TY  - JOUR
A1  - Deane, Katrina E.
A1  - Brunk, Michael G. K.
A1  - Curran, Andrew W.
A1  - Zempeltzi, Marina M.
A1  - Ma, Jing
A1  - Lin, Xiao
A1  - Abela, Francesca
A1  - Aksit, Sümeyra
A1  - Deliano, Matthias
A1  - Ohl, Frank W.
A1  - Happel, Max F. K.
T1  - Ketamine anaesthesia induces gain enhancement via recurrent excitation in granular input layers of the auditory cortex
JF  - The Journal of Physiology
N2  - Ketamine is commonly used as an anaesthetic agent and has more recently gained attention as an antidepressant. It has been linked to increased stimulus‐locked excitability, inhibition of interneurons and modulation of intrinsic neuronal oscillations. However, the functional network mechanisms are still elusive. A better understanding of these anaesthetic network effects may improve upon previous interpretations of seminal studies conducted under anaesthesia and have widespread relevance for neuroscience with awake and anaesthetized subjects as well as in medicine. Here, we investigated the effects of anaesthetic doses of ketamine (15 mg kg\(^{-1}\) h\(^{-1}\)i.p.) on the network activity after pure‐tone stimulation within the auditory cortex of male Mongolian gerbils (Meriones unguiculatus). We used laminar current source density (CSD) analysis and subsequent layer‐specific continuous wavelet analysis to investigate spatiotemporal response dynamics on cortical columnar processing in awake and ketamine‐anaesthetized animals. We found thalamocortical input processing within granular layers III/IV to be significantly increased under ketamine. This layer‐dependent gain enhancement under ketamine was not due to changes in cross‐trial phase coherence but was rather attributed to a broadband increase in magnitude reflecting an increase in recurrent excitation. A time–frequency analysis was indicative of a prolonged period of stimulus‐induced excitation possibly due to a reduced coupling of excitation and inhibition in granular input circuits – in line with the common hypothesis of cortical disinhibition via suppression of GABAergic interneurons.
KW  - auditory cortex
KW  - continuous wavelet analysis
KW  - current source density
KW  - ketamine anaesthesia
KW  - laminar recording
KW  - mesoscopic
KW  - microcircuitry
KW  - population dynamics
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216123
VL  - 598
IS  - 13
SP  - 2741
EP  - 2755
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bauriedl, Saskia Corinna
T1  - The influence of riboregulation on fitness and virulence in Neisseria meningitidis
T1  - Der Einfluss der Riboregulation auf Fitness und Virulenz von  Neisseria meningitidis
N2  - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) is a human commensal that occasionally causes life-threatening infections such as bacterial meningitis and septicemia. Despite experi-mental evidence that the expression of small non-coding RNAs (sRNAs) as well as the RNA chaperone Hfq affect meningococcal physiology, the impact of RNA-based regula-tion (riboregulation) on fitness and virulence in N. meningitidis is only poorly understood. Therefore, this study addressed these issues using a combination of high-throughput tech-nologies. 
A differential RNA-sequencing (dRNA-seq) approach was applied to produce a single-nucleotide resolution map of the primary transcriptome of N. meningitidis strain 8013. The dRNA-seq analysis predicted 1,625 transcriptional start sites including 65 putative sRNAs, of which 20 were further validated by northern blot analysis. By Hfq RNA im-munopreci-pitation sequencing a large Hfq-centered post-transcriptional regulatory net-work comprising 23 sRNAs and 401 potential mRNA targets was identified. Rifampicin stability assays demonstrated that Hfq binding confers enhanced stability on its associat-ed sRNAs. Based on these data, the interactions of two paralogous sRNAs and their cog-nate target mRNA prpB were validated in vivo as well as in vitro. Both sRNAs directly repress prpB encoding a methylisocitrate lyse which was previously shown to be involved in meningococcal colonization of the human nasopharynx. 
Besides the well-described RNA chaperone Hfq, FinO-domain proteins have recently been recognized as a widespread family of RNA-binding proteins (RBPs) with regulatory roles in diverse bacteria. They display an intriguing bandwidth of target sites, ranging from a single RNA pair as recognized by plasmid-encoded FinO to the global RNA regu-lons of enterobacterial ProQ proteins. To better understand the intrinsic targeting mode of this RBP family, in vivo targets of the minimal ProQ protein of N. meningitidis were de-termined. In vivo UV crosslinking with RNA deep sequencing (UV-CLIP) identified as-sociations of ProQ with 16 sRNAs and 166 mRNAs encoding a variety of biological functions and thus revealed ProQ as another global RBP in meningococci. It could be shown that meningococcal ProQ predominantly binds to highly structured RNA regions including DNA uptake sequences (DUS) and rho-independent transcription terminators and stabilizes many of its RNA targets as proved by rifampicin stability experiments. As expected from the large suite of ProQ-bound RNAs, proQ deletion globally affects both gene and protein expression in N. meningitidis, changing the expression levels of at least 244 mRNAs and 80 proteins. Phenotypic analyses suggested that ProQ promotes oxida-tive stress tolerance and UV damage repair capacity, both of which are required for full virulence of N. meningitidis. 
