TY - THES A1 - Rodamer, Michael T1 - Development of practice-oriented LC-MS/MS methods for the determination of important drugs and their application for building PK/PD concepts T1 - Die Verwendung von praxisorientierten LC-MS/MS Methoden für die Bestimmung von wichtigen Arzneistoffen und ihre Verwendung zur Erstellung von PK/PD Konzepten N2 - In this thesis eight robust and reliable LC-MS/MS methods were developed and validated to analyze atorvastatin, clopidogrel, furosemide, itraconazole, loratadine, naproxen, nisoldipine and sunitinib in human plasma. The active metabolites 2-hydroxyatorvastatin, 4-hydroxyatorvastatin, hydroxyitraconazole, descarboethoxy-loratadine, 4-hydroxynisoldipine and N-desethylsunitinib were also included in the corresponding methods. Due to the different physical, chemical and pharmacokinetic properties of the analytes a wide spectrum regarding sample preparation techniques, chromatography and mass spectrometric detection was covered. Protein precipitation methods were developed for furosemide, itraconazole, naproxen, nisoldipine and sunitinib. Liquid-liquid extraction methods were developed for atorvastatin, clopidogrel and loratadine. Criteria to choose protein precipitation or liquid-liquid extraction were the final plasma concentrations of the drugs, which are mainly dependant on the dose, bioavailability and t1/2 and of course cost-effectiveness. Altogether, the methods have a concentration range from 0.001 ng/mL (LLOQ of clopidogrel) to 50000 ng/mL (highest calibration point for naproxen), covering 5 x 107 orders of magnitude. The runtime of the methods ranged from 2 to 4 minutes, facilitating a high sample throughput. All developed methods were validated according to recent guidelines as they were used to analyze sampes from clinical trials. Excellent linearity, intra-day and inter-day precision and accuracy were observed in the validated calibration ranges. Hemolyzed, lipemic and different batches of human plasma as well as sample dilution did not affect the determiantion of the analytes. Clopidogrel, loratadine, nisoldipine and sunitinib and if available their metabolites were subjected to a matrix effect test, resulting in no influence of different batches of human plasma on the analytical methods. Noteworthy is clopidogrel that shows a slight effect on one of the two used mass spectrometers. However, that effect was reproducible and did therefore not affect clopidogrel determination. No evidence of instability during chromatography, extraction and sample storage processes for all analytes except 4-hydroxyatorvastatin was found, for which a significant decrease was observed after three months. During incurred sample reanalysis of study samples 95 % of the samples were within ±15 % with respect to the first analysis. Moreover, the atorvastatin, loratadine and clopidogrel method were compared on two generations of triple quadrupole mass spectrometers, the API 3000™ and the API 5000™. The new ion source and the changes in the ion path of the API 5000™ provided higher sensitivity, the extend depending on the substance. However, the API 3000™ had very good precision in the performed system comparison. The validated methods showed excellent performance and quality data during routine sample analysis of eight clinical trials. Moreover, they are suitable for high sample throughput due to their short run times. N2 - In dieser Dissertation wurden acht robuste und verlässliche LC-MS/MS-Methoden zur Analyse von Atorvastatin, Clopidogrel, Furosemid, Itraconazol, Loratadin, Naproxen Nisoldipin und Sunitinib in Humanplasma entwickelt und validiert. Außerdem enthalten die Methoden die aktiven Metaboliten 2-Hydroxyatorvastatin, 4-Hydroxyatorvastatin, Hydroxyitraconazol, Descarboethoxyloratadin, 4-Hydroxynisoldipin und N-Desethylsunitinib. Wegen der unterschiedlichen physikalischen, chemischen und pharmakokinetischen Eigenschaften der Analyten, deckt diese Arbeit ein weites Spektrum bezüglich Probenaufarbeitung, Chromatographie und Massenspektrometrie ab. Präzipitationsmethoden wurden für Furosemid, Itraconazol, Naproxen, Nisoldipin und Sunitinib entwickelt. Flüssig-flüssig-Extraktionen wurden für Atorvastatin, Clopidogrel und Loratadin entwickelt. Kriterien für die Auswahl von Präzipitation oder Extraktion waren die erwartete Plasmakonzentration, die im Wesentlichen von der Dosis, Bioverfügbarkeit und Halbwertszeit abhängig ist, und natürlich Kosteneffektivität. Insgesamt erstrecken sich die Methoden über einen Kalibrierbereich von 0.001 ng/mL (LLOQ von Clopidogrel) bis zu 50000 ng/mL (HLOQ von Naproxen), das entspricht 5x107 Größenordnungen. Die Laufzeiten pro Probe liegen im Bereich von zwei bis vier Minuten, was einen sehr hohen Probendurchsatz ermöglicht. Alle in dieser Arbeit entwickelten Methoden wurden gemäß aktueller