dass eine shRNA vermittelte Depletion des Chronphin zu einer starken Zunahme der Invasivität in den Zelllinien GBM6840 und DBTRG-05-MG in vitro führt. Chronophin Expression in der Zelllinie U87 führte zu einer starken Abnahme der Invasivität. Es gab hingegen keinen Chronophin abhängigen Unterschied in der Proliferation von GBM6840 und DBTRG-05-MG Zellen, die entweder eine Kontroll- oder eine Chronophin gerichtete shRNA exprimierten, sowie keinen zwischen U87 Zellen, die mit einem Leervektor oder einem Chronophin codierenden Konstrukt transfiziert worden waren. Die Zunahme der Invasion nach Chronophin Depletion konnte mit einer Zunahme der Direktionalität der Zellen bei der Migration in einer 2D Umgebung korreliert werden. Desweiteren konnte durch Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in GBM6840 Zellen eine Erniedrigung der Direktionalität bei der Migration in 2D Kultur ebenso erreicht werden, wie eine Reduktion der Invasivität von Chronophin shRNA exprimierenden GBM6840 Zellen auf Kontrollniveau. Die Expression einer nicht-phosphorylierbaren Cofilin Mutante, der S3A Mutante, erniedrigte sowohl die Direktionalität in der 2D Migration als auch die Invasivität von GBM6840 Chronophin shRNA exprimierenden Zellen zurück auf Kontrollniveau. Diese Experimente lieferten wichtige Hinweise darauf, dass die Phosphoregulation von Cofilin ursächlich an der Entstehung der Phänotypen beteiligt war, die nach Chronophin Knockdown beobachtet wurden. In vivo konnte nach Injektion in NOD-SCID Mäuse eine dramatische Wachstumsreduktion der Chronophin depletierten Zellen gemessen werden. Durch Charakterisierung des Transkriptoms der Zelllinie GBM6840 mittels Microarrays und nachfolgender Vergleich der Ergebnisse mit Microarray-Profilen von Normalhirngewebe und verschiedenen Gliomentitäten konnten zwei spezifisch Chronophin abhängig regulierte Transkripte identifiziert werden, MXI1 und EDIL3, die potentiell mit der Progression und Invasivität von Gliomen verknüpft sind. MXI1, ein potentieller negativer Regulator der c-myc abhängigen Transkription, war nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 stark herunterreguliert. In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Aktiviät eines c-myc Reporterplasmids nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 erhöht, nach Chronophin Expression in U87 jedoch erniedrigt. Das c-myc Protein selbst wies eine deutliche Reduktion nach Chronophin Depletion in GBM6840 auf. Abschließend wurde die Expression von Proteasen untersucht, für die eine Rolle in der Gliominvasion bekannt ist. Hier wurden jedoch keine größeren Chronophin abhängigen Expressionsunterschiede gefunden. Zusammenfassend gesagt konnte eine umfassende Charakterisierung der Rolle des Chronophin in der Gliompathogenese erreicht werden. Zum einen konnte gezeigt werden, dass Chronophin ein äußerst wichtiger Regulator der Invasion ist, zum anderen dass es zu Chronophin abhängigen transkriptomischen Veränderungen kommt, die potentiell zur Malignisierung des Tumors beitragen. Daher sind die Proteine die die Cofilinphosphorylierung regulieren potentielle therapeutische Zielmoleküle für eine anti-invasive Therapie im Glioblastom. Inhibitoren für die Kinasen, die Regulatoren des Cofilin sind, die ROCK- und LIM-Kinasen, sind verfügbar und stellen möglicherweise vielversprechende Substanzen für die anti-invasive Therapie dar. KW - Zellmigration KW - Chronophin KW - Invasion KW - Glioblastom KW - Gliom KW - PDXP KW - Glioma KW - Glioblastoma KW - Invasion KW - Migration Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109292 ER - TY - JOUR A1 - Rudel, Thomas A1 - Mehlitz, Adrian T1 - Modulation of host signaling and cellular responses by Chlamydia JF - Cell Communication and Signaling N2 - Modulation of host cell signaling and cellular functions is key to intracellular survival of pathogenic bacteria. Intracellular growth has several advantages e.g. escape from the humoral immune response and access to a stable nutrient rich environment. Growth in such a preferred niche comes at the price of an ongoing competition between the bacteria and the host as well as other microbes that compete for the very same host resources. This requires specialization and constant evolution of dedicated systems for adhesion, invasion and accommodation. Interestingly, obligate