TY - THES A1 - Geis, Tanja T1 - Molekularbiologische und immunologische Untersuchungen zu klinisch relevanten immunodominanten Antigenen von Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien (MRSA) für eine Antikörpertherapie T1 - Molecular and immunological characterization of immunodominant antigens of MRSA N2 - Zusammenfassung: Staphylococcus aureus ist einer der häufigsten Erreger von nosokomialen Infektionen. Die grampositiven in Haufen angeordneten kokkoiden Bakterien verursachen neben harmlosen lokal-oberflächlichen Hautinfektionen auch gefürchtete lebensbedrohliche Systeminfektionen. Ein großes Problem in der Therapie von S. aureus-Infektionen stellen die zunehmenden Multiresistenzen dieses Erregers dar. Die Entwicklung neuer Antibiotika reicht hierbei auf Dauer oft nicht aus, da immer wieder neue Resistenzen der Bakterien zu erwarten sind. Es besteht daher dringender Bedarf an der Entwicklung alternativer Therapieformen im Kampf gegen multiresistente Problemkeime wie S. aureus. Eine Möglichkeit besteht in der Immuntherapie, zum Beispiel durch Gewinnung von monoklonalen Antikörpern gegen geeignete Targetstrukturen von S. aureus. In den beiden immundominanten Antigenen IsaA und IsaB scheinen solche geeigneten Angriffsstrukturen gefunden zu sein. In dieser Arbeit wurde eine IsaB-Mutante hergestellt und nachfolgend phänotypisch charakterisiert. Diese Arbeiten bilden die Grundlage für die Aufklärung der Funktion von IsaB. Weiterhin sollte ein humaner monoklonaler Antikörper gegen IsaA generiert werden. Zur Testung der Antigenspezifität war es notwendig einen anti-IsaA-spezifischen ELISA zu entwickeln. Durch die Fusion der Hybridomzelllinie HAB mit B-Lymphozyten aus lymphatischem Gewebe septikämischer Patienten sollten Fusionszellen gewonnen werden, die spezifische anti-IsaA-Antikörper produzieren. Durch den Einsatz einer humanen Hybridomzelllinie sollten Kreuzspezies-Reaktionen, wie sie bei murinen therapeutischen Antikörpern beobachtet wurden, ausgeschaltet werden. Es wurden mehrere Fusionen mit lymphatischem Material (Lymphknoten, Blut-B-Lymphozyten) durchgeführt. Eine spezifische Antikörperproduktion blieb hierbei jedoch aus. Ein anti-IsaA-spezifischer ELISA konnte auf der Grundlage polyklonaler anti-IsaA-Antikörper aus immunisierten Kaninchen erfolgreich etabliert werden. Der ELISA zeigte die höchste Spezifität bei einer Antigenbeschichtung von 2 µg/ml IsaA und einer optimalen Primärantikörperkonzentration von 1 : 25600. In einem weiteren Teil der Arbeit sollte die Spezifität des polyklonalen Antikörpers und das Vorkommen von IsaA bei verschiedenen Staphylococcus aureus-Stämmen und anderen Bakterienspezies getestet werden. Dazu wurde mittels Western-Blot die Expression von IsaA untersucht. Ergebnis dieser Untersuchung war, dass IsaA unabhängig von der Herkunft, vom Infektionstyp oder Resistenzeigenschaften von allen S. aureus-Isolaten exprimiert wird. Von den anderen untersuchten Bakteriespezies zeigte der IsaA-spezifische polyklonale Antikörper auch eine Reaktion gegen S. haemolyticus, S. hominis, S. lugdunensis, S. warnerii und S. cohnii. Ob diese Staphylokokkenarten ein IsaA-homologes Protein mit konservierten Domänen exprimieren, das mit dem Antiserum kreuzreagiert, müssen zukünftige Untersuchungen zeigen. Die Herstellung der IsaB-Mutante erfolgte durch Konstruktion eines Inaktivierungsplasmides (pTG1), in dem eine Erythromycinkassette zwischen ein „upstream“- und „downstream“-Fragment kloniert wurde. Als Grundlage diente der temperatursensitive „shuttle“-Vektor pBT2, der bei erhöhter Temperatur in S. aureus nicht weiter replizieren kann und dadurch homologe Fragmente auf dem Vektor mit genomischen Abschnitten rekombinieren. Die erfolgreicher Herstellung der isaB-Mutante wurde im Southern-Blot überprüft. Die Mutante wurde verschiedenen vergleichenden Experimenten mit dem Wildtyp unterzogen, um Informationen über die mögliche Funktion des Targetproteins IsaB im Hinblick auf Wachstum und Virulenz für S. aureus zu gewinnen. Die Wachstumsexperimente ergaben einen deutlichen Unterschied im Wachstumsverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp. Da die Mutante deutlich schneller wuchs als der Wildtyp scheint IsaB wichtig für das Wachstum von S. aureus zu sein. In vitro-Experimente zur Testung von möglichen in vivo-Umwelteinflüssen bzw. Stressfaktoren auf das Wachsum der Stämme erfolgten mittels Zusetzung von Glucose und NaCl. Hier zeigte sich ein deutlicher Wachstumsvorteil des Wildtyps gegenüber der isaB-Mutante, so dass unter extremen Umweltbedingungen IsaB S. aureus ein besseres Wachsen ermöglicht. In weiteren Experimenten wurden das Hämolyse- und Proteolyseverhalten der Mutante im Vergleich zum Wildtyp untersucht. IsaB scheint Einfluss auf die Expression von Hämolysinen und Proteasen zu haben, die wichtige Virulenzfaktoren von S. aureus sind. Die Untersuchungen zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) von Wildtyp und Mutante ergaben ebenfalls Unterschiede für verschiedene Antibiotika, so dass IsaB Einfluss auf die Antibiotikaempfindlichkeit zu nehmen scheint. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Eignung von IsaB als Targetprotein für eine Antikörpertherapie bei lebensbedrohlichen S. aureus-Infektionen. N2 - Summary: Staphylococcus aureus is one of the most frequent causes of nosocomial infections. The spectrum of diseases ranges from self limiting local infections of the skin to feared life-threatening systemic infections. The increasing rate of multi-resistant S. aureus strains represents a serious problem in the therapy of infections due to S. aureus. In addition to the development of new antibiotics, it is very important to develop alternative forms of therapy in the fight against multi-resistant bacteria, such as S. aureus. As an alternative, immuno-therapeutical methods can be developed, for example the use of monoclonal antibodies against target elements of S. aureus. A prerequisite for the development of therapeutical antibodies is the identification of immuno-dominant antigens which should preferentially be located on the cell surface of the pathogen or being secreted proteins. Recently, two immunodominant antigens named IsaA and IsaB have been identified which seem to be suitable structures for an antibody-based immuno-therapeutical approach. To learn more about the function of the immunodominant antigens and to evaluate the role in diseases caused by S. aureus in this work an isaB-mutant was constructed and phenotypically characterized. Moreover, a human monoclonal antibody against IsaA should be generated. For testing the specificity of monoclonal antibodies, it was necessary to develop an anti-IsaA-specific ELISA. By fusion of the human heteromyeloma cell line HAB-1 with B-lymphocytes from lymphatic material of patients with sepsis anti-IsaA producing hybridoma clones should be generated and later on tested in different models. By application of the human heteromyeloma cell line cross-reactions of species, as they were observed with murine antibodies, can be circumvented. In this work, several fusions of different lymphatic material were accomplished. However, specific anti-IsaA producing antibodies could not be generated. Furthermore, an anti-IsaA-specific ELISA could successfully be established on the basis of polyclonal anti-IsaA-antibodies from immunized rabbits. The ELISA showed the highest specificity at an antigen-coating of 2 µg/ml of IsaA and an optimal primary antibody concentration of 1:25600. To evaluate the expression of IsaA protein within the species S. aureus and to test the specificity of the antibody Western blot experiments were performed using different S. aureus strains, strains from other staphylococcal species and also non-staphylococcal isolates. These experiments reveal that IsaA is specifically expressed by all S. aureus strains tested, independently of the origin of the strains and regardless the type of infection the strains have caused or the type of resistance they do express. The isaB-mutant was created via constructing an inactivating plasmid (pTG1), in which the erythromycin resistance cassette ermB was cloned between an upstream and downstream fragment of isaB in the temperature-sensitive shuttle-vector pBT2, which cannot replicate in S. aureus at higher temperatures (42°C) facilitating homologous recombination with homologous sequences in the genome. The successful construction of the isaB-mutant was proven by Southern blot hybridization. Moreover, the mutant was submitted to different comparative experiments with the wildtype, in order to get information about the possible function of the target protein IsaB. Growth experiments have clearly demonstrated a faster growth behaviour of the isaB-mutant cells compared to the wildtype. However, in the presence of high salt and glucose concentrations the wildtype grew much faster suggesting a role of IsaB in growth under extreme environmental conditions. The results of this work clearly support the idea of using IsaB as a target protein for immuno-therapy against life-threatening infections due to S. aureus. KW - MRSA KW - monoklonale Antikörper KW - immunodominante Antigene KW - ELISA KW - Immuntherapie KW - MRSA KW - monoclonal antibodies KW - immunodominant antigens KW - ELISA KW - immuntherapy Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18108 ER - TY - THES A1 - Lindner, Karin T1 - Untersuchungen zum Einfluss der ATP-abhängigen Protease ClpXP auf die Regulation und Expression Virulenz-assoziierter Gene des uropathogenen E. coli Stammes 536 T1 - Influence of the ATP-dependent protease ClpXP on regulation and expression of virulence-associated genes of uropathogenic E. coli strain 536 N2 - Die ATP-abhängige Serinprotease ClpXP ist für die Kontrolle und Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Enzymen und regulatorischer Proteine sowie für den Abbau fehlge-falteter Proteine verantwortlich. Sie besteht aus zwei Komponenten, der Protease ClpP und der ATPase ClpX, welche für die Substratspezifität verantwortlich ist und zusätzlich als Chaperon wirken kann. Durch den gezielten Abbau globaler Regulatoren wie dem alternativen Sigmafaktor RpoS kommt die regulatorische Funktion der Protease auf post-translationaler Ebene zum Tragen. Um den Einfluss der Protease ClpXP auf die Virulenz-eigenschaften uropathogener Escherichia coli zu studieren, wurde der uropathogene E. coli Stamm 536 als Modellorganismus verwendet. Uropathogene E. coli Stämme werden als häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Der E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) unterscheidet sich von apathogenen Stämmen durch die Anwesenheit von bislang sechs charakterisierten Pathogenitätsinseln (PAIs), die für eine Reihe verschiedener Virulenzfaktoren wie Prf- und S-Fimbrien, alpha-Hämolysin, dem Kapselantigen K15 und Eisenaufnahmesystemen kodieren. Zudem exprimiert der Stamm Curli-Fimbrien, eine Flagelle vom Serotyp H31 und ist aufgrund seines glatten Lipopolysaccharid Phänotyps (O6 Antigen) serumresistent. