TY - THES A1 - Melms, Hannah T1 - Charakterisierung und Analyse mesenchymaler Stammzellen dentalen Ursprungs mit Fokus auf die dentalen Aspekte der Hypophosphatasie - Etablierung eines in vitro Modells - T1 - Characterization and analysis of mesenchymal stem cells of dental origin with focus on the dental aspects of hypophosphatasia - Establishment of an in vitro model - N2 - Im seltenen Krankheitsbild der Hypophosphatasie (HPP) treten aufgrund der Fehlfunktion der Gewebe-unspezifischen Alkalischen Phosphatase (tissue-nonspecific alkaline phosphatase, TNAP) skelettale und dentale Symptome in sehr variabler Ausprägung auf. Der vorzeitige Verlust von Milchzähnen ist das zahnmedizinische Leitsymptom und in vielen Fällen ein erstes Anzeichen dieser Erkrankung. In dieser Arbeit wurde ein in vitro Modell der HPP etabliert und der Fokus auf die dentalen Aspekte dieser Erkrankung gelegt. Hierzu wurden mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus Bereichen analysiert, die bei einer Erkrankung von dieser Mineralisierungsstörung betroffen sind. Es wurden dentale Stammzellen aus der Pulpa (dental pulp stem cells, DPSCs) und dem parodontalen Ligament (periodontal ligament stem cells, PDLSCs) isoliert und im Vergleich zu Stammzellen aus dem Knochenmark (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) charakterisiert. Um den Einfluss der Spendervariabilität zu reduzieren, wurden aus dem gesamten dentalen Probenmaterial nur vollständige Probenpaare aus DPSCs und PDLSCs von 5 Spendern für die vergleichenden Analysen verwendet. Die dentalen MSCs konnten somit paarweise direkt miteinander verglichen werden. DPSCs gelten seit ihrer Entdeckung von Gronthos et al. im Jahr 2000 als geeignete Quelle für die Stammzellgewinnung mit vielversprechenden Anwendungsmöglichkeiten im Bereich des Tissue Engineering und der regenerativen muskuloskelettalen Medizin. PDLSCs sind aufgrund der parodontalen Problematik der HPP von besonderem Interesse in dieser Arbeit. Die Isolation von Stammzellen aus Pulpa und PDL konnte mit dem Nachweis der sogenannten Minimalkriterien für MSCs bestätigt werden. In diesem durch Enzyminhibition mit Levamisol induzierten in vitro Modell der HPP wurde die TNAP-abhängige Genexpression, die Enzym-Aktivität und das osteogene Differenzierungspotenzial an diesen drei Mineralisierungs-assoziierten MSCs untersucht. Die erweiterte Genexpressionsanalyse in Kooperation mit der Core Unit Systemmedizin der Universität Würzburg mit einer RNA-Sequenzierung der PDLSCs ergab interessante Einblicke in die differentielle Genexpression nach der TNAP-Inhibition während der osteogenen Differenzierung und Ansatzpunkte für weitere Analysen. Die beobachteten Genregulationen waren nach dem derzeitigen Verständnis pathologischer Zusammenhänge nachvollziehbar und simulierten in vitro HPP-relevante Signalwege repräsentativ. Insbesondere die signifikante Genregulation von P2X7 und DMP1, sowie Zusammenhänge aus dem Wnt-Signalweg zeigen hinsichtlich der dentalen Aspekte der HPP neue Ansatzpunkte auf. Die erhöhte P2X7-Expression in diesem in vitro HPP-Modell scheint mit der Parodontitis-Problematik der HPP zu korrelieren und verdeutlicht unter anderem die multifaktorielle Ätiologie und Pathogenese der Parodontitis. Die Tatsache, dass die experimentellen Beobachtungen in Einklang mit dem klinischen Bild der HPP gebracht werden können, bestätigt die Relevanz des hier etablierten in vitro Modells. Zusammenfassend konnten anhand dieses in vitro Modells der HPP neue Aspekte aufgedeckt werden, die nicht nur im Hinblick auf die dentale Problematik der HPP aufschlussreich sind. N2 - In the rare clinical picture of hypophosphatasia (HPP) skeletal and dental symptoms occur in very variable severity due to a dysfunction of the enzyme tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP). The premature loss of deciduous teeth is the main dental symptom and in many cases the first sign of this disease. In this thesis, an in vitro model for HPP was established and the research focus was put on the dental aspects of this disease. Mesenchymal stem cells (MSCs) from areas affected by this mineralization disorder were analyzed. Dental pulp stem cells (DPSCs) and periodontal ligament stem cells (PDLSCs) were isolated and characterized in comparison to bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). In order to reduce the influence of donor variability, only complete pairs of DPSCs and PDLSCs from five donors were used for comparative analysis. The mesenchymal stem cell character of the isolated cells from the dental pulp and the PDL was confirmed by the verification of the so-called minimal criteria for MSCs. In this in vitro model for HPP, which was induced by inhibition of TNAP enzyme with levamisole, the TNAP-dependent gene expression, the enzyme activity and the osteogenic differentiation potential of these three mineralization-associated MSCs were investigated. Additionally, an extended gene expression analysis was performed in cooperation with the Core Unit System Medicine of the University of Würzburg using the RNA sequencing technique. Analysis of RNAs isolated from PDLSCs provided interesting insights into the differential gene expression due to TNAP inhibition during osteogenic differentiation and consequently starting points for further analyses. The observed gene regulation was in line with the current understanding of pathological relationships and simulated HPP-relevant signaling pathways in vitro. In particular, the significant gene regulation of P2X7 and DMP1, as well as correlations from the Wnt signaling pathway, reveal new considerable approaches for the dental aspects of HPP. The increased P2X7 expression in this in vitro HPP model seems to correlate with the periodontal disease of HPP and illustrates, among other things, the multifactorial etiology and pathogenesis of periodontitis. The fact that the experimental observations can be reconciled with the clinical picture of HPP confirms the relevance of the in vitro model established here. In summary, this in vitro model for HPP has revealed a number of new interesting aspects - not only with regard to the dental problems of HPP. KW - Hypophosphatasie KW - Stammzellen KW - Hypophosphatasia KW - Mesenchymale Stammzellen KW - mesenchymal stem cells KW - dentale Stammzellen KW - dental stem cells KW - osteogene Differenzierung KW - osteogenic differentiation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189844 ER - TY - THES A1 - Riekert, Maximilian T1 - Der Einfluss mesenchymaler Stammzellen auf T-Zellsubpopulationen bei gesunden Probanden und Patienten mit rheumatischen Erkrankungen T1 - The influence of mesenchymal stem cells on T-cell subsets in healthy donors and patients with rheumatic diseases N2 - In dieser Arbeit wurde der Einfluss mesenchymaler Stammzellen (MSC) auf verschiedene T-Zellsubpopulationen in vitro untersucht. Dazu wurden Naive- und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen aus humanen PBMCs von gesunden Probanden und Patienten mit Autoimmun-Arthritis bei rheumatischen Erkrankungen isoliert und im Beisein/in Abwesenheit von MSCs unter Th-17-polarisierenden Bedingungen kultiviert. Nach einer 6 Tage umfassenden Inkubationszeit erfolgte die flowzytometrische Bestimmung des Phänotyps, der Proliferation, der Apoptose, des Zytokinprofils und der Chemokinrezeptorexpression Naiver und Nicht-Naiver-CD4+ T-Zellen im Beisein/in Abwesenheit von MSCs. Die Phänotypen wurden als CD45RA+CD27+ Naive-, CD45RA-CD27+ Gedächtnis-, CD45RA- CD27- Effektor- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen definiert und ihre jeweiligen prozentualen Anteile an allen CD4+ T-Zellen bestimmt. Nach Beurteilung der Proliferation und Apoptose, erfolgte die Analyse der IFNγ-, IL-17-, IL-9- und IL-13-Produktion für jeden der vier Phänotypen. Zusätzlich wurde der prozentuale Anteil an FoxP3+CD25+CD127- Tregs und deren IL-10-Produktion bestimmt. Abschließend erfolgte die Messung der CCR5-, CCR6- und CXCR3- Expression. Insgesamt konnte sowohl in der Naiven CD4+- als auch in der Nicht-Naiven CD4+ T- Zellfraktion eine Hemmung der Proliferation und Apoptose CD4+ T-Zellen durch MSCs gemessen werden. Zudem supprimierten MSCs die Produktion der Zytokine IFNγ, IL-17, IL-9 und IL-10 und steigerten teilweise die Produktion von antiinflammatorischem IL-13. In den vier untersuchten Phänotypen verhielt