Together, this work uncovers the co-existence of two major post-transcriptional regulons, one governed by ProQ, the other by Hfq, in N. meningitidis. It further highlights the role of these distinct RBPs and its associated sRNAs to bacterial virulence and indicates that riboregulation is likely to contribute to the way how meningococci adapt to different host niches.
N2  - Neisseria meningitidis (N. meningitidis) ist ein kommensal lebendes Bakterium, welches unter nicht vollständig geklärten Bedingungen auch lebensbedrohliche Infektionen im Menschen wie bakterielle Meningitis und Sepsis verursachen kann. Obwohl experimentell nachgewiesen wurde, dass die Expression kleiner, nicht kodierender RNAs (sRNAs) so-wie des RNA-Chaperons Hfq in Meningokokken physiologisch relevant ist, blieb der Ein-fluss der RNA-basierten Genregulation (Riboregulation) auf die Fitness und Virulenz von N. meningitidis bisher unvollständig verstanden. Daher befasste sich diese Studie durch Kombination verschiedener Hochdurchsatz-Technologien mit dieser Fragestellung. 
Es wurde differentielle RNA-Sequenzierung (dRNA-seq) angewendet, um das primäre Transkriptom des N. meningitidis Stamms 8013 möglichst genau zu kartieren. Die durch-geführte dRNA-seq-Analyse detektierte 1.625 Transkriptionsstartstellen (TSS) einschließ-lich 65 potentieller sRNAs. Durch Anwendung von Northern-Blot-Analysen konnten an-schließend 20 sRNAs experimentell validiert werden. Darüber hinaus wurde durch Ko-Immunopräzipitation mit Hfq (RIP-seq) ein großes, Hfq-zentriertes, post-         transkripti-onelles regulatorisches Netzwerk identifiziert, welches 23 sRNAs und 401 mRNAs um-fasst. Rifampicin-Stabilitätsversuche zeigten, dass durch Hfq-Bindung die Stabilität die-ser sRNAs erhöht wird. Basierend auf diesen Daten konnte die Interaktion zwischen zweier Hfq-gebundener paraloger sRNAs und der prpB mRNA sowohl in vivo als auch in vitro bestätigt werden. Beide sRNAs reprimieren die Translation des PrpB-Genes, wel-ches für eine Methylisocitratlyase kodiert und wahrscheinlich die Kolonisation des menschlichen Nasopharynxs durch Meningokokken begünstigt. 
Neben dem ausführlich charakterisierten RNA-Chaperon Hfq wurden Proteine mit FinO-Domäne kürzlich als eine neue Familie von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) mit regula-torischen Funktionen in verschiedenen Bakterien identifiziert. Sie weisen eine große Bandbreite regulierter Gene auf: Während das Plasmid-kodierte FinO-Protein nur ein ein-zelnes RNA-Paar bindet, stellt das enterobakterielle ProQ-Protein ein globales RBP dar. Um die Wirkungsweise dieser RBP-Familie besser zu verstehen, wurde in vivo untersucht, wie viele RNAs mit dem minimalen ProQ-Protein in N. meningitidis assoziiert sind. Durch Kombination von UV-Crosslinken mit RNA-Sequenzierung (UV-CLIP) konnte die Bin-dung von 16 sRNAs und 166 biologisch diverser mRNAs mit ProQ identifiziert werden, welches daher ebenfalls ein globales RBP in Meningokokken darstellt. Es konnte gezeigt werden, dass ProQ vorwiegend RNA-Regionen mit ausgeprägter Sekundärstruktur bin-det, darunter DNA-Aufnahmesequenzen (DUS) und Rho-unabhängige Transkriptions-terminatoren. Die ProQ-Bindung führt dabei häufig zur Stabilisation der RNAs, was durch Rifampicin-Stabilitätsexperimente nachgewiesen wurde. Wie aufgrund der großen Zahl ProQ-gebundener RNAs zu erwarten, beeinflusste die Deletion des ProQ Proteins die zelluläre Expression von mindestens 244 mRNAs und 80 Proteinen. Phänotypische Analysen deuten darauf hin, dass ProQ sowohl die Toleranz gegenüber oxidativem Stress als auch die Reparatur von DNA-Schäden reguliert, die beide für die vollständige Viru-lenz von N. meningitidis von Bedeutung sind. 
