TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Johann T1 - Wasserstoffbrückengesteuerte Ausrichtung von Merocyaninfarbstoffen für photorefraktive Materialien T1 - Hydrogen-Bond-Directed Orientation of Merocyanine Dyes for Photorefractive Materials N2 - Merocyaninchromophore spielen eine herausragende Rolle bei der Entwicklung von photorefraktiven Materialien für Anwendungen in der Holographie. Der photorefraktive Effekt beruht auf einer Orientierung der dipolaren Merocyanine in einem elektrischen Feld. Diese können umso effektiver ausgerichtet werden, je größer ihr Dipolmoment ist. Folglich sollten Merocyanine mit sehr großen Dipolmomenten den gewünschten Effekt hervorbringen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass solche Merocyanine Dimere mit antiparalleler zentrosymmetrischer Struktur bilden. In dieser Anordnung addieren sich die Dipolmomente destruktiv, so dass die dipolare Eigenschaft des Materials verloren geht. In dieser Arbeit ist es gelungen, Merocyanine über sechsfache Wasserstoffbrückenbindungen zu supramolekularen Strukturen mit großen resultierenden Dipolmomenten zu assoziieren. Diese Komplexe werden in schwach polaren Lösungsmitteln sogar bei sehr niedrigen Farbstoffkonzentrationen gebildet. N2 - Merocyanine dyes play a major role in the development of photorefractive materials to be applied in holography. The photorefractive effect is based on the orientation of dipolar merocyanine dyes by an external electric field. Merocyanine dyes with very high dipole moments are supposed to be the most suitable for achieving an optimal effect because, with increasing dipole moment, a higher degree of orientation can be achieved are the more efective is the their orientation. However, strongly dipolar merocyanine dyes form antiparallel dimers with vanishing dipole moment due to their dipolar interaction. Thus, the dimers can not be oriented by an electric field. In this thesis, merocyanine dyes were successfully assembled through six-fold hydrogen-bonding into supramolecular structures with large resulting dipole moments. In less polar solvents, these complexes are formed even at very low dye concentration. KW - Merocyanine KW - Wasserstoffbrückenbindung KW - Supramolekulare Chemie KW - Ausrichtung KW - Polymethinfarbstoff KW - Rezeptor KW - Dipolmoment KW - Dipol-Dipol-Wechselwir KW - Hamilton-Rezeptor KW - Merocyanine Dye KW - Hydrogen-Bond KW - Orientation KW - Supramolecular Chemistry KW - Synthesis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27156 ER - TY - THES A1 - Andres, Oliver T1 - Interaktion von Masernviren mit vaskulären Endothelzellen T1 - Interaction of measles virus with vascular endothelial cells N2 - Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind. N2 - Although an effective live vaccine is available, measles still represents a major infectious disease causing about 750,000 deaths a year, preferentially in children. Due to the measles virus (MV)-induced immunosuppression secondary bacterial infections as otitis or pneumonia are common complications. Neurological involvement can lead to the acute postinfectious measles encephalitis (APME), which usually ends up with severe cerebral damage, or to the lethal subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). In particular, immunosuppressed patients may acquire serious complications such as giant-cell pneumonia or measles inclusion body encephalitis (MIBE). However, the pathogenesis of complicated measles is poorly understood. Apart from epithelial cells, monocytes, macrophages and lymphocytes vascular endothelial cells (EC) are supposed to be important target cells for MV and involved in the pathogenesis of classic and complicated measles. Immunohistochemistry of pathologic sections has repeatedly revealed infected vascular EC in areas of extensive infection and inflammation. A systematic in-vitro analysis of the interaction of MV with human vascular EC has not been performed yet. This dissertation issues now a basic and systematic investigation of the interaction of attenuated and virulent MV strains with human vascular EC and aims to create a basis to define molecular mechanisms of MV pathogenesis. Natural conditions were approached by using primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and a human brain microvascular endothelial cell line (HBMEC) as cell culture models and attenuated and virulent MV strains as infectious agents. As a prerequisite for all experiments, both the primary cells and the cell line were examined for their growth features and their expression of EC specific marker molecules. The surface proteins membrane cofactor protein (MCP or CD46) and signaling lymphocytic activation molecule (SLAM or CD150) have previously been described as cellular receptors for MV. It has been proven here that HUVEC and HBMEC express CD46 constitutively, whereas SLAM was not detectable on various cellular levels. Neither the activation of EC with a range of cytokines and stimulants nor the contact of EC with inactivated MV induced the expression of SLAM, although an expression of toll-like receptor 2 (TLR2) by EC can be observed. Several studies on the infection of EC with MV displayed that the attenuated MV strain Edmonston (Edm) and, to a lower extent, the virulent MV strains WTFb, Wü4797 and Wü5679 are able to infect EC, accompanied by morphologic alte¬rations and cytopathic effects. Further experiments revealed efficient replication and spreading especially of Edm and Wü4797 in EC cultures. However, CD46 specific antibodies were able to reduce the