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Protease ClpXP auf die Regulation und Expression Virulenz-assoziierter Gene des E. coli Stammes 536 sowohl auf Protein-, als auch auf Transkriptebene näher zu charakterisieren. Um den Einfluss der clpX- und clpP-Deletion auf die Proteinexpression des E. coli Stammes 536 zu untersuchen, wurde die Methode der zweidimensionalen (2-D) Gelelektrophorese angewendet. Es wurden zytoplasmatische und extrazelluläre Proteine der logarithmischen und stationären Wachstumsphase untersucht und in diesem Zusammenhang jeweils ein internes Mastergel aller 93 identifizierten zytoplasmatischen und aller 127 identifizierten Proteinen des extrazellulären Proteoms angefertigt. In der zytoplasmatischen Fraktion konnte für 13 Proteine aus der logarithmischen und für 25 Proteine aus der stationären Wachstums-phase eine unterschiedliche Expression festgestellt werden. Die 2-D Analyse der Proteine aus dem Kulturüberstand ergab ein erhöhtes Sekretionsvermögen der clpX- und clpP-negativen Stämme sowohl in der logarithmischen als auch in der stationären Wachstums-phase. Darüber hinaus konnte eine reduzierte Expression von Hauptstrukturuntereinheiten der Prf-, S-, CS12-ähnlichen und Typ 1-Fimbrien sowie des Autotransporters Ag43 in den clpX- und clpP-Mutanten nachgewiesen werden. Zusätzlich wiesen diese Stämme eine verstärkte Expression des Flagellins FliC auf. Durch Western Blot-Analysen und weitere phänotypische Tests konnten die Ergebnisse aus den Proteomstudien für Prf-, S- und Typ 1-Fimbrien sowie für die Flagellenexpression bestätigt werden. Zudem war eine stark verlangsamte Expression von Curli und Cellulose bei Temperaturen unter 37 °C, eine erhöhte Motilität und ein „hyperflagellierter“ Phänotyp der clpX- und clpP-negativen Stämme zu beobachten. Demgegenüber hatte ClpXP keinen Einfluss auf die alpha-Hämolysinproduktion, die Expression des Lipopolysaccharides, die Serumresistenz und in vivo-Virulenz dieses Stammes. Bei anschließenden Transkriptionsanalysen (semiquantitative Real-Time Reverse Transkrip-tion (RT)-PCR) der Gene, welche für die Hauptstrukturuntereinheiten von Fimbrien kodieren, konnte eine reduzierte Transkription der Determinanten für Prf-, S-, und Curli-Fimbrien, aber eine erhöhte Transkription für Gencluster der Typ 1- und CS12-ähnlichen Fimbrien und keine Änderung der Transkriptmengen für Gene des Pix-Fimbrienoperons in den Mutantenstämmen nachgewiesen werden. Die Transkription der beiden Antigen 43 Varianten ORF52III und ORF47V war durch die Deletion von clpX und clpP gleichermaßen betroffen und deutlich reduziert. ClpXP hatte aber keinen Einfluss auf die Transkription des „Masterregulatorgens“ flhC der Flagellen-Regulationskaskade, beeinflusst jedoch die in der Hierarchie weiter unten liegender Operons positiv, da eine deutlich erhöhte Expression von fliA und fliC nachgewiesen werden konnte. Demzufolge hat ClpXP einen negativen regulatorischen Effekt auf die Flagellenexpression, der aber erst auf posttranskriptionaler oder posttranslationaler Ebene auftritt. Viele der beobachteten Einflüsse, v.a. auf die Flagellen- und Fimbrienexpression, konnten auf die fehlende regulatorische Wirkung von RpoS zurückgeführt werden, welches ausschließlich durch ClpXP degradiert wird. Zudem lassen die Ergebnisse vermuten, dass der globale Regulator Lrp, welcher eine wichtige Rolle bei der Regulation der Fimbrienexpression spielt, direkt oder indirekt durch ClpXP beeinflusst wird, wodurch die regulatorischen Netzwerke zusätzlich gestört werden. N2 - ClpXP is an ATP-dependent serine protease that controls the level and availability of key metabolic enzymes or regulatory proteins and plays a role in breakdown of abnormal and misfolded proteins. ClpXP consists of two independent components. ClpP has proteolytic activity, whereas ClpX has ATPase activity, provides the substrate specificity and function as a molecular chaperone. The proteolysis of global regulators such as the alternative sigma factor RpoS contributes to its function as a regulator on posttranslational level. To analyse the impact of the protease ClpXP on the virulence factors of uropathogenic Escherichia coli, the uropathogenic E. coli strain 536 was chosen as a model organism. Uropathogenic E. coli are the most frequently isolated causative agents of infections of the urinary tract in humans. The E. coli isolate 536 (O6:K15:H31) carries six pathogenicity islands (PAIs) that encode its key virulence factors such as alpha-hemolysins, P-related and S-fimbriae, capsule and iron-uptake systems, that are absent from non-pathogenic isolates. In addition, the strain expresses curli, flagella of serotype H31 and is due to its smooth lipopolysaccharide resistant to human serum. The aim of this study was to characterize the impact of the ATP-dependent protease ClpXP on the expression and regulation of virulence-associated genes of strain E. coli 536 and its clpX- and clpP-deficient mutants on the protein- as well as on the transcriptional level. In order to study the impact of ClpXP on global protein expression of E. coli strain 536, the proteome pattern of total cell extracts as well as of secreted proteins (“secretome”) from the exponential and stationary phase of strain 536 and its isogenic clpX and clpP mutants were compared by two-dimensional (2-D) gel electrophoresis. Internal master gels were prepared for all identified 93 proteins from the cytoplasmic and 127 proteins from the extracellular fraction. Analysis of the cytoplasmic fraction revealed an altered expression of 13 proteins from the exponential and 25 proteins from the stationary phase. 2-D analysis of the secretome exhibited a highly increased secretion ability of the clpX- and clpP-deficient strains in both, exponential and stationary phase, compared to wild type strain 536. In contrast, both mutant strains showed a reduced abundance of the major subunits of S-, P-related, putative CS12-like and type 1-fimbriae as well as the autotransporter protein antigen 43. Additionally, the mutant strains showed a higher expression of flagellin FliC compared to the wild type strain. Results from proteome studies concerning P-related, S- and type 1-fimbriae as well as flagella expression were confirmed by Western blot-analysis and further phenotypic assays. Additionally, a retarded expression of curli and cellulose at temperatures of 30 °C and below, as well as a “hyperflagellated” phenotype with higher motility could be detected upon clpX- and clpP deletion. In contrast, ClpXP had no influence on alpha-hemolysin- and lipopolysaccharide expression, serum resistance and in vivo virulence of strain 536. Following transcriptional analysis (semi-quantitative real-time reverse transcription (RT)-PCR) of genes coding for major fimbrial subunits, a reduced transcription of the determinants coding for S- and P-related fimbriae and curli was observed in the clpX- and clpP-deficient variants. Besides, enhanced transcription of CS12-like and type 1-fimbrial determinants and no differences with respect to transcription of the pix fimbrial gene cluster were detected in the clpX- and clpP mutants relative to the wild type. Transcription of both antigen 43 gene variants, ORF52III and ORF47V, was negatively influenced upon clpX- and clpP deletion and the relative expression was reduced compared to the wild type. Furthermore, it has been shown, that ClpXP had no influence on the “master regulator gene” flhC of flagellar regulation cascade, but enhanced transcription of genes from operons downstream of flhC, like fliA and fliC. These results suggest that ClpXP plays a role as a negative regulator of flagella regulation at the post-transcriptional or post-translational level. Many of the observed effects, particularly on flagellar- and fimbrial gene expression, are due to malfunction of RpoS, which is degraded especially by ClpXP. Additionally, the obtained results indicate that Lrp, a global regulator that plays a dominant role in fimbrial gene expression, is influenced, directly or indirectly by ClpXP and that therefore the corresponding regulatory networks are disordered in clpX and clpP mutants. KW - Escherichia coli KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Clp KW - ClpX KW - ClpP KW - Regulation KW - Virulenz-assoziierte Gene KW - pathogene E. coli KW - ClpX KW - ClpP KW - regulation KW - virulence-associated genes KW - pathogenic E. coli Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17627 ER - TY - THES A1 - Müller, Claudia Maria T1 - Studies on the Role of Histone-like Proteins in Gene Regulation in Uropathogenic Escherichia coli Isolate 536 T1 - Untersuchungen zur Rolle von Histon-ähnlichen Proteinen bei der Genregulation im Uropathogenen Escherichia coli Isolat 536 N2 - In this study, the role of histone-like proteins in gene regulation in uropathogenic Escherichia coli isolate 536 was monitored. The histone-like nucleoid structuring protein H-NS is a global regulator in Escherichia coli that has been intensively studied in non-pathogenic strains. No comprehensive study on the role of H-NS and it’s homolog StpA on gene expression in a pathogenic E. coli strain has been carried out so far. Moreover, we identified a third, so far uncharacterized member of the H-NS-like protein family in uropathogenic E. coli isolate 536, which was designated Hlp (H-NS-like protein). Hlp is a 134-amino acid protein, which shares 58 % sequence identity with H-NS. The gene coding for the Hlp protein, hlp, is found in several uropathogenic E. coli variants, but not in non-pathogenic E. coli K-12. In UPEC strains 536 and CFT073, Hlp is encoded on a possibly horizontally acquired 23-kb genomic region inserted into the serU locus. Studies on hlp transcription revealed, that the gene is transcribed monocistronically from a single promoter and that expression is repressed by H-NS. Purified Hlp protein was binding to its own and to the hns promoter, thereby mediating negative auto- and crossregulation. Furthermore, Hlp and H-NS were directly interacting, resulting in the formation of stable heteromers. Complementation studies with hns mutant strains in a K-12 background revealed that the Hlp protein had in vivo activity, being able to complement the lack of H-NS in terms of motility, growth, and repression of the proU, bgl, and clyA genes. When analyzing the role of the histone-like proteins in expression of virulence-associated genes by using DNA arrays and classical phenotypic assays, most of the observed effects were mediated by the H-NS protein alone. Expression profiling revealed that transcript level of more than 500 genes was affected by an hns mutation, resulting in increased expression of alpha-hemolysin, fimbriae and iron-uptake systems, as well as genes involved in stress adaptation. Furthermore, several other putative virulence factors were found to be part of the H-NS regulon. On the other hand, no effect of StpA alone was observed. An hns stpA double mutant, however, exhibited a distinct gene expression pattern that differed in great parts from that of the hns single mutant. This suggests a direct interaction between the two homologs and the existence of distinct regulons of H-NS and an H-NS/StpA heteromeric complex. Although the H-NS protein has – either as homomer or in complex with StpA – a marked impact on gene expression in pathogenic E. coli strains, its effect on urovirulence is ambiguous. At a high infection dose, hns mutants accelerate lethality in murine UTI and sepsis models relative to the wild type, probably due to increased production of alpha-hemolysin. At lower infectious dose, however, mutants lacking H-NS are attenuated through their impaired growth rate, which can only partially be compensated by the higher expression of numerous virulence factors. As seen with StpA, an hlp single mutant did not exhibit a notable phenotype under standard growth conditions. A severe growth defect of hns hlp double