TY - THES A1 - Brembs, Björn T1 - An Analysis of Associative Learning in Drosophila at the Flight Simulator T1 - Eine Ananlyse des assoziativen Lernens von Drosophila im Flugsimulator N2 - Most natural learning situations are of a complex nature and consist of a tight conjunction of the animal's behavior (B) with the perceived stimuli. According to the behavior of the animal in response to these stimuli, they are classified as being either biologically neutral (conditioned stimuli, CS) or important (unconditioned stimuli, US or reinforcer). A typical learning situation is thus identified by a three term contingency of B, CS and US. A functional characterization of the single associations during conditioning in such a three term contingency has so far hardly been possible. Therefore, the operational distinction between classical conditioning as a behavior-independent learning process (CS-US associations) and operant conditioning as essentially behavior-dependent learning (B-US associations) has proven very valuable. However, most learning experiments described so far have not been successful in fully separating operant from classical conditioning into single-association tasks. The Drosophila flight simulator in which the relevant behavior is a single motor variable (yaw torque), allows for the first time to completely separate the operant (B-US, B-CS) and the classical (CS-US) components of a complex learning situation and to examine their interactions. In this thesis the contributions of the single associations (CS-US, B-US and B-CS) to memory formation are studied. Moreover, for the first time a particularly prominent single association (CS-US) is characterized extensively in a three term contingency. A yoked control shows that classical (CS-US) pattern learning requires more training than operant pattern learning. Additionally, it can be demonstrated that an operantly trained stimulus can be successfully transferred from the behavior used during training to a new behavior in a subsequent test phase. This result shows unambiguously that during operant conditioning classical (CS-US) associations can be formed. In an extension to this insight, it emerges that such a classical association blocks the formation of an operant association, which would have been formed without the operant control of the learned stimuli. Instead the operant component seems to develop less markedly and is probably merged into a complex three-way association. This three-way association could either be implemented as a sequential B-CS-US or as a hierarchical (B-CS)-US association. The comparison of a simple classical (CS-US) with a composite operant (B, CS and US) learning situation and of a simple operant (B-US) with another composite operant (B, CS and US) learning situation, suggests a hierarchy of predictors of reinforcement. Operant behavior occurring during composite operant conditioning is hardly conditioned at all. The associability of classical stimuli that bear no relation to the behavior of the animal is of an intermediate value, as is operant behavior alone. Stimuli that are controlled by operant behavior accrue associative strength most easily. If several stimuli are available as potential predictors, again the question arises which CS-US associations are formed? A number of different studies in vertebrates yielded amazingly congruent results. These results inspired to examine and compare the properties of the CS-US association in a complex learning situation at the flight simulator with these vertebrate results. It is shown for the first time that Drosophila can learn compound stimuli and recall the individual components independently and in similar proportions. The attempt to obtain second-order conditioning with these stimuli, yielded a relatively small effect. In comparison with vertebrate data, blocking and sensory preconditioning experiments produced conforming as well as dissenting results. While no blocking could be found, a sound sensory preconditioning effect was obtained. Possible reasons for the failure to find blocking are discussed and further experiments are suggested. The sensory preconditioning effect found in this study is revealed using simultaneous stimulus presentation and depends on the amount of preconditioning. It is argued that this effect is a case of 'incidental learning', where two stimuli are associated without the need of reinforcement. Finally, the implications of the results obtained in this study for the general understanding of memory formation in complex learning situations are discussed. N2 - Die meisten Lernsituationen sind von komplexer Natur und bestehen aus einer engen Verknüpfung des Verhaltens eines Tieres (B) mit den wahrgenommenen Stimuli. Entsprechend der Reaktion des Tieres auf diese Stimuli werden diese als entweder biologisch neutral (konditionierte Stimuli, CS) oder signifikant (unkonditionierte Stimuli, US oder Verstärker) klassifiziert. Eine typische Lernsituation ist also durch eine Dreiwegebeziehung zwischen B, CS und US gekennzeichnet. Eine funktionelle Charakterisierung der Einzelassoziationen während des Lernens in einer solchen Dreiwegebeziehung war