intracellular bacteria of the order Chlamydiales have evolved an impressive degree of control over several important host cell functions. In this review we summarize how Chlamydia controls its host cell with a special focus on signal transduction and cellular modulation. KW - Chlamydia KW - Invasion KW - Inclusion KW - Type III secretion KW - Tarp KW - Inc KW - Signaling KW - Trafficking Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97225 UR - http://www.biosignaling.com/content/11/1/90 ER - TY - THES A1 - Alexander, Stephanie T1 - Collective cancer cell invasion \(in\) \(vivo\): function of β1 and β3 integrins in perivascular invasion and resistance to therapy T1 - Kollektive Tumorzellinvasion \(in\) \(vivo\): Funktion von β1 und β3 Integrinen in perivaskulärer Invasion und Therapieresistenz N2 - Pro-migratory signals mediated by the tumor microenvironment contribute to the cancer progression cascade, including invasion, metastasis and resistance to therapy. Derived from in vitro studies, isolated molecular steps of cancer invasion programs have been identified but their integration into the tumor microenvironment and suitability as molecular targets remain elusive. The purpose of the study was to visualize central aspects of tumor progression, including proliferation, survival and invasion by real-time intravital microscopy. The specific aims were to monitor the kinetics, mode, adhesion and chemoattraction mechanisms of tumor cell invasion, the involved guidance structures, and the response of invasion zones to anti-cancer therapy. To reach deeper tumor regions by optical imaging with subcellular resolution, near-infrared and infrared excited multiphoton microscopy was combined with a modified dorsal skinfold chamber model. Implanted HT-1080 fibrosarcoma and B16/F10 and MV3 melanoma tumors developed zones of invasive growth consisting of collective invasion strands that retained cell-cell contacts and high mitotic activity while invading at velocities of up to 200 μm per day. Collective invasion occurred predominantly along preexisting tissue structures, including blood and lymph vessels, collagen fibers and muscle strands of the deep dermis, and was thereby insensitive to RNAi based knockdown and/or antibody-based treatment against β1 and β3 integrins, chemokine (SDF-1/CXCL12) and growth factor (EGF) signaling. Therapeutic hypofractionated irradiation induced partial to complete regression of the tumor main mass, yet failed to eradicate the collective invasion strands, suggesting a microenvironmentally privileged niche. Whereas no radiosensitization was achieved by interference with EGFR or doxorubicin, the simultaneous inhibition of β1 and β3 integrins impaired cell proliferation and survival in spontaneously growing tumors and strongly enhanced the radiation response up to complete eradication of both main tumor and invasion strands. In conclusion, collective invasion in vivo is a robust process which follows preexisting tissue structures and is mainly independent of established adhesion and chemoattractant signaling. Due to its altered biological response to irradiation, collective invasion strands represent a microenvironmentally controlled and clinically relevant resistance niche to therapy. Therefore supportive regimens, such as anoikisinduction by anti-integrin therapy, may serve to enhance radio- and chemoefficacy and complement classical treatment regimens. N2 - Die Progression von Tumorerkrankungen, einschließlich Tumorinvasion, Metastasierung und Therapieresistenz wird unter anderem durch migrationsfördernde Signale aus der Tumorumgebung vermittelt. Zur bisherigen Aufklärung einzelner Schritte des Tumorinvasions- und Progressionsprogramms trugen dabei wesentlich In-vitro-Studien bei, jedoch erfordert die Darstellung der Relevanz molekularer Zielstrukturen und deren Funktion im Tumormikromilieu die Validierung in geeigneten In-vivo-Tumormodellen. Ziel dieser Studie war, zelluläre und molekulare Mechanismen der Tumorprogression inklusive Proliferation, Überleben und Invasion mittels Echtzeit-Intravitalmikroskopie darzustellen. Untersucht wurden insbesondere die Kinetik und Arten der Tumorzellinvasion, die zugrunde liegenden Adhäsionswege und pro-migratorischen Signale (EGF, SDF-1), beteiligte Leitstrukturen des