mutants at low temperatures, however, suggests a biological relevance of H-NS/Hlp heteromers under certain circumstances. Furthermore, these mutants expressed more capsular polysaccharide and curli fimbriae, thereby indicating a distinct role of H-NS and Hlp in regulation of these surface structures. The H-NS paralogs Hlp and StpA also modulated H-NS-mediated regulation of fimbrial adhesins, and are oppositely required for normal growth at low or high temperatures, respectively. Finally, expression levels of the three histone-like proteins H-NS, StpA and Hlp itself varied with different temperatures, thereby suggesting a flexible composition of the nucleoid-associated protein pool. Hence, we propose that the biological role of Hlp and StpA does not rely on a distinct function of the single protein, but rather on their interaction with the global regulator H-NS. N2 - In dieser Studie wurde die Rolle von Histon-ähnlichen Proteinen bei der Genregulation im uropathogenen Escherichia coli (UPEC) Isolat 536 untersucht. Das Histon-ähnliche Protein H-NS (engl. histone-like nucleoid structuring protein) ist ein globaler Regulator in E. coli, der in apathogenen Stämmen eingehend untersucht worden ist. Im Gegensatz dazu liegen noch keine umfassenden Studien zur Rolle von H-NS und des homologen Proteins StpA in einem pathogenen E. coli Stamm vor. Zudem konnten wir ein drittes, bis jetzt noch nicht charakterisiertes Mitglied der Familie von H-NS-ähnlichen Protein im uropathogenen E. coli Isolat 536 identifizieren, das Hlp benannt wurde (für H-NS-like protein). Hlp ist ein aus 134 Aminosäuren bestehendes Protein, dessen Sequenz zu 58 % identisch mit der des H-NS Proteins ist. Das Gen, das für das Hlp Protein kodiert, hlp, konnte in zahlreichen uropathogenen und Fäkalisolaten nachgewiesen werden, jedoch nicht im apathogenen E. coli K-12. In den UPEC Isolaten 536 und CFT073 ist das hlp Gen auf einer 23-kb großen genomischen Insel lokalisiert, die in den serU Lokus inseriert ist und möglicherweise über horizontalen Gentransfer erworben wurde. Untersuchungen zur Transkription des hlp Gens ergaben, dass das Gen monocistronisch von einem einzigen Promotor transkribiert, und dessen Expression durch H-NS reprimiert wird. Rekombinantes Hlp Protein war befähigt, sowohl an seinen eigenen, als auch an den hns Promotor zu binden, was zu negativer Auto- und Kreuzregulation führte. Zudem konnte gezeigt werden, dass Hlp und H-NS direkt miteinander interagieren, was zu stabilen Heteromeren führte. Komplementierungsstudien in hns Mutanten einiger K-12 Stämme ergaben, dass das Hlp Protein über in vivo Aktivität verfügt, was es befähigte, die Abwesenheit von H-NS bei zahlreichen Phänotypen wie z.B. Motilität, Wachstum, und Repression der proU, bgl und clyA Gene zu komplementieren. Die Rolle der Histon-ähnlichen Proteine bei der Expression von Virulenz-assoziierten Genen wurde mittels DNA Array Technologie, sowie klassischen phänotypischen Tests analysiert. Dabei wurden die meisten der beobachteten Effekte einzig durch das H-NS Protein bedingt. Die Expressionsstudien ergaben, dass über 500 Gene von einer hns Mutation beeinflusst wurden, was eine verstärkte Expression des alpha-Hämolysins, mehrerer Fimbrien und Eisenaufnahmesysteme sowie von Genen, die in Stress-Antworten involviert sind, bedingte. Des Weiteren konnten zahlreiche putative Virulenzfaktoren dem H-NS-Regulon zugeordnet werden. Andererseits konnten keine Effekt durch StpA beobachtet werden. Eine hns stpA Doppelmutante wies jedoch ein eindeutiges Expressionsmuster auf, das in großen Teilen von dem der hns Einzelmutante abwich. Dies legt nahe, dass beide Proteine direkt miteinander interagieren, was das Auftreten von unterschiedlichen Regulons zur Folge hat, die entweder durch H-NS oder einem heteromeren H-NS/StpA Komplex beeinflusst werden. Obwohl das H-NS Protein – entweder als Homomer oder als Komplex mit StpA – einen sehr starken Einfluss auf die Genexpression pathogener E. coli Stämme nimmt, bleiben dessen Effekte auf die tatsächliche Virulenz im Urogenitaltrakt unklar. In einem experimentellen Mausmodell der aufsteigenden Harnwegsinfektion bewirken hns Mutanten, in hoher Dosis verabreicht, eine rasch eintretende Lethalität, was vermutlich der verstärkten Produktion von alpha-Hämolysin zuzuschreiben ist. In verringerter Dosis verabreicht, sind diese Mutanten durch ihre langsameren Wachstumsraten jedoch attenuiert, was nur teilweise durch die vestärkte Expression zahlreicher Virulenzfaktoren kompensiert werden kann. Wie schon bei StpA beobachtet, besitzt eine hlp Mutante keinen offensichtlichen Phänotyp, zumindest unter Standard-Wachstumsbedingungen. Jedoch macht sich in hns hlp Doppelmutanten ein starker Wachstumsdefekt bei erniedrigten Temperaturen bemerkbar, was eine biologische Relevanz von H-NS/Hlp Heteromeren unter bestimmten Bedingungen nahe legt. Des Weiteren exprimierten diese Mutanten erhöhte Mengen an Kapsel-Polysacchariden und Curli-Adhesin, was als Indiz für eine besondere Rolle für H NS und Hlp bei der Regulation dieser Oberflächenstrukturen dienen kann. Zudem hatten beide H-NS-Paraloge Hlp und StpA einen modulierenden Effekt bei der H-NS-vermittelten Regulation weiterer Fimbrien-Adhesine und waren in gegenläufigen Maßen für normales Wachstum bei erhöhten bzw. erniedrigten Temperaturen notwendig. Zuletzt variierte das Expressionsniveau der drei Histon-ähnlichen Proteine H-NS, StpA und Hlp bei unterschiedlichen Temperaturen, was auf eine flexible Zusammensetzung verfügbarer Nucleoid-assoziierter Proteine hindeutet. Dies alles impliziert, dass die biologische Relevanz von Hlp, und StpA gleichermaßen, nicht auf gesonderten Funktionen des einzelnen Proteins beruht, sondern vielmehr auf deren Interaktionen mit dem globalen Regulatorprotein H-NS. KW - Escherichia coli KW - Pathogenität KW - Histone-like proteins KW - Genregulation KW - Histon-ähnliche Proteine KW - H-NS KW - StpA KW - Genregulation KW - UPECs KW - Histone-like proteins KW - H-NS KW - StpA KW - Gene regulation KW - UPECs Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17617 ER - TY - THES A1 - Michaelis, Kai T1 - Untersuchungen zur Genomstruktur und Biofilmbildung von pathogenen Escherichia coli Isolaten T1 - Analysis of genome structure and biofilm formation of pathogenic Escherichia coli strains N2 - Das Kerngenom pathogener Escherichia coli Isolate wird von zahlreichen variablen Regionen unterbrochen, die meist durch horizontalen Gentransfer erworben wurden und über das ganze Chromosom verteilt sind. Diese variablen Bereiche tragen häufig Gene für Virulenz- und Fitnessfaktoren und sind oftmals nur instabil in das Chromosom integriert. Um die Verbreitung variabler Bereiche, die insbesondere Virulenzfaktoren kodieren, innerhalb verschiedener klinischer Isolate näher untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit ein spezieller DNA-Array entwickelt. Dieser enthielt zahlreiche Sonden für Gene, die für die Virulenz von verschiedenen Erregern der Gattung E. coli als auch der Untergruppe Shigella charakteristisch sind. Mit diesem "Pathoarray" wurde die Verbreitung von Virulenzgenen in unterschiedlichen E. coli Isolaten untersucht. Zusätzlich wurden Unterschiede im Kerngenom mit Hilfe eines kommerziell erwerbbaren DNA-Arrays bestimmt. Ein Vergleich des Kerngenoms von uropathogenen Stämmen mit Derivaten, bei denen Pathogenitätsinseln deletiert sind, bestätigte die Auffassung, dass der Deletion von Pathogenitätsinseln ein spezieller Mechanismus zu Grunde liegt, von dem das Kerngenom nicht betroffen ist. Das Kerngenom der untersuchten Stämme war prinzipiell sehr konserviert und unterschied sich lediglich durch wenige Gene aus Bakteriophagen. Die größten Unterschiede wurden bei Genen beobachtet, die zum variablen Teil des Genoms gehören und charakteristisch für das jeweilige Isolat waren. Mit Hilfe der DNA-Array Technologie lassen sich auch Änderungen von Expressionsprofilen studieren, die von Mutationen oder durch Umwelteinflüsse bedingt werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde durch Transkriptomanalysen das RfaH-abhängige Regulon untersucht, insbesondere im Hinblick auf solche Gene, die die Biofilmbildung beeinflussen. Beim Vergleich der Transkriptome von E. coli 536rfaH mit dem Wildtyp wurde eine signifikant erhöhte Expression von Antigen 43 festgestellt. Im E. coli K-12 Stammhintergrund konnte dieses Oberflächenprotein als Hauptfaktor für die RfaH-abhängige Biofilmbildung identifiziert werden. Das verkürzte LPS-Kernoligosaccharid im Stamm MG1655rfaH hatte ebenfalls einen großen Einfluss auf die verstärkte Biofilmbildung. Vermutlich verstärkte die verbesserte Präsentation von Agn43 durch ein verkürztes LPS die Biofilmbildung signifikant. Andere Oberflächenstrukturen, wie die Colansäure-Kapsel, zeigten keinen Effekt auf die Biofilmbildung von E. coli MG1655rfaH. Neben den Expressionsprofilen der Stämme 536 und 536rfaH bei 37 Grad C wurden auch die Expressionsprofile bei 30 Grad C sowie von Biofilmen analysiert. Prinzipiell konnten bei allen untersuchten Wachstumsbedingungen nur geringe Unterschiede zwischen 536 und 536rfaH festgestellt werden. Beim Vergleich der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen (Temperatureffekt und planktonische Zellen vs. Biofilm) wurden jedoch deutliche Unterschiede beobachtet. Sowohl Gene des Kerngenoms als auch Gene von Pathogenitätsinseln waren temperaturabhängig reguliert. Bei E. coli Isolaten lassen sich neben genomischen Unterschieden auch phänotypische Unterschiede beobachten. Es wurde festgestellt, dass die Biofilmbildung von E. coli Isolaten abhängig von verschiedenen Faktoren und molekularen Mechanismen ist. Zudem konnte dargelegt werden, wie Unterschiede in der Zusammensetzung der äußeren Membran durch eine veränderte LPS-Struktur und die Expression von Adhäsinen die Biofilmbildung beeinflussen können. N2 - Evolutionary adaptation is the driving force for the variability observed within genomes of all different Escherichia coli pathotypes. Beside the core genome, shared by all strains, also variable regions, which can be strain-specific, are scattered on the chromosome. These flexible regions mostly encode virulence factors as well as other fitness factors and are acquired through horizontal gene transfer but are also characterised by their instability. To shed a closer light on the distribution of these virulence factors among different clinical isolates, DNA-arrays were used for genome comparisons. One aim of this Ph.D. thesis was the design of a DNA-array with specific probes for typical virulence-related genes of pathogenic E. coli. With this tool in hand, the distribution of virulence genes among several E. coli isolates was analysed. In addition to virulence related genes, also differences in the core genome of well-known uropathogenic isolates of E. coli were detected using DNA-array technology. Furthermore, the core genome of different wildtype strains was compared with derivatives shown to have lost pathogenicity islands. The results confirmed the assumption that PAI deletion from core genome is a specific process and underlies a specific mechanism. The core genome itself was very conserved and the observed small differences related to genes derived from different bacteriophages. The majority of differences were detected for the flexible regions, which differ in a strain-specific manner. DNA-array technology is also a versatile tool to gain insights in changes of gene expression levels caused by gene function