experimentell bisher kaum zugänglich. Operationell wird daher zwischen klassischer Konditionierung als verhaltensunabhängigem Lernvorgang (CS-US Assoziationen) und operanter Konditionierung als essentiell verhaltensabhängigem Lernen (B-US Assoziationen) unterschieden. In den meisten bisher beschriebenen Lernexperimenten ist noch nicht einmal diese Trennung in Einzelassoziationen vollständig durchzuführen gewesen. Im Drosophila Flugsimulator, in dem das relevante Verhalten eine einzelne Bewegungsvariable (das Gierungsdrehmoment) ist, können zum ersten Mal die operanten (B-US, B-CS) und die klassischen (CS-US) Bestandteile einer komplexen Lernsituation völlig getrennt und auf ihre Interaktionen hin untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die Beiträge der Einzelassoziationen (CS-US, B-US und B-CS) bei der Akquisition der Gedächtnismatrize in komplexen Lernsituationen untersucht, als auch die Eigenschaften einer besonders prominenten Einzelassoziation (CS-US) während einer komplexen Lernsituation zum ersten Mal weitgehend charakterisiert. Mit einer gejochten (yoked) Kontrolle kann gezeigt werden, dass das klassische (CS-US) Musterlernen umfangreicheres Training als das operante Musterlernen erfordert. Außerdem kann die Fliege einen operant gelernter Stimulus von dem Verhalten mit dem er gelernt wurde, auf ein anderes Verhalten im Test übertragen. Dieses Resultat zeigt eindeutig, dass während der operanten Konditionierung klassische (CS-US) Assoziationen gebildet werden können. In einer Erweiterung dieses Ergebnisses zeigt sich, dass solch eine klassische Assoziation, wenn sie gebildet wird, die Bildung einer operanten Assoziation blockiert, die ohne operante Kontrolle der klassisch assoziierten Stimuli gebildet würde. Stattdessen scheint sich der operante Bestandteil weniger ausgeprägt zu entwickeln und ist eventuell in einer komplexen Dreiwege-Assoziation eingebunden. Die Dreiwege-Assoziation könnte entweder als sequentielle B-CS-US oder als hierarchische (B-CS)-US Assoziation implementiert sein. Der Vergleich einer einfachen klassischen (CS-US) mit einer komplexen operanten (B, CS und US) Lernsituation und einer einfachen operanten (B-US) mit einer anderen komplexen operanten (B, CS und US) Lernsituation, ermöglicht das Postulat einer Hierarchie der Prädiktoren für Verstärker. Operantes Verhalten während einer komplexen operanten Lernsituation wird wenig oder überhaupt nicht konditioniert. Die Assoziierbarkeit der klassischen Stimuli ohne Relation zum Verhalten des Tieres (CS-US) sind - wie operantes Verhalten alleine (B-US) auch - von mittlerer Assoziierbarkeit. Stimuli die von operantem Verhalten kon-trolliert werden, erhöhen am schnellsten ihre assoziative Stärke. Sind mehrere Stimuli während des Lernvorgangs zugänglich, stellt sich erneut die Frage, welche von den CS-US Assoziationen gebildet werden. Eine Vielzahl verschiedenster Studien in Vertebraten wiesen erstaunlich übereinstimmende Ergebnisse auf. Diese Ergebnisse inspirierten dazu, die Eigenschaften der CS-US Assoziationen in der komplexen Lernsituation am Flugsimulator zu untersuchen und mit Ergebnissen in Vertebraten zu vergleichen. Es wird erstmals gezeigt, dass Drosophila zusammengesetzte Stimuli lernen und die Einzelkomponenten unabhängig voneinander und in etwa ähnlichen Proportionen wiedererkennen kann. Der Versuch "Lernen zweiter Ordnung" mit diesen Stimuli zu erzielen, liefert einen relativ kleinen Effekt. Die Gegenüberstellung mit Daten aus Vertebraten liefert sowohl Abweichungen als auch Übereinstimmungen hinsichtlich der Lernregeln, die beim klassischen Konditionieren von Vertebraten gefunden wurden. Während es ein deutliches "sensorisches Präkonditionieren" gibt, konnte kein "Blocken" gefunden werden. Das sensorische Präkonditionieren in dieser Studie zeigt sich bei gleichzeitiger Stimuluspräsentation und ist vom Mass der Präkonditionierung abhängig. Es wird argumentiert, dass dieser Effekt ein Fall "beiläufigen Lernens" ist, bei dem zwei Stimuli ohne die Notwendigkeit der Verstärkung assoziiert werden. Für das nicht gefundene Blocken werden mögliche Gründe diskutiert und weiterführende Experimente vor-geschlagen. Abschließend wird über die Implikationen der Resultate dieser Arbeit für das allgemeine Verständnis der Gedächtnisbildung in komplexen Lernsituationen nachgedacht. KW - Taufliege KW - Lernen KW - Flugsimulator KW - Drosophila KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Assoziation KW - assoziativ KW - Flugsimulator KW - Lernregeln KW - operantes Konditionieren KW - klassisches Konditionieren KW - Drosophila KW - learning KW - memory KW - association KW - associative KW - flight simulator KW - learning rules KW - operant conditioning KW - classical conditioning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1039 ER - TY - THES A1 - Bausenwein, Burkhard T1 - Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless T1 - Functional characterisation of Daughter of Sevenless N2 - Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse. N2 - One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Daughter of Sevenless KW - Multi-Adaptor-Protein KW - PH-Domäne KW - SH2-Domänen Bindungsstelle