Tumorstromas, und Strategien, therapeutisch gegen Invasionszonen vorzugehen. Um tiefe Tumorareale mittels subzellulär aufgelöster optischer Bildgebung zu erreichen, wurde nah-infrarote und infrarote Multiphotonenmikroskopie mit einem modifizierten Rückenkammermodell kombiniert. Orthotope Xeno- und Allotransplantate von HT-1080-Fibrosarkom- und B16/F10- oder MV3-Melanomzellen entwickelten dabei ausgeprägte invasive Wachstumszonen bestehend aus kollektiven Invasionssträngen mit intakten Zell-Zell-Kontakten und zeitgleicher Mitoseaktivität, die Geschwindigkeiten von bis zu 200 μm pro Tag erreichten. Diese kollektive Invasion orientierte sich bevorzugt entlang von Funktionsstrukturen der tiefen Dermis wie Blut- und Lymphgefäßen, Kollagenfasern und Muskelsträngen. RNAibasierende Herrunterregulation und/oder Injektion blockierender Antikörper gegen β1 und β3 Integrine, wie auch Inhibition von EGF führten nur zu minimaler Änderung der Invasionseffizienz. Therapeutische hypofraktionierte Bestrahlung induzierte partielle bis komplette Regression der Tumorhauptmasse, nicht jedoch der kollektiven Invasionsstränge, was auf eine kombinierte Invasions- und Resistenznische hinweist. Weder Doxorubicin noch gegen EGFR gerichtete Antikörper steigerten die Radiosensitivität, jedoch führte die simultane Inhibition von β1 und β3 Integrinen zu einer starken Hemmung von Proliferation und Überleben spontan wachsender Tumoren (Anoikis) und verstärkte die Strahlungssensitivität bis hin zum kompletten Verschwinden von sowohl Tumorhauptmasse wie auch Invasionsträngen. Kollektive Invasion ist somit ein wichtiger Invasionsmodus, der sich an vorbestehenden Gewebsstrukturen orientiert und unabhängig von Integrinen und EGF- und SDF-1-Signalen erfolgt. Die kollektiven Stränge entwickeln dabei eine vom Haupttumor verschiedene biologische Reaktion auf Bestrahlung und entsprechen damit einer durch die Mikroumgebung kontrollierten und von Integrinsignalen abhängenden Resistenznische. Somit könnte eine zusätzliche anti- Integrin-Therapie die Effizienz von Bestrahlung und Chemotherapie erhöhen und klassische Behandlungsschemen/-programme ergänzen. KW - Tumorzelle KW - Kollektive Invasion KW - Multiphotonenmikroskopie KW - Integrine KW - collective invasion KW - multiphoton microscopy KW - integrins KW - Invasion KW - Integrine Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85435 ER - TY - THES A1 - Kubisch, Alexander T1 - Range border formation in the light of dispersal evolution T1 - Die Ausbildung von Verbreitungsgrenzen unter Berücksichtigung der Evolution des Ausbreitungsverhaltens N2 - Understanding the emergence of species' ranges is one of the most fundamental challenges in ecology. Early on, geographical barriers were identified as obvious natural constraints to the spread of species. However, many range borders occur along gradually changing landscapes, where no sharp barriers are obvious. Mechanistic explanations for this seeming contradiction incorporate environmental gradients that either affect the spatio-temporal variability of conditions or the increasing fragmentation of habitat. Additionally, biological mechanisms like Allee effects (i.e. decreased growth rates at low population sizes or densities), condition-dependent dispersal, and biological interactions with other species have been shown to severely affect the location of range margins. The role of dispersal has been in the focus of many studies dealing with range border formation. Dispersal is known to be highly plastic and evolvable, even over short ecological time-scales. However, only few studies concentrated on the impact of evolving dispersal on range dynamics. This thesis aims at filling this gap. I study the influence of evolving dispersal rates on the persistence of spatially structured populations in environmental gradients and its consequences for the establishment of range borders. More specially I investigate scenarios of range formation in equilibrium, periods of range expansion, and range shifts under global climate change ... N2 - Die Frage nach den Ursachen für die Ausbildung von Verbreitungsgrenzen ist ein zentrales Thema ökologischer Forschung. Dabei wurde die Bedeutung geographischer Barrieren als natürliche Grenzen der Ausbreitung von Populationen früh erkannt. Jedoch findet man oft auch