disorders or environmental differences. The expression profiling approach using DNA-arrays was employed in the second part of this thesis. In this work, the RfaH-related regulon was studied by transcriptome analysis. Besides the already known effect of RfaH on facilitated capsule, LPS and alpha-haemolysin expression, the focus was set on genes involved in biofilm formation. Comparison of the 536rfaH and the wildtype strain transcriptomes revealed a significant upregulation of agn43 transcript levels. In order to study the underlying mechanisms of RfaH-dependent increased biofilm formation, selected mutants of E. coli K-12 and 536 were generated and tested for their biofilm forming capacities. In MG1655rfaH we could show that Agn43 is the major factor leading to biofilm formation. In addition, this phenotype was dependent on the LPS core truncation coming along within rfaH deficient strains. In conclusion, these results demonstrated that the LPS core truncation leads to unshielding of Agn43 in this strain, thus supporting autoaggregation and biofilm formation. Other surface structures like colanic acid had no influence on this effect. Besides the expression profiles of strains E. coli 536 and 536rfaH at 37 degrees, also expression profiles at 30 degrees and in biofilms were analysed. Typical differences in either stage were characterised. In general, when comparing the expression profiles from wildtype and mutant the changes observed were very small. However, the influence of temperature and also the mode of growth (planktonic cells vs. biofilm) affected the expression profiles in both strains more severely. In conclusion, E. coli strains not only differ in their genotypes, moreover complex phenotypic differences are observable. The obtained phenotypic differences in biofilm formation were shown to be multifactorial. The phenotype was attributed to variances in the composition of the outer membrane. In this context, the influence of LPS structures and adhesin expression was pointed out. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Transkriptomanalyse KW - Genomvariabilität KW - DNA-Array KW - Transkriptomanalyse KW - Biofilmbildung KW - Phasenvariation KW - genome variability KW - DNA-array KW - transcriptome analysis KW - biofilm formation KW - phase variation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17593 ER - TY - THES A1 - Schmitter, Tim T1 - CEACAM3: ein neuartiger phagozytischer Rezeptor der angeborenen Immunantwort zur Erkennung human-spezifischer Pathogene T1 - CEACAM3: a new phagocytic receptor of the innate immunity recognizing human-specific pathogens N2 - Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort. N2 - The exclusivley human specific pathogen Neisseria gonorrhoeae is the causative agent of gonorrhoea a veneric disease characterized by an acute inflammation of infected area and a massive infiltration of granulocytes. During an acute, symptomatic gonorrhoeae the pathogen is able to interact with CEACAM proteins of different cells by the means of their so called OpaCEA-adhesins. In this doctaral thesis the pathogen-phagocyte-interaction was to be investigated by cell biology, biochemical and genetical methods. The contact of OpaCEA-expressing gonococci with primary granulocytes induces ruffling of the membrane and lammelipodia-like protrusion finally leading to the CEACAM-dependent phagocytosis of the pathogenic bacteria. Earlier infection-studies with pro-myelomonocytic cells were able to show that the phenotypic cytoskeleton rearrangement and the internalisation of gonococci was dependet on the stimulation of Src-family kinases and the small GTPase Rac. Initial in vitro infection studies with transiently transfected human epithelial 293 cells showed that exclusively CEACAM3-mediated internalisation of OpaCEA-expressing gonococci depends on the catalytic activity of Src-family kinases. This was further corroborated by infecting CEACAM3-expressing, genetic manipulated S-/Y-/F--deficient mouse fibroblasts with gonococci, as only cells reconstituted with c-Src were able to internalise OpaCEA-expressing gonococci. Bacterial ligation of CEACAM3 leads to Src-family kinase dependent tyrosin phosphorylation within the cytoplasmatic-tail of CEACAM3 and on the molecular level the kinase itself is able to directly interact with phosphorylated CEACAM3 via its SH2-domain. Accordingly, stimulation of the small GTPase Rac is connected to bacterial CEACAM3 ligation, as expression of a dominant negative Rac constructs only interferes with CEACAM3, but not with CEACAM6 mediated internalisation of gonococci. In addition recruitment of Rac to adhering bacteria and Rac stimulation is dependent on CEACAM3 mediated uptake and expression of the OpaCEA-adhesins. A critical part of CEACAM3 mediated signal transduction turned out to be it’s ITAM like sequence. Either mutation of both tyrosine residues or deletion of the whole cytoplasmatic tail inhibited CEACAM3-mediated Rac stimulation and accordingly internalisation of OpaCEA-expressing gonococci. However CEACAM3-mediated internalisation is not restricted to gonococci as CEACAM-binding Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae also stimulate Rac-GTP-loading while taken up via CEACAM3. In the last part of the doctoral thesis I was able to identify the molecular link between Rac stimulation and bacterial CEACAM3 engagement. Vav serves as a specific GEF towards the stimulation of the small GTPase Rac, as a dominant negative version of Vav or a specific Vav-siRNA blocks CEACAM3-mediated uptake of OpaCEA-expressing gonococci and GTP-loading of Rac respectively. Vav directly binds to CEACAM3 via it’s SH2 domain leading to a CEACAM3-Vav protein complex after phosphorylation of tyrosinresidue 230 of CEACAM3. by stimulated Src-family kinases. The uniqueness of CEACAM3-initiated signal transduction provided a method to identify it’s relevance during phagocytosis of CEACAM binding bacteria in primary human granulocytes. Especially the pharmacological inhibitor PP2 interferes in a concentration dependent manner with the uptake of gonococci in granulocytes while Nystatin which inhibits CEACAM1 and CEACAM6 dependent internalisation in vitro has no effect on bacterial uptakte in human granulocytes. Accordingly, interference of CEACAM3 mediated stimulation of Vav (TAT-Vav-dn) or Rac (Tat-Rac-dn) inhibited uptake of OpaCEA-gonococci into primary cells. In addition a CEACAM3-specific but not a CEACAM1 or CEACAM6 specific monoclonal antibody inhibited internalisation and elimination of CEACAM-binding bacteria. Therefore, the results presented in this doctoral thesis describe CEACAM3 which is exclusively expressed on human granulocytes as a novel single-chain phagocytic receptor of the innate immune system. KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Immunreaktion KW - Rezeptor KW - CEACAMs KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Haemophilus influenzae KW - Moraxella catarrhalis KW - angeborene Immunabwehr KW - CEACAMs KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Haemophilus influenzae KW - Moraxella catarrhalis KW - innate Immunity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17271 ER - TY - THES A1 - Middendorf, Barbara T1 - Untersuchungen zur Instabilität von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 : "Island Probing" von PAI I(536) - PAI V(536) T1 - Studies on the instability of pathogenicity islands of the uropathogenic Escherichia coli strain 536: 'Island Probing' of PAI I(536) - PAI V(536) N2 - Der uropathogene Escherichia coli Stamm 536 (O6:K15:H31) stammt aus einem Patienten mit akuter Pyelonephritis und ist heute einer der Hauptmodellorganismen für Studien zum Vorkommen und zur Funktionalität von Pathogenitätsinseln (PAIs). Sein Genom enthält sechs genetische Elemente (PAI I(536) bis PAI VI(536)), die an unterschiedlichen Stellen des Chromosoms integriert sind und die Hauptkriterien für PAIs erfüllen. Sie kodieren für viele Virulenzfaktoren des Stammes, sind am 3' Ende von tRNA Genen integriert, enthalten teils kryptische Fragmente mobiler genetischer Elemente wie Integrase- oder Transposasegene und werden meist von IS Elementen oder 'direct repeats' (DRs) flankiert. Darüber hinaus haben sie die Tendenz, instabil zu sein und aus dem Chromosom zu deletieren. Mit Ausnahme von PAI IV(536) sind alle PAIs von E. coli 536 mit intakten Integrasegenen assoziiert, die zu int Genen des Coliphagen P4 bzw. des Shigella flexneri Phagen SfX ähnlich sind. Neuere Untersuchungen zeigen, daß diese Gene exprimiert werden und für funktionelle Enzyme kodieren. Zusätzlich werden die PAIs ebenfalls mit Ausnahme von PAI IV(536) von DRs unterschiedlicher Größe flankiert, die den Randbereichen von Prophagen im prokaryontischen Chromosom entsprechen. Es ist daher wahrscheinlich, daß PAI-Deletionen vergleichbar zum Insertions-/Exzisionsmechanismus von Bakteriophagen durch die jeweilige PAI-assoziierte Integrase vermittelt werden und durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs erfolgen. Die Instabilität von PAI I(536) und PAI II(536) ist schon früh belegt worden. Jede Insel kodiert für eine Hämolysindeterminante und ihre Kodeletion führt zu einem ahämolytischen Phänotyp, der mit einer Häufigkeit von 3×10(-5) in vivo und bis 1x10(-3) in vitro auftritt. Die Exzision erfolgt durch ortsspezifische Rekombination zwischen den 16 bp bzw. 18 bp großen flankierenden DRs der PAIs. Da den übrigen E. coli 536-spezifischen PAIs entsprechende phänotypische Marker fehlen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit das 'Island Probing'-Verfahren angewendet, um die Instabilität von PAI I(536) bis PAI V(536) im Detail zu untersuchen. Dazu wurde der negative Selektionsmarker sacB separat in die PAIs integriert. Zellen, die diesen Marker tragen, sind saccharosesensitiv und können nur in Gegenwart hoher Saccharosekonzentrationen wachsen, nachdem die sacB-markierte PAI aus dem Chromosom deletiert wurde. Auf diese Weise konnten von sacB-markierten Derivaten des Stammes E. coli 536 gezielt PAI-negative Zellen isoliert werden, um die Grunddeletionsraten der PAIs zu bestimmen und ihre Randbereiche zu analysieren. Zusätzlich wurde der Einfluß verschiedener Umwelteinflüsse wie niedrige/hohe Temperatur, osmotischer Streß, Nährstoffmangel, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Gegenwart konjugativer Plasmide auf die Exzisionsrate untersucht. Die in dieser Arbeit vorgestellten Daten zeigen, daß PAIs von E. coli 536 mit unterschiedlicher Häufigkeit deletieren. Während PAI II(536) und PAI III(536) mit Deletionsraten von 2×10(-5) bzw. 5x10(-5) am instabilsten sind, liegen die Exzisionsraten von PAI I(536) und PAI V(536) mit 2x10(-6) bzw. 1×10(-6) niedriger und deuten auf eine fortschreitende Stabilisierung dieser PAIs hin. Im Gegensatz dazu ist PAI IV(536) bereits vollständig stabil in das Chromosom eingebettet. Während die Exzision von PAI I(536), PAI II(536) und PAI V(536) RecA-unabhängig ist und auf ortsspezifischer Rekombination zwischen ihren flankierenden DRs beruht, treten bei PAI III(536) zwei alternative Deletionsmechanismen auf. Die Exzision dieser PAI erfolgt entweder vollständig durch ortsspezifische Rekombination zwischen den flankierenden DRs oder partiell durch homologe Rekombination zwischen zwei IS100 Elementen innerhalb der PAI. Unabhängig vom Rekombinationsmechanismus führt die Deletion aber in allen Fällen zur Bildung zirkulärer Intermediate (CIs), die vermutlich aufgrund fehlender Replikationsstartpunkte bei nachfolgenden Zellteilungen verlorengehen. Obwohl CIs von PAI II(536) und PAI III(536) mit Hilfe spezifischer PCR-Reaktionen identifiziert werden konnten, war ein PCR-Nachweis PAI I(536)- und PAI V(536)-spezifischer CIs bedingt durch die niedrigen Deletionsraten dieser Inseln nicht möglich. Interessanterweise konnte in dieser Arbeit erstmalig gezeigt werden, daß die Deletion von PAI II(536) und PAI III(536) bei niedriger Wachstumstemperatur, hoher Zelldichte und Nährstoffmangel in vitro induzierbar ist, d. h. unter Bedingungen, die auch in natürlichen Biofilmen auftreten können. Andere Bedingungen wie osmotischer Streß, subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen oder die Anwesenheit konjugativer Plasmide haben keinen Einfluß auf die Deletionsrate der PAIs. Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Instabilität von PAIs bei E. coli 536 in vivo eine wichtige Rolle spielt indem sie zur Genomflexibilität und Evolution sowie zur Modulation der Virulenzgenexpression der Bakterien beiträgt. N2 - The uropathogenic Escherichia coli strain 536 (O6:K15:H31) was originally isolated from a patient suffering from acute pyelonephritis and is now one of the best-characterized model organisms to study the existence and functionality of pathogenicity islands (PAIs). Its genome carries six genetic elements (PAI I(536)-PAI VI(536)), which are inserted at different sites of the chromosome and exhibit the main features of PAIs: They encode many virulence genes of this strain, they are inserted at the 3’ end of tRNA genes, they are associated with sometimes cryptic fragments of mobile genetic elements such as integrase genes or transposase genes, and they are flanked by IS elements or direct repeats (DRs). Furthermore, they have the tendency to be instable and to delete from the chromosome. With the exception of PAI IV(536) all PAIs of E. coli strain 536 are associated with intact integrase genes, which are similar to the int genes of coliphage P4 and the Shigella flexneri phage SfX, respectively. Recently, it was shown, that these genes can be expressed and code for functional enzymes. Furthermore, with exception of PAI IV(536), the PAIs of strain 536 are flanked by DRs of different size, which correspond to the left and right end junctions of prophages in the prokaryotic chromosome. Therefore, it is very likely, that comparable to the insertion/excision mechanism of bacteriophages the deletion of PAIs is mediated by the respective PAI-encoded integrase and functions via site-specific recombination between the flanking DRs. Instability of PAI I(536) and PAI II(536) has been described very early. Each island encodes a hly gene cluster and their co-deletion leads to a non-hemolytic phenotype, which can appear with a frequency of 3x10(-5) in vivo and up to 1x10(-3) in vitro. The excision of both PAIs is the result of site-specific recombination between their 16 bp and 18 bp flanking DRs, respectively. Since all other E. coli 536-specific PAIs lack a comparable phenotypic marker, we used the 'Island Probing' approach to investigate the instability of PAI I(536) to PAI V(536) in more detail. For this purpose, the counterselectable marker sacB was integrated separately into the PAIs. Cells carrying this marker have a sucrose sensitive phenotype and are only able to grow on high concentrations of sucrose after the deletion of the sacB-labeled PAI from the chromosome. Thus, we were able to isolate PAI-negative cells systematically from sacB-positive derivatives of E. coli strain 536 to estimate the basic deletion rate of the PAIs and to analyze their junctions to the chromosome in more detail. Additionally, the influence of different environmental conditions such as low or elevated temperature, osmotic stress, depletion of nutrients, subinhibitory concentrations of antibiotics, and the presence of conjugative plasmids on the excision rate of the PAIs was investigated. According to the data presented in this study, PAIs of E. coli strain 536 delete with different frequencies. While PAI II(536) and PAI III(536) are the most unstable islands with deletion rates of 2×10(-5) and 5×10(-5), respectively, the excision rates of PAI I(536) and PAI V(536) are lower with values of 2×10(-6) and 1×10(-6), respectively, which indicates a progressive stabilization of these PAIs. In contrast, PAI IV(536) is already stably embedded in the chromosome. While the excision of PAI I(536), PAI II(536), and PAI V(536) is RecA-independent and is based on site-specific recombination between their flanking DRs, two alternative deletion mechanisms were identified in case of PAI III(536). This PAI either deletes in its entirety by site-specific recombination between its flanking DRs or partially by homologous recombination between two IS100 elements located within the PAI. Independent of the recombination mechanism, deletion leads in all cases to the formation of so-called circular intermediates (CIs), which lack an origin of replication and are probably lost during the following cell divisions. Such CIs of PAI II(536) and PAI III(536) were detected by specific PCR reactions, but an experimental proof of PAI I(536)- and PAI V(536)-specific CIs was not possible probably because of the low deletion rate of these islands. Interestingly, this study demonstrates for the first time that deletion of PAI II(536) and PAI III(536) is inducible by low incubation temperature, high cell density, and low nutrient supply, i.e. conditions that can also occur in natural biofilms. Other stimuli such as osmotic stress, subinhibitory antibiotic concentrations, or the presence of conjugative plasmids seem to have no effect on the deletion rates of the PAIs. In summary, the presented results suggest that instability of PAIs of the E. coli strain 536 is important in vivo by contributing to genome flexibility and evolution as well as to the modulation of virulence gene expression of the bacteria. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Pathogenitätsinseln KW - Genomplastizität KW - Deletionsrate KW - ortsspezifische/homologe Rekombination KW - zirkuläre Intermediate KW - pathogenicity islands KW - genome plasticity KW - deletion rate KW - site-specific/homologous recombination KW - circular intermediates Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16573 ER - TY - THES A1 - Winkelmann, Julia T1 - Molekulare Charakterisierung Saposin-ähnlicher Proteine von Entamoeba histolytica SCHAUDINN T1 - Molecular characterization of saposin-like proteins of Entamoeba histolytica SCHAUDINN N2 - Saposin-ähnliche Proteine (SAPLIPs) sind membraninteragierende Proteine, die sich durch die konservierte Position von drei Disulfidbrücken, einer typischen alpha-helikalen Proteinfaltung und der Fähigkeit mit Lipiden zu interagieren, auszeichnen. Ihre zellulären Funktionen sind äußerst vielfältig. Bis zum Beginn des Genomsequenzierungsprojektes waren die Amoebapores die einzigen bekannten und charakterisierten SAPLIPs von Entamoeba histolytica, dem Erreger der humanen Amöbenruhr. Aufgrund ihrer antimikrobiellen Aktivität stellen sie für diesen parasitischen Einzeller, der sich von phagozytierten Bakterien ernährt, wichtige Effektormoleküle dar. Sie können aber auch cytolytisch auf Wirtszellen wirken und werden deshalb als bedeutender Pathogenitätsfaktor angesehen. Die theoretische computergestützte Datenbankanalyse nach Abschluss der Genomsequenzierung ergab, dass es 16 weitere Gene kodierend für SAPLIPs zusätzlich zu den drei Amoebapore-Genen gibt. Die Sequenzen der neuen SAPLIPs sind abgesehen von dem Cysteinmotiv divers und auch die Größe der Proteine ist sehr unterschiedlich (77 - 1009 Aminosäuren). Alle besitzen sie jedoch eine einzige, C-terminal gelegene SAPLIP Domäne. Außer der SAPLIP-Domäne konnten keine weiteren bekannten funktionellen oder strukturellen Domänen in den relevanten Datenbanken identifiziert werden, die auf mögliche Funktionen hätten hinweisen können. Alle SAPLIP-Gene werden gleichzeitig in axenisch kultivierten Trophozoiten transkribiert wie durch reverse Transkriptions-PCR gezeigt wurde. Die vergleichende transkriptionelle Analyse im Mikroarray ergab, dass nach Kontakt mit menschlichen Kolonzellen keine Hochregulierung dieser Gene mit Ausnahme des Amoebapore A Gens stattfindet. Für die parallele Klonierung der verschiedenen SAPLIP-Domänen wurde ein ”Expressionsscreening” in E.coli mit dem grün fluoreszierenden Protein als Reporterprotein etabliert, das die erfolgreiche Klonierung und Expression eines Fragments aufgrund der Fluoreszenz der Bakterienkolonie bereits auf der Ebene der Transformation anzeigt. Die rekombinant exprimierte und bis zur Homogenität gereinigte SAPLIP-Domäne von SAPLIP 12 wies Amoebapore-ähnliche Aktivitäten auf. Unter Verwendung von Liposomen konnte porenbildende Aktivität nachgewiesen werden, wobei diese Aktivität stark an einen sauren pH-Wert gebunden ist. Die SAPLIP-Domäne 12 ist aber auch antibakteriell und dieses sogar mit vergleichbarer Selektivität wie Amoebapore A, nämlich Zelllyse von gram-positiven B. megaterium war nachweisbar, jedoch nicht von gram-negativen E. coli. Strukturell unterscheiden sich die SAPLIP-Domäne 12 und Amoebapore A bezüglich der Exposition positiver Ladungsansammlungen auf der Proteinoberfläche und des Fehlens des für den Mechanismus der Amoebapores essentiellen Histidinrestes an entsprechender Position in der Sequenz. Darüber hinaus übt die SAPLIP-Domäne 12 eine im Vergleich zum Amoebapore A geringere spezifische Aktivität aus. Diese Eigenschaften weisen darauf hin, dass es sich um einen anderen Wirkungsmechanismus handeln könnte. Für die SAPLIP-Domäne 12 wäre eine über die positiven Ladungen der Proteinoberfläche vermittelte Interaktion mit den negativ geladenen Phospholipidköpfen von Membranen denkbar, die bei Erreichen einer bestimmten Konzentration in einer Störung der Lipidordnung und letztendlich in der Auflösung der Membranstruktur resultieren könnte. SAPLIP 3 ähnelt den Amoebapores in der Größe und molekularen Architektur und kann somit als funktionelle Einheit angesehen werden, es unterscheidet sich aber durch eine hohe negative Nettoladung von den Amoebapores. Außerdem ist das rekombinante SAPLIP 3 nicht antibakteriell und die Membraninteraktionen dieses SAPLIPs unterscheiden sich grundlegend von denjenigen, die für die Amoebapores beschrieben sind. SAPLIP 3 zerstört nicht einfach die Liposomenstruktur wie von den porenbildenden Amoebapores bekannt, sondern es vermittelt die Fusion von multilamellaren Liposomen unter Freisetzung des Liposomeninhalts. Diese Aktivität ist abhängig von der Anwesenheit anionischer Lipide und von einem sauren pH-Wert. Die Fähigkeit zur Vesikelfusion sowie die Verteilung der negativen Ladungen von SAPLIP 3 auf der Proteinoberfläche ähneln Merkmalen des humanen Saposin C. Neben der Funktion als Cofaktor von Exohydrolasen, die im Sphingolipid Katabolismus involviert sind, wird angenommen, dass die Fähigkeit von Saposin C, Vesikel zu fusionieren, wichtig für die Reorganisation der humanen lysosomalen Kompartimente ist. Die Saposin C-ähnlichen Charakteristika von SAPLIP 3 geben Grund zu der Annahme, dass es bereits in einem so basalen Organismus wie der Amöbe ein Protein mit Saposin-ähnlichen membranfusionierenden Aktivitäten gibt und dass dieses SAPLIP entsprechende Funktionen während endo- und exozytotischer Transportprozesse in der Amöbe übernehmen könnte. N2 - Saposin-like proteins (SAPLIPs) are membrane-interacting