KW - Rezeptor-Tyrosin-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Daughter of Sevenless KW - multi-adaptor-protein KW - PH-domain KW - SH2-domain binding site KW - receptor tyrosin kinase KW - signal transduction Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-814 ER - TY - THES A1 - Keller, Andreas T1 - Genetic Intervention in Sensory Systems of a Fly T1 - Genetische Intervention in sensorischen Systemen einer Fliege N2 - Die vorliegende Arbeit vergleicht Transgene, die in Drosophila Neuronen exprimiert wurden, um diese abzutöten oder zu blockieren. Tetanus Neurotoxin erwies sich als sehr effizient, um chemische Synapsen zu blockieren. Synapsen, die aus einer chemischen und einer elektrischen Komponente bestehen, ließen sich dagegen mit einem ektopisch exprimierten humanen Kalium-Kanal zuverlässiger ausschalten. Es wurden drei Möglichkeiten verglichen, eine zeitliche Kontrolle über die Funktion von Neuronen zu erlangen. Keines der getesteten Systeme erwies sich als universell anwendbar, aber die durch Rekombination induzierte Tetanus Neurotoxin Expression ist ein vielversprechender Ansatz. Die aus dieser vergleichenden methodischen Studie gewonnenen Ergebnisse wurden angewendet, um die Rolle von Neuronen in sensorischen Systemen bei der Verarbeitung verschiedener sensorischer Informationen zu untersuchen. Chemische und mechanische Rezeptorneuronen konnten den olfaktorisch gesteuerten Verhaltensweisen beziehungsweise den lokomotorischen Leistungen, denen sie zu Grunde liegen, zugeordnet werden. Hauptthema der Arbeit ist die Suche nach Neuronen, die an der Bewegungsdetektion im visuellen System beteiligt sind. Dabei zeigte sich, daß weder L2 noch L4 Neuronen im ersten visuellen Neuropil essentiell für die Detektion von Bewegung sind. Vielmehr deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Bewegungsdetektion über das Netzwerk der amacrinen Zellen (a) erfolgt. Die für vertikale Bewegung sensitiven VS Zellen in der Lobula Platte erwiesen sich als nicht notwendig für die Verhaltensreaktionen auf vertikale Bewegungsreize. Daraus folgt auch, daß in der Strukturmutante optomotor blind das Fehlen der VS Zellen nicht ursächlich für die stark eingeschränkten Reaktionen auf vertikale Bewegung ist. Ein anderer Defekt in optomotor blind muß dafür verantwortlich sein. Die Arbeit zeigt das große Potential der beschriebenen Methoden zur Untersuchung der Informationsverarbeitung im Nervensystem von Drosophila. Einzelne Neuronengruppen konnten komplexen Verhaltensweisen zugeordnet werden und Theorien über die Informationsverarbeitung konnten in Verhaltensexperimenten mit transgenen Fliegen getestet werden. Eine weitere Verfeinerung der Methodik zur genetischen Intervention wird das Drosophila Gehirn zu einem noch besseren Modell für die Informationsverarbeitung in Nervensystemen machen. N2 - Different transgenes that can be expressed in neurons to kill or block them were compared. Tetanus neurotoxin blocked chemical synapses very efficiently. Synapses consisting of a chemical and an electrical component were blocked more reliably by expressing a human inwardly rectifying potassium channel. To gain temporal control over neuronal function, three genetic tools have been investigated. None of the systems is without drawbacks, however, the recombination induced tetanus neurotoxin expression is a promising approach. The knowledge gained from the comparative methodological study was used to investigate the role of neurons in sensory systems in processing different sensory informations. Receptor neurons sensitive for chemical or mechanical stimuli were correlated to specific olfactory behaviors or locomotor tasks. The main topic of this thesis is the much discussed question of which neurons are involved in motion processing in the visual system of flies. Neither L2 nor L4 neurons in the first visual neuropil are essential for motion-detection. The results indicate that maybe motion is detected by the network of amacrine cells (a). The vertical motion-sensitive VS cells in the lobula plate are not necessary for behavioral responses to vertical motion. This finding implies that the lack of VS cells in the structural mutant optomotor blind is not causally related to the altered responses to motion stimuli. Other abnormalities in optomotor blind are responsible for this behavioral phenotype. This work shows the potential of the described methods in studying information processing in the Drosophila brain. Groups of neurons were correlated to complex behavioral responses and theories about information processing were tested by behavioral experiments with transgenic flies. The refinement of the genetic tools to interfere with neuronal function will make the Drosophila brain an even better model to study information processing in nervous systems. KW - Taufliege KW - Bewegungssehen KW - Neurophysiologie KW - Nervengift KW - Drosophila KW - Tetanus Neurotoxin KW - Bewegungsdetektion KW - Visuelles System KW - Lamina KW - Lobula Platte KW - Drosophila KW - Tetanus Neurotoxin KW - Motion detection KW - visual system KW - lamina KW - lobula plate Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-680 ER -