in sich graduell ändernden Landschaften, in denen keine Barrieren zu finden sind, sehr scharfe Verbreitungsgrenzen. Mechanistische Erklärungen hierfür unterscheiden zwischen solchen Umweltgradienten, welche entweder die Variabilität der biotischen und abiotischen Umgebung in Raum und Zeit oder die Fragmentierung von Habitat beeinflussen. Dabei wird die spezifische Lage der Verbreitungsgrenze von weiteren Mechanismen beeinflusst, wie Allee-Effekten (d.h. verringerte Wachstumsraten bei kleiner Populationsgröße oder -dichte), zustands- bzw. kontextabhängigem Dispersal und biologischen Interaktionen. Dispersal, das heißt Ausbreitung im Raum mit potentiellen Konsequenzen für den Genaustausch zwischen Populationen, stand im Fokus vieler Studien, die sich mit der Ausbildung von Verbreitungsgrenzen beschäftigt haben. Es ist bekannt, dass das Ausbreitungsverhalten von Populationen sehr variabel ist und selbst innerhalb kurzer Zeit evolvieren kann. Trotzdem haben sich erst wenige Studien mit den Folgen der Evolution des Ausbreitungsverhaltens für biogeographische Muster befasst. Die vorliegende Dissertation verfolgt das Ziel, diese Lücke zu füllen. Ich untersuche den Einfluss evolvierender Emigrationsraten auf das Überleben von räumlich strukturierten Populationen, sowie dessen Konsequenzen für die Etablierung und Dynamik von Verbreitungsgebieten. Dafür ziehe ich verschiedene Szenarien heran. Diese bilden die Verbreitung von Arten im Gleichgewicht, während Phasen der Expansion des Verbreitungsgebietes, sowie im Kontext des globalen Klimawandels ab ... KW - Areal KW - Verhalten KW - Evolution KW - Simulation KW - Verbreitungsgrenzen KW - Ausbreitung KW - Invasion KW - range formation KW - dispersal KW - evolution KW - individual-based simulation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70639 ER - TY - THES A1 - Adae, Jasmin T1 - Interaktion von malignen Tumorzellen mit extrazellulärer Matrix und Migration: Rolle von Rac und ROCK T1 - Interaction of malignant tumor cells with extracellular matrix and migration: role of Rac and ROCK N2 - Auf dem Weg vom Primärtumor zur systemischen Metastasierung, der Haupttodesursache von Krebserkrankungen, ist die Einzelzellmigration von Tumorzellen durch dreidimensionales Bindegewebe ein entscheidender Schritt. Die vorliegende Arbeit zeigt Untersuchungen zur Tumorzellmigration und –plastizität in einem 3D-Migrationsmodell. Kleine G-Proteine kontrollieren Zytoskelettfunktionen, insbesondere Aktinpolymerisation und die Bildung von Zellprotrusionen durch Rac sowie Actomyosinkontraktion durch Rho. Durch pharmakologische Inhibitoren von Rac und dem Rho-Effektor ROCK soll deren Bedeutung für Einzelzellmigration in einem dreidimensionalen Modell und vor allem der Effekt auf Morphologie, Plastizität und Migration von Tumorzellen geklärt werden. Nach Inhibition von ROCK zeigen hochinvasive HT1080 Fibrosarkomzellen einen multipolar-dendritischen und sessilen Phänotyp. Nach Hemmung von Rac wird hingegen ein rundlicher, aber ebenfalls apolarer und sessiler Phänotyp induziert. Bei simultaner Inhibition von Rac und ROCK entstehen rundliche, apolare, sessile Zellen mit abortiven Pseudopodien. Wird das Gleichgewicht von Rac und ROCK durch konstitutive Aktivierung von ROCK gestört, so entsteht eine zweigeteilte Population, bestehend aus rundlichen Zellen, die Blebs bilden, und langgezogenen Zellen. Nach Sortierung nach ihrem ß1-Integrinexpressionsniveau zeigten Zellen mit niedriger Integrin-Expression einen rundlichen Migrationstyp mit blasenartigen dynamischen Protrusionen, während Zellen mit hoher Integrin-Expression langgezogen-mesenchymal migrierten. Somit steuern ROCK und Rac gemeinsam und zeitgleich die mesenchymale Einzelzellmigration. Während Rac Protrusion vermittelt, ist ROCK für Kontraktilität und Retraktion verantwortlich. Erst durch Koordination von Rac und Rho/ROCK entsteht somit Polarität und 3D mesenchymale Migration. N2 - In the development from a primary tumor to metastatic dissemintation, which is the main cause of death from cancer, single cell migration through three-dimensional tumor stroma is an essential step. This work presents data concerning tumor cell migration and plasticity in a three-dimensional migration model. Small G-proteins control cytosceletal functions, especially actin polymerisation