TY - THES A1 - Wobbe, Christina T1 - Hochaufgelöste Mikroskopie mittels strukturierter Beleuchtung zur altersabhängigen Akkumulation autofluoreszierender Granula im retinalen Pigmentepithel des Menschen T1 - High-resolution microscopy using structured illumination for age-dependent accumulation of autofluorescent granules in human retinal pigment epithelium N2 - Die Technik der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (structured illumination microscopy, SIM) ist eine etablierte ultrastrukturelle Aufnahmemethode, die der hochauflösenden Visualisierung intrazellulärer Strukturen dient. In der Ophthalmologie findet diese Art der Bildgebung bisher wenig Anwendung. SIM ermöglicht die histologische Darstellung retinaler Strukturen, wie der Zellen des humanen retinalen Pigmentepithels (RPE). In den Zellen des RPE reichern sich Granula an, die für die Autofluoreszenz-Bildgebung von Bedeutung sind. Anhand der Morphologie und autofluoreszierenden Merkmale lassen sich grundsätzlich drei Granulatypen im RPE unterscheiden: Melanosomen (M), Melanolipofuszin (ML)- und Lipofuszin (L)-Granula. Die Anwendung der SIM ermöglicht die präzise Darstellung und Differenzierung dieser autofluoreszierenden Strukturen, sowie die Bestimmung ihrer Anzahl und Lokalisation. Ziel der Arbeit ist die Darstellung der im humanen RPE lokalisierten Granula mithilfe der SIM. Anhand der unterschiedlichen Autofluoreszenz (AF) der Granula können diese innerhalb des RPE-Zellkörpers klassifiziert, sowie deren Anzahl und Dichte analysiert werden. Diese Analyse wird in Altersgruppen und Retinalokalisationen differenziert. Zudem sind direkte Vergleiche zwischen der Histologie (SIM, ex vivo) und klinischen Aufnahmen (Fundusautofluoreszenz, in vivo) kaum existent. Durch Ermittlung der Gesamt-AF pro Zelle in Korrelation zu der intrazellulären Granuladichte und -verteilung soll eine neue Interpretationsebene ermöglicht werden. Diese Arbeit soll helfen anhand der gewonnenen Daten die Stoffwechselmechanismen der Retina und deren Einfluss auf die Fundusautofluoreszenz (FAF) besser verstehen zu können. Sie soll insbesondere dazu beitragen bestehende und neue klinische FAF-Bildgebungsverfahren zu validieren, die Diagnostik pathologischer Prozesse der Retina zu optimieren und sowohl eine möglichst frühe Erkennung als auch präzise Prognostik zu ermöglichen. Zudem sollen die Daten eine belastbare Basis darstellen, um die mit einem hohen Zeitaufwand verbundene manuelle Zellanalyse einer geschulten künstlichen Intelligenz zu überlassen. Damit könnte der Analyseprozess von Gewebeproben immens beschleunigt werden und in seiner Effizienz maximiert werden. N2 - Structured illumination microscopy (SIM) is an established ultrastructural imaging technique for high-resolution visualization of intracellular structures. So far, this type of imaging has not been used much in ophthalmology. SIM enables the histological visualization of retinal structures, such as the cells of the hu- man retinal pigment epithelium (RPE). Granules accumulate in the cells of the RPE, which are important for autofluorescence imaging. Basically, three types of granules in the RPE can be distinguished on the basis of the morphology and autofluorescent characteristics: Melanosomes (M), Melanolipofuscin (ML) granules and Lipofuscin (L) granules. The use of SIM enables the precise representation and differentiation of these autofluorescent structures, as well as the determination of their number and localization. The aim of this work is to visualize the granules localized in human RPE using SIM. Based on the different autofluorescence (AF) of the granules, they can be classified within the RPE cell body and their number and density can be analyzed. This analysis is differentiated into age groups and retinal localizations. In addition, direct comparisons between histology (SIM, ex vivo) and clinical images (fundus autofluorescence, in vivo) hardly exist. By determining the total AF per cell in correlation to the intracellular granule density and distribution, a new level of interpretation should be made possible. This work will help to understand the metabolic mechanisms of the retina and their influence on fundus autofluorescence (FAF). In particular, it should contribute to validating existing and new clinical FAF imaging methods, optimizing the diagnosis of pathological processes in the retina and enabling both early detection and precise prognosis. In addition, the data should provide a reliable basis for leaving the time-consuming manual cell analysis to a trained artificial intelligence. This could immensely accelerate the analysis process of tissue samples and maximize its efficiency. KW - Netzhaut KW - Retinales Pigmentepithel KW - Autofluoreszenz KW - structured illumination microscopy KW - Retina Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321490 ER - TY - THES A1 - Willmann, Lukas T1 - Altersabhängige Makuladegeneration - Regeneration des retinalen Pigmentepithels durch Anregung zur Proliferation durch den Transkriptionsfaktor E2F2 T1 - Age-related macular degeneration - regeneration of retinal pigment epithelium by stimulation of proliferation by transcription factor E2F2 N2 - Altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist weltweit die häufigste Ursache von irreversibler Erblindung des alternden Menschen. Mit der anti-VEGF-Behandlung steht für die deutlich seltenere feuchte AMD eine zugelassene Therapie bereit, die deutlich häufigere trockene AMD entzieht sich aktuell jedoch jeglicher Therapie. Ein zentraler Pathomechanismus der AMD ist der progrediente Untergang des retinalen Pigmentepithels (RPE). Die Rarifizierung und letztendlich Atrophie des RPEs führt zum Untergang der funktionellen Einheit aus RPE, Photorezeptoren und Bruch’scher Membran und somit zum irreversiblen Funktionsverlust. Ein möglicher therapeutischer Ansatz, der progredienten Atrophie des RPEs entgegenzuwirken, ist, das prinzipiell post- mitotischen RPE zur Proliferation anzuregen. Grundlage unserer in vitro Untersuchungen ist das ARPE-19 Zellmodell. Um die Proliferation anzuregen wurden die RPE-Zellen mit E2F2, einem Zellzyklus- regulierendem Transkriptionsfaktor, transfiziert. Zunächst wurde ein nicht-proliferatives RPE-Zellmodell mit spontanem Wachstumsarrest etabliert. Innerhalb von zwei Wochen konnte die Ausbildung von Zonulae occludentes als Zeichen der Integrität des adhärenten Zellmonolayers beobachtet werden. Die chemische Transfektion von E2F2 unter einem CMV-Promoter führte zur Überexpression von E2F2-Protein. Der proliferationssteigernde Effekt von E2F2 konnte durch die Proliferationsmarker Cyclin D1 sowie Ki67, dem Anstieg der BrdU-Aufnahme und der nach Transfektion mit E2F2 zunehmenden Gesamtzellzahl nachgewiesen werden. Der Zellzahlerhöhung standen jedoch potentiell qualitative und funktionelle Einbußen entgegen. So zeigten sich nach Behandlung mit E2F2 die Zellviabilität reduziert und die Apoptoserate sowie die Permeabilität des Epithels erhöht. Diese Einschränkungen waren jedoch nur passager bis 7 Tage nach Transfektion sichtbar und reversibel. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass diese Defizite nicht durch E2F2 selbst, sondern durch das Transfektionsreagenz PEI bedingt waren. Weitere funktionelle Defizite könnten durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) verursacht werden. Hier zeigte sich durch E2F2 keine De-Differenzierung im Sinne einer typischen EMT-Marker- Expression. Die vorliegende Arbeit zeigt in einem in vitro Zellmodell die Grundlagen eines vielversprechenden Ansatzes zur Therapie der trockenen AMD: Durch Überexpression eines den Zellzyklus regulierenden Gens (hier E2F2) wurde die RPE-Regeneration angeregt. Analog zur schon zugelassenen Gentherapie des RPEs bei RPE65-assoziierten Netzhautdystrophien durch den Transfer von funktionstüchtigem RPE65-Gen mittels Adeno-assoziierten Viren könnte mittels E2F2, übertragen mit einem lentiviralen Verktor, eine Stimulation des RPEs zur Proliferation möglich sein. Entscheidend ist der möglichst gute Struktur- und Funktionserhalt des Photorezeptor-Bruch-Membran-RPE Komplexes. Eine Therapie sollte daher in frühen Krankheitsstadien erfolgen, um die Progression zu fortgeschrittenen Erkrankungsstadien mit irreversiblem Funktionsverlust zu verzögern oder zu verhindern. N2 - Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of irreversible blindness in the ageing population worldwide. While for wet AMD an approved therapy is available in form of anti-VEGF treatment, the by far more common dry AMD is currently outside the scope of any therapy. A central pathomechanism of AMD is the progressive degeneration of the retinal pigment epithelium (RPE). Rarefication and finally atrophy of the RPE leads to the collapse of the functional unit consisting of RPE, photoreceptors and Bruch’s membrane, resulting in irreversible loss of function. A possible therapeutic strategy to prevent RPE atrophy is to stimulate the post-mitotic RPE to proliferate. The basis of our in vitro investigations is an ARPE-19 cell culture model. To stimulate proliferation, the RPE cells were transfected with E2F2, a cell cycle regulating transcription factor. First, a non-proliferative RPE cell model with spontaneous growth arrest was established. Within two weeks, the formation of zonulae occludentes was observed as a sign of the integrity of the adherent cell monolayer. Chemical transfection of E2F2 under a CMV promoter led to overexpression of E2F2 protein. The proliferation enhancing effect of E2F2 was demonstrated by proliferation markers cyclin D1 and Ki67, the increase in BrdU uptake, and the increase in total cell number after transfection with E2F2. However, the increase in cell proliferation was potentially offset by qualitative and functional losses. After treatment with E2F2, cell viability was reduced, and apoptosis rate and permeability of the epithelium were increased. These shortcomings were only temporarily detectable up to 7 days after transfection and were reversible. Our results suggest that these deficits were not caused by E2F2 itself, but by the transfection reagent PEI. Further functional deficits could be caused by epithelial-mesenchymal transition (EMT). Here, E2F2 did not show any de-differentiation in the form of typical EMT marker expression. The present study shows the basics of a promising approach for the therapy of dry AMD in an in vitro cell model: RPE regeneration was stimulated by overexpression of a gene regulating the cell cycle (here E2F2). Analogous to approved gene therapy of the RPE for RPE65-associated retinal dystrophies through transfer of functional RPE gene by adeno-associated viruses, a lentiviral vector delivering E2F2 could stimulate the RPE to proliferate. It is essential to preserve the structure and function of the photoreceptor-Bruch's membrane-RPE complex. Therapy therefore needs to take place in early stages of the disease to prevent or slow down progression to advanced stages with irreversible loss of function. KW - Netzhaut KW - Senile Makuladegeneration KW - In vitro KW - Regeneration KW - Makuladegeneration KW - E2F2 KW - transcription factor KW - RPE KW - retinal pigment epithelium KW - retina KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-291833 ER - TY - THES A1 - Stojic, Jelena T1 - Cloning and functional characterization of novel genes expressed preferentially in the human retina N2 - The human retina is a multi-layered neuronal tissue specialized for the reception and processing of visual information. The retina is composed of a great diversity of neuronal cell types including rod and cone photoreceptors, bipolar cells, ganglion cells, amacrine cells, horizontal cells and Müller glia. In response to light, a coordinated series of molecular events, the so-called phototransduction cascade, is triggered in photoreceptor cells and the signals from the photoreceptors are further processed by the bipolar and ganglion cells to the higher centers of the brain. The retina as highly complex system may be greatly susceptible to genetic defects which can lead to a wide range of disease phenotypes. Therefore, isolation and characterisation of the genes active in the human retina will facilitate our deeper understanding of retinal physiology and mechanisms underlying retinal degeneration and provide novel candidates for the retinal disease genes. To identify novel genes that are specifically or predominantly expressed in the human retina, a cDNA library enriched for retina specific transcripts was generated using suppression subtractive hybridization (SSH) technique. In total, 1113 clones were randomly isolated from the retina SSH cDNA library and partially sequenced. On the basis of BLASTN algorithm analysis these clones were classified into four categories including those with I) significant homology to known human genes (766/1113), II) significant homology to partial transcripts and hypothetical gene predictions (162/1113), III) no homology to known mRNAs (149/1113), and IV) vector sequences and clones derived from mitochondrial genes (36/1113). After correcting for redundancy, category I represented 234 known human genes and category II a total of 92unknown transcripts. Clones from category I, were selected for expression analysis by RT-PCR in a great number of human tissues. This resulted in the identification of 16 genes which were expressed exclusively in the retina, 13 which were highly expressed in the retina compared to other tissues, 12 genes which were specifically expressed in neuronal tissues and 48 ubiquitously expressed genes. Thus, our expression analysis resulted in the identification of 29 genes exclusively or abundantly transcribed in the human retina. Of those, retina specific genes L25,L33, L35, L37, L38 and L40 were selected for further analysis. To characterize the complete mRNA sequences of these transcripts a full-length human retina cDNA library was constructed. The analysis of the L25 gene revealed three splicing variants of the ABCC5 gene, consequently named ABCC5_SV1 (SV1), ABCC5_SV2 (SV2) and ABCC5_SV3 (SV3).These isoforms comprise the first five exons of ABCC5 and additional novel exons named 5a, 5b and 5c, generated by differential exon usage. The determined lengths of the three transcripts are 2039 bp, 1962 bp, and 1887 bp in size, respectively. RT-PCR, real-time PCR and Northern blot analysis of ABCC5 as well as the isoforms SV1, SV2 and SV3demonstrated high levels of expression for all transcripts in the retina compared to other tissues. Analysis of their nucleotide sequences revealed that inclusion of exon 5a in splicing variant SV1 produced a frame shift and premature termination codon (PTC). Our data show that this splice variant is the target of nonsense mediated mRNA decay (NMD). This was shown by inhibition of protein synthesis with antibiotics puromycin and anisomycin in human cell lines A-RPE 19 and Y79. Our analysis resulted in an increase of the PTC containing transcript and a decrease of the ABCC5 transcript. Conversely, the amount of both transcripts (SV1 and ABCC5) returned to pre-treatment levels after removal of the inhibitors. Together, our results suggest that alternative splicing of the ubiquitously expressed ABCC5 gene in addition to NMD is involved in retina-specific transcriptional regulation of the mRNA level of ABCC5. In contrast, additional experiments demonstrated that the levels of expression ofSV2 and SV3 isoforms do not appear to influence ABCC5 transcription. Several of the cloned genes were selected for additional genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in order to construct their SNP maps which are going to be used for future association studies of complex disease AMD. Thus, identification of novel retinal genes and their functional characterization will further our elucidation of retinal physiology in general and in the diseased state in particular, by providing candidate retinal disease genes. N2 - Die menschliche Retina ist ein vielschichtiges neuronales Gewebe, das auf die Aufnahme und Verarbeitung visueller Informationen spezialisiert ist. Sie besteht aus einergroßen Vielfalt neuronaler Zelltypen, inklusive der Stäbchen und Zapfen (Photorezeptoren), Bipolar- und Ganglionzellen, Amakrinen Zellen sowie Horizontalzellen und Müllerglia. Als Antwort auf einen Lichteinfall wird eine koordinierte Serie von molekularen Ereignissen, die so genannte Phototransduktionskaskade, in den Photorezeptoren ausgelöst, die von den Photorezeptoren kommenden Signale von den Bipolar- und Ganglionzellen weiterverarbeitetund an höhere Hirnzentren gesandt. Als äußerst komplexes System kann die Retina hochanfällig für genetische Defektesein, die zu einem breiten Spektrum an Krankheitsphänotypen führen können. Deshalb wird die Isolation und Charakterisierung von in der Retina aktiven Genen unser tieferes Verständnis für die Physiologie der Netzhaut, sowie den einer Retinadegeneration zu Grundeliegenden Mechanismen, erleichtern. Um neue Gene, die spezifisch oder überwiegend in der Netzhaut exprimiert werden, identifizieren zu können wurde, unter Nutzung der subtractive hybridization technique (SSH) eine cDNA Bibliothek, angereichert mit retinaspezifischen Genen, generiert. Insgesamt wurden 1113 Klone zufällig aus der Retina SSH cDNA Bibliothek ausgewählt und teilweise sequenziert. Auf der Basis einer BLASTN Algorithmus Analyse wurden diese Klone in 4 Kategorien eingeteilt, wobei I) Klone mit signifikanten Homologien zu bekannten menschlichen Genen (766/1113) beinhaltet, II) Klone mitsignifikanten Homologien zu partiellen Transkripten und hypothetischen Genvorhersagen (162/1113), III) Klone ohne Homologie zu bekannten mRNAs (149/1113) und IV)Vektorsequenzen und Klone, erhalten von mitochondrialen Genen (36/1113). Nach Redundanzkorrektur repräsentierte Kategorie I 234 bekannte menschliche Gene undKategorie II insgesamt 92 unbekannte Transkripte. Klone der Kategorie I wurden für eine Expressionsanalyse mittels RT-PCR in einer Vielzahl menschlicher Gewebe ausgewählt. Dies führte zur Identifikation von 16 exklusiv inder Retina exprimierten Genen, weiteren 13 mit, im Vergleich zu anderen Geweben, hoher Expression in der Netzhaut, 12 Genen, die spezifisch in neuronalen Geweben exprimiertwerden, sowie 48 ubiquitär exprimierten Genen. Somit resultierte unsere Expressionsanalysen der Identifikation von 29 exklusiv oder reichlich in der menschlichen Retina transkribierten Genen. Aus diesen wurden die retinaspezifischen Gene L25, L33, L35, L38 und L40 für weitere Analysen ausgewählt. Um die kompletten mRNA Sequenzen dieser Transkripte zucharakterisieren wurde eine full-length human retina cDNA Bibliothek konstruiert. Die Analyse des L25 Genes erbrachte 3 Splicevarianten des ABCC5 Genes, die konsequent mit ABCC5_SV1 (SV1), ABCC5_SV2 (SV2) und ABCC5_SV3 (SV3) benannt wurden. Diese Isoformen bestehen aus den ersten 5 Exonen von ABCC5 und zusätzlichenneuen 5a, 5b und 5c genannten Exonen, die durch unterschiedliche Exonnutzung entstehen. Die ermittelten Längen der drei Transkripte sind 2039 bp, 1962 bp, und 1887 bp. RT-PCR, real time PCR und Northern Blot Analyse des ABCC5 Genes sowie der Isoformen SV1, SV2und SV3, konnten hohe Expressionslevel all dieser Transkripte in der Retina im Vergleich zu anderen Geweben zeigen. Die Analyse ihrer Nukleotidsequenzen enthüllte, dass der Einschluss von Exon 5a in Splicevariante SV1 eine Leserahmenverschiebung sowie die Entstehung eines premature termination Kodons (PTC) bewirkt. Unsere Daten zeigen, dass diese Splicevariante Ziel eines nonsense mediated mRNA decay (NMD) ist. Dies wurde durch Hemmung der Proteinsynthese mittels Gabe der Antibiotika Puromycin und Anisomycin in den humanen Zelllinien ARPE-19 und Y79 gezeigt. Es kam bei diesem Versuch zu einem Anstieg des PTC enthaltenden Transkripts und einem Abfall des ABCC5Transkripts. Umgekehrt ging die Menge beider Transkripte (SV1 und ABCC5) nach Wegnahme der Inhibitoren auf die Ausgangswerte vor Antibiotikagabe zurück. Zusammengefasst weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass alternatives Splicing des ubiqitärexprimierten ABCC5 Genes zusätzlich zu NMD in der retinaspezifischen Transkriptionsregulation der mRNA Level des ABCC5 Genes involviert ist. Im Gegensatzdazu zeigten zusätzliche Experimente, dass die Expressionslevel der SV2 und SV3 Isoformendie ABCC5 Transkription scheinbar nicht beeinflussen. Einige dieser klonierten Gene wurden zur zusätzliche Genotypisierungen ihrer single nucleotide Polymorphismen (SNPs) ausgewählt, mit dem Ziel SNP Karten zu erstellen, die für spätere Assoziationsstudien komplexer AMD Erkrankungen verwendet werden sollen.Auf diese Weise wird die Identifizierung neuer retinaler Gene sowie deren Funktionscharakterisierung die Aufklärung der Netzhautphysiologie im Allgemeinen und deren krankhafter Veränderungen im besonderen fördern, indem sie Kandidatengene für Retinaerkrankungen zu Verfügung stellt. KW - Netzhaut KW - cDNS KW - Senile Makuladegeneration KW - Genanalyse KW - retina KW - AMD KW - cDNA library KW - NMD KW - ncRNA genes Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13746 ER - TY - THES A1 - Schulz, Heidi T1 - Towards a comprehensive description of the human retinal transcriptome: identification and characterization of differentially expressed genes T1 - Identifizierung und Charakterisierung von differenziell exprimierten Genen - ein Beitrag zur umfassenden Beschreibung des Transkriptoms der menschilchen Netzhaut N2 - The human retina is a multilayered neuroectodermal tissue specialized in the transformation of light energy into electric impulses which can be transmitted to the brain where they are perceived as vision. Since the retina is easily accessible and functional aspects are directly recordable, the study of this tissue has been at the forefront of neuroscience research for over a century. Studies have revealed that the distinct functions of the retina require a large degree of differentiation which is achieved by the coordinated function of