TY  - THES
A1  - Kampka, Justyna
T1  - Funktionelle Analyse der Histon-Demethylase UTX in hämatopoetisch differenzierenden murinen ES-Zellen
T1  - Functional analysis of the histone demethylase UTX during hematopoietic murine ESC differentiation
N2  - Murine embryonale Stammzellen (ES-Zellen) stellen mit ihrem Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotenzial einen einzigartigen Zelltyp für die Grundlagenforschung und angewandte Wissenschaften dar. Auf Grund ihrer Fähigkeit, in vitro die embryonale Entwicklung eines Organismus nachzuahmen, sind sie für die Untersuchung der Zell-Differenzierung, wie z.B. der embryonalen Hämatopoese geeignet. Während der ES-Zell-Selbsterneuerung und -Differenzierung spielen epigenetischen Modifikationen, unter anderem Histon-Methylierungen, eine wichtige Rolle. Transkriptionell aktivierende (H3K4me2/3, di- bzw. trimethyliertes Lysin 4 an Histon 3) und reprimierende (H3K27me2/3; di- bzw. trimethyliertes Lysin 27 an Histon 3) Histon-Methylierungs-Muster und die epigenetische Gen-Regulierung werden unter anderem durch die entgegenwirkenden PcG- und MLL-Protein-Komplexe koordiniert. Die H3K27me2/3-spezifische Demethylase UTX/KDM6A ist eine Komponente des MLL-Komplexes und somit an aktivierenden Gen-Regulationsmechanismen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit war es mein Ziel zu untersuchen, inwieweit UTX für die Aufrechterhaltung der ES-Zell-Pluripotenz und für die ES-Zell-Differenzierung, insbesondere die hämatopoetische Differenzierung, von Bedeutung ist. Meine Daten zeigten, dass UTX in undifferenzierten ES-Zellen, während der ES-Zell-Differenzierung und in adulten Geweben ubiquitär exprimiert ist. Um Aufschluss über die UTX-Funktion zu bekommen, wurde UTX in ES-Zellen mittels RNA-Interferenz und Gene-Targeting gezielt ablatiert. Genexpressions-Analysen zeigten, dass die Expression von Pluripotenzgenen, genauso wie die Zellproliferation und die Verteilung der Zellzyklus-Phasen in ES-Zellen durch den Verlust von UTX unbeeinflusst blieben, während globale H3K4me3- sowie H3K27me3-Level reduziert waren. Während der ES-Zell-Differenzierung konnte ich eine verminderte Induktion der mesodermalen und hämatopoetischen Marker Flk1, Brachyury, Runx1 und Gata1 beobachten. Zudem war die Expression von UTY, dem auf dem Y-Chromosom kodierten UTX-Homolog, in ES-Zellen und während der Differenzierung runterreguliert, was auf eine Regulierung durch UTX schließen lässt. Des Weiteren zeigten UTX-Knockdown und –Knockout-Zellen in funktionellen hämatopoetischen in vitro Assays eine verminderte Fähigkeit, Blast-Kolonien und hämatopoetische Vorläuferzellen zu generieren. Interessanterweise zeigten ChIP-Analysen in differenzierenden wt und UTX-Knockout-EBs unveränderte H3K27me3-Level an Promotoren der hämatopoetischen Gene, was auf eine Demethylase-unabhängige Funktion von UTX während der frühen Hämatopoese hindeutet. Um die Funktion von UTX während der Entwicklung in vivo, insbesondere während der embryonalen Hämatopoese, untersuchen zu können, habe ich eine konditionelle UTX-Knockout-Maus hergestellt, die für eine gezielte UTX-Deletion im hämatopoetischen System verwendet wird. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass UTX für die ES-Zell-Proliferation und –Pluripotenz unbedeutend ist und die Reduzierung der H3K27-Trimethylierung auch bei fehlendem UTX weiterhin herbeigeführt werden kann. Im Gegensatz dazu übernimmt UTX eine entscheidende Rolle während der mesodermalen und hämatopoetischen ES-Zell-Differenzierung, vermutlich über eine Histon-Demethylase-unabhängige Funktion.