and the formation of cell protrusions through Rac as well as actomyosin contractility through Rho. Using pharmacological inhibitors of Rac and the Rho effector ROCK their impact on single-cell-migration in a three-dimensional model and particularly on morphology and plasticity of migration of tumor cells should be clarified. After inhibition of ROCK highly invasive HT1080 fibrosarcoma cells show a multipolar-dendritic and sessile phenotype. Inhibtion of Rac however induced a rounded phenotype which was also apolar and sessile. Simultaneous inhibition of ROCK and Rac resulted in rounded, apolar, sessile cells with abortive pseudopods. After disturbing the balance of ROCK and Rac by constitutive activation of ROCK, a divided population of cells developed, consisting of rounded, blebby cells and elongated cells. After sorting the cells according to their level of ß1-integrin expression, cells with low expression of integrins adopted a rounded type of migration with blebby dynamic protrusions, whereas cells with high integrin expression migrated in a elongated-mesenchymal way. Thus ROCK and Rac control together and simultaneously mesenchymal single cell migration. While Rac mediates protrusion, ROCK is responsible for contractility and retraction. Consequently only by coordination of Rho/ROCK and Rac polarity and mesenchymal 3D migration becomes possible. KW - Zellmigration KW - Invasion KW - Karzinomzellen KW - Rac KW - ROCK KW - Zellmigration KW - Invasion KW - Karzinomzellen KW - Rac KW - ROCK KW - cell migration KW - invasion KW - carcinoma cells KW - Rac KW - ROCK Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52894 ER - TY - THES A1 - Mayer, Christian T1 - Pfadbildung durch invasive Melanomzellen : Matrixdefekte, Zellfragmente und erleichterte Migration T1 - Release of cell fragments and extracellular matrix remodelling by invading melanoma cells N2 - Die metastatische Invasion von Tumorzellen durch die extrazelluläre Matrix von Geweben erfordert aktive Zellmigration sowie häufig auch den Umbau der Gewebestruktur. In dieser Arbeit sollte mittels metastasierender MV3-Melonomzellen in einem 3D-Kollagenmatrixmodell der migrationsassozierte Matrixumbau zellulär und molekular untersucht werden, insbesondere die physikalische Charakterisierung gebildeter Matrixdefekte, die molekulare Identifi kation freigesetzter Zellbestandteile, sowie den Einfluß pfadbildender Zellen auf die Invasion nachfolgender Zellen. Die Daten zeigen, daß MV3-Melanomzellen während der Migration durch ein 3DKollagengewebe komplette Zellfragmente in zurückbleibenden röhrenförmigen Trassen deponieren. Diese beinhalteten Zytoplasma und teils Zytoskelett umgeben von intakter Zellmembran mit integrierten Oberflächenrezeptoren wie β1-Integrinen, nicht jedoch DNA-Material. Der Durchmesser der Fragmente lag überwiegend bei 1-5 μm, selten über 10 μm, entsprechend unspezifisch freigesetzter Zellfragmente, die während der Migration vom Zellhinterende abgeschilftet werden. In einem Sphäroidmodell ließen sich mehrere Invasionsfronten nachweisen, in denen einer ersten pfadbildenden Zelle entlang neu gebildeter Matrixtrassen weitere Zellen den gleichen präformierten Trassen folgten. Die videomikroskopischen Befunde wurden mittels Konfokalmikroskopie bestätigt. Eine erwartete höhere Migrationsgeschwindigkeit der nachfolgenden Zellen in dem präformierten Pfad bestätigte sich jedoch nicht. Somit führt die Invasion von MV3-Melanomzellen zur Ausbildung strukturell umgebauter Matrixtrassen, die aus Matrixdefekt freigesetzten Zellfragmenten und angrenzender Extrazellulärmatrix bestehen und nachfolgenden Zellen als Leitstruktur für eine orientierte Form der Invasion dienen (Kettenwanderung). Diese Befunde beleuchten die Dynamik von Zellarrangements ähnlich dem Invasionsmuster in histopathologischen Tumorproben. N2 - Tumor cell invasion requires coordinated cell adhesion to an extracellular matrix (ECM) substrate at the leading edge and concomitant detachment at the cell rear. Known detachment mechanisms include the slow sliding of focal contacts, the detachment of adhesion receptors by affinity and avidity regulation, as well as the shedding of adhesion receptors, most notably integrins. In highly invasive melanoma cells migrating within 3D collagen matrices, beta1 integrins and CD44 are released