approximately 55 different cell types. The highly structured anatomy and the functional differentiation of the retina is a result of its distinctive transcriptome and proteome. Due to the complexity of the retina it has been difficult to estimate the number of genes actively transcribed in this tissue. Great efforts in the elucidation of retinal disease genes have led to the identification of 139 retina disease loci with 90 of the corresponding genes cloned thus far . In contrast to the success in the hereditary disorders, efforts to identify the genetic factors conferring manifestations known as age-related macular degeneration (AMD) have revealed sparse results. AMD is a retinal disease affecting a significant percentage of the older population. This disorder is likely due to exogenic as well as genetic factors. To further our understanding of retinal physiology and facilitate the identification of genes underlying retinal degenerations, particularly AMD, our efforts concentrated on the systematic analysis of the retinal transcriptome. Since approximately half of all retinal degeneration-associated genes identified to date are preferentially expressed in retina, it is plausible that the investigation of gene expression profiles and the identification of retina-expressed transcripts could be an important starting point for characterizing candidate genes for the retinal diseases. The expressed sequence tags approach included the assessment of all retinal expressed sequence tags (EST) clusters indexed in the UniGene database and of 1080 single-pass ESTs derived from an in-house generated human retina suppression subtracted hybridization (SSH) cDNA library. In total, 6603 EST clusters were evaluated during this thesis and detailed in-silico analysis was performed on 750 EST clusters. The expression of the genes was evaluated using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), followed by confirmation using quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR), as well as conventional and virtual Northern blot analysis. The expression profiling of 337 selected EST clusters led to the identification of 111 transcripts, of which 60 are specific or abundant to the retina, 3 are expressed at high levels in the retinal pigment epithelium (RPE), and 48 are expressed in brain as well as in retina. The EST approach used to select candidate transcripts allowed us to assess the effectiveness of the two available resources, the UniGene database and the retinal SSH (retSSH) cDNA library. From the results obtained, it is evident that the generation of suppression subtracted libraries to identify cell-specific transcripts constitutes the most straight-forward and efficient strategy. In addition to the high percentage of candidate genes that are identified from an SSH cDNA library, it has the added benefit that genes expressed at low levels can be identified. Furthermore, comparison of our retina-enriched gene set with previously published studies demonstrated only limited overlap of the identified genes further confirming the valuable source of retinal genes from our retinal SSH cDNA library. The effort of our and other groups has resulted in the establishment of the full-length coding sequence of 55 of the 111 genes uniquely or preferentially expressed in the retina. Using various methods such as bioinformatical analysis, EST assembly, cDNA library screening, and rapid amplification of cDNA ends (RACE) a number of genes were cloned in the scope of this thesis including C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1, and GRM7. Bioinformatic analyses and cDNA library screening were used to isolate the full-length cDNA sequence and determine the genomic organization of C7orf9, also identified as RFRP. This 1190 bp retina-specific transcript from chromosome 7p15.3 encodes a precursor protein for at least two small neuropeptides, referred to as RFRP-1 and RFRP-3. Since C7orf9 is localized in the critical region for dominant cystoid macular dystrophy (CYMD) its role in the pathology was investigated. Southern blot analysis and sequencing of samples from two affected individuals of the original pedigree used to localize the disease gene excluded the gene from involvement in this disease. Multiple isoforms of the C12orf7 gene were assembled from a number of clones identified from library screenings, PCR amplifications, and RACE experiments. The gene variants, transcribed from chromosome 12q13.13, have been found to be expressed exclusively in retina. Because of the multiple alternative splicing of the gene, we can only speculate about the nature of the protein it encodes. The longest transcript, which includes all six exons plus the last intervening sequence, encodes a 471 aa protein which contains a nuclear localization signal and five ankyrin repeats. The existence of many isoforms is also observed in mouse suggesting that they may have a relevant role in cellular physiology. Five novel splice variants of the glutamate metabotropic receptor 7 (GRM7) resulting from the use of alternative 3’-end exons were identified and characterized. One of the novel variants, GRM7_v3, encodes a 924 aa protein and is therefore the longest putative GRM7 protein reported to date. Even though they are not retina-specific, the isoforms are preferentially expressed in the nervous system. Although the functional properties of the specific carboxyl-termini are still unclear, it is known that axon targeting of GRM7_v1 is mediated by the last 60 aa of the protein. Hence the novel isoforms may direct the protein to specific subcellular localizations. The C1orf32 gene, preferentially expressed in retina, is organized in 10 exons and is transcribed from chromosome 1q24.1. Bioinformatic analyses of the 639 aa putative protein not only identified the mouse and rat orthologous genes but also the LISCH7 gene as a potential member of the same family. Since the LISCH7 protein has been shown to function as a low density lipoprotein receptor, the C1orf32 protein may be involved in retinal lipid homeostasis. Disturbances in lipid metabolism have been proposed as one of the pathways involved in AMD etiology. Thus, the role of C1orf32 in this complex disease should be investigated. Expression analyses of the death-associated protein-like 1 (DAPL1) gene revealed that it is expressed in both the retina and the RPE at high levels. The 552 bp transcript encodes a 107 aa putative protein and is transcribed from chromosome 2q24.1. In-silico analyses identified an additional 12 related proteins from various species which share high similarity constituting a novel protein family. The similarity to the death-associated-protein (DAP) is particularly interesting since this protein has been found to be indispensable for programmed cell death. Therefore, DAPL1 is an excellent candidate for retinal disease as apoptosis is generally the ultimate cause in retinal degeneration. The retina-specific C4orf11 and C14orf29 genes localized on chromosome 4q21.22 and 14q22.1, respectively, are both transcribed in more than one isoform. The encoded proteins do not contain any known domains but because of their retina-specific expression they may be important for proper retinal physiology. As part of the long-term goals of the project, several of the cloned genes are being genotyped to construct single nucleotide polymorphism (SNP) maps. Projects to investigate haplotype frequencies of candidate genes in large cohorts of controls and AMD patients are ongoing. Thus, by establishing a collection of 111 genes expressed exclusively or preferentially in the retina, the present work has laid the foundation for future research in retinal diseases. N2 - Die menschliche Retina ist ein mehrschichtiges neuroektodermales Gewebe, das auf die Umwandlung von Lichtenergie in elektrische Impulse spezialisiert ist. Diese Impulse werden zum Gehirn weitergeleitet, wo sie als Bilder gesehen werden. Da die Retina experimentell leicht zugänglich ist und funktionelle Aspekte direkt untersucht werden können, nehmen Experimente an diesem Gewebe in der neurologischen Forschung seit mehr als einem Jahrhundert einen Spitzenplatz ein. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Funktionen der Retina durch eine enorme Differenzierung in mehr als 55 Zelltypen, die koordiniert miteinander in Kontakt treten, ermöglicht wird. Die hohe strukturelle und funktionelle Komplexität der Retina wiederum ist das Resultat ihres Transkriptoms und ihres Proteoms. Die Komplexität der Retina erschwert es, die Zahl aktiv transkribierter Gene in diesem Gewebe zu schätzen. Durch die vielfältigen Bemühungen, Gene zu identifizieren, die mit retinalen Erkrankungen in Zusammenhang stehen, konnten bisher 139 Genloci mit retinalen Krankheiten in Verbindung gebracht werden und in 90 Fällen wurden die jeweiligen Gene bereits kloniert . Während auf dem Gebiet der hereditären Erkrankungen damit bereits große Erfolge erzielt wurden, sind die Resultate, was komplexe Erkrankungen wie die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) betrifft, noch spärlich. AMD ist eine retinale Erkrankung, die einen signifikanten Prozentsatz der älteren Bevölkerung betrifft. Es wird angenommen, dass sowohl exogene als auf genetische Faktoren als Auslöser beteiligt sind. Um die Physiologie der Retina besser zu verstehen und die Identifikation von Genen, die in retinale Erkrankungen involviert sind, zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit ein Schwerpunkt auf die systematische Analyse des retinalen Transkriptoms gelegt. Etwa die Hälfte aller Gene, die bei retinalen Erkrankungen eine Rolle spielen und bis heute identifiziert wurden, werden überwiegend in der Retina exprimiert. Das Erstellen von Genexpressionsprofilen und die Identifikation von retina-spezifischen Transkripten ist daher der erste wichtige Schritt für die Charakterisierung von Kandidatengenen für retinale Erkrankungen. Zu diesem Zweck wurde eine „Expressed Sequence Tags“ (ESTs) Analyse durchgeführt, in der alle Retina „Clusters“ der UniGene Datenbank sowie 1080 einzelne ESTs einer laboreigenen, suppressiv-subtraktiv hybridisierten (SSH) cDNA Bank der menschlichen Retina bewertet. Insgesamt wurden 6603 EST „Clusters“ während dieser Arbeit untersucht und für 750 eine detaillierte in-silico Analyse angeschlossen. Die Expression der Gene wurde mittels reverser Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht und mit quantitativer RT-PCR (qRT-PCR) bestätigt. Außerdem wurden konventionelle und virtuelle Northern Blot Hybridisierungen zur Aufklärung der Expressionsprofile eingesetzt. Die Expressionsprofile von 337 EST „clustern“ führte zur Identifikation von 111 Transkripten, von denen 60 abundant oder spezifisch in der Retina exprimiert werden, drei eine hohe Expression im retinalen Pigmentepithel (RPE) zeigen und 48 sowohl in der Retina als auch im Gehirn vorkommen. Die Bewertung der ESTs zur Auswahl von Kandidatengenen erlaubte einen direkten Vergleich der beiden genutzten Datenressoucen, der UniGene