capability of Edm to infect EC clearly, the replication of Wü4797, however, was not affected. Activation of EC by preincubation with a range of cytokines or stimulants had no significant effect on MV infection, interferon-α and -γ seemed to lower the extent of MV infection. The following analyses of differential receptor modulation by MV indicate that CD46 acts as a cellular receptor only for the attenuated strain Edm, but not for the virulent strains WTFb, Wü4797 or Wü5679. The results of this dissertation provide clear evidence of a CD46- and SLAM-independent infection of human vascular EC with virulent MV strains. In consequence, a further, yet unidentified cellular receptor on EC or a receptor-independent uptake and spreading mechanism of MV in EC cultures must be postulated. Finally, it is certain that EC are involved in the pathogenesis of MV-induced complications, whether directly or indirectly. KW - Masern KW - Endothel KW - Masernvirus KW - Infektion KW - Paramyxovirose KW - Slow-Virus-Infektion KW - Virusinfektion KW - Encephalitis KW - Rezeptor KW - Toll-like-Rezeptoren KW - SLAM KW - CD150 KW - CD46 KW - HUVEC KW - HBMEC KW - measles KW - HUVEC KW - HBMEC KW - SLAM KW - CD46 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25650 ER - TY - THES A1 - Großmann, Claudia T1 - Interaktion zwischen der Signaltransduktion von Aldosteron, Mineralocorticoidrezeptor und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor T1 - Cross-talk between Aldosterone / Mineralocorticoid Receptor and EGFR Signaling N2 - Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen. N2 - Classically, aldosterone-bound MR regulates blood pressure as well as salt and water homeostasis. Recent clinical studies have shown that aldosterone can additionally lead to cardiovascular and renal remodeling; however, the underlying mechanisms are still unclear. The EGFR is a growth factor and heterologous signal transducer for G-protein-coupled receptors of for example angiotensin II, phenylephrine and endothelin-1. There are indications in literature that there is cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling. For example, mineralocorticoids can lead to both enhanced vascular remodeling and an increase in EGFR-mRNA after cerebral injury and they can also augment EGF-induced vasoconstriction. Therefore, one attractive hypothesis to explain the pathophysiological effects of aldosterone is an aldosterone-induced EGFR expression with consequently increased signaling of vasoactive and profibrotic peptides. To evaluate this hypothesis, we tested EGFR expression after aldosterone incubation in different model systems. We found an aldosterone-induced EGFR expression in a heterologous expression system of CHO cells, in endogenously MR-expression cell lines as well as in primary culture. This was also true in the kidney, aorta and the heart of adrenalectomized rats equipped with osmotic minipumps. The closely related glucocorticoid receptor did not lead to enhanced EGFR expression, making this phenomenon MR specific. Because of its possible therapeutical relevance for remodeling processes, the underlying molecular mechanism of the MR/EGFR cross-talk is of special interest. To characterize it we looked at the promoter activity of the EGFR which was enhanced after incubation with aldosterone. Furthermore, we could narrow down the EGFR promoter regions involved in this interaction down to two DNA fragments. Concerning the MR, the n-terminal A/B-domain is necessary to elicit full activation of the promoter while the domains C, D, E and F by themselves are not enough. To gain evidence for the physiological and pathophysiological relevance of the interaction between the MR and the EGFR, we looked at formation of extracellular matrix and sodium reabsorption in the renal collecting duct. As an indicator for enhanced formation of extracellular matrix and remodeling, we measured fibronectin secretion of human aortal smooth muscle cells. After incubation with aldosterone and especially in the presence of EGF, an increase in fibronectin secretion could be measured that was antagonized by inhibitors of the EGFR cascade. This supports the hypothesis that the aldosterone-EGFR cross-talk is involved in cardiovascular and renal remodeling processes. Besides this pathophysiological effect, aldosterone-induced EGFR expression in the renal collecting duct can also lead to a reduction in sodium reabsoption. This counteracts the increase in sodium reabsorption classically induced by aldosterone and can therefore function as a negative feedback loop limiting long-term aldosterone-induced sodium reabsorption. In addition to traditional genomic effects, steroids can also elicit non-genotropic actions. Aldosterone, for example, can lead to MR- and EGFR-mediated activation of ERK1/2 and JNK1/2. The non-genotropic aldosterone-induced ERK activation is also reduced by c-Src-inhibitors and leads to an increase in the cytosolic-nuclear shuttling of the MR. Therefore, the non-genotropic effects can modulate genomic effects via the EGFR pathway. Furthermore, aldosterone can induce a rise in the concentration of cytosolic calcium which is independent on the MR. Consequently, non-genotropic actions are partially mediated by the MR and partially MR-independent. Overall, there is a cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling on different levels with evidence for relevance for physiological and pathophysiological processes. KW - Aldosteron KW - Corticosteroide KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - Mineralocorticoidrezeptor