sich die Zytokinproduktion variabel und war bei CD45RA-CD27+ Gedächtnis- und CD45RA-CD27- Effektor-Zellen am größten. Der hemmende Einfluss der MSCs war auf diese beiden Phänotypen ebenfalls am stärksten ausgeprägt. CD45RA+CD27+ Naive- und CD45RA+CD27- TEMRA-Zellen produzierten in Kultur mit MSCs mitunter vermehrt proinflammatorische Zytokine. Analog zur Proliferation und Apoptose verminderten MSCs die Expression von CCR5, CCR6 und CXCR3 auf CD4+ T-Zellen. Die beschriebenen Effekte der MSCs konnten sowohl bei gesunden Probanden, als auch bei Patienten mit rheumatischen Erkrankungen nachgewiesen werden. Durch die Verwendung eines Transwell®-Systems konnte gezeigt werden, dass MSCs ihre Wirkung auf T-Lymphozyten nicht nur durch direkten Zell-Zell-Kontakt, sondern auch über lösliche Faktoren ausüben. Die Resultate dieser Arbeit verdeutlichen den immunsuppressiven Charakter der MSCs auf Naive und Nicht-Naive CD4+ T-Zellen unter Th17-polarisierenden Bedingungen in vitro. Jedoch zeigt die Analyse der Zytokinproduktion in den untersuchten T-Zell-Phänotypen, dass MSCs neben ihrer immunsuppressiven Eigenschaft die Zytokinantwort einzelner T-Zellphänotypen steigern können. MSCs scheinen daher am ehesten eine immunmodulatorische Rolle zu spielen, indem sie übersteigerte Immunreaktionen herabsetzen und bei Bedarf immunstimulierend wirken. N2 - In this thesis the influence of mesenchymal stem cells (MSCs) on different T cell subsets was investigated in vitro. Naive- and Non-Naive CD4+ T cells were isolated from human PBMCs of healthy donors and patients with rheumatic diseases and cultured in presence/in absence of MSCs under Th17 polarizing conditions. After incubation for six days phenotype, proliferation, apoptosis, cytokine profile and expression of chemokine receptors of Naive- and Non-Naive CD4+ T cells in presence/in absence of MSCs was determined by flow cytometry. T cell subsets were defined as CD45RA+CD27+ Naive, CD45RA-CD27+ Memory, CD45RA-CD27- Effektor and CD45RA+CD27- TEMRA cells and the percentage of total CD4+ T cells was calculated. After assessing proliferation and apoptosis, production of IFNγ, IL-17, IL-9 and IL-13 was analyzed for each of the four subsets. Additionally, the percentages of FoxP3+CD25+CD127- Tregs and the corresponding production of IL-10 were determined. Finally, the expression of chemokine receptors CCR5, CCR6 and CXCR3 was measured. In both the Naive and Non-Naive CD4+ cell fraction an inhibition of proliferation and apoptosis of CD4+ T cells through MSCs was analyzed. Moreover, MSCs suppressed the production of the cytokines IFNγ, IL-17, IL-9 and IL-10 and partially enhanced the production of IL-13. The cytokine production varied in the four analyzed T cell subsets, with the highest cytokine production among CD45RA-CD27+ Memory and CD45RA-CD27- Effector cells. The inhibiting influence of MSCs on these two subsets was most prominent. CD45RA+CD27+ Naive and CD45RA+CD27- TEMRA cells occasionally produced more proinflammatory cytokines in culture with MSCs. Like similar effects of MSCs on proliferation and apoptosis, MSCs diminished the expression of CCR5, CCR6 and CXCR3 on CD4+ T cells. The effects of MSCs were demonstrated in both, healthy donors and patients with rheumatic diseases. By the use of a Transwell®-System it was shown that MSCs exert their effects not only through direct cell-cell-contact but also by soluble factors. The results of this thesis elucidate the immunosuppressive character of MSCs on Naive and Non-Naive CD4+ T cells under Th17-polarizing conditions in vitro. However, the analysis of the cytokine production in the investigated T cell subsets showed, that MSCs are able to enhance the immune response besides their immunosuppressive properties. Therefore, MSCs most likely seem to play an immunomodulatory role, by reducing exaggerated immune reactions and, if required are also able to act immune stimulating. KW - mesenchymal KW - stem KW - cell KW - Rheuma KW - Mesenchymale Stammzellen KW - Mesenchymal Stem Cells KW - Rheuma KW - Immunologie KW - Immunology KW - T-Zellen KW - T-Cells KW - Subpopulationen KW - Subsets Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178195 ER -