Datenbank und der retinalen SSH (retSSH) cDNA Bank. Die Resultate zeigten, dass die Generierung einer SSH Bank zur Identifikation zellspezifischer Transkripte die effektivere Methode darstellt. Durch die Nutzung dieser cDNA Bank konnte nicht nur ein Großteil der Kandidatengene, sondern auch Gene mit einer niedrigen Expression identifiziert werden. Außerdem zeigt die cDNA Bank eine Anreicherung an Retina-Transkripten. Somit stellt die retSSH cDNA Bank eine wertvolle Quelle zu Identifizierung neuer retinaler Gene dar. Durch diese und andere Arbeiten konnte die vollständige kodierende Sequenz von 55 der 111 retinaspezifischen oder –abundanten Gene ermittelt werden. Mittels verschiedener Methoden wie bioinformatische Analysen, „EST assembly“, cDNA Bank „screening“ und „RACE-Experimenten“ konnten im Lauf dieser Arbeit mehrere Gene, darunter C1orf32, C4orf11, C7orf9, C12orf7, C14orf29, DAPL1 und GRM7, kloniert werden. Mit bioinformatischen Analysen und cDNA Bank „screening“ wurde die Volllänge cDNA Sequenz und die genomische Organisation von C7orf9 (alias RFRP), ermittelt. Das 1190 bp retinaspezifische Transkript auf Chromosom 7p15.3 kodiert ein Vorläuferprotein für mindestens zwei kleine Neuropeptide, RFRP-1 und RFRP-3. Da C7orf9 in einer kritischen Region für die dominante zystoide Makuladystrophie liegt, wurde eine mögliche Rolle für die Pathologie der Krankheit untersucht. Mittels Southern Blot Hybridisierungen und der Sequenzierung von C7orf9 zweier betroffener Patienten des gleichen Stammbaums, der für die Lokalisierung des Krankheitsgens verwendet worden war, konnte eine Beteiligung des Genes am Krankheitsbild ausgeschlossen werden. Mehrere Isoformen des C12orf7 Gens konnten mit Hilfe verschiedener Klone aus cDNA Bank „screeining“, PCR Amplifikationen und „RACE-Experimenten“ identifiziert werden. Die von Chromosom 12q13.13 transkribierten Genvarianten zeigen eine retinaspezifische Expression. Aufgrund der vielfältigen Spleißvarianten des Gens kann über die Eigenschaften des kodierten Proteins nur spekuliert werden. Das längste Transkript, das alle sechs Exone und die letzte Intron-Sequenz enthält, kodiert ein Protein mit 471 AS, das ein Kernlokalisierungssignal und fünf Ankyrin „Domains“ aufweist. Die Existenz mehrere Isoformen wurde auch in der Maus nachgewiesen, was auf eine funktionelle Relevanz in der Physiologie der Zelle hinweist. Fünf neue Spleißvarianten des Glutamat metabotropen Rezeptors 7 (GRM7) mit alternativen Exonen am 3´Ende wurden identifiziert und charakterisiert. Eine der neuen Varianten, GRM7_v3 kodiert ein 924 AS-langer Protein und stellt damit das mutmaßlich längste GRM7 Protein dar. Die Isoformen werden nicht retinaspezifisch, sondern verstärkt in neuronalen Gewebe exprimiert. Obwohl die funktionellen Eigenschaften der spezifischen Carboxyl-Enden noch nicht geklärt sind, ist bekannt, dass „axon-targeting“ von GRM7_v1 von den letzten 60 AS des Proteins vermittelt wird. Die neuen Isoformen könnten daher eine Rolle im subzellulären Transport des Proteins spielen. Das C1orf32 Gen, das vorwiegend in der Retina exprimiert wird, besitzt zehn Exone und liegt auf Chromosom 1q24.1. Mit bioinformatische Analysen konnten nicht nur die orthologen Gene des putativen Proteins mit 639 AS in Maus und Ratte, sondern auch das LISCH7 Gen als potentielles Mitglied der Genfamilie identifiziert werden. Für LISCH7 ist eine Funktion als „low density lipoprotein receptor“ bekannt, das C1orf32 Protein ist damit möglicherweise in den retinalen Fettstoffwechsel involviert. Störungen im Fettstoffwechsel sind als Ursache für AMD vorgeschlagen worden, die Rolle von C1orf32 in dieser komplexen Krankheit sollte deshalb untersucht werden. Expressionsanalysen des „death-associated protein-like 1“ (DAPL1) Gens zeigten eine hohe Expression sowohl in Retina als auch im retinales Pigmentepithel. Das 552 bp Transkript kodiert ein Protein mit 107 AS und liegt auf Chromosom 2q24.1. In-silico Analysen identifizierten 12 weitere verwandte Proteine verschiedener Spezies, die eine hohe Ähnlichkeit aufweisen und eine neue Proteinfamilie darstellen. Vor allem die Ähnlichkeit mit dem „death-associated“ Protein, das für den programmierten Zelltod essentiell ist, ist von besonderem Interesse. Apoptose ist meist der ultimative Grund der retinalen Degeneration und somit stellt DAPL1 ein ausgezeichnetes Kandidatengen für Retinopathien dar. C4orf11, lokalisiert auf Chromosom 4q21.22 und C14orf2, lokalisiert auf Chromosom 14q22.1, sind retinaspezifische Genen und werden in mehren Isoformen transkribiert. Die kodierten Proteine enthalten keine bekannten Domänen, wegen ihrer retinaspezifischen Transkription kann allerdings eine wichtige Rolle für die Funktion der Retina nicht ausgeschlossen werden. Als eines der langfristigen Ziele dieses Projekts wurden mehrere der geklonten Gene genotypisiert um „single nucleotide polymorphism“ (SNP) Karten zu erstellen. Die derzeitigen Projekte untersuchen die Haplotypfrequenzen der Kandidatengene in großen Kohorten von AMD Patienten und nicht betroffenen Kontrollpersonen. Die Kollektion von 111 retinaspezifischen oder –abundanten Genen, die in dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert wurden, hat damit eine wichtige Grundlage für die weitere Erforschung retinaler Erkrankungen gelegt. KW - Netzhaut KW - Transkription KW - Gen KW - Netzhaut KW - Transkriptome KW - Retina KW - Transcriptome KW - Retina Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7278 ER - TY - THES A1 - Sauer, Christian T1 - Untersuchungen zu den genetischen Ursachen hereditärer Netzhautdegenerationen des Menschen T1 - Analyses of the genetic causes of hereditary retinal degenerations in human N2 - Die Positionsklonierung hat sich als erfolgreiche Strategie zur Identifizierung und Isolierung von Genen erwiesen. Da ihre Anwendung im Allgemeinen keine Informationen über den zugrundeliegenden Pathomechanismus einer Erkrankung voraussetzt, eignen sich die Methoden der Positionsklonierung in besonderem Maße für die Erforschung hereditärer Netzhauterkrankungen. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit wurden sie zur Untersuchung ausgewählter retinaler Degenerationen eingesetzt. Dabei konnten wichtige Beiträge für die Aufklärung der genetische Ursachen dieser Erkrankungen geleistet werden. Die autosomal dominante North Carolina Makuladystrophie (NCMD) oder die zentral areoläre Pigmentepitheldystrophie (CAPED) sind allelische Erkrankungen mit allenfalls gering progredientem Verlauf. Ihr Genlokus liegt in einem etwa 7,2 cM großen Bereich auf 6q14-q16.2 zwischen den DNA-Markern D6S424 und D6S1671. Mit Hilfe von 21 polymorphen DNA-Markern welche den NCMD-Lokus (MCDR1) flankieren, wurden Kopplungsanalysen in drei deutschen NCMD-Familien durchgeführt. Die Analyse der krankheitsassoziierten Haplotypen erbrachte Hinweise auf einen gemeinsamen Vorfahren aller drei Familien. Darüber hinaus konnte der MCDR1-Lokus auf 3,2 cM eingeengt werden und wird von den Markern D6S249 und D6S475 flankiert. Dies bedeutet einen wichtigen Schritt auf dem Weg zur Klonierung des zugrundeliegenden Krankheitsgens. Eine häufige Ursache für den frühzeitigen Verlust der zentralen Sehschärfe bei Jungen ist die X-gebundene juvenile Retinoschisis (RS). Ihr Genlokus wurde in einen etwa 900 kb großen Bereich auf dem kurzen Arm des X-Chromosoms (Xp22.2) kartiert, wo er von den DNA-Markern DXS418 und DXS999/DXS7161 flankiert wird. Die Analyse von EST-Sequenzen aus dieser Region ermöglichte die Isolierung eines neuen retinaspezifischen Transkriptes, welches als RS1 bezeichnet wurde. Das RS1-Gen besteht aus sechs Exonen und codiert ein Protein, welches eine in der Evolution hoch konservierte Discoidin-Domäne enthält. Diese Domäne ist in anderen Proteinen u.a. an der Ausbildung von Zell-Zell-Interaktionen beteiligt. Mutationsanalysen in betroffenen Personen aus neun nicht-verwandten RS-Familien ergaben neun verschiedene Sequenzveränderungen die mit dem Krankheitsbild der jeweiligen Familie segregierten. Einen ersten Einblick in die zeitliche und räumliche Expression ergab die Untersuchung des murinen Orthologs Rs1h mit Hilfe von Northern Blot, RT-PCR und RNA in situ-Hybridisierungen. Rs1h wird in der Maus hauptsächlich in den Photorezeptoren exprimiert. Die Expression beginnt erst postnatal und ist mit der Entwicklung der Photorezeptoren korreliert. Das Auftreten zahlreicher weißlich-gelber Flecken, sogenannter Drusen, in radiärer Anordung am hinteren Augenpol ist das charakteristische Merkmal einer Gruppe von Netzhauterkrankungen mit gemeinsamer Ätiologie, die unter dem Begriffen Doynsche Honigwaben Dystrophie (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) oder radiäre Drusen zusammengefasst werden. Der Genlokus dieser Erkrankung wurde auf den kurzen Arm von Chromosom 2 in den Bereich 2p16 kartiert. Die Durchsuchung von EST-Datenbanken führte zur Identifizierung des neuronal exprimerten Gens pNEU60. Dieses besteht aus zwei Exonen, wobei der vollständige codierende Bereich im zweiten Exon liegt. Die Analyse des pNEU60-Proteins ergab eine Struktur aus sieben Transmembrandomänen, dem gemeinsamen Merkmal G-Protein gekoppelter Rezeptoren, wie z.B. Rhodopsin. Patienten mit radiären Drusen zeigten keinerlei Sequenzveränderungen in pNEU60. Die Untersuchung von fast 200 Patienten mit der phänotypisch sehr ähnlichen altersbedingten Makuladegeneration (AMD), führte zur Identifizierung von drei potentiellen Mutationen, darunter eine nonsense-Mutation, sowie zwei polymorphen Veränderungen. Die Assoziation einer einzigen missense-Mutation (R345W) im ubiquitär exprimierten Gen EFEMP1 (EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1) mit der DHRD und MLVT wurde von einer amerikanischen Arbeitsgruppe nachgewiesen. Die R345W Mutation in diesem proximal zu pNEU60 liegenden Gen wurde in den zur Verfügung stehenden zwei MLVT-Familien sowie einer DHRD-Familie nachgewiesen. Bei der Analyse von 14 Patienten mit sporadischen radiären Drusen konnte weder die R345W Mutation, noch irgendeine andere krankheitsassoziierte Mutation nachgewiesen werden. Es wurden jedoch drei polymorphe Sequenzvarianten, sowie zwei polymorphe Di- bzw. Trinukleotidsequenzen identifiziert. Die Klonierung des orthologen EFEMP1-Gens des Rinds diente als Voraussetzung zur Untersuchung der Interaktionsfähigkeit von EFEMP1 mit anderen Proteinen. Mit der Anwendung des Hefe Zwei-Hybrid Systems konnte gezeigt werden, dass die EGF-Domänen von EFEMP1 eine Interaktion mit sich selbst ermöglichen. Die Einführung der R345W Mutation hatte dabei keinen Einfluss auf diese Wechselwirkungen. Die beschriebene Interaktion mit dem zur Familie der Ubiquiline gehörenden Protein DA41 konnte nicht reproduziert werden. Das Gen welches mit der inkompletten Form der X-gebundenen kongenitalen stationären Nachtblindheit (CSNB2) assoziiert ist, codiert die a1-Untereinheit des retinaspezifischen spannungsabhängigen L-Typ Kalziumkanals (CACNA1F). Mit Hilfe von RT-PCR Analysen und RNA in situ-Hybridisierungen wurde die räumliche Expression dieses Gens in