KW - Aldosteron KW - EGFR KW - kardiovaskuläres Remodeling KW - nicht-genotrope Steroidwirkungen KW - mineralocorticoid receptor KW - aldosterone KW - EGFR KW - cardiovascular remodeling KW - nongenotropic steroid effects Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22260 ER - TY - THES A1 - Rupprecht, Daniel T1 - Synthese und Optimierung sequenzselektiver künstlicher Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide T1 - Synthesis and Optimization of Sequence Selective Artificial Receptors for Biologically Relevant Oligopeptides N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von künstlichen Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide und besteht aus drei Teilen. Im ersten Teil wurde auf der Basis von computergestützten de novo Berechnungen ein künstlicher Rezeptor für den D-Alanin-D-Alanin-C-Terminus entwickelt. Diese Peptidsequenz befindet sich in bakteriellen Zellwänden und nimmt eine Schlüsselfunktion in der Wirkungsweise des Antibiotikums Vancomycin ein. Zur Entwicklung dieses Rezeptors wurde ein Guanidiniocarbonylpyrrol als Bindungsmotiv für Carboxylate mit einer Cyclotribenzylen-Einheit verknüpft. Letztere ist entsprechend der theoretischen Berechnungen in der Lage, die Methylreste des Alanins größenselektiv durch hydrophobe Wechselwirkungen zu koordinieren. Dieser Rezeptor wurde in umfangreichen Bindungsstudien bezüglich seiner Affinität in Wasser und seiner Substratselektivität untersucht. Zur Erhöhung der Löslichkeit und zur Bestimmung der Komplexstruktur mit NMR-Techniken in Wasser wurde ein weiteres Derivat des Rezeptors synthetisiert, welches in peripherer Position mit Triethylenglykolseitenketten substituiert ist. Auf diese Weise gelang es, einen hoch affinen (log K = 4,7) und hoch selektiven künstlichen Rezeptor für den D-Ala-D-Ala-Terminus darzustellen und umfassend zu charakterisieren. So konnte gezeigt werden, dass ein de novo Design derartiger Rezeptoren prinzipiell möglich ist. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein künstlicher Rezeptor für die interne RGD-Peptidsequenz entwickelt. Diese nimmt eine zentrale Funktion in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Erkennungsprozessen ein. Dieses Teilprojekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Schrader (Universität Marburg) durchgeführt. Dazu wurde ein Bindungsmotiv für Alkylguanidine (in der Seitenkette von Arg, R) über einen geeigneten Spacer mit einem Bindungsmotiv für Carboxylate (in der Seitenkette von Asp, D) verknüpft. Nach der Synthese und Charakterisierung einer Reihe von vier Rezeptoren konnte die grundsätzliche Anwendbarkeit dieses Ansatzes bestätigt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass der verwendete Spacer für die Effektivität der Koordinierung von besonderer Bedeutung ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde in einem dritten Teilprojekt ein kombinatorisches Festphasenprotokoll zur Optimierung derartiger Spacer entwickelt. Dabei wurde das Carboxylat-Bindungsmotiv (ein Guanidiniocarbonylpyrrol) auf einem polymeren Träger immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden umfangreiche Studien zur Synthese von Pyrrol-Tricarboxylaten und zur Verwendung verschiedener Schutzgruppen unternommen. Die Eigenschaften von drei Schutzgruppen unterschiedlicher Sensitivität (basisch, stark sauer und photolytisch spaltbar) auf dem Acylguanidin wurden in Lösung und an der festen Phase untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein umfangreiches HPLC-Protokoll zur Charakterisierung der Reaktion entwickelt. So gelang die Entwicklung und Etablierung eines universell einsetzbaren Protokolls zur Optimierung derartiger Rezeptoren, womit zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in der kombinatorischen Chemie aber auch in weiteren Teilbereichen wie der Katalyse oder der Chromatographie ermöglicht werden. N2 - The present thesis deals with the development of artificial receptors for biologically relevant peptides and consists of three parts. In the first part an artificial receptor for the D-Ala-D-Ala-D-Terminus was developed. This target plays an important role in the mode of action of the antibiotic Vancomycin. A carboxylate binding site (CBS) was synthetically combined with a cyclotribenzylene moiety. The cyclotribenzylene is capable of size selective hydrophobic coordination of the alanine methyl side chain at least according to theoretical calculations. After the synthesis the receptor was investigated regarding affinity and selectivity of target coordination in buffered aqueous media. Furthermore, a water soluble analogue with triethylene glycole substitution in peripheric position was synthesized and characterized. By this method a highly effective (log K = 4.7) and highly selective artificial receptor for D-Ala-D-Ala was developed and the usefulness of a de novo receptor design was demonstrated. In the second part an artificial receptor for the internal RGD peptide was developed, which plays an important role in cell-cell- and cell-matrix-recognition. This part was carried out in cooperation with the workgroup of Prof. Schrader (University of Marburg). Therefore, a supramolecular binding motif for alkyl guanidines (as in the side chain of Arg, R) was combined synthetically with a binding motif for carboxylates (as in the side chain of Asp, D) via a suitable spacer. After synthesis and characterization of a series of four receptors with different flexibility this concept was confirmed while lining out the particular importance of the choice of spacer. Based on these