N2  - Mouse embryonic stem cells (ESCs) through their potential to self-renew and to differentiate provide a unique cell type for basic and applied research. Due to their ability to mimic the embryonic development of an organism in vitro, they are suitable for the study of cellular differentiation such as embryonic hematopoiesis. ESC self-renewal and differentiation are associated with epigenetic modifications, including histone methylation. The opposing PcG and MLL protein complexes coordinate transcriptionally repressing (H3K27me2/3, di- and trimethylated histone 3 at lysine 27) and activating (H3K4me2/3; di- and trimethylated histone 3 at lysine 4) histone methylation patterns respectively, and epigenetic gene regulation. The H3K27me2/3-specific demethylase UTX/KDM6A is a component of the MLL complex and thus involved in transcriptional activation of gene expression. Within the scope of my thesis, I aimed to analyze to what extent UTX contributes to the maintenance of ESC pluripotency and differentiation, in particular to the hematopoietic differentiation. My data showed that UTX is ubiquitously expressed in undifferentiated ESCs, during ESC differentiation and in adult tissue. In order to study the UTX specific function, I specifically down-regulated UTX in ESCs via RNA interference and gene targeting. Gene expression profiling of ESCs showed that the expression of pluripotency genes, as well as cell proliferation and cell cycle phase distribution remained unaffected by the loss of UTX. However, global H3K4me3 and H3K27me3 levels were reduced. I observed a decreased induction of the mesodermal and hematopoietic genes Flk1, Brachyury, Runx1 and Gata1 in differentiating ESCs. Furthermore, the expression of UTY, the homologue of UTX encoded on the Y chromosome, was down- regulated in ESCs and in EBs, suggesting a regulatory function of UTX. In addition, using functional hematopoietic in vitro assays, UTX knockdown and knockout cells showed reduced blast colony formation and decreased differentiation of hematopoietic progenitor cells. Interestingly, ChIP analysis of wt and UTX KO EBs revealed comparable enrichment of H3K27me3 at the promoters of the hematopoietic genes, suggesting a demethylase independent role for UTX during early hematopoiesis. In order to investigate the role of UTX during development in vivo, particularly during embryonic hematopoiesis, I generated a conditional UTX knockout mouse, which will be used for a specific deletion of UTX in the hematopoietic system. In conclusion, my data revealed that UTX is insignificant for ESC proliferation and pluripotency and that the loss of H3K27 trimethylation is induced even in the absence of UTX. Furthermore, the data reported in this work suggest that UTX is required for mesodermal and hematopoietic ESC differentiation, presumably via a histone demethylase independent function.
KW  - Hämatopoese
KW  - Epigenetik
KW  - Embryonale Stammzellen
KW  - Histon-Demethylase UTX
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108058
ER  - 
TY  - THES
A1  - Varagnolo, Linda
T1  - PRC2 inhibition counteracts the culture-associated loss of engraftment potential of human cord blood-derived hematopoietic stem/progenitor cells
T1  - Die Inhibition des PRC2 wirkt dem Kultur-bedingten Verlust des Repopulationspotenzials in humanen hämatopoetischen Stammzellen/Vorläuferzellen aus Nabelschnurblut entgegen
N2  - Cord blood hematopoietic stem cells (CB-HSCs) are an outstanding source for the treatment of a variety of malignant and non-malignant disorders. However, the low amount of cells collected per donor is often insufficient for treatment of adult patients. In order to make sufficient numbers of CB-HSCs available for adults, expansion is required. Different approaches were described for HSC expansion, however these approaches are impeded by the loss of engrafting potential during ex vivo culture. Little is known about the underlying molecular mechanisms. Epigenetic mechanisms play essential roles in controlling stem cell potential and fate decisions and epigenetic strategies are considered for HSC expansion. Therefore, this study aimed to characterize global and local epigenotypes during the expansion of human CB-CD34+, a well established CB progenitor cell type, to better understand the molecular mechanisms leading to the culture-associated loss of engrafting potential. Human CB-CD34+ cells were cultured using 2 different cytokine cocktails: the STF cocktail containing SCF, TPO, FGF-1 and the STFIA cocktail, which combines STF with Angiopoietin-like 5 (Angptl5) and Insulin-like growth factor-binding protein 2 (IGFBP2). The latter expands CB-HSCs ex vivo. Subsequently, the NOD-scid gamma (NSG) mouse model was used to study the engraftment potential of expanded cells. Engraftment potential achieved by fresh CB-CD34+ cells was maintained when CB-CD34+ cells were expanded under STFIA but not under STF conditions. To explore global chromatin changes in freshly isolated and expanded CB-CD34+ cells, levels of the activating H3K4me3 and the repressive H3K27me3 histone marks were determined by chromatin flow cytometry and Western blot analyses. For analysis of genome-wide chromatin changes following ex vivo expansion, transcriptome profiling by microarray and chromatin immunoprecipitation combined with deep sequencing (ChIP-seq) were performed. Additionally, local chromatin transitions were monitored by ChIP analyses on promoter regions of developmental and self-renewal factors. On a global level, freshly isolated CD34+ and CD34- cells differed in H3K4me3 and H3K27me3 levels. After 7 days of expansion, CD34+ and CD34- cells adopted similar levels of active and repressive marks. Expanding the cells without IGFBP2 and Angptl5 led to a higher global H3K27me3 level. ChIP-seq analyses revealed a cytokine cocktail-dependent redistribution of H3K27me3 profiles. Chemical inhibition of the H3K27 methyltransferase EZH2 counteracted the culture-associated loss of NSG engraftment potential. Collectively, the data presented in this study revealed that by adding epigeneticly active compounds in the culture media we observed changes on a chromatin level which counteracted the loss of engraftment potential. H3K27me3 rather than H3K4me3 may be critical to establish a specific engraftment supporting transcriptional program. Furthermore, I identified a critical function for the Polycomb repressive complex 2-component EZH2 in the loss of engraftment potential during the in vitro expansion of HPSCs. Taken together this thesis provides a better molecular understanding of chromatin changes upon expansion of CB-HSPCs and opens up new perspectives for epigenetic ex vivo expansion strategies.