proteins that are characterized by the conserved position of three disulphide bonds, a typical alpha-helical fold and the ability to interact with lipids. Their cellular functions are extremely diverse. Until the beginning of the genome-sequencing project, the amoebapores were the only known and characterized SAPLIPs of Entamoeba histolytica, which is the causative agent of human amoebiasis. Due to their antimicrobial activity, these proteins are important effector molecules of this unicellular parasite, which feeds on phagocytozed bacteria. However, they also exert cytolytic activity against host cells and therefore, they are considered to be a major pathogenicity factor of the amoeba. The theoretical computer-based data base analysis after the completion of genome sequencing revealed 16 genes coding for SAPLIPs in addition to the three amoebapore genes. The sequences of the novel SAPLIPs are diverse apart from the cysteine motif and furthermore, the sizes of the proteins are highly different (77 – 1009 amino acid residues). They all contain a single, C-terminally located SAPLIP domain. Beside the SAPLIP domain, no other functional or structural domains were identified in the relevant databases that would have pointed to possible functions. All SAPLIP-genes are transcribed in axenically cultured trophozoites at the same time as shown by reverse transcription PCR. The comparative transcriptional analysis using microarrays revealed that after six hours of contact with human cells and their phagocytosis none of these genes, with the exception of the amoebapore A gene, was upregulated. In order to clone the different fragments in parallel, an expression screening in E. coli with the green fluorescent protein as reporter protein was established, which indicates the successful cloning and expression of a fragment by the fluorescence of the bacterial colony already at the level of transformation. The SAPLIP domain 12, which has been recombinantly expressed and purified to homogeneity, exerts amoebapore-like activities. Using liposomes, pore-forming activity was detected, which is strongly dependent on acidic pH. Furthermore, the SAPLIP domain 12 is antibacterial even with similar selectivity as amoebapore A in that cell lysis of gram-positive B. megaterium was detectable but not of gram-negative E. coli. Structurally, the SAPLIP domain 12 differs from the amoebapores by exposing patches of positive charges on the protein surface und by lacking a histidine residue at a corresponding position in its sequence, which has been shown to be essential for the mechanism of amoebapore A. Moreover, the SAPLIP domain 12 displays a lower specific activity. These features indicate that this SAPLIP domain may act by means of another mechanism. It may interact with the negatively charged phospholipid head groups of membranes by its positively charged protein surface and after reaching a certain threshold concentration, possibly resulting in a disturbance of the lipid order and finally in the disintegration of the membrane structure. SAPLIP 3 resembles the amoebapores in size and molecular architecture and could therefore be considered as a functional unit, but it differs from the amoebapores by a highly negative net charge. Besides, the recombinant protein is not antibacterial and the membrane interactions of this SAPLIP are completely different from those described for the amoebapores. SAPLIP 3 does not simply destroy the liposome structure as known from the pore-forming amoebapores but induces leaky fusion of multilamellar liposomes. This activity is dependent on the presence of negatively charged lipids and on acidic pH. The capability of vesicle fusion as well as the negative charge distribution of SAPLIP 3 resembles features of the human saposin C. Beside its function as a cofactor of exohydrolases, which are involved in the sphingolipid catabolism, saposin C is considered to be involved in the reorganization of human lysosomal compartments due to its fusogenic activity. The saposin C-like characteristics of SAPLIP 3 suggest that a protein with saposin-like membrane fusogenic activity already exists in such a basal organism like an amoeba and that this SAPLIP fulfils corresponding functions during endo- and exocytotic transport processes in the amoeba. KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapor-Proteine KW - Molekularbiologie KW - Saposin-ähnliche Proteine KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapores KW - Membraninteraktionen KW - Saposin-like proteins KW - Entamoeba histolytica KW - Amoebapores KW - membrane interactions Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15927 ER - TY - THES A1 - Michel, Antje T1 - Molekularbiologische Untersuchungen zur Eignung Virulenz-relevanter Faktoren als Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika gegen Staphylococcus aureus T1 - Molecular analysis of virulence-relevant factors as targets for the development of new antibiotics N2 - Staphylococcus aureus ist ein bedeutender opportunistischer Krankheitserreger, der eine Vielzahl von Infektionen in Menschen und Tieren hervorrufen kann. Das Krankheitsbild reicht von leichten Hautinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Endokarditis, Sepsis oder Pneumonien. S. aureus ist ein Haupterreger nosokomialer Infektionen. Besonders die Antibiotikaresistenzentwicklung von S. aureus–Stämmen ist problematisch. Als wirksame Antibiotika können zur Zeit oft nur noch Vancomycin, Synercid oder Linezolid zur Therapie eingesetzt werden. Die alarmierende Resistenzentwicklung in S. aureus verdeutlicht, dass die Entwicklung neuer Antibiotika und die Identifizierung neuer bakterieller Angriffsstrukturen dringend erforderlich ist. Gängige antiinfektive Therapeutika sind gegen die bakterielle Zellwandsynthese, den DNA- und RNA-Stoffwechsel oder die Proteinbiosynthese gerichtet. In dieser Arbeit sollten Virulenz-relevante Zielstrukturen für die Entwicklung neuer Antibiotika untersucht werden. Insgesamt wurden sieben Gene analysiert, von denen vier zu Anfang dieser Arbeit in S. aureus noch nicht charakterisiert waren. Die Zielgene (clpP, purH, ssrA und smpB) in S. aureus sollten deletiert werden, um ihre Überlebensnotwendigkeit in vitro- und in vivo zu überprüfen. Eine Deletion gelang bei den Genen clpP und purH, die somit als nicht essenziell in S. aureus zu betrachten sind. Die bereits zuvor als nicht-essenziell charakterisierten Gene arlR, arlS und putP wurden deletiert und die Mutanten dclpP, darlR, darlS, dpurH und dputP wurden phänotypisch in Hinsicht auf ihren Einfluss auf die Pathogenität in S. aureus analysiert. Die differenzielle Genexpression der Mutanten dclpP und darlR wurde mit Hilfe von Microarray-Hybridisierungsexperimenten untersucht. Die ∆clpP-Mutante zeigte einen starken Wachstumsdefekt bei verschiedenen Temperaturen (30, 37, 42°C) und war nicht mehr in der Lage bei 20°C zu wachsen. Ebenso war das Wachstum unter anaeroben Bedingungen stark beeinträchtigt. Der Stamm dclpP wies eine verringerte hämolytische Aktivität sowie eine verminderte Adhärenz an Polystyren auf. Außerdem konnte eine stark erhöhte autolytische Aktivität in einem Triton X-100-Assay beobachtet werden. In einem Invasions-Zellkulturassay mit 293T-Epithelzellen konnte eine ~10-fach erhöhte Invasivität im Vergleich zu dem isogenen Wildtyp festgestellt werden. Die Komplementierung der ∆clpP-Mutante durch Einführung eines clpP-Expressionsvektors führte nahezu bei allen getesteten Bedingungen zur Wiederherstellung des wildtypischen Phänotyps. Die Transkriptomanalyse der dclpP-Mutante ergab eine deutliche Veränderung in der Genexpression (15 % aller Gene). Eine computerunterstützte Analyse der Upstreambereiche der deregulierten Gene führte zu der Identifizierung verschiedener Regulons, die bei der bakteriellen Antwort auf verschiedene Stressbedingungen eine Rolle spielen. Die clpP-Deletion betrifft besonders Regulatoren, deren Aktivität in Abhängigkeit zu veränderten Redox-Bedingungen reguliert wird, wie z. B. verschiedenen Stressbedingungen und Anaerobiose. Die Konstruktion der darlR- und darlS-Mutanten führte zu einer gesteigerten hämolytischen Aktivität, einer erhöhten Adhärenz an Polystyren sowie einer erhöhten autolytischen Aktivität in Triton X-100-Assays. Die Internalisierungsrate durch 293T-Epithelzellen war vermindert. Die darlR-Mutante wurde in einem Katheter-assoziierten Infektionsmodell in Ratten eingesetzt. Die kompetitive Infektion mit Mutante und Wildtyp ergab einen deutlichen Nachteil bei der Etablierung einer Infektion durch die Mutante. Die Transkriptomanalyse der 8325darlR-Mutante in der exponenziellen und in der stationären Phase unterstreicht den großen Einfluss des ArlRS-Zwei-Komponenten-Systems auf die Regulation der Genexpression in S. aureus. In der exponenziellen Phase wurden insgesamt 5 % und in der stationären Phase 15 % der Gene differenziell exprimiert. dpurH- und dputP-Mutanten wiesen in vitro keine Veränderungen im Wachstums-verhalten, der Biofilmbildung oder hämolytischen Aktivität auf. In einem Infektionsmodell in Ratten führte die Deletion von purH in dem S. aureus-Stamm MA12 zu einer signifikanten Verminderung der Virulenz. Die Herstellung von smpB- und ssrA-Deletionsmutanten verlief ohne Erfolg. Es wurde versucht, einen direkten Nachweis für den essenziellen Charakter dieser Gene durch den Einsatz konditional letaler Expressionssysteme zu erbringen. Weder der Austausch des wildtypischen durch einen regulierbaren Promotor noch eine Antisense-RNA-Strategie war für eine eindeutige Klärung dieser Frage ausreichend. Es konnte durch diese Arbeit jedoch gezeigt werden, dass die Antisense-RNA-Strategie eine Beeinträchtigung des Wachstums von S. aureus bewirkt. N2 - Staphylococcus aureus is an important opportunistic pathogen that can cause a wide range of diseases in humans and animals. The outcome of an infection can range from mild skin infections to life-threatening infections, like endocarditis, bacteraemia and pneumonia. Currently, methicillin-resistant S. aureus strains (MRSA) that have acquired numerous additional resistances towards several antibiotics have established in the hospital-setting. Therefore, the treatment of hospital-acquired infections with S. aureus in a rising number of patients is becoming increasingly complicated. The remaining effective antibiotics to treat infections with multi-resistant MRSA are vancomycin, synercid, and linezolid. However, MRSA isolates with intermediate and high resistance towards vancomycin have been described recently, as well as synercid- and linezolid-resistant strains. The emergence and spreading of multi-resistant S. aureus is alarming and emphasises the need to develop new antibiotics. Currently, well-established therapeutics targeting processes of cell wall biosynthesis, DNA and RNA metabolism, and protein biosynthesis. This study comprises the investigation of putative targets of novel antibiotics. Therefore, seven target genes were selected and functionally characterised in vitro and in vivo. Four of these genes have not been characterised in S. aureus at the beginnig of this study. A deletion mutagenesis approach for these genes (clpP, purH, ssrA and smpB) should provide an indication of their essientiallity for the organism. clpP and purH could be successfully inactivated, supporting their non-essential role in S. aureus. The non-essential genes arlR, arlS and putP were inactivated and different phenotypic studies of the S. aureus