insights a solid phase protocol for optimization of such artificial receptors, especially with internal spacers, was developed in a third part. Hence, the guanidiniocarbonyl pyrrole moiety was immobilized on polymeric support. In this context extensive research aimed at the synthesis of pyrrole tricarboxylates and the use of various protective groups was performed. The chemical behavior of the protective groups of ´different sensitivity (basic, strong acidic and photolytic cleavable) for acyl guanidines was characterized in solution and on solid support. Furthermore, an N to C solid phase protocol was established. These results obtained now open the door of a wide range of applications of the CBS for receptor optimization, catalysis or chromatography. KW - Oligopeptide KW - Kombinatorische Synthese KW - Rezeptor KW - supramolekulare Chemie KW - organische Synthese KW - Bioorganik KW - kombinatorische Methodenentwicklung KW - Schutzgruppenstrategie KW - Supramolecular Chemistry KW - Organic Synthesis KW - Bioorganic Chemistry KW - Combinatorial Method Development KW - Protective Group Strategy Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20277 ER - TY - THES A1 - Hartung, Anke T1 - Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling T1 - Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Plasmamembrandomänen und deren Auswirkung auf den BMP Signalweg N2 - Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs. N2 - Endozytose von Wachstumsfaktor-Rezeptoren spielt eine entscheidende Rolle bei Aktivierung und Übertragung wie auch bei der Schwächung von Signalen. Störungen der Endozytose können schwere Krankheitsbilder hervorrufen, z.B. durch ihren Einfluss auf die Regulation der Rezeptormenge an der Zelloberfläche. BMPs sind Mitglieder der TGF-ß Superfamilie und sind involviert in die Regulation von Proliferation, Differenzierung, Chemotaxis und Apoptose. Zwei Arten von Transmembranproteinen, die Serin/Threonin-Kinase Aktivität besitzen, sind bedeutend für den BMP Signalweg – die BMP Rezeptoren BRI und BRII. Die Aktivierung von BRI und BRII erfolgt durch Ligandenbindung an präformierte Komplexe (PFCs) oder BMP2-induzierte Signalkomplexe (BISCs), die aus beiden Rezeptorarten bestehen. Wenn BMP2 an PFCs bindet, wird die Smad-Signalkaskade initiiert, wohingegen BISCs Smad-unabhängige Signale über p38 weiterleiten, was schließlich zur Produktion von alkalischer Phosphatase (ALP) führt. Das Feld der BMP Rezeptor Endozytose wurde noch nicht sehr ausführlich untersucht, genauso wenig wie die potentielle Rolle, die unterschiedliche Rezeptorlokalisierungen in verschiedenen Plasmamembran-Regionen bei der Initiierung der Signalwege, die durch PFCs bzw. BISCs aktiviert werden, spielen könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Membrandomänen sowie deren Einfluss auf die BMP Signalkaskade untersucht. Mittels Reinigung von Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus Zelllysaten und anschließender Gradientenultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass BRI und BRII mit dem caveolären Markerprotein cav-1 kofraktionieren. Darüber hinaus interagieren beide Rezeptorarten mit cav-1 und kolokalisieren auch teilweise mit cav-1 an der Plasmamembran. Obwohl diese Ergebnisse auf ein eindeutiges Vorkommen der Rezeptoren in Caveolae schließen lassen, kofraktionieren sie auch mit DRMs in Zellen, die von Natur aus keine Caveolae ausbilden, woraus man eine zusätzliche nichtcaveoläre Raft-Lokalisierung schlussfolgern kann. Des Weiteren konnte BRII mittels Immun- Elektronenmikroskopie in „clathrin-coated pits“ (CCPs) lokalisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass beide untersuchten Membranregionen die BMP Signalkaskade auf unterschiedliche Art und Weise beeinflussen. Es wurde bewiesen, dass Smad1/5 unabhängig von endozytotischen Vorgängen an der Plasmamembran phosphoryliert wird. Einerseits führte die Zerstörung von DRM-Regionen durch Cholesterindepletion zur spezifischen Inhibierung der BMP2-vermittelten ALP Produktion, ohne gleichzeitig die BMP Signalkaskade über Smads zu beeinflussen. Andererseits bewirkte eine spezifische Blockierung der Clathrin-vermittelten Endozytose eine Inhibition des BMP2-induzierten Smad-Signalwegs und auch der ALP Produktion, was auf ein Zusammenspiel von Smad-unabhängigen und Smad-abhängigen Signalwegen bei der ALP-Induzierung schließen lässt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen die Schlussfolgerung zu, dass verschiedene endozytotische Wege und Membranregionen einen bedeutenden, regulatorischen Einfluss auf die BMP Signalkaskade ausüben. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Membranlokalisierung von BMP Rezeptoren für das Einschlagen verschiedener Signalwege ausgehend von PFCs und BISCs verantwortlich ist. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Endocytose KW - BMP KW - Rezeptoren KW - Endozytose KW - Lipid Raft KW - Caveolae KW - BMP KW - receptors KW - endocytosis KW - lipid raft KW - caveolae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18360 ER - TY - THES A1 - Schwegmann, Michael T1 - Eine molekulare Fliegenfalle zur Erkennung von biologisch relevanten (poly)-anionischen Substraten T1 - a molecular flytrap for the recognition of biologically relevant (poly)-anionic substrates N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein multivalenter Rezeptor auf Basis von Guanidiniocarbonylpyrrolen zur Komplexierung von biologisch relevanten (poly)- anionischen Substraten wie Citrat, Malat und Tatrat dargestellt werden. Der Rezeptor bindet Citrat selbst in Gegenwart eines 1000fachen Überschusses an NaCl und einem 10fachen Überschuss an Bis-tris Puffer mit einer hohen Bindungskonstante von KAss = 86000 M-1 in Wasser. Wenn man Rezeptoren auf Metall- und Boronsäurebasis nicht berücksichtigt, handelt es sich nach meinem Wissen um den besten Citrat-Rezeptor, der in der Literatur bisher publiziert ist. Außerdem zeigt der Rezeptor mit einem Faktor von mindestens 8 eine hohe Selektivität für Citrat gegenüber anderen biologisch relevanten Dicarboxylaten wie Malat und Tatrat. Mithilfe von Bindungsstudien und Molecular Modeling Rechnungen konnte hergeleitet werden, welchen Einfluss die verschiedenen nicht-kovalenten Wechselwirkungen auf die Bindungskonstante haben. Dabei konnte gezeigt werden, dass Flexibilität, Hydroxy-Funktionen, pi-Stacking und Symmetrie bei den Substraten Einfluss auf die Bindungskonstanten zeigen, wobei vor allem die unpolaren Wechselwirkungen und die zusätzliche Hydroxy-Funktionen einen hohen Anteil an der Bindung zu haben scheinen. Neben der selektiven Erkennung von Citrat durch den Rezeptor konnte zusätzlich ein Sensorsystem mit Carboxyfluorescein auf Basis eines indicator displacement assays entwickelt werden, mit dem die Anwesenheit von Citrat im Gegensatz zu anderen Carboxylaten mit dem bloßen Auge (naked eye) erkannt werden kann. Neben den Polycarboxylaten zeigt der Rezeptor außerdem noch hohe Bindungskonstanten für polyanionische Zucker. So konnten z.B. für Glucophosphate mit UV-Spektroskopie Bindungskonstanten von KAss = ca. 20000 M-1 in dem sehr polaren Lösemittelgemisch 10 % DMSO/Wasser (pH = 4, Acetat-Puffer) gefunden werden. N2 - In the course of this work a multivalent receptor based on guanidiniocarbonyl-pyrrolcations for the complexation of biologically relevant (poly)-anionic substrates like citrate, malate or tatrate was synthesised. The receptor binds citrate in the presence of a 1000fold excess of NaCl and a 10fold excess of bis-tris buffer with a high binding constant of KAss = 86000 M-1 in water. To the best of my knowledge is hence the most efficient receptor for the binding of citrate in water reported so far, if receptors on metall- and boronic acid-basis are neglected. Furthermore receptor shows a high selectivity with a factor of at least 8 for citrate against other biologically relevant dicarboxylates like malate or tartrate. With the aid of binding studies and molecular modeling calculations could be determined, which influence the different non covalent interactions have on the binding constant. It was demonstrated in this way, that flexibility, hydroxyfunctions,pi-stacking and symmetry of the substrates have a major influence on the binding constant. Especially unpolar interactions and interactions with the hydroxy group seem to play a major role in the binding mode. In addition to the selective recognition of citrate with the receptor a sensor system with carboxyfluoresceine based on an indicator displacement assay (ida) could be developed. With this ida it was possible to detect citrate in contrast to other biologically relevant substrates with the naked eye. Furthermore the receptor showed high binding constants for anionic sugars. In a solvent mixture of 10 % DMSO/Water (pH = 4, acetate buffer) bindings constants of KAss = ca. 20000 M-1 were measured for the glucophosphates. KW - Supramolekulare Chemie KW - Rezeptor KW - Molekulare Erkennung KW - Molekulare Erkennung KW - Supramolekulare Chemie KW - Bioorganische Chemie KW - molecular recognition KW - supramolecular chemistry KW - bioorganic chemistry Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17829 ER - TY - THES A1 - Schmitter, Tim T1 - CEACAM3: ein neuartiger phagozytischer Rezeptor der angeborenen Immunantwort zur Erkennung human-spezifischer Pathogene T1 - CEACAM3: a new phagocytic receptor of the innate immunity recognizing human-specific pathogens N2 - Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort. N2 - The exclusivley human specific pathogen Neisseria gonorrhoeae is the causative agent of gonorrhoea a veneric disease characterized by an acute inflammation of infected area and a massive infiltration of granulocytes. During an acute, symptomatic gonorrhoeae the pathogen is able to interact with CEACAM proteins of different cells by the means of their so called OpaCEA-adhesins. In this doctaral thesis the pathogen-phagocyte-interaction was to be investigated by cell biology, biochemical and genetical methods. The contact of OpaCEA-expressing gonococci with primary granulocytes induces ruffling of the membrane and lammelipodia-like protrusion finally leading to the CEACAM-dependent phagocytosis of the pathogenic bacteria. Earlier infection-studies with pro-myelomonocytic cells were able to show that the phenotypic cytoskeleton rearrangement and the internalisation of gonococci was dependet on the stimulation of Src-family kinases and the small GTPase Rac. Initial in vitro infection studies with transiently transfected human epithelial 293 cells showed that exclusively CEACAM3-mediated internalisation of OpaCEA-expressing gonococci depends on the catalytic activity of Src-family kinases. This was further corroborated by infecting CEACAM3-expressing, genetic manipulated S-/Y-/F--deficient mouse fibroblasts with gonococci, as only cells reconstituted with c-Src were able to internalise OpaCEA-expressing gonococci. Bacterial ligation of CEACAM3 leads to Src-family kinase dependent tyrosin phosphorylation within the cytoplasmatic-tail of CEACAM3 and on the molecular level the kinase itself is able to directly interact with phosphorylated