upon retraction of the trailing edge, together with ripping-off complete cell fragments to become deposited along the migration trail of remodeled matrix. Cell fragments reach a size up to 12 microm in diameter, contain cytoplasm and occasionally polymerized actin enclosed by intact cell membrane including surface beta1 integrins, but do not include nuclear material. The release of cell fragments was migration dependent, as impairment of motility by a blocking anti-beta1 integrin antibody also blocked cell particle release. Invasion-associated deposition of cell fragments combines the secretory-type release of vesicles with a physical mechanism of rear retraction and migration efficiency. The deposition of cell fragments may further represent a disregulated detachment strategy with implications for neoplastic cell behavior, such as the paracrine effects on neighbor cells or a negative impact on immune effector cells. KW - Migration KW - Zellfragmente KW - Pfadbildung KW - Matrixumbau KW - Invasion KW - migration KW - invasion KW - cellfragments KW - pathways Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19657 ER - TY - THES A1 - Gareiß, Barbara T1 - Einfluss niedermolekularer Protein-Tyrosin-Phosphatasen von Listeria monocytogenes auf die listerielle Genexpression und Virulenz T1 - Influence of low molecular weight protein tyrosine phosphatases of Listeria monocytogenes on the listerial gene expression and virulence N2 - Im Genom von Listeria monocytogenes konnten zwei Gene identifiziert werden, die mutmaßlich für niedermolekulare Protein-Tyrosin Phosphatasen (LMW-PTPs) kodieren, Lmo0938/Ptp-1 und Lmo2540/Ptp-2, beide ähneln LMW-PTPs von B. subtilis. Einzel- und Doppeldeletionen der ptp-Gene beeinflussten die Transkription zahlreicher Gene, wie anhand von Gesamtgenom-DNA-Microarray-Analysen und quantitativer RT-PCR gezeigt werden konnten. Insbesondere waren die Gene für i) die Internaline A und B, ii) den Osmoprotektanten-Transporter OpuC, iii) MCP, notwendig zur Flagellen-Bewegung und iv) eine Anzahl von den Proteinen, die in die Nährstoffaufnahme sowie den intrazellulären Metabolismus involviert sind, in vitro herunterreguliert. Die PrfA-regulierten Virulenzgene wurden in den Mutanten verstärkt exprimiert. Im Wesentlichen konnte das gleiche Transkriptionsmuster in infizierten Caco-2-Enterocyten beobachtet werden. Die verringerte Invasivität (abhängig von InlA) und die Unbeweglichkeit der Mutanten passt zu den Transkriptionsergebnissen. Jedoch wurden weder die intrazelluläre Replikation innerhalb eukaryontischer Wirtszellen noch die Resistenz gegen Stressbedingungen durch die Deletion beeinträchtigt. Die Proteome des Wildtyps und der ptp-Mutanten wurden durch 2-dimensionale Gelelektrophorese verglichen und es zeigte sich, dass die Transkriptionsergebnisse nicht vollständig im Proteom reflektiert wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ptps in die Regulationsnetzwerke des alternativen Stress-Sigmafaktor SigB und von PrfA eingreifen. Der ähnliche Effekt beider Ptps auf die Transkription oder auf den Proteinlevel deutet eine Interaktion oder Kooperation der beiden Enzyme an. N2 - In the genome of Listeria monocytogenes we identified two genes putatively encoding low molecular weight protein-tyrosine phosphatases (LMW PTPs), Lmo0938/Ptp-1 and Lmo2540/Ptp-2, similar to LMW PTPS of B. subtilis and S. aureus. Single and double deletions of the ptp genes affected transcription of numerous genes, shown by whole-genome DNA-microarray analysis and quantitative RT-PCR. In particular the genes for i) the internalins AB, ii) the osmoprotectant uptake system OpuC, iii) MCP, important for flagellar motion, and iv) a number of proteins involved in nutrient uptake and intracellular metabolism, were down regulated in vitro. The PrfA-regulated virulence genes were up regulated in the mutants. Essentially the same transcription pattern was observed in infected Caco-2 enterocytes. The decreased invasiveness (dependent on InlA) and non-motility of the mutants matches the transcription results. However, neither replication within eukaryotic host cells nor resistance against stress conditions was impaired by the deletions. The proteomes of wild type and Ptp-mutants were compared by 2-D-protein gel electrophoresis, surprisingly showing that the