deletion mutants ∆clpP, ∆arlR, ∆arlS, ∆purH and ∆putP were performed. Whole genome microarray analysis was applied on ∆clpP and ∆arlR mutants to study the manifold transcriptional changes by the inactivation of these two regulators in S. aureus. The growth rate of ∆clpP was strongly reduced at different temperatures (30°C, 37°C, 42°C) and completely inhibited at 20°C. Growth was highly impaired under anaerobic conditions. Moreover, ClpP deficiency resulted in a reduced hemolytic activity and diminished adherence to polystyren as well as a strongly enhanced autolytic activity. The invasiveness of ∆clpP was significantly elevated (~10-fold) compared to the isogenic wildtype as shown in an invasion assay with the 293T epithelial cell line. All these effects could be successfully reverted by complementation of the mutant strain with a vector expressing the native clpP sequence. The microarray analysis of ∆clpP revaeled a strong shift of the bacterial transcriptome (15 % of all genes were differentially regulated). Especially regulators and genes which reply to varying redox conditions, for example as a result of different stresses or anaerobiosis, were shown to be affected at the transcriptional level. Deletion mutants of the virulence-associated two component system genes arlR and arlS caused a higher hemolytical activity, enhanced adherence to polystyrene and an enhanced autolytic activity in a Triton X-100 assay. Furthermore, internalisation of arlRS bacteria by 293T epithelial cells was diminished, and ∆arlR was significantly less infectious than the wildtype in a catheter-related infection model in rats. The microarray analysis of ∆arlR in the exponential and stationary growth phase revealed a strong influence of the ArlRS-system on gene expression in S. aureus. In the exponential phase a total of 5 %, and in the stationary phase 15 % of all genes were differentially regulated. ∆purH and ∆putP showed no alterations of growth, biofilm formation or hemolytic properties compared to the wild type strain. Inactivation of purH, however, caused a significant attenuation of S. aureus MA12 in a rat-infection model. Since the construction of ssrA and smpB deletion mutants have failed, conditional lethal expression systems should be utilised to address the question of essentiality of these genes. It could be shown by this study that neither the genetic exchange of the wildtype promoter with an in vitro adjustable promoter nor an antisense RNA-based approach were sufficient to clearify the status of ssrA and smpB as essential genes in S. aureus. Importantly, the expression of antisense RNAs for both genes resulted in a growth defect of S. aureus KW - Staphylococcus aureus KW - Antibiotikum KW - Virulenz KW - Transkriptom KW - Staphylococcus aureus KW - Antibiotikum KW - Virulenz KW - Transkriptom KW - Staphylococcus aureus KW - antibiotics KW - virulence KW - transcriptome Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15128 ER - TY - THES A1 - Agerer, Franziska T1 - Integrin-vermittelte Invasion von Staphylococcus aureus in Säugerzellen T1 - Integrin mediated internalisation of Staphylococcus aureus in human cells N2 - Der Gram-positive Erreger Staphylococcus aureus ist ein Bestandteil der normalen Haut und Schleimhautflora des Menschen, kann aber auch ein weites Spektrum von Krankheitsbildern hervorrufen. Ein besonderes Charakteristikum dieses Pathogens besteht in der Expression von Oberflächenstrukturen, welche eine hohe Affinität für Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) von eukaryontischen Organismen aufweisen und die kollektiv als MSCRAMM (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) bezeichnet werden. Das auf der Bakterienoberfläche gebundene Fn kann in der Folge als eine Art molekulare Brücke zwischen FnBP exprimierenden S. aureus und dem Fn-Rezeptor auf der Wirtszellseite, dem Integrin 51, dienen. Neben der Anheftung an das Wirtsgewebe kann die indirekte Assoziation mit Integrin 51 die Aufnahme der Bakterien durch die eukaryontische Zelle auslösen. Wie die bakterielle Adhäsion an Integrin 51 und die Aggregation der Integrine durch die mit Fn-beschichteten Bakterien in ein Signal zur Aufnahme der Pathogene durch die Zelle umgesetzt wird, ist nicht vollständig geklärt und sollte im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein neues und effektives Protokoll zur fluoreszenzmikroskopischen Differenzierung von extra- und intrazellulären Bakterien entwickelt. Diese Methode besitzt den Vorteil, von Bakterien-spezifischen Antikörpern unabhängig zu sein. Dadurch bietet sich die Möglichkeit, Bakterien, gegen die es noch keine spezifischen Antiseren gibt, dennoch auf ihre zelluläre Lokalisation und Invasivität mittels mikrobiologischer Methoden untersuchen zu können. Im Hinblick auf die nähere Untersuchung der Signaltransduktion bei der Invasion von S. aureus war die kritische Rolle von Tyrosinkinasen für die Integrin-vermittelte Invasion ein erster wichtiger Hinweis. Diese Befunde führten zu weiteren spezifischeren Untersuchungen, wobei eine wichtige Rolle für Kinasen der Src Familie gezeigt werden konnte. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung der Src-Kinasen für die Internalisierung von S. aureus war ein dramatischer Rückgang der Aufnahmerate in Src/Yes/Fyn-defizienten Maus-Fibroblasten, verglichen mit Src-rekonstituierten Zellen. Auf biochemischer Ebene konnte eine deutliche Aktivierung der Src-Kinase nach einer Infektion mit S. aureus, nicht aber nach Infektion mit dem nicht-pathogenen S. carnosus festgestellt werden. Integrin-reiche fokale Kontakte (FK) sind angereichert mit Proteinen wie Talin, Vinculin, Paxillin, Tensin, -Actinin oder Zyxin sowie Signalenzymen wie der Fokalen Adhäsions Kinase (FAK) oder Kinasen der Src Familie. Die Protein Tyrosin Kinase (PTK) FAK ist nach Integrinstimulierung eines der Schlüsselenzyme in FK. Dies war der Anlass nach der Bedeutung von FAK für die Integrin-vermittelte Internalisierung von S. aureus zu fragen. Ebenfalls ein wichtiger Hinweis waren die starken Rekrutierungen von Markerproteinen von fokalen Komplexen zum Ort von zellgebunden S. aureus nicht aber von S. carnosus. Daraufhin wurde mittels dominant-negativer FAK-Mutanten und FAKdefizienter Mausfibroblasten der Einfluss von FAK für die Internalisierung von S. aureus untersucht. Bei beiden Versuchsansätzen konnte ein starker Rückgang der Aufnahme beobachtet werden. Zusammengefasst bestätigten diese Ergebnisse die essentielle Rolle von FAK für die Integrin vermittelte Aufnahme der pathogenen S. aureus. Bei der Reorganisation des Aktin-Zytoskeletts spielen eine Reihe von Proteinen eine wichtige Rolle, darunter auch Cortactin. Cortactin ist ein bekanntes Substrat der Src-Kinasen und es lag nahe, nach einer funktionellen Verbindung von Src, FAK und Cortactin zu suchen. Dominant-negative Cortactin-Mutanten, die keine Assoziation mit dem Arp2/3 Komplex oder mit Dynamin aufweisen, oder welche die von Src-vermittelte Phosphorylierung am C-Terminus verhindern, blockierten die Aufnahme von S. aureus. Mikroskopisch konnte eine starke Rekrutierung von Cortactin zu zellgebundenen S. aureus beobachtet werden, jedoch wurde die Rekrutierung nicht von FAK beeinflusst. Die Phosphorylierung von Cortactin aufgrund S. aureus-Infektion war allerdings FAK- und Src-abhängig. Diese Ergebnisse legen nahe, dass ine bisher unbeschriebene FAK/Src Cortactin Signalachse für die Regulation der Integrin-Internalisierung verantwortlich ist. Die detaillierten Untersuchungen der rezeptorvermittelten Aufnahme und der dabei induzierten Signaltransduktion in Wirtszellen gaben neue Erkenntnisse über die Pathogenitätsstrategien von S. aureus. Darüber hinaus ermöglichen diese Arbeiten neue Einblicke in die molekularen Vorgänge, welche die Internalisierung von Integrinen steuern. N2 - The gram-positive bacterium S. aureus is part of the normal skin and mucosal flora of humans, but it can also give rise to a wide spectrum of infectious diseases. Virulence-associated features of this pathogen include surface structures that interact with extracellular matrix (ECM) proteins of eukaryotic organisms. These adhesins have been collectively termed MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules). Fibronectin (Fn) binding to bacterial FnBPs functions as a molecular bridge linking the pathogen to the principal cellular Fn receptor, the integrin 51. In addition to allowing adherence of the bacteria to the host cell surface, the clustering of integrins also leads to the internalization of the microorganisms. How the integrin engagement by the fibronectin-coated bacteria is transduced into the cell and how this signal initiates bacterial engulfment is poorly characterized. Therefore, the major aim of this work was to identify host components that regulate integrin-dependent internalization of pathogenic S. aureus. As a first step, a novel and elegant microscopic method for the evaluation of bacterial invasiveness into eukaryotic cells was developed. The protocol is based on differential fluorescent staining of extracellular and intracellular bacteria and allows quantification of bacterial invasiveness using a fluorescence microscope. The most important advance of this method is the fact, that the bacteria are covalently labeled and therefore, robust and invariant staining of the total bacterial population is achieved. In addition, the protocol does not rely on bacteria-specific antibodies making this the method of choice in case specific antisera against the pathogen are not available. Functional analysis of signaling pathways involved in the uptake process revealed an important role for protein tyrosine kinases (PTKs) during integrin-mediated internalisation of S. aureus. The important function of Src PTKs was further corroborated by the dramatic decrease of S. aureus uptake by Src/Yes/Fyn-deficient cells compared to Src-expressing cells. Biochemically, a significant activation of Src PTKs was observed in human epithelial cells in response to infection with S. aureus, whereas there was no activation after an infection with the non-pathogenic S. carnosus. Integrin-initiated focal contacts (FC) are enriched in specific marker proteins such as vinculin, paxillin, tensin, actinin, or zyxin as well as signaling enzymes including the focal adhesion kinase (FAK) or Src PTKs. In contrast to S. carnosus, contact of S. aureus with the eukaryotic host cell membrane resulted in strong recruitment of FC marker proteins to the site of adherent bacteria. To investigate the role of FAK for the internalization of S. aureus, dominantnegative FAK-mutants and FAK-deficient mouse cells were infected with the pathogen. In all cases, a major reduction in the number of internalized S. aureus was observed. Taken together these results demonstrated an essential role of FAK for the integrin-mediated uptake of S. aureus and suggested that an active FAK/Src complex regulates bacterial internalization via integrins. In a further approach, effectors of the FAK/Src complex and potential regulators of actin cytoskeleton dynamics during internalization of S. aureus were investigated. Biochemical analysis of infected cells revealed the actin-binding protein cortactin as a major tyrosine phosphorylated protein in response to pathogenic staphylococci. Furthermore, cortactin was recruited to the vicinity of cell-bound S. aureus, but not to S. carnosus. Various dominant-negative cortactin mutants that were either compromised in their