CEACAM3 via its SH2-domain. Accordingly, stimulation of the small GTPase Rac is connected to bacterial CEACAM3 ligation, as expression of a dominant negative Rac constructs only interferes with CEACAM3, but not with CEACAM6 mediated internalisation of gonococci. In addition recruitment of Rac to adhering bacteria and Rac stimulation is dependent on CEACAM3 mediated uptake and expression of the OpaCEA-adhesins. A critical part of CEACAM3 mediated signal transduction turned out to be it’s ITAM like sequence. Either mutation of both tyrosine residues or deletion of the whole cytoplasmatic tail inhibited CEACAM3-mediated Rac stimulation and accordingly internalisation of OpaCEA-expressing gonococci. However CEACAM3-mediated internalisation is not restricted to gonococci as CEACAM-binding Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae also stimulate Rac-GTP-loading while taken up via CEACAM3. In the last part of the doctoral thesis I was able to identify the molecular link between Rac stimulation and bacterial CEACAM3 engagement. Vav serves as a specific GEF towards the stimulation of the small GTPase Rac, as a dominant negative version of Vav or a specific Vav-siRNA blocks CEACAM3-mediated uptake of OpaCEA-expressing gonococci and GTP-loading of Rac respectively. Vav directly binds to CEACAM3 via it’s SH2 domain leading to a CEACAM3-Vav protein complex after phosphorylation of tyrosinresidue 230 of CEACAM3. by stimulated Src-family kinases. The uniqueness of CEACAM3-initiated signal transduction provided a method to identify it’s relevance during phagocytosis of CEACAM binding bacteria in primary human granulocytes. Especially the pharmacological inhibitor PP2 interferes in a concentration dependent manner with the uptake of gonococci in granulocytes while Nystatin which inhibits CEACAM1 and CEACAM6 dependent internalisation in vitro has no effect on bacterial uptakte in human granulocytes. Accordingly, interference of CEACAM3 mediated stimulation of Vav (TAT-Vav-dn) or Rac (Tat-Rac-dn) inhibited uptake of OpaCEA-gonococci into primary cells. In addition a CEACAM3-specific but not a CEACAM1 or CEACAM6 specific monoclonal antibody inhibited internalisation and elimination of CEACAM-binding bacteria. Therefore, the results presented in this doctoral thesis describe CEACAM3 which is exclusively expressed on human granulocytes as a novel single-chain phagocytic receptor of the innate immune system. KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Immunreaktion KW - Rezeptor KW - CEACAMs KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Haemophilus influenzae KW - Moraxella catarrhalis KW - angeborene Immunabwehr KW - CEACAMs KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Haemophilus influenzae KW - Moraxella catarrhalis KW - innate Immunity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17271 ER - TY - THES A1 - Heindel, Ulla T1 - G-Protein gekoppelte Rezeptoren für Parathormon : molekulare Determinanten der intrazellulären Signalwegankopplung T1 - G-protein coupled receptors for parathyroid hormone: molecular insights into intracellular signalling N2 - In der vorliegenden Dissertation gelang es, die strukturellen und molekularen Determinanten der PTH-Rezeptoren für die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege näher zu charakterisieren. Die Regulation des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels wird zum erheblichen Teil über den PTH1-Rezeptor (P1R) vermittelt. Parathormon (PTH) aktiviert am P1R mindestens zwei Signalwege: den durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelten Weg und den Phospholipase C-Signalweg (PLC). Der nahe verwandte PTH2-Rezeptor (P2R) kann außer durch PTH auch über das tuberoinfundibiläre Peptid (TIP39) aktiviert werden. Jedoch besitzt dieser Rezeptor keine Ankopplung an den PLC-Signalweg. Zur Aufklärung der strukturellen und molekularen Determinaten der intrazellulären Signalwegankopplung wurden verschiedene Versuchsansätze ausgewählt, die eine Untergliederung dieser Arbeit in drei Teilprojekte ermöglicht: 1) Die PTH-Rezeptoren sind wichtige Vertreter der Klasse II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der siebten Transmembrandomäne dieser Klasse zeigt ein hoch konserviertes, cytosolnahes „YCFXN“-Motiv in diesem Bereich. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte durch Punktmutationen der einzelnen Aminosäuren dieses Motivs gezeigt werden, dass dieser Abschnitt eine entscheidende Determinierungsregion dieser Rezeptorfamilie sowohl für die Ankopplung an den cAMP-Weg, als auch an den PLC-Signalweg darstellt. Die Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass dieser Bereich für die Stabilisierung der Konformation dieser Rezeptoren von großer Bedeutung ist. 2) In einem zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde durch stufenweise Angleichung des P2R an den P1R eine Reihe von funktionell exprimierten P2R/P1R Hybridrezeptoren hergestellt, die eine Übereinstimmung des intrazellulären Bereichs des P1R von bis zu 95 % erreichen. Der Nachweis des PLC-Signalwegs durch die Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositolphosphate und des intrazellulären Kalziums zeigte eindrucksvoll, dass trotz einer weitgehenden intrazellulären Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des P2R mit dem P1R die Eigenschaft des P1R an den PLC-Signalweg zu koppeln nicht auf den P2R übertragen werden kann. Dies legt nahe, dass auch extrazelluläre Bereiche und Transmembranabschnitte die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege steuern. Im