Zusammenfassend beschreibt diese Arbeit die Koexistenz von zwei großen posttranskrip-tionellen Regulons in N. meningitidis, von denen eines von ProQ und das andere von Hfq kontrolliert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle beider RBPs und ihrer assozi-ierten sRNAs für die bakterielle Virulenz verdeutlicht und hervorgehoben, dass Riboregu-lation sehr wahrscheinlich dazu beiträgt, wie sich Meningokokken an verschiedene Wirts-nischen anpassen.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Small non-messenger RNS
KW  - Hfq
KW  - ProQ
KW  - Non-coding RNA
KW  - High throughput screening
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192978
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eltschkner, Sandra
T1  - Targeting the Bacterial Fatty-Acid Synthesis Pathway: Towards the Development of Slow-Onset Inhibitors and the Characterisation of Protein-Protein Interactions
T1  - Die bakterielle Fettsäurebiosynthese als Zielobjekt zur Entwicklung langsam bindender Inhibitoren und zur Charakterisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen
N2  - A continuous arms race between the development of novel antibiotics and the evolution of corresponding resistance mechanisms in bacteria has been observed, since antibiotic agents like arsphenamines (e.g. Salvarsan, developed by Paul Ehrlich [1]), sulphonamides (e.g. Prontosil, Gerhard Domagk [2]) and penicillin (Alexander Fleming [3]) were first applied to effectively cure bacterial infections in the early 20th century. The rapid emergence of resistances in contrast to the currently lagging discovery of antibiotics displays a severe threat to human health. Some serious infectious diseases, such as tuberculosis or melioidosis, which were either thought to be an issue only in Third-World countries in case of tuberculosis, or regionally restricted with respect to melioidosis, are now on the rise to expand to other areas. In contrast, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is already present in clinical setups all over the world and causes severe infections in immunocompromised patients. Thus, there is an urgent need for new and effective antimicrobial agents, which impair vital functions of the pathogen’s metabolism.
One central metabolic pathway is represented by the bacterial fatty-acid synthesis pathway (FAS II), which is essential for the synthesis of long and branched-chain fatty acids, as well as mycolic acids. These substances play a major role as modulating components of the properties of the most important protective barrier – the cell envelope. The integrity of the bacterial cell wall and the associated membrane(s) is crucial for cell growth and for protection against physical strain, intrusion of antibiotic agents and regulation of uptake of ions and other small molecules. Thus, this central pathway represents a promising target for antibiotic action against pathogens to combat infectious diseases. The last and rate-limiting step is catalysed by the trans-2-enoyl-ACP reductase (ENR) FabI or InhA (in mycobacteria), which has been demonstrated to be a valuable target for drug design and can be addressed, amongst others, by diphenyl ether (DPE) compounds, derived from triclosan (TCL) – the first one of this class which was discovered to bind to ENR enzymes [4, 5].
Based on this scaffold, inhibitors containing different combinations of substituents at crucial positions, as well as a novel type of substituent at position five were investigated regarding their binding behaviour towards the Burkholderia pseudomallei and Mycobacterium tuberculosis ENR enzymes bpFabI and InhA, respectively, by structural, kinetic and in-vivo experiments. Generally, substitution patterns modulate the association and dissociation velocities of the different ENR inhibitors in the context of the two-step slow-onset binding mechanism, which is observed for both enzymes. These alterations in the rapidity of complex formation and decomposition have a crucial impact on the residence time of a compound and hence, on the pharmacokinetic properties of potential drug candidates. For example, the substituents at the 2’-position of the DPE scaffold influence the ground- and transition state stability during the binding process to bpFabI, whereas 4’-substituents primarily alter the transition state [6]. The novel triazole group attached to the 5-position of the scaffold, targeting the hydrophobic part of the substrate-binding pocket in InhA, significantly enhances the energy barrier of the transition state of inhibitor binding [7] and decelerates the association- as well as the dissociation processes. Combinations with different substituents at the 2’-position can enhance or diminish this effect, e.g. by ground-state stabilisation, which will result in an increased residence time of the respective inhibitor on InhA.
Further structural investigations carried out in this work, confirm the proposed binding mode of a customised saFabI inhibitor [8], carrying a pyridone moiety on the DPE scaffold to expand interactions with the protein environment. Structural and preliminary kinetic data confirm the binding of the same inhibitor to InhA in a related fashion. Comparisons with structures of the ENR inhibitor AFN-1252 [9] bound to ENR enzymes from other organisms, addressing a similar region as the pyridone-moiety of the DPE inhibitor, suggest that also the DPE inhibitor bears the potential to display binding to homologues of saFabI and InhA and may be optimised accordingly.