transcription results were not completely reflected in the proteome. The results show that the Ptps interfere with the stress sigma factor SigB and PrfA regulatory networks. The similar effect of both Ptps on transcription or on protein level suggests an interaction or cooperation of the two enzymes. KW - Listeria monocytogenes KW - Genexpression KW - Proteintyrosinphosphatase KW - Listeria monocytogenes KW - niedermolekulare Protein-Tyrosin-Phosphatasen KW - Transkriptionsregulation KW - Proteom KW - Invasion KW - Listeria monocytogenes KW - low molecular weight protein tyrosine phosphatase KW - transcription regulation KW - proteome KW - invasion Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19853 ER - TY - THES A1 - Agerer, Franziska T1 - Integrin-vermittelte Invasion von Staphylococcus aureus in Säugerzellen T1 - Integrin mediated internalisation of Staphylococcus aureus in human cells N2 - Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern. N2 - The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins. KW - Staphylococcus aureus KW - Integrine KW - Infektion KW - Signaltransduktion KW - Invasion KW - S.aureus KW - Integrine KW - Signaltransduktion KW - invasion KW - S.aureus KW - integrin KW - signal transduction Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14557 ER - TY - THES A1 - Hess, Petra T1 - Genetische und molekularbiologische Analyse von fim Determinanten bei Citrobacter freundii und Escherichia coli T1 - Genetical and molecular biological analysis of fim determinants from Citrobacter freundii and Escherichia coli N2 - Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro über einen ausschließlich Mikrotubuli-abhängigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identität zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 Stämmen Invasivität. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adhäsindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Invasionsfähigkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 Stämme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. Für die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Phänotyps demonstriert. Darüber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der für die Invasivität essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut überein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 Stämmen gelang es in Westernblots, das Adhäsin FimCfH an der Bakterienoberfläche nachzuweisen. Dies konnte auch für FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 Stämmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 Stämmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli über das Adhäsin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren vermögen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli Stämmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsfähigkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adhäsintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollständig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den übrigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den übrigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim ähnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli Stämme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend für die Invasivität. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert. N2 - Citrobacter freundii, which belong to the family of Enterobacteriaceae, are Gram-negative, motile and rod shaped bacteria. As an opportunistic pathogen they are known to be involved in urinary tract infections as well as in newborn meningitis. In vitro, the internalization of C. freundii 3009 into the endosomes of the urinary bladder epithelial cell line T24 exclusively follows a microtubule dependent mechanism. Previously, a chromosomal invasion determinant of C. freundii 3009 has been identified and cloned in plasmid pTO3. This invasion determinant shows high identity to the type 1 fimbrial gene cluster (fim) of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Interestingly, non-invasive E. coli K12 strains become invasive, when they are transformed with plasmid pTO3. In contrast, recombinant E. coli K12 strains harbouring the fim operon of either S. enterica serovar Typhimurium and E. coli, respectively, or other E. coli adhesin determinants were not