N2  - Hämatopoetische Stammzellen aus Nabelschnurblut (CB-HSCs) sind eine bedeutende Quelle für die Behandlung einer Vielzahl maligner und nicht-maligner Erkrankungen. Allerdings ist die geringe Anzahl an Stammzellen, die von einem Spender gewonnen werden kann, meist nicht ausreichend für die Rekonstitution des hämatopoetischen Systems erwachsener Patienten. Um eine ausreichende Menge an CB-HSCs zu gewinnen, ist eine Expansion der Zellen erforderlich. Verschiedene Ansätze zur ex vivo Expansion von HSCs wurden beschrieben, allerdings waren diese Ansätze durch den Verlust des Repopulationspotentials während der ex vivo Kultivierung nicht umsetzbar. Über die zugrundeliegenden Mechanismen ist wenig bekannt. Epigenetische Mechanismen spielen eine entscheidende Rolle in der Kontrolle von Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzellen.  Aus diesem Grund werden epigenetische Strategien zur HSC-Expansion in Betracht gezogen. Das Ziel dieser Studie war, globale und lokale Epigenotypen während der Expansion humaner CB-CD34+-Zellen (CB-Vorläuferzellen) zu charakterisieren. Diese Studien sollten zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen, welche zum Kultivierungs-assoziierten Verlust des Repopulationspotentials führen. Humane CB-CD34+-Zellen wurden in zwei verschiedene Zytokin-Cocktails kultiviert: Der sogenannte STF-Cocktail, welcher SCF, TPO und FGF-1 enthält und der STFIA-Cocktail, welcher STF mit Angptl5 und IGFBP2 kombiniert. Aus der Literatur war zu Beginn dieser Doktorarbeit war bekannt, dass CB-HSCs ex vivo in STFIA, nicht aber in STF expandiert werden können. In Übereinstimmung mit diesem Befund zeigen die hier vorgestellten heterologen Transplantationsexperimente, dass das Repopulationspotential frischer CB-CD34+-Zellen nur erhalten blieb, wenn die Zellen unter STFIA, jedoch nicht, wenn sie unter STF-Bedingungen expandiert waren. Um die globalen Chromatinveränderungen frisch isolierter und expandierter Zellen zu untersuchen, wurden die Level der aktivierenden Histonmodifikation H3K4me3 und der repressiven H3K27me3-Modifikation durch Chromatin-Durchflusszytometrie und Western Blot Analyse bestimmt. Zur Analyse der genomweiten Chromatinveränderungen nach ex vivo Expansion wurden Transkriptomprofile durch Mikroarray und Chromatin-Immunpräzipitation, in Kombination mit Deep-Sequencing (ChiP-Seq) durchgeführt.
Zusätzlich wurden lokale Chromatinveränderungen durch ChiP-Analysen an Promotorregionen von Entwicklungs- und Selbsterneuerungs-Faktoren analysiert. Auf globaler Ebene unterschieden sich frisch isolierte CD34+ und CD34- Zellen in ihren H3K4me3 und H3K27me3 Leveln. Nach siebentägiger Expansion nahmen CD34+ und CD34- Zellen ähnliche Level aktiver und repressiver Markierungen an. Die Expansion der Zellen ohne IGFBP2 und Angptl5 führte zu höheren globalen H3K27me3 Leveln. ChiP-seq Analysen zeigten eine Zytokin-Cocktail-abhängige Neuverteilung von H3K27me3 Mustern. Die chemische Inhibition der H3K27me-Transferase EZH2 wirkte dem Kultivierungs-assoziierten Verlust des NSG Repopulationspotentials entgegen. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass durch die Zugabe von spezifischen Zytokinen in das Kulturmedium Veränderungen auf Chromatinebene verbunden sind, die dem kultivierungs-assoziierten Verlust des Repopulationspotentials entgegen wirken. Diese Daten zeigen weiterhin, dass die durch die PRC2 Komponente EZH2 vermittelte H3K27me3, nicht jedoch die H3K4me3 Histonmodifikation ein kritischer Faktor für die Etablierung eines die Repopulation fördernden Transkriptionsprogrammes ist. Somit dient diese Arbeit einem besseren molekularen Verständnis der Chromatinveränderungen während der Expansion von CB-HSPCs und eröffnet eine Perspektive für neue epigenetische ex vivo Expansionsstrategien.
KW  - Epigenetik
KW  - Hämatopoese
KW  - PRC2
KW  - Cord blood-derived hematopoietic stem and progenitor cells
KW  - Hematopoietic stem cell ex-vivo expansion
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108073
ER  -