Weiteren konnte für den cAMP-Signalweg durch diese Hybridrezeptoren gezeigt werden, dass im Kontext des P2R eingefügte Teilabschnitte des P1R (C-Terminus, zweite und dritte intrazelluläre Schleife ) zusammenwirken und eine effizientere Ankopplung an den cAMP-Weg ermöglichen. Weiterführende Untersuchungen der Membrantranslokation von beta Arrestin2 mit einer anschließenden Internalisierung des Rezeptors zeigten, dass sowohl der P2R als auch die hiervon abgeleiteten Hybridrezeptoren selektiv durch Stimulation mit TIP39, nicht jedoch nach einer Stimulation mit PTH, eine Translokation bewirken. Dieses Ereignis ist von den untersuchten Signalwegen (cAMP-, PLC- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalweg) unabhängig. Erstmals wurde hier gezeigt, dass der P2R eine Phosphorilierung von MAPK bewirkt, wobei hierfür einer beta-Arrestin2 Translokation nicht notwendig ist. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der PTH-Rezeptor in unterschiedlichen Rezeptorkonformationen existiert, so dass einzelne Rezeptorabschnitte unabhängig voneinander verschiedene Signale aktivieren können. 3) Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifikation von intrazellulären Interaktionspartnern des humanen P1R. Neue Protein–Interaktionen mit dem humanen P1R wurden mit einem „Yeast-two-Hybrid“ System identifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnte, als ein potentiell bedeutender intrazellulärer Interaktionspartner des humanen P1R, das PDZ-Protein PDZK1 identifiziert werden. Es gelang mit Hilfe von Koimmunpräzipitations-Experimenten und von GST-pull-down-Assays die Interaktion von PDZK1 mit dem P1R zu verifizieren. PDZK1 bindet an eine Liganden-Bindungsdomäne innerhalb des C-terminalen Abschnitts des P1R, vermutlich an die letzten vier Aminosäuren. Durch einen Hefe-Interaktionstest konnte von den vier in diesem Protein vorkommenden PDZ-Domänen die PDZ1-Domäne als einzige selektiv mit dem P1R interagierende Domäne identifiziert werden. In der Niere interagiert PDZK1 über die PDZ3-Domäne mit dem Na/Pi-Transporter IIa. Eine attraktive Hypothese ist daher die Funktion von PDZK1 als einem Bindeglied zwischem dem Rezeptor und dem Transporter und die damit einhergehende PTH- vermittelte Regulation des Phosphattransports in der Niere. Diese Hypothese bedarf aber nochweiterer funktioneller Analysen (z.B. durch Untersuchungen an PDZK1 Knock-Out Mäusen). N2 - In this project we identified structural and molecular determinants of the PTH receptor familiy with importance for coupling to intracellular signaling pathways. The PTH1-receptor (P1R) is involved in the systemic regulation of calcium and phosphate metabolism, and plays a decisive role in bone metabolism. PTH achieves this by activation of at least two intracellular signalling pathways: the adenylyl cylase (AC) and the phospholipase C (PLC) pathway. The closely related PTH2-receptor (P2R) is, in addition to PTH, also activated by tuberoinfundibular peptide of 39 residues (TIP 39), but unlike the P1R, does not couple to the PLC signaling pathway. This project achieved the identification of structural and molecular deteminatnts by three different approaches: 1) The PTH receptors belong to the class II of G-protein coupled receptors. A comparison of the amino acid sequences of the seventh transmembrane domain shows a highly conserved “YCFXN”-motif near the cytosolic interface of this domain. To examine the role of this conserved motif individual point mutations of these amino acids were generated and evaluated. Studies of the receptor mutants obtained showed that this region plays an important role in coupling to the adenylyl cylase pathway as well as to the PLC signaling pathway. The data obtained in this work suggests that the “YCFXN”-motif is of significant importance for the stabilisation of the receptor conformation. 2) To identify the structural features responsible for activating the PLC pathway, we engineered a series of hybrid P1R/P2R receptor chimeras by gradually adapting the P2R’s cytosolic interface to a P1R-like sequence. These modifications of key differing regions in the second and third loop, and the C-terminal tail allowed for > 95 % of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R. Despite these changes it was not possible to transfer the property of P1R to couple to the PLC signaling pathway to the P2R as shown impressively by the lack of activation of the PLC signaling pathway using measurements of inositol and intracellular calcium. Apparently, extracellular regions as well as transmembrane domains are required for selective coupling to intracellular signaling pathways. By contrast we could show for the cAMP signaling pathway, that when > 95 % of the P2R´s cytosolic interface had a P1R-like sequence, P1R epitopes apparently interacted with each other to result in a more efficient coupling to the cAMP signaling pathway. Stimulation of the receptor by its ligands leads to translocation of -arrestin2 to the cell surface thus initiating internalisation of the receptor. The P2R, as well as the hybrid P1R/P2R receptor chimeras, showed beta arrestin2 translocation selectively after stimulation with TIP39 but not after stimulation with PTH. Ligand-induced translocation of beta-arrestin2 was completely independent from cAMP-, PLC- and mitogen activated proteinkinases (MAPK) signaling pathways in the P2R and its derived chimeric mutants. Furthermore, we could show here for the first time, that the P2R can activate MAPK and that this is independent from a beta-arrestin2 translocation. In conclusion, the PTH-receptors can exist in different receptor conformations which apparently allow the receptors to activate different signals independently. 