invasive. In this work the genes of this chromosomal determinant, which are essential for invasiveness, were identified. This was achieved on one hand by subcloning parts of the invasion determinant of plasmid pTO3. Subsequently, the ability of the resulting plasmids to confer invasiveness to E. coli K12 strains was examined by gentamicin protection assays. Interestingly, the internalization of those recombinant E. coli K12 strains is not only inhibited by an analogue of the natural receptor of the adhesin FimCfH, namely mannose, but also by chitin hydrolysate [(GlcNAc)n]. On the other hand, mutants of wild type C. freundii 3009 were constructed by deleting the central part of this particular invasion determinant. These chromosomal deletion mutants showed a considerable lower invasion rate of the human epithelial cell line T24 in comparison to the wild type. Complementation of one of these mutants fully restored the wild type phenotype. Furthermore, it is known that C. freundii 3009 is capable to invade and replicate in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC). The results presented here demonstrate that not only C. freundii 3009 is capable to breach the blood-brain-barrier in a newborn rat animal model, but also recombinant E. coli strain HB101pPH1 which carries the chromosomal fimCf determinant. In addition to the functional analysis of the C. freundii 3009 fim determinant by performing gentamicin protection assays and mannose sensitive yeast agglutination, the expression of the corresponding gene products was shown. Proteins essential for invasion, namely FimCfA, FimCfD, FimCfF and FimCfH, were specifically radio labelled using a T7 phage expression system and their molecular weight was determined. The observed molecular weights are in agreement with the calculated ones from deduced amino acid sequences. Furthermore, the presence of the fimbrial adhesin minor subunit FimCfH on the outer surface of C. freundii 3009 as well as appropriate recombinant E. coli K12 strains was shown using Westernblot technique. Expression of the minor subunit FimCfF on the outer surface was also shown for the recombinant E. coli K12 strains using the same technique. However, electron microscopic studies of C. freundii 3009 or E. coli K12 strains harbouring the fimCf determinant indicate that FimCf protein subunits are not assembled in hair like appendages called fimbriae. Since certain type 1 fimbrial variants of E. coli are able to induce bacterial internalization by bladder epithelial cells via the adhesin FimEcH, the fimEc gene cluster from human pathogenic E. coli strains 536 (uropathogenic isolate) and IHE3034 (newborn meningitis isolate) were cloned in order to examine the role of type 1 fimbriae of these strains in invasiveness. In addition, E. coli K1 strain IHE3034 and the isogenic fim negative insertion mutant IHE3034-2 were characterized for their invasion capability. Although type 1 fimbriae are known to be an indispensable virulence factor of uropathogenic E. coli (UPEC), several clinical UPEC strains, which are incapable of expressing this particular adhesin, were isolated and identified. By performing genetic analysis, it could be demonstrated that the fimEc operon is completely deleted from the chromosome in 11 of those isolates. In another 6 isolates the presence of only the 3´-end of the gene fimECH could be found. Furthermore, an IS1 element inserted in the fim deletion was identified in these 6 strains. In the remaining 11 isolates also the DNA region adjacent to the fimEc cluster was affected by this deletion process. In conclusion, it was ascertained that in C. freundii 3009 a fim like determinant functions as an invasion system. Type 1 fimbriae of E. coli strains 536 and IHE3034 are necessary but not sufficient to confer invasiveness. Although type 1 fimbriae of uropathogenic E. coli are known to be an important virulence factor, in several clinical uropathogenic E. coli strains the fimEc operon was deleted. KW - Citrobacter freundii KW - Virulenzfaktor KW - Molekulargenetik KW - Citrobacter freundii KW - UPEC KW - Invasion KW - Typ 1 Fimbrien KW - Harnwegsinfektionen KW - Citrobacter freundii KW - UPEC KW - invasion KW - type 1 fimbriae KW - urinary tract infection Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7635 ER -