der Netzhaut untersucht. Dabei wurde das CACNA1F-Transkript in der äußeren und inneren Körnerschicht, sowie in der Ganglienzellschicht nachgewiesen. N2 - The positional cloning strategy is a powerful tool for the identification and isolation of genes. The application of positional cloning methods to the investigation of hereditary retinal disorders proved to be suitable as they require no informations about the pathology underlying the disease. For the investigations described in this thesis several retinal degenerations were selected for the examination with the positional cloning strategy. The findings of those researches contribute to the further enlightenment of the genetic causes of those disorders. Autosomal dominant North Carolina macular dystrophy (NCMD) or central areolar pigment epithelial dystrophy (CAPED) is an allelic disorder with slow progression. It maps to an approximately 7.2 cM interval between DNA markers at D6S424 and D6S1671 on 6q14-q16.2. A total of 21 polymorphic DNA markers flanking the NCMD locus (MCDR1) were used for genetic linkage analysis in three multigeneration families of German descent expressing the NCMD phenotype. The analysis of the disease associated haplotypes provide evidence for an ancestral founder for all three families. In addition the haplotype analysis refined the MCDR1 locus to a 3.2 cM interval flanked by markers D6S249 and D6S475. This facilitates further approaches in cloning the gene underlying NCMD. X-linked juvenile retinoschisis (RS) is an important cause of early vision lost in males. The RS gene has been localized to Xp22.2 to an approximately 900 kb interval between DXS418 and DXS999/DXS7161. The analysis of expressed sequence tags (ESTs) have identified a novel transcript, designated RS1, within the RS locus that is exclusively expressed in retina. RS1 consists of six exons and encodes for a protein containing the highly conserved discoidin-domain which is implicated in cell-cell interaction. Mutational analyses of RS1 in affected individuals from nine unrelated RS families revealed nine different sequence variations segregating with the disease phenotype in the respective families. The temporal and spatial expression of the murine ortholog Rs1h was studied by northern blot and RT-PCR analyses as well as RNA in situ hybridizations. Predominant expression of Rs1h was found in photoreceptor cells starting postnatal with correlation to photoreceptor development. The appearance of multiple yellowish-white drusen in the posterior pole of the retina is characteristic of a group of retinal disorders with a common etiology, often referred to a Doyne honeycomb retinal dystrophy (DHRD), Malattia Leventinese (MLVT) or radial drusen. The gene underlying this disorder has been mapped to the short arm of chromosome 2 at 2p16. EST database searches led to the identification of the neuronal tissue specific gene pNEU60. The complete coding sequence of this gene is located in the second of two exons. Motif searches in protein databases revealed homology to a seven transmembrane domain which is a hallmark for G-protein coupled receptors like rhodopsin. While mutational analyses in patients with radial drusen identified no sequence variation in pNEU60, three potential pathogenic variants and two frequent polymorphic changes were found in a cohort of almost 200 patients with phenotypically similar age-related macular degeneration (AMD). The association of DHRD and MLVT with a single missense mutation (R345W) in the ubiquitously expressed gene encoding the EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 1 (EFEMP1) has been recently demonstrated by a research group from the United States. The presence of the R345W mutation has been demonstrated for our two MLVT-families and the one DRHD-family. The mutational analyses in 14 unrelated individuals with sporadic early onset drusen did not detect the R345W mutation or any other disease-associated mutation. Three different polymorphic sequence variations and two intragenic polymorphic repeats were present in similar frequencies in the patients and control individuals. As a prerequisite to the analysis of the interaction capability of EFEMP1, he bovine ortholog of this gene has been cloned. The use of a yeast two hybrid system demonstrated that the EGF-motifs of EFEMP1 could interact with each other. The introduction of the R345W mutation had no effect on that interaction. The described interaction of EFEMP1 with DA41, a family member of the ubiquilin protein family could not be reproduced. The gene associated with the incomplete form of the X-linked congenital stationary nightblindness encodes the a1-subunit of a retina specific L-type calcium-channel (CACNA1F). The spatial expression of this gene within the retina has been investigated by RT-PCR analyses and RNA in situ hybridizations. Transcriptional activity could be detected in the outer an inner nuclear layer as well as in the ganglion cell layer. KW - Netzhautdegeneration KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - Netzhaut KW - Degeneration KW - Makula KW - Positionsklonierung KW - North Carolina Makuladystrophie KW - Retinoschisis KW - Radiäre Drusen KW - Nachtblindheit KW - retina KW - degeneration KW - makula KW - positional cloning KW - North Carolina Makuladystrophy KW - Retinoschisis KW - radial drusen KW - night blindness Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1936 ER - TY - THES A1 - Pröbster, Carla T1 - Quantitative Fundusautofluoreszenz des sich entwickelnden und reifenden Auges T1 - Quantitative Fundus Autofluorescence in the Developing and Maturing Healthy Eye N2 - Die quantitative Fundusautofluoreszenz (QAF) erlaubt den Vergleich von Autofluoreszenzintensitäten zwischen Probanden. Zur QAF im sich entwickelnden und reifenden Auge liegen bisher nur sehr wenige Daten vor. In dieser Studie wurde bei 70 augengesunden kaukasischen Kindern (5 - 18 Jahren) eine multimodale Bildgebung durchgeführt (QAF, OCT). Die QAF und retinalen Dicken wurden an definierten Lokalisationen bestimmt (entlang des horizontalen Meridians, ETDRS-Analysemuster, und weitere). Die weitere Analyse erfolgte mittels eigens dafür erstellten Fiji-plugins. Für die verschiedenen Altersgruppen wurden Standardretinae erstellt. 53 Patienten wurden eingeschlossen. Die QAF war in der Kindheit niedrig, nahm aber stetig zu, auch an der Fovea. Es bestanden keine Geschlechtsunterschiede. Die QAF-Verteilung war ähnlich der von Erwachsenen mit einem Maximum im superior-temporalen Quadranten. An individuellen Punkten blieben die retinalen Schichtdicken mit dem Alter stabil. Im ETDRS-Analysemuster zeigte sich ein signifikanter Anstieg des retinalen Pigmentepithel mit dem Alter. Die Standardretinae zeigten einen signifikanten Anstieg der QAF mit dem Alter. QAF-Bildgebung ist auch bei jungen Kindern verlässlich durchführbar. Funktions-Struktur-Analysen zeigten eine Verdickung der äußeren Retina und zunehmender QAF mit dem Alter. Dies ist wahrscheinlich auf ein Zunahme von autofluoreszenten Granula in der äußeren Retina zurückzuführen. Standardretinae können zukünftig helfen Pathologien zu erkennen oder Therapien zu überwachen. N2 - Quantitative fundus autofluorescence (QAF) enables comparisons of autofluorescence intensities among participants. There are only very limited data of QAF in the maturing eye available.In this study, 70 healthy Caucasian children (5–18 years) were multimodal imaged, including QAF and spectral domain optical coherence tomography. QAF and retinal thicknesses were measured at predefined locations (along horizontal meridian; Early Treatment Diabetic Retinopathy Study [ETDRS] grid) and correlated using custom written Fiji plugins. Standard retinae for different age groups were generated. Fifty-three participants were included. QAF was low in childhood but increased steadily, also at the fovea, with no gender differences. The QAF distribution was similar to adults showing highest values superior-temporally. At individual points, retinal thickness remained stable, while using the ETDRS pattern, the retinal pigment epithelium (RPE) thickness increased significantly with aging. Standard QAF retinae of age groups also showed an increase with aging.QAF can be reliably performed in young children. Function–structure correlation showed a thickening of the outer retina and an increasing QAF with aging, probably related to the histologic low number of RPE autofluorescent granules at a younger age but further deposition of these granules during maturation. Standard retinae help to distinguish abnormal QAF in the diseased retina of age-matched patients. KW - Augenhintergrund KW - Netzhaut Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-296996 ER - TY - THES A1 - Müller, Jonathan T1 - Charakterisierung von CEACAM1 in der Retina und Choroidea am Mausmodell T1 - Characterization of CEACAM1 in retina and choroid in mouse model N2 - Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) ist ein multifunktionales Zell-Zell Adhäsionsprotein, das in eine Vielzahl an zellulären Prozessen involviert ist, wie zum Beispiel der Differenzierung von Geweben, der Tumorsuppression, Metastasierung, Angiogenese und Apoptose. Außerdem hat es modulierende Eigenschaften auf die angeborene und erworbene Immunantwort. In der vorliegenden Arbeit charakterisierte ich initial die Lokalisation und die CEACAM1-exprimierenden Zelltypen im Auge und bestimmte quantitativ die Expression von Ceacam1 in der Retina und Choroidea zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Es zeigte sich hierbei, dass Ceacam1 zu allen untersuchten Zeitpunkten, sowohl während der Entwicklung als auch im adulten retinalen und choroidalen Gewebe nachweisbar war. Mittels Immunhistochemie konnte die Expression von CEACAM1 im Corneaepithel, den Gefäßen der Iris und des Ziliarkörpers, im nicht-pigmentierten Epithel des Ziliarkörpers, sowie in den retinalen und choroidalen Gefäßen nachgewiesen werden. Durch Doppelfärbung mit Kollagen IV konnte die endotheliale Expression von CEACAM1 in den Endothelzellen der Gefäße bestätigt werden. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die Funktion von CEACAM1 im Auge und verglich dazu wildtypische Retinae mit Cc1-/--Retinae. Es zeigten sich keine offensichtlichen morphologischen Veränderungen der retinalen Schichten und die anschließend durchgeführten morphometrischen Analysen der Schichtdicken der retinalen Neurone zeigte keine Anzeichen einer Neurodegeneration. Allerdings waren in Cc1-/--Retinae kleine Zysten und IBA1 positive, phagozytisch aktive Zellen im subneuroretinalen Raum, also dem Bereich zwischen RPE und den Außensegmenten der Photorezeptoren zu erkennen. Die anschließend durchgeführten Expressionsanalysen immunmodulierender Faktoren und von Mitgliedern des TGF-β-Signalwegs in retinalen und choroidealen Proben wildtypischer und Cc1-/--Mäusen zeigten keine veränderte Expression für Iba1, Ccl2 sowie Tnf-α. Jedoch konnten signifikant erhöhte Werte für TGF-β1 in der Gruppe der 2-4 als auch der Gruppe der 9 Monate alten Cc1-/--Retinae im Vergleich zu wildtypischen Retinae nachgewiesen werden. Basierend auf den Daten der vorliegenden Arbeit kann geschlussfolgert werden, dass die Deletion von CEACAM1 unter physiologischen Bedingungen die Struktur der Retina und Choroidea nicht offensichtlich beeinflusst. Allerdings führt die Deletion zu erhöhten Tgfβ1 Spiegeln in der Retina und zur Aktivierung und Akkumulation von IBA1 positiven Zellen im subneuroretinalen Raum. N2 - Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (Ceacam1, Cc1) is a multi-functional cell– cell adhesion protein, involved in the differentiation and arrangement of tissue three-dimensional structure, tumor suppression, metastasis, angiogenesis and apoptosis. Moreover, it has been shown to modulate innate and adaptive immune responses. Amongst others, it is expressed in vascular endothelial cells during vascular development and in adult blood vessels that are activated by angiogenic processes. In this study, we aimed to learn about the function of Ceacam1 in the eye. We therefore characterized the cell type specific expression of Ceacam1 in the ocular tissues, analyzed its retinal and choroidal expression at different developmental time points and studied the ocular morphology of Ceacam1- knockout (Cc1-/-) mice. Finally, we analyzed the molecular expression levels of immune modulating factors and members of the TGF-β signaling family in retinal and choroidal tissues of Cc1-/- mice. Our data show that Ceacam1 is expressed in developing and mature retinal and choroidal endothelial cells. Furthermore, its deletion promotes the accumulation of phagocytic active and Iba1-positive cells in the subretinal space and significant upregulated TGF-β1 expression levels in the retina. KW - Angiogenese KW - Vaskularisation KW - Netzhaut KW - Aderhaut KW - CEACAM1 KW - Retina KW - Choroidea Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-305546 ER - TY - THES A1 - Lichtenstein, Leonie T1 - Color vision and retinal development of the compound eye in bees T1 - Farbensehen und retinale Entwicklung des Komplexauges bei Bienen N2 - The superfamiliy of bees, Apiformes, comprises more than 20,000 species. Within the group, the eusocial species like honeybees and bumblebees are receiving increased attention due to their outstanding importance for pollination of many crop and wild plants, their exceptional eusocial lifestyle and complex behavioral repertoire, which makes them an interesting invertebrate model to study mechanisms of sensory perception, learning and memory. In bees and most animals, vision is one of the major senses since almost every living organism and many biological processes depend on light energy. Bees show various forms of vision, e.g. color vision, achromatic vision or polarized vision in order to orientate in space, recognize mating partners, detect suitable nest sites and search for rewarding food sources. To catch photons and convert light energy into electric signals, bees possess compound eyes which consists of thousands of single ommatidia comprising a fixed number of photoreceptors; they are characterized by a specific opsin protein with distinct spectral sensitivity. Different visual demands, e.g. the detection of a single virgin queen by a drone, or the identification and discrimination of flowers during foraging bouts by workers, gave rise to the exceptional sex-specific morphology and physiology of male and female compound eyes in honeybees. Since Karl von Frisch first demonstrated color vision in honeybees more than 100 years ago, much effort has been devoted to gain insight into the molecular, morphological and physiological characteristics of (sex-specific) bee compound eyes and the corresponding photoreceptors. However, to date, almost nothing is known about the underlying mechanisms during pupal development which pattern the retina and give rise to the distinct photoreceptor distribution. Hence, in Chapter 2 and 3 I aimed to better understand the retinal development and photoreceptor determination in the honeybee eye. In a first step, the intrinsic temporal expression pattern of opsins within the retina was evaluated by quantifying opsin mRNA expression levels during the pupal phase of honeybee workers and drones. First results revealed that honeybee workers and drones express three different opsin genes, UVop, BLop and Lop1 during pupal development which give rise to an ultraviolet, blue, and green-light sensitive photoreceptor. Moreover, opsin expression patterns differed between both sexes and the onset of a particular opsin occurred at different time points during retinal development. Immunostainings of the developing honeybee retina in Chapter 2 showed that at the beginning of pupation the retina consist only of a thin hypodermis. However, at this stage all retinal structures are already present. From about mid of pupation, opsin expression levels increase and goes hand in hand with the differentiation of the rhabdoms, suggesting a two-step process in photoreceptor development and differentiation in the honeybee compound eye. In a first step the photoreceptor cells meet its fate during late pupation; in a second step, the quantity of opsin expression in each photoreceptor strongly increase up to the 25-fold shortly after eclosion. To date, the underlying mechanisms leading to different photoreceptor types have been intensively studied in the fruit fly, Drosophila melanogaster, and to some extend in butterflies. Interestingly, the molecular mechanisms seemed to be conserved within insects and e.g. the two transcription factors, spalt and spineless, which have been shown to be essential for photoreceptor determination in flies and butterflies, have been also identified in the honeybee. In chapter 3, I investigated the expression patterns of both transcription factors during pupal development of honeybee workers and showed that spalt is mainly expressed during the first few pupal stages which might correlate with the onset of BLop expression. Further, spineless showed a prominent peak at mid of pupation which might initiates the expression of Lop1. However, whether spalt and spineless are also essential for photoreceptor determination in the honeybee has still to be investigated, e.g. by a knockdown/out of the respective transcription factor during retinal development which leads to a spectral phenotype, e.g. a dichromatic eye. Such spectral phenotypes can then be tested in behavioral experiments in order to test the function of specific photoreceptors for color perception and the entrainment of the circadian clock. In order to evaluate the color discrimination capabilities of bees and the quality of color perception, a reliable behavioral experiment under controlled conditions is a prerequisite. Hence, in chapter 4, I aimed to establish the visual PER paradigm as a suitable method for behaviorally testing color vision in bees. Since PER color vision has considered to be difficult in bees and was not successful in Western honeybees without ablating the bee’s antennae or presenting color stimuli in combination with other cues for several decades, the experimental setup was first established in bumblebees which have been shown to be robust and reliable, e.g. during electrophysiological recordings. Workers and drones of the bufftailed bumblebee, Bombus terrestris were able to associate different monochromatic light stimuli with a sugar reward and succeeded in discriminating a rewarded color stimulus from an unrewarded color stimulus. They were also able to retrieve the learned stimulus after two hours, and workers successfully transferred the learned information to a new behavioral context. In the next step, the experimental setup was adapted to honeybees. In chapter 5, I tested the setup in two medium-sized honeybees, the Eastern honeybee, Apis cerana and the Western honeybee, Apis mellifera. Both honeybee species were able to associate and discriminate between two monochromatic light stimuli, blue and green light, with peak sensitivities of 435 nm and 528 nm. Eastern and Western honeybees also successfully retrieve the learned stimulus after two hours, similar to the bumblebees. Visual conditioning setups and training protocols in my study significantly differed from previous studies using PER conditioning. A crucial feature found to be important for a successful visual PER conditioning is the duration of the conditioned stimulus presentation. In chapter 6, I systematically tested different length of stimuli presentations, since visual PER conditioning in earlier studies tended to be only successful when the conditioned stimulus is presented for more than 10 seconds. In this thesis, intact honeybee workers could successfully discriminate two monochromatic lights when the stimulus was presented 10 s before reward was offered, but failed, when the duration of stimulus presentation was shorter than 4 s. In order to allow a more comparable conditioning, I developed a new setup which includes a shutter, driven by a PC based software program. The revised setup allows a more precise and automatized visual PER conditioning, facilitating performance levels comparable to olfactory conditioning and providing now an excellent method to evaluate visual perception and cognition of bees under constant and controlled conditions in future studies. N2 - Die Bienen umfassen weltweit mehr als 20000 Arten, aber besonders eusoziale Honigbienen und Hummeln gewinnen durch ihre essenzielle Rolle bei der Bestäubung vieler Wild- und Kulturpflanzen zunehmend an Bedeutung. Ihr einzigartiger eusozialer Lebensstil, aber auch ihr komplexes Verhaltensrepertoire macht sie zu einem interessanten Insektenmodel, um Mechanismen sensorischer Wahrnehmung, sowie Fähigkeiten des Lernens und Gedächtnisses näher zu untersuchen. Da beinahe jeder lebende Organismus und viele biologische Prozessen durch Sonnenenergie beeinflusst werden, ist die Fähigkeit des Sehens im Tierreich weit verbreitet und zählt auch bei Bienen zu den wichtigsten sensorischen Sinnen. Um geeignete Nistplätze, Futterquellen oder auch Paarungsspartner zu finden, sowie zur Orientierung, nutzen Bienen verschiedenste Formen des Sehens, z. B. Farbensehen, achromatisches Sehen, oder auch das Polarisationssehen. Um Photonen einfangen und diese in ein elektrisches Signal für die weitere Verarbeitung umzuwandeln zu können, besitzen Bienen Komplexaugen, die sich aus mehreren tausend Einzelaugen, den sogeannten Ommatiden zusammensetzen. Jedes Ommatidium enthält eine festgelegte Anzahl an Photorezeptoren, welche durch ein spezifisches Opsin- Protein mit einer bestimmten spektralen Empfindlichkeit charakterisiert sind. Unterschiedliche visuelle Ansprüche wie zum Beispiel die Wahrnehmung einer einzelnen Königin während ihres Paarungsfluges durch einen Drohn oder die Identifizierung und Unterscheidung von Blüten während des Sammelflugs einer Arbeiterin, führten zu einer geschlechtsspezifischen Morphologie und Physiologie männlicher und