Richtlinien (FDA, GLP) validiert und verwendet um Proben aus Pharmakokinetikstudien zu analysieren. Ausgezeichnete Linearität, Präzision und Genauigkeit zeichnen diese Methoden aus. Hämolysiertes, lipämisches und verschiedene Batches von Humanplasma, sowie Vorverdünnung hatten bei keiner Methode Einfluss auf die Bestimmung der Analyten. Clopidogrel, Loratadin, Nisoldipin und Sunitinib und gegebenenfalls deren Metabolite wurden einem Matrix-Effekt-Test unterzogen. Dabei wurde festgestellt, dass keine der Methoden durch die Probenmatrix beeinflusst wurde. Erwähnenswert ist Clopidogrel, da an einem der Massenspektrometer ein leichter Effekt beobachtet werden konnte, der sich auf alle untersuchten Matrices gleich auswirkte und somit keinen Einfluss auf die gesamte Methode hatte. Weiterhin fand sich bei keiner der untersuchten Substanzen ein Hinweis auf Instabilität während der Probenlagerung, -aufarbeitung und -messung, außer bei 4-Hydroxyatorvastatin, dessen Konzentration nach drei Monaten signifikant abnahm. Während der Reanalyse von Studienproben (incurred samples) lagen über 95 % der Proben innerhalb von ±15 % im Vergleich zur ersten Messung. Außerdem wurden die Methoden zur Bestimmung von Atorvastatin, Loratadin und Clopidogrel an zwei Generationen von Massenspektrometern verglichen, nämlich dem API 3000™ und dem API 5000™. Die neue Ionenquelle und die Verbesserungen im Ionenpfad beim API 5000™ ermöglichten - abhängig von der analysierten Substanz - höhere Sensitivität. Allerdings konnte das API 3000™ bei den durchgeführten Experimenten mit einer hohen Präzision aufwarten. Die validierten Methoden zeigten im Alltagbetrieb bei der Messung von acht klinischen Studien hervorragende Performance und Qualitätsdaten. Darüber hinaus sind die Methoden aufgrund ihrer kurzen Laufzeiten ideal für Messungen die einen hohen Probendurchsatz erfordern. KW - LC-MS KW - Validierung KW - Tandem-Massenspektrometrie KW - Bioanalytik KW - Klinische Studie KW - LC-MS/MS KW - Tandem Mass Spectrometry KW - Method Validation KW - Pharmacokinetics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70809 ER - TY - THES A1 - Freitag, Claudia T1 - Quantifizierung von Aminosäuren in Infusionslösungen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(Tandem) - Massenspektrometrie(HPLC-[MS/]MS) Methodenentwicklung und Validierung T1 - Quantitation of amino acids in infusion solutions by high performance liquid chromatography - (tandem) - mass spectrometry (HPLC-[MS/MS]) - method development and validation N2 - Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminosäuren (AS) in Infusionslösungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der für die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminosäuren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminosäuren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminosäuren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ansätze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptansäure), führte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Spülzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Gerät stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich störte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle schwer validierbar wäre. Weiterführende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der Säule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-Säule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. ähnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode über einen weiten Bereich eine lineare Abhängigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. Für drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-Lösung der Infusionslösung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS führte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung über reine Standardlösungen nicht möglich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixlösung durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminosäuren in Infusionslösungen mit hoher Präzision und Richtigkeit bestimmt werden können. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30% - 350%, zehn weitere im Bereich von 50% - 350% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98% -102.0%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5% – 101.5%) quantifiziert werden. Für His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierfür in weiteren Studien geklärt werden müsste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionslösungsformulierungen möglich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschränkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionslösung und einen Verdünnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt über eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode beträgt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich kürzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebräuchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung anzusetzen sind. N2 - The aim of this study was to develop an HPLC-MS(/MS) method to be used within pharmaceutical quality control for the direct quantitation of amino acids (AS) in infusion solutions. The validation within the limits of the intended purpose was part of the objective. In the course of the method development the ESI-MS/MS fragmentation pattern of 21 amino acids, 20 stable isotope labelled amino acids, which were used as internal standards, and some further substances were determined. By knowing precursor- and product ions a SRM-method for specific MS/MS analysis was created. Interferences due to the respective fragmentation pattern within the analytes were detected, which had to be considered during the following HPLC-MS method development. The HPLC-MS method development for the analysis of underivatized AS comprised two different approaches: the RP-HPLC using an ion-pair reagent (IP) und the hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Problems occurred using the RP-HPLC. Due to the IP, in this study TDFHA (tridecafluoroheptanoic acid), long equilibration-, re-equilibration and rinsing-times were necessary so that this method is very time consuming despite short HPLC run times. Because of the contamination with TDFHA the use of the LC-MS system was limited. Furthermore, despite long equilibration times, retention times of the analytes were poorly reproducible. A validation of the method within the requirements of the pharmaceutical quality control would be therefore hardly to perform. Thus, further studies were not carried out. The following studies were focused on HILIC. Different parameters (percentage of organic solvent in the eluent, pH of the eluent, column temperature, buffer concentration in the eluent, gradient elution) were checked concerning their effects on the separation of AS on a ZIC®-HILIC column. By optimizing the parameters, a HILIC-HPLC method was developed, by which 21 AS and 20 of their stable labelled isotopes were eluted within 20 min. All AS, which interfered with other AS due to their fragmentation pattern, were chromatographically separated. Moreover, the SIM mode was found to be suitable for the separation of AS, thus avoiding SRM mode and tandem mass spectrometry. During the validation studies the HILIC-HPLC-MS method showed linear relation between AS-concentration and measured value over a wide range. Linearity was tested with the Mandel test revealing better fit by quadratic regression for three of 21 AS (NAcCys, NAcTyr and Pro). Recovery studies showed an influence of the matrix of the infusion solution, which led to deviations in the quotients areaAS / areaIS. As a result, quantitation by calibration with pure AS standard solutions was not possible within the given limits. Thus, validation was performed with matrix solution. Thereby it was shown that with the developed HPLC-MS method AS could be deter-mined in infusion solutions with high precision and accuracy. Nine of 21 AS were quantified in the range of 30%-350%, ten AS in the range of 50%-350% within the given requirements of pharmaceutical quality control (individual recovery value: 98% -102.0%, mean recovery value (threefold determination): 98.5% – 101.5%). His and Phe could not be quantified within the acceptance criteria; the reason for this would have to be found out in further studies. With the developed method the simultaneous quantitation of different AS infusion solutions, which differ in analytes concentrations with constant matrix concentration, can be realized. For instance, the formulations „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ can be mentioned, which could be determined by using the validated method. Sample preparation is fast and simple, consisting in addition of IS-formulation to the infusion solution and a single dilution step. Quantitation is performed by external standard calibration; the 5-point-regression-line is made by analyzing AS- and IS-standard solution after adding the electrolyte matrix solution, which is easily to produce. HPLC-MS analysis time is 35 min (including equilibration time), thus considerably shorter than the approximately 120 min required with the still common AS analytical method (ion exchange chromatography with postcolumn ninhydrin derivatization). KW - Aminosäuren KW - Qualitätskontrolle KW - HPLC-MS KW - Aminosäuren KW - hydrophile Interaktionschromatographie KW -   HILIC KW - Validierung KW - Methodenentwicklung KW - Infusionslösungen KW - amino acids KW - hydrophilic interaction chromatography KW - HILIC KW - HPLC-MS KW - validation KW - method development KW - infusion solutions Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65198 ER -