Both of the newly investigated substituents, the pyridone moiety at the 4’-position as well as the 5-triazole substituent, provide a good starting point to modify the DPE scaffold also towards improved kinetic properties against ENR enzymes other than the herein studied and combining both groups on the DPE scaffold may have beneficial effects. The understanding of the underlying binding mechanism is a crucial factor to promote the dedicated design of inhibitors with superior pharmacokinetic characteristics.
A second target for a structure-based drug-design approach is the interaction surface between ENR enzymes and the acyl-carrier protein (ACP), which delivers the growing acyl chain to each distinct enzyme of the dissociated FAS-II system and presumably recognises its respective interaction partner via electrostatic contacts. The interface between saACP and saFabI was investigated using different approaches including crosslinking experiments and the design of fusion constructs connecting the ACP and the FabI subunits via a flexible linker region of varying lengths and compositions. The crosslinking studies confirmed a set of residues to be part of the contact interface of a previously proposed complex model [10] and displayed high crosslinking efficiency of saACP to saFabI when mutated to cysteine residues. However, crystals of the complex obtained from either the single components, or of the fusion constructs usually displayed weak diffraction, which supports the assumption that complex formation is highly transient. To obtain ordered crystals for structural characterisation of the complex it is necessary to trap the complex in a fixed state, e.g. by a high-affinity substrate attached to ACP [11], which abolishes rapid complex dissociation. For this purpose, acyl-coupled long-residence time inhibitors might be a valuable tool to elucidate the detailed architecture of the ACP-FabI interface. This may provide a novel basis for the development of inhibitors that specifically target the FAS-II biosynthesis pathway.
N2  - Seit Beginn der Anwendung antibiotischer Substanzen wie Arsphenaminen, z.B. Salvarsan, entwickelt von Paul Ehrlich [1], Sulfonamiden, z.B. Prontosil, dessen antibakterielle Wirksamkeit durch Gerhard Domagk nachgewiesen wurde [2], oder des von Alexander Fleming entdeckten Penicillins [3] zur effektiven Bekämpfung von Infektionskrankheiten Anfang des 20. Jahrhunderts findet ein kontinuierliches Wettrüsten zwischen der Entstehung von Antibiotikaresistenzen in Bakterien und der Entwicklung neuer Antibiotika statt. Vor allem die zügige Entstehung von Resistenzen im Gegensatz zum eher stockenden Fortschritt der Entdeckung neuer Antibiotika stellt ein ernstzunehmendes Risiko für die menschliche Gesundheit dar. Einige stark lebensbedrohliche Infektionskrankheiten, darunter Tuberkulose und Melioidose, erfahren dadurch eine erhöhte Verbreitung. Ein Anstieg der Zahl der Tuberkuloseerkrankungen in Gebieten, in denen die Krankheit bereits als ausgerottet galt, beispielsweise in Europa; oder im Falle der Melioidose, eine Verbreitung in Gebiete, in denen die Krankheitserreger natürlicherweise nicht vorkommen; sind u.a. die Folgen fehlender Wirkstoffe zur Bekämpfung resistenter Stämme. Methicillinresistente Staphylococcus-aureus- (MRSA-) Stämme sind hingegen bereits fast weltweit in Krankenhäusern verbreitet und gelten dort als Quelle schwerer Infektionen, die vor allem für Patienten mit geschwächtem Immunsystem eine ernsthafte Bedrohung darstellen. Die mannigfaltigen Vorkommen resistenter Erreger und die eingeschränkten Behandlungsmöglichkeiten dadurch verursachter Infektionen machen die Entwicklung neuer, wirksamer Antibiotika dringend notwendig.
Ein zentraler Stoffwechselweg der Bakterien ist die Fettsäurebiosynthese II, die im Hinblick auf die Herstellung lang- und verzweigtkettiger Fettsäuren sowie von Mykolsäuren essentiell ist. Die Zusammensetzung der Fettsäuren trägt maßgeblich zur Funktionsfähigkeit der unentbehrlichen Schutzbarriere der Zelle – nämlich der Zellhülle – bei. Eine intakte Zellwand und deren assoziierte Membranen schützen die Zelle vor physikalischem Stress, vor dem Eindringen antibiotischer Substanzen und regulieren die Aufnahme anderer Kleinmoleküle und Ionen. Genau aus diesem Grunde stellt die Fettsäurebiosynthese ein attraktives Ziel für die Entwicklung von Antibiotika dar. Die Enoyl-ACP-Reduktase (ENR), welche den letzten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt des Synthesezyklus katalysiert, wurde als hervorragendes Zielmolekül identifiziert und wird unter anderem von Diphenylethern gehemmt. Diese Verbindungen sind von Triclosan abgeleitet, dessen Bindung an ENR-Enzyme als erstem