weiblicher Komplexaugen. Seit Karl von Frisch vor mehr als 100 Jahren zeigen konnte, dass Honigbienen Farben wahrnehmen können, wurden viele Anstrengungen unternommen, ein besseres Verständnis für die molekularen und physiologischen Eigenschaften des (geschlechtsspezifischen) Bienenkomplexauges zu entwickeln. Dennoch ist bis heute wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen bekannt, die während der Puppenentwicklung der Biene zur Bildung der Retina und der spezifischen Verteilung der Photorezeptoren innerhalb der Retina führen. Daher wurde in Kapitel 2 dieser Thesis das Ziel verfolgt, die retinale Entwicklung sowie die Determinierung der Photorezeptoren im Honigbienenauge weiter aufzuschlüsseln. In einem ersten Schritt wurde das zeitliche Opsinexpressionsmuster während der Puppenentwicklung von Drohnen und Arbeiterinnen der Honigbiene durch Quantifizierung der Opsin-mRNA Expression, untersucht. Erste Ergebnisse zeigten, dass Drohnen und Arbeiterinnen während ihrer Puppenentwicklung drei verschiedene Opsin-Gene, UVop, BLop und Lop1 exprimieren, welche letztendlich drei verschiedene Photorezeptortypen hervorbringen, einen ultraviolett- , blau- und grün-sensitiven Photorezeptor. Die Opsin-Expressionsmuster unterschieden sich nicht nur zwischen den Geschlechtern, sondern auch im Expressionsbeginn der jeweiligen Opsine während der Retinaentwicklung. Immunfärbungen der sich entwickelnden Retina zeigten außerdem, dass die Retina von Honigbienen zu Beginn ihrer Entwicklung zunächst nur aus einer sehr dünnen Hypodermis besteht, jedoch bereits alle retinale Strukturen enthält. Die Photorezeptordeterminierung bei Honigbienen lässt auf einen zweistufigen Prozess schließen, da ab etwa der Mitte der Verpuppung die Opsinexpression signifikant zunimmt und Hand in Hand mit der Differenzierung der Rhabdome verläuft. Im ersten Schritt, während der späten Puppenphase, erfolgt die Festlegung des Photorezeptortyps in den jeweiligen Photorezeptorzellen. Im zweiten Schritt, kurz nach dem Schlupf der Biene, nimmt dann die Quantität der Opsinexpression stark zu, nämlich bis um das 25-fache. Bisher wurden die zugrundliegenden Mechanismen, die die verschiedenen Photorezeptortypen determinieren, zum Teil in Schmetterlingen, aber besonders intensiv in der Taufliege, Drosophila melanogaster, untersucht. Interessanterweise scheinen die molekularen Mechanismen innerhalb der Insekten konserviert zu sein und beispielsweise die zwei Transkriptionsfaktoren, spalt und spineless, welche während der Photorezeptordeterminierung in Fliegen und Schmetterlingen eine essenzielle Rolle spielen, auch in der Honigbiene identifiziert. In Kapitel 3 habe ich die Expressionsmuster dieser beiden Transkriptionsfaktoren während der Puppenentwicklung von Honigbienenarbeiterinnen untersucht und konnte zeigen, dass spalt hauptsächlich in den ersten Puppenstadien exprimiert wird was vermutlich mit dem Beginn der BLop -Expression korreliert. Spineless zeigte hingegen in der Mitte der Puppenentwicklung einen markantes Maximum in seiner mRNA Expression, was mit der Expression von Lop1 zusammenhängen könnte. Ob spalt und spineless jedoch auch in der Honigbiene eine Rolle in der Photorezeptordeterminierung spielen, bleibt noch zu untersuchen. Zum Beispiel durch einen Knockdown/out des jeweiligen Transkriptionsfaktors während der Retinaentwicklung, der zu einem spektralen Phänotyp, beispielsweise einem dichromatischen Auge, führt. Solche spektralen Phänotypen könnten dann in Verhaltensexperimenten getestet werden, um Aufschluss über die Funktion einzelner Photorezeptoren für das Farbensehen und die Synchronisierung der inneren Uhr gewinnen zu können. Um jedoch die Farbunterscheidungsfähigkeiten von Bienen und die Qualität in der Farbwahrnehmung evaluieren zu können ist ein zuverlässiger Verhaltensversuch vonnöten. Daher war es in Kapitel 4 mein Ziel, das visuelle PER Paradigma als passende Verhaltensmethode für das Testen von Farbensehen in Bienen zu etablieren. Seit mehreren Jahrzehnten gilt die visuelle Konditionierung der PER bei Bienen als schwierig und war bei der europäischen Honigbiene bisher ohne ein Abschneiden der Antennen oder ohne Präsentation weiterer Cues, wie Duft oder Bewegenung, nicht erfolgreich. Daher wurde das experimentelle Setup zunächst bei Hummeln etabliert, welche sich schon in anderen Studien als zuverlässige und robuste Versuchstiere herausgestellt hatten, beispielsweise während elektrophysiologischer Untersuchungen. Arbeiterinnen und Drohnen der schwarzen Erdhummel, Bombus terrestris, waren fähig verschiedene monochromatische Lichtstimuli mit einer Zuckerbelohnung zu assoziieren und schafften es auch, einen unbelohnten von einem belohnten Farbstimulus zu unterscheiden. Auch konnten sie den gelernten Stimulus nach zwei Stunden erneut abrufen und Arbeiterinnen zeigten die Fähigkeit, die gelernte Information erfolgreich in einen neuen Verhaltenskontext zu übertragen. Im nächsten Schritt wurde der Versuchsaufbau für Honigbienen adaptiert, sodass ich diesen in Kapitel 5 bei zwei mittelgroßen Honigbienenarten, der asiatischen Honigbiene, Apis cerana, und in der europäischen Honigbiene, Apis mellifera, verwenden konnte. Beide Honigbienenarten waren fähig, zwei monochromatische Lichtstimuli, Blau und Grün, mit Absorptionsmaxima von 435 nm und 528 nm, mit einer Belohnung zu assoziieren und zwischen beiden Stimuli zu unterscheiden. Ähnlich den Hummeln, konnten auch die asiatischen und europäischen Honigbienen den gelernten Stimulus erfolgreich nach zwei Stunden erneut abrufen. Die visuellen Konditionierungssetups und -Protokolle in meinen Untersuchungen unterschieden sich von denen vorangegangener Studien um einen entscheidenden Faktor, der von besonderer Bedeutung für eine erfolgreiche visuelle Konditionierung der PER von Bienen zu sein scheint, nämlich die Präsentationsdauer des konditionierten Stimulus. Da in vorangegangenen Studien eine visuelle Konditionierung der PER dazu tendierte nur dann erfolgsversprechend zu sein, wenn der konditionierte Stimulus für mehr als 10 s präsentiert wurde, habe ich in Kapitel 6 verschiedene Längen der Stimuluspräsentation systematisch getestet. Unmanipulierte Honigbienenarbeiterinnen konnten erfolgreich zwischen zwei monochromatischen Stimuli unterscheiden, wenn der Stimulus für 10 s präsentiert wurde, aber scheiterten, wenn die Stimuluspräsentation kürzer als 4 s war. Um ein vergleichbareres Konditionieren der Bienen zu ermöglichen, entwickelte ich ein neues Setup, welches einen Shutter beinhaltete, der durch ein PC basiertes Softwareprogramm gesteuert wurde. Das überarbeitete Setup ermöglicht eine präzisiere und automatisierte visuelle PER Konditionierung und bietet nun für zukünftige Studien eine exzellente Methode, visuelle Wahrnehmung und Kognition von Bienen unter konstanten und kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. KW - Biene KW - Komplexauge KW - Farbensehen KW - bees KW - compound eyes KW - retinal development KW - color vision KW - Netzhaut KW - Entwicklung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150997 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Florian Christoph T1 - Bestimmung der Netzhautdicke in Abhängigkeit von Alter und Achsenlänge des Auges mit Hilfe der Optischen Kohärenz-Tomographie T1 - Determination of retinal thickness in relation to the age and axial length using optical coherence tomography N2 - Die vorliegende Dissertation geht der Fragestellung nach, inwieweit ein Zusammenhang zwischen der Netzhautdicke und dem Alter des entsprechenden Probanden einerseits sowie der Netzhautdicke und der Achsenlänge des Augapfels andererseits besteht. Der klinische Eindruck, daß die Bulbuswand myoper / kurzsichtiger Augen, die sich durch eine größere Achsenlänge des Auges auszeichnen, dünner ist, wurde bereits durch sonographische Untersuchungen dokumentiert. Allerdings stößt diese Untersuchungstechnik mit ihrem Auflösungsvermögen von 150 µm bei der Quantifizierung der Netzhautdicke als innerste der drei Bulbuswandschichten an ihre Grenzen. Mit dem Retinal Thickness Analyzer (RTA) und der Optischen Kohärenz- Tomographie (Optical Coherence Tomography, OCT) stehen mittlerweile sehr viel genauere Meßmethoden zur Verfügung, die Netzhautdicke in vivo zu bestimmen. In der vorliegenden, prospektiv durchgeführten Studie, wurde die exakteste dieser Untersuchungsverfahren zur Messung der Netzhautdicke, die Optische Kohärenz- Tomographie (Auflösungsvermögen 10 – 15 µm), bei 159 Probanden (Alter 13 bis 92 Jahren mit einer homogenen Verteilung zwischen 20 und 80 Jahren) mit mindestens einer normalen Netzhaut durchgeführt. Die Netzhautdickenmessung erfolgte dabei mit einem 2,8 mm langen linearen horizontalen Scan, zentriert auf die Foveola, der durch einen zusätzlichen gleichartigen, jedoch vertikalen Scan ergänzt wurde. Als Messergebnis lieferte das OCT jeweils ein entsprechendes Schnittbild der Netzhaut von 2,8 mm Länge im Bereich der Makula, das eine exakte Bestimmung der Netzhautdicke erlaubt. Mit dieser wurde anschließend der statistische Zusammenhang mit der sonographisch ermittelten Achsenlänge des Augapfels (Mittelwert: 23,6 ± 1,1 mm, Bereich: 20,5 bis 28,5 mm; Mittelwert des sphärischen Äquivalent der Refraktion: – 0,16 ± 2,23 dpt, Bereich: + 7,25 dpt bis – 11,125 dpt) sowie mit dem Lebensalter der Probanden untersucht. In der Foveola beträgt die Netzhautdicke durchschnittlich 142 ± 18 µm, in 1 mm Abstand nasal davon 266 ± 17 µm, temporal davon 249 ± 18 µm. Demzufolge müssen Netzhautdicken im Bereich der Foveola unter 110 µm und über 190 µm, perifoveal unter 200 µm oder über 300 µm als pathologisch gewertet werden, wenn man eine Irrtumswahrscheinlichkeit von 5 % zugrunde legt. Aufgrund der guten Korrelation korrespondierender Netzhautareale der beiden Augen eines Individuums (Messung bei insgesamt 46 Probanden) sollten große Seitenunterschiede auch innerhalb dieses Normbereiches zu einer kritischen Prüfung der Meßwerte führen und bei methodischer Fehlerfreiheit als pathologisch gewertet werden. Der Unterschied von 17 µm zwischen nasaler und temporaler Netzhautdicke ist statistisch hochsignifikant (Korrelationskoeffizient r = 0,82, p < 0,0001) und durch die nach nasal zur Papille zusammenlaufenden Nervenfasern bedingt. Die Netzhautdicke in der Nähe der Gefäßbögen ist mit etwa 270 µm hochsignifikant größer als in der temporalen Netzhaut (p < 0,0001), wodurch der bündelförmige Verlauf der Nervenfasern zur Darstellung kommt. Die Korrelation korrespondierender Netzhautareale desselben Probanden 1 mm superior und inferior der Foveola ist hoch (p < 0,0001). Der mittlere Variationskoeffizient der mit Hilfe der OCT ermittelten Netzhautdicke in der Foveola beträgt 4,2 % (6 µm), ein Beleg für die hohe Reproduzierbarkeit der OCT-Messungen. 