3) Another goal of this work was the identification of intracellular proteins interacting with the human P1R. A yeast-two-hybrid system was used to identify new protein-protein interactions of the human P1R. Using this method a possible important interacting protein could be identified. This protein was a PDZ-protein, named PDZK1. To verify this interaction co-immunoprecipitation experiments as well as GST-pull-down experiments were done. Binding of PDZK1 occurred within the C terminal region of the P1R and there probably within the last four amino acids. PDZK1 has four PDZ-domains of which the first one was the exclusively interacting domain with the P1R, as determined by a additional yeast-two-hybrid interaction experiment. In kidney the interaction of PDZK1 with the Na/Pi-transporter type IIa occurs via the third PDZ-domain. A hypothesis is that PDZK1 acts as a connecting link between the receptor and the transporter together with a PTH-mediated regulation of the phosphate-transport in kidney. However, this hypothesis will require further studies (e.g. experiments with PDZK1 knock-out mice). KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - Intrazellulärraum KW - Signaltransduktion KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - PTH KW - cAMP KW - Inositol KW - PDZ KW - G-protein coupled receptors KW - PTH KW - cAMP KW - PLC KW - PDZ Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17213 ER - TY - THES A1 - Kemmer, Diana T1 - Natürliche Lebensmittelinhaltsstoffe als Liganden des Ah Rezeptors - Identifizierung und Charakterisierung von Beta-Carbolinen mit AhR Ligandenpotential mittels funktioneller Bioassays T1 - Natural food constituents acting as ligands of the Ah receptor - identification and characterization of ß-carbolines with AhR ligand capacity using functional bioassays N2 - In der vorliegenden Arbeit werden Studien zur Identifizierung und Charakterisierung von Lebensmittelinhaltsstoffen als natürliche Liganden des Ah Rezeptors („aryl hydrocarbon receptor“) vorgestellt. Der Ah Rezeptor ist ein liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor, der an der Expression zahlreicher Metabolismusenzyme beteiligt ist. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen anhand von funktionellen AhR-abhängigen Bioassays stand die Klasse der ß-Carboline und ihrer Derivate, deren natürliches Vorkommen bereits in zahlreichen Lebensmitteln und im menschlichen Organismus beschrieben ist. Die ß-Carboline wurden für die Untersuchung auf ihr mögliches AhR Ligandenpotential ausgewählt, da sie von der Aminosäure Tryptophan abgeleitet sind, die selbst als schwacher AhR Agonist identifiziert wurde, und weil das trizyklische 9H-Pyridol[3,4-b]-Ringsystem der ß-Carboline eine strukturelle Ähnlichkeit zum prototypischen AhR Liganden 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) aufweist. Die Schwerpunkte der Untersuchungen zur AhR Ligandenaktivität von ß-Carbolinen lagen auf den Aspekten: 1) Etablierung von rekombinanten, zellbasierten funktionellen Reportergenassays; 2) Identifizierung und Charakterisierung von ß-Carbolinderivaten als Liganden des Ah Rezeptors mittels funktioneller Reportergenassays; 3) Charakterisierung mechanistischer Aspekte im AhR vermittelten Signaltransduktionsweg mittels in vitro und ex vivo Gelretardation Assays am Beispiel ausgewählter ß-Carbolinderivate mit AhR Ligandenaktivität und 4) Beschreibung der AhR Ligandenaktivität von Soja- und Würzsaucen als Modellsysteme für komplexe natürliche Lebensmittel. N2 - This research summarizes studies on the identification and characterization of compounds present in food samples, which can act as ligands of the aryl hydrocarbon receptor (Ah receptor, AhR). The Ah receptor represents a ligand-dependent transcription factor and is involved in the expression of various enzymes of the xenobiotic metabolism. Our analyses using functional AhR-dependent bioassays were focusing on ß-carbolines and their derivatives. These compounds have been described to be naturally occurring in foods and in the human body. The ß-carbolines were chosen to be evaluated for their potential to act as AhR ligands because they are derived from the amino acid tryptophan, which is a weak AhR agonist itself, and due to their structural resemblance to the tricyclic 9H-pyridol[3,4-b] ring system of the ß-carbolines to the prototypic AhR ligand 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). As the main focus of the studies was to evaluate the capacity of ß-carbolines to act as AhR ligands, the studies covered the following aspects: 1) Establishment of recombinant, cell-based functional reporter gene assays; 2) Identification and characterization of ß-carboline derivatives as ligands of the AhR by the means of functional reporter gene assays; 3) Characterization of mechanistic aspects in the AhR-mediated signal transduction pathway of distinct ß-carboline derivatives acting as AhR ligands using in vitro and ex vivo gelretardation assays; and 4) Description of the AhR ligand activities of soy and seasoning sauces, representing model systems for complex and natural food products. KW - Carbolin KW - Kohlenwasserstoffe KW - Arylgruppe KW - Rezeptor KW - Bioassay KW - ß-Carboline KW - Ah Rezeptor KW - Bioassay KW - natürliche Liganden KW - TCDD KW - ß-carbolines KW - Ah receptor KW - bioassay KW - natural ligands KW - TCDD Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15193 ER -