association with the Arp2/3 complex or dynamin-2, or that lacked critical tyrosine phosphorylation sites in the C-terminal domain interfered with the uptake of S. aureus. As both FAK and cortactin are substrates of active Src kinases and both are responsive to integrin stimulation, it was hypothesized that there is a functional link between FAK, Src, and cortactin. Though the recruitment of cortacin to the vicinity of cell-bound S. aureus was not influenced by the presence of FAK, the phosphorylation status of cortactin after infection with S. aureus or after integrin stimulation by a fibronectin matrix was dependent on both FAK and Src. Together, these results reveal a novel FAK/Src-cortactin signalling axis regulating integrin internalisation. The detailed examination of the FnBP-triggered, integrin-mediated bacterial uptake offers new insight into the pathogenicity strategies of S. aureus and might open up novel avenues for therapeutic intervention. In addition, this work furthers our understanding of the molecular processes regulating the internalisation of integrins. KW - Staphylococcus aureus KW - Integrine KW - Infektion KW - Signaltransduktion KW - Invasion KW - S.aureus KW - Integrine KW - Signaltransduktion KW - invasion KW - S.aureus KW - integrin KW - signal transduction Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14557 ER - TY - THES A1 - Schneider, György T1 - Studies on the architecture and on transferability of pathogenicity islands of uropathogenic Escherichia coli strain 536 T1 - Untersuchungen zur genetischen Struktur und Übertragbarkeit von Pathogenitätsinseln des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536 N2 - The establishment of genomic approaches including the sequence determination of complete bacterial genomes started a new era in microbiological research. Since then more than two hundred prokaryotic and eukaryotic genomes have been completely sequenced, and there are additional complete genome projects including different bacterial species and strains in progress (http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). The continously growing amount of bacterial DNA sequence information gives us also the possibility to gain deeper insight into bacterial pathogenesis. With the help of comparative genomics, microbiological research can focus on those DNA sequences that are present in pathogenic bacteria but are absent in non-pathogenic strains. With this knowledge and with the help of molecular biological methods such as PCR,DNA-chip technology, subtractive hybridisation, transcriptomics and proteomics we can analyse in detail what makes a particular bacterial strain pathogenic. This knowledge also gives us the possibility to develop new vaccines, therapeutic approaches or diagnostic tools. The aim of this work was the structural and functional analysis of DNA regions of uropathogenic Escherichia coli strain 536 that belong to the flexible E. coli gene pool. The first part of this thesis focused on the identification and structural characterisation of pathogenicity island V of strain 536 (PAI V536). PAI V536 is integrated at the pheV tRNA gene at 64 minutes of the E. coli K-12 chromosome. In addition to the intact pheV tRNA gene, a truncated copy ('pheV) that represents the last 22 bp of this gene’s 3'-end was identified 49 kb downstream of pheV on PAI V536. The analysis of the DNA sequence flanked by pheV and 'pheV revealed characteristics that are typical of PAIs. This DNA region exhibits homology to IS-elements and prophages and also comprises determinants coding for the Pix fimbriae, a phosphoglycerate transport system, an autotransporter, as well as for hypothetical proteins. Downstream of 'pheV, the K15 capsule determinant (kpsK15) of this strain is located. Structural analysis of the 20-kb kpsK15 locus revealed a so far unknown genetic organisation indicative of recombination events between a group 2 and group 3 capsule gene cluster. Downstream of the capsule determinant, the genes encoding a type II secretion system (general secretion pathway -GSP) are located on PAI V536. The K15 capsule locus was functionally characterized. Specific inactivation of each of the regions 1 to 3 of the kpsK15 gene cluster, and the use of a K15 capsule-specific antiserum demonstrated that this determinant is the functional K15 capsule locus of strain 536. It has been shown in an experimental murine model of ascending urinary tract infection with suckling mice that the K15 capsule contributes to urovirulence. Interestingly, the K15 capsule is not involved in serum resistance of strain 536. Inactivation of the PAI V536-encoded type II secretion system excluded a role of this general secretion pathway for capsule biosynthesis and virulence of strain 536 in the murine ascending urinary tract infection model. In the second part of the thesis, the transferability of PAIs was further investigated. Using PAI II536 as a model, mobilisation of this island from strain 536 into suitable recipient strains was investigated. For this purpose, an antibiotic resistance cassette, the R6K origin of replication as well as plasmid pGP704 carrying the mobilisation region of plasmid RP4 have been inserted into PAI II536. Transformation with the helper plasmid RP4, resulted a derivative of strain 536 that was used as a donor for conjugation experiments, while for recipient the pir + laboratory strain SY327 was used. After deletion the circularised PAI II536 was mobilised with the help of the conjugative helper plasmid (RP4) into the recipient laboratory strain SY327. The frequency of this event was about 10-8. It was also demonstrated that in the transconjugant strains the mobilized PAI II536 could be permanently present as a circular form and also can be integrated into the chromosome at the same chromosomal insertion site (leuX) as in the donor strain 536. Furthermore, after mobilisation and chromosomal integration of PAI II536 it was possible to remobilise this PAI back to a PAI II536-negative derivative of strain 536. The results obtained in this thesis increase our knowledge of the structure and function of a pathogenicity island of uropathogenic E. coli strain 536 and shed some light on the mechanisms contributing to genome plasticity and evolution of pathogenic E. coli variants. N2 - Mit der Einführung von Genomanalytik einschließlich der Sequenzbestimmung bakterieller Genome, startete eine neue Ära in der mikrobiologischen Forschung. Seit Beginn dieser Ära sind mehr als 200 prokaryotische und eukaryotische Genome komplett sequenziert worden. Weitere Genomanalysen über verschiedene Bakterienspezies und Stämme sind in Arbeit(http://www.tigr.org, http://www.sanger.ac.uk). Durch die stetig anwachsende Menge an Informationen über bakterielle DNA Sequenzen, sind wir in der Lage, einen tieferen Einblick in die bakterielle Pathogenität zu bekommen. Mittels vergleichender Genomanalyse kann sich die mikrobiologische Forschung auf bestimmte DNA Sequenzen konzentrieren, welche in pathogenen Stämmen vorhanden sind, in apathogenen Stämmen aber fehlen. Mit diesem Wissen und durch molekularbiologische Methoden wie Polymerase Kettenreaktion, DNA-Chip- Technologie, Subtraktiver Hybridisierung, Transkriptom- und Proteom-Analyse können wir im Detail untersuchen, welche Faktoren für die Pathogenität eines speziellen Bakterienstammes verantwortlich sind. Diese Erkenntnisse geben uns auch die Möglichkeit neue Impfstoffe, therapeutische Verfahren und diagnostische Werkzeuge zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Struktur und Funktion von DNA-Regionen des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536, welche zum flexiblen Genpool von E. coli gehören. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Identifizierung und strukturelle Charakterisierung der Pathogenitätsinsel V des E. coli Stammes 536 (PAI V536). Die Integrationsstelle von PAI V536 liegt im E. coli K-12 Chromosom beim tRNA Gen pheV bei 64 Minuten. Zusätzlich zum intakten pheV tRNA Gen wurde auf der PAI V536 eine verkürzte Kopie des Gens (´pheV) 49 kb stromabwärts von pheV identifiziert. Diese Kopie repräsentiert die letzten 22 bp des 3´-Endes von pheV. Eine Analyse der von pheV und ´pheV eingeschlossenen DNASequenz zeigte typische Eigenschaften einer Pathogenitätsinsel. Die untersuchte DNA-Region besitzt Homologie zu IS-Elementen und Prophagen, außerdem beinhaltet sie Determinanten, die für Pix Fimbrien, ein Phosphoglycerat-Transportsystem, einen Autotransporter sowie für unbekannte Proteine kodieren können. Stromabwärts von ´pheV liegt die K15 Kapsel Determinante (kpsK15) des E. coli Stammes 536. Eine strukturelle Analyse des 20-kb kpsK15 Lokus zeigte eine bislang unbekannte genetische Anordnung, welche auf ein Rekombinationsereignis zwischen einem Gruppe 2 und einem Gruppe 3 Kapsel Gencluster hinweist. Stromabwärts der Kapsel Determinante sind auf der PAI V Gene lokalisiert, welche für ein Typ II Sekretionssystem („General Secretion Pathway“) kodieren. Der K15 Kapsel Lokus wurde funktional charakterisiert. Die spezifische Inaktivierung der Regionen 1 bis 3 des kpsK15 Genclusters und die Verwendung eines K15 Kapsel-spezifischen Antiserums zeigten, daß es sich tatsächlich um den funktionalen K15 Kapsellokus des E. coli Stammes 536 handelt. Im Tiermodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion bei neugeborenen und säugenden Mäusen, konnte gezeigt werden, daß die K15 Kapsel zur Urovirulenz beiträgt. Interessanterweise trägt die K15 Kapsel des E. coli Stammes 536 nicht zur Serumresistenz bei. Die Inaktivierung des in der PAI V536 kodierten Typ II Sekretionssystems schließt eine Rolle des „General Secretion Pathways“ bei der Kapsel Biosynthese und bei der Virulenz des E. coli Stammes 536 im Mausinfektionsmodel einer aufsteigenden Harnwegsinfektion aus. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Mobilisierung von Pathogenitätsinseln untersucht. PAI II536 wurde als Model genutzt, um den Transfer einer PAI von E. coli 536 in einen geeigneten Rezipientenstamm zu zeigen. Zu diesem Zweck wurde eine Antibiotikaresistenzkassette, der Replikationsstartpunkt RK6 und das Plasmid pGP704, das die Mobilisierungsregion des Plamides RP4 besitzt, in die PAI II536 inseriert. Nach Transformation des Helferplasmids RP4 wurde das daraus resultierende Derivat des E. coli Stammes 536 als Donor für Konjugationsexperimente mit dem Rezipientenstamm SY327 eingesetzt. Diese Mobilisierungsexperimente zeigten, daß die gesamte PAI II536 mit einer Frequenz von ungefähr 10-8 in einen Rezipientenstamm übertragen werden kann. In den Transkonjuganten konnte PAI II536 an derselben chromosomalen Insertionsstelle (leuX) wie im Donorstamm E. coli 536 inserieren. Weiterhin war es möglich PAI II536, nach Mobilisierung und chromosomaler Integration in einem Rezipientenstamm, wieder zurück in ein PAI II536 negatives Derivat von E. coli 536 zu transferieren. Die Ergebnisse dieser Arbeit erweitern unser Wissen hinsichtlich der Struktur und Funktion einer Pathogenitätsinsel des uropathogenen E. coli Stammes 536 und geben Aufschluß über den Mechanismus, der zur Genomplastizität und Evolution pathogener E. coli Varianten beiträgt. KW - Escherichia coli KW - Urogenitalsystem KW - Infektion KW - Pathogenität KW - Genanalyse KW - Escherichia coli KW - UTI KW - Pathogenitätsinseln KW - Kapsel KW - Übertrag KW - Escherichia coli KW - UTI KW - pathogenicity islands KW - capsule KW - transfer Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14231 ER -