1 mm nasal und temporal ist der Variationskoeffizient der Netzhautdicke mit 2 % (5,5 µm) bzw. 2,2 % (5,5 µm) nochmals niedriger, bedingt durch die in diesem perifoveolaren Bereich der Netzhaut nur geringgradigen Unterschiede in der Netzhautdicke. Entgegen der Studienhypothese besteht eine Korrelation nur zwischen der nasalen, nicht jedoch der temporalen oder foveolaren Netzhautdicke und dem Alter des entsprechenden Probanden. Ebenso wenig besteht eine Korrelation zwischen der Netzhautdicke und der Achsenlänge des Auges. Demzufolge muß bei Messungen der foveolaren oder temporalen Netzhautdicke bei pathologisch veränderter Netzhaut, z.B. bei einem Makulaödem, weder ein Korrekturfaktor für das Probandenalter noch für die Achsenlänge des Auges berücksichtigt werden. Die vorliegenden Ergebnissen der Netzhautdicke sind daher als Normwerte für die nicht pathologisch veränderte Netzhaut anzusehen. Bei der nasalen Netzhautdicke ist ggf. aber eine geringfügig dünnere Netzhaut im hohen Alter zu berücksichtigen. N2 - PURPOSE: It is unknown whether the thickness of the retina depends on axial length or on age. We therefore used optical coherence tomography (OCT) to study this relationship. METHODS AND MATERIALS: We recruited 159 subjects aged 13-92 years (205 eyes) without macular pathology. OCT measurements included three horizontal scans and one vertical scan through the fovea. Axial length was determined by an analog high-resolution biometric unit. RESULTS: There was no correlation between retinal thickness and either axial length or age. Mean retinal thickness in the fovea was 142 +/- 18 microns. In the nasal retina thickness was significantly increased to 266 +/- 17 microns, compared to 249 +/- 18 microns in the temporal retina. Retinal thickness in subjects two eyes was significantly correlated. CONCLUSIONS: Since retinal thickness does not depend upon age or length of the eye, no corrections are necessary when analyzing pathological retinal thickening, such as in diabetic retinal disease. KW - Netzhaut KW - Dickenmessung KW - Auge KW - Längenmessung KW - Alter KW - normale Netzhautdicke KW - Achsenlänge des Auges KW - Alter des Auges KW - Optische Kohärenz-Tomographie KW - retinal thickness KW - age KW - axial length KW - optical coherence tomography KW - OCT Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35985 ER - TY - THES A1 - Förster, Johanna R. T1 - Identifizierung und Analyse von Proteininteraktionen bei zwei Mitgliedern der MAGUK-p55-Subfamilie, MPP4 und MPP5 T1 - Identification and analysis of protein interactions of two members of the MAGUK p55 subfamily, MPP4 and MPP5 N2 - Gegenstand der vorliegenden Untersuchungen waren das retinaspezifische palmitoylierte Membranprotein 4 (engl. membrane palmitoylated protein 4, MPP4) und das ubiquitär exprimierte MPP5, die beide zur großen Familie der Membran-assoziierten Guanylatkinasen (engl. membrane-associated guanylate kinases, MAGUKs) gehören. Beide Proteine haben wichtige organisatorische Funktionen als Adapterproteine in der Netzhaut. MPP4 ist am Aufbau von präsynaptischen Proteinkomplexen in den Photorezeptor-Ribbonsynapsen beteiligt. Ein Fehlen von MPP4 in Mäusen führt zum Verlust von einigen präsynaptischen Proteinen von der Ribbonsynapse, was eine wichtige Rolle von MPP4 für die Organisation dieses Komplexes indiziert. Um neue Komponenten dieses Multiproteinkomplexes zu identifizieren, wurde in der vorliegenden Arbeit ein proteomischer Ansatz etabliert. Dazu wurde der MPP4-assoziierte Proteinkomplex aus Proteinextrakten der bovinen Retina durch Immunaffinitätschromatographie isoliert, mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und resultierende Protein-spots massenspektrometrisch analysiert. Diese Untersuchungen identifizierten 18 kopräzipitierte Proteine. Darunter waren der bekannte Interaktionspartner Veli3 und das MAGUK-Protein PSD95. Für letzteres konnte gezeigt werden, dass speziell die β-Isoform von PSD95 mit MPP4 über die N-terminalen L27-Domänen heterodimerisiert. Daneben konnte die Assoziation von MPP4 mit Hsc70 und Recoverin durch unabhängige Bindungs-assays verifiziert werden, wobei diese Interaktionen indirekt waren und möglicherweise von retinaspezifischen Proteinen vermittelt werden. Diese Ergebnisse unterstützen die herausragende Rolle von MPP4 als Gerüstprotein für die Organisation eines Proteinkomplexes der Photorezeptorsynapse, der an der Regulierung der Ca2+-Homöostase in den präsynaptischen Enden, sowie vermutlich auch an der Exozytose der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Die übrigen kopräzipitierten Proteine waren Bestandteile des Zytoskeletts und verschiedener Signalwege und wahrscheinlich unspezifische Kontaminanten. Das MPP5-Protein ist Teil eines evolutionär konservierten Proteinkomplexes, der für die Entstehung und Aufrechterhaltung der apikobasalen Polarität in Epithelzellen eine wichtige Rolle spielt und in der Netzhaut für die speziellen Zellverbindungen zwischen Müller-Gliazellen und Photorezeptoren in der externen limitierenden Membran essentiell ist. Mutationen, die zu Störungen in der Funktion dieses Proteinkomplexes führen, verursachen retinale Defekte bei Mensch (z.B. Retinitis Pigmentosa, Lebersche kongenitale Amaurose), Maus, Zebrafisch und Fruchtfliege. Die PDZ-Domäne von MPP5 bindet an den C-Terminus der CRB-Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde die Auswirkung einer Punktmutation in der PDZ-Domäne von MPP5 (V301N), funktionell untersucht. Diese hat im Zebrafisch eine fehlende Photorezeptoradhäsion und die Zerstörung der retinalen Architektur zur Folge. Es wurde gezeigt, dass die V301N-Mutation die Interaktion zwischen MPP5 und den drei CRB-Isoformen verhindert. Außerdem führt sie zu einer Fehllokalisierung von heterolog exprimiertem MPP5V301N in MDCK-Zellen, die zudem einen erhöhten transepithelialen Widerstand aufweisen. Über quantitative real-time PCR wurde in diesen Zellen eine verminderte Genexpression von Untereinheiten des apikalen epithelialen Natriumkanals ENaC und der basolateralen Na+/K+-ATPase festgestellt, was die Ursache für einen verminderten Ionenfluss durch die Zellschicht darstellen könnte. Somit übt heterolog exprimiertes MPP5V301N in MDCK-Zellen einen dominanten Effekt aus, der möglicherweise über einen Einfluss auf die Genregulation bestimmter Proteine vermittelt wird. Zur Untersuchung welche Auswirkungen die MPP5V301N-Mutation in vivo hat, wurde eine MPP5V301N-knock-in-Mauslinie generiert. Die bisherige Charakterisierung der Mäuse zeigte bei heterozygoten Tieren keinen äußerlich erkennbaren Phänotyp, wohingegen homozygote Mäuse nicht lebensfähig waren. Vermutlich führt das Vorkommen beider mutanter Allele in frühen embryonalen Stadien zum Abstoßen der Embryos. Das Mausmodell bietet die Basis für weitere Untersuchungen über die molekularen Konsequenzen einer Expression von MPP5V301N in der Netzhaut und anderen Geweben und wird Beiträge zur Aufklärung von Entstehungsmechanismen CRB1-MPP5-assoziierter Netzhauterkrankungen liefern. N2 - The objects of the present study were the retina specific membrane palmitoylated protein 4 (MPP4) and the ubiquitous expressed MPP5 protein which belong to the large family of the membrane-associated guanylate kinase homologs (MAGUKs). Both proteins have important organizational functions as adaptor proteins in the retina. MPP4 is involved in the assembly of presynaptic protein complexes in the photoreceptor synapses. The absence of MPP4 in mice leads to the loss of several presynaptic proteins from the ribbon synapse indicating an important role for MPP4 in organizing this complex. This work was aimed to identify new components of this multiprotein complex by establishing a proteomic approach. More precisely, the MPP4-associated protein complex was isolated with immunoaffinity chromatography from bovine retinal protein extracts followed by two-dimensional electrophoresis and analysis of the resulting protein spots by mass spectrometry. This analysis identified 18 co-precipitated proteins. Among these molecules the known interacting partner Veli3 and the MAGUK protein PSD95 were detected. For the latter, a selective association between MPP4 and the PSD95-β isoform was demonstrated showing specific heterodimerization of their N-terminal L27 domains. Additionally independent binding assays verified the association of MPP4 with recoverin and Hsc70. These interactions seem to be indirect and are presumably mediated by retina specific proteins in vivo. In summary, these findings support a protruding role for MPP4 as scaffolding protein for the organization of a protein complex of the photoreceptor synapses, which is involved in the regulation of Ca2+ homeostasis within the presynaptic terminals and eventually plays a role in synaptic vesicle exocytosis. The remaining co-precipitated proteins represented cytoskeletal constituents and components of different pathways and were probably unspecific contaminants. The MPP5 protein, a member of the evolutionarily conserved CRB protein complex, plays an important role in establishing and maintaining the apicobasal polarity of epithelial cells. Furthermore, this complex is essential for specific cell junctions between Müller glia cells and photoreceptors in the outer limiting membrane of the retina. Mutations that disrupt the function of this protein complex were reported to cause retinal defects in human (e.g. retinitis pigmentosa, Leber’s congenital amaurosis), mouse, zebrafish and fruit fly. The PDZ domain of MPP5 binds to the C-terminus of the CRB proteins. The present study aimed to analyze the consequences of a point mutation within the PDZ domain of MPP5 (V301N). In zebrafish, this mutation resulted in the loss of photoreceptor adhesion and in the disruption of retinal layers. It was demonstrated that the V301N mutation prevents the interaction between MPP5 and the three CRB isoforms. Additionally, heterologously expressed MPP5V301N mislocalizes in MDCK cells which furthermore develop an increased transepithelial resistance. Quantitative real-time PCR revealed decreased gene expression levels for subunits of the apical epithelial sodium channel (ENaC) and the basolateral Na+/K+-ATPase, supposedly causing the reduced ion movement through the cell layer. Thus, heterologously expressed MPP5V301N apparently has a dominant effect in MDCK cells which might be mediated by an influence on the gene expression of other yet unknown proteins. To further elucidate the MPP5V301N mutation in vivo, a knock in mouse line was generated. So far the characterization of these mice revealed no apparent phenotype for heterozygous animals, whereas homozygous mice were not viable. The presence of both mutant alleles presumably results in a rejection at early embryonic stages. The mouse model provides the basis to further analyze molecular consequences of MPP5V301N expression in the retina and other tissues and will contribute to enlighten the development of CRB1-MPP5-associated retinal diseases. KW - Netzhaut KW - Multiproteinkomplex KW - Domäne KW - Ribbon-Synapse KW - Proteomanalyse KW - MPP4 KW - PSD95 KW - MPP5 KW - ENaC KW - Na-K-ATPase KW - photoreceptor synapse KW - proteomic approach KW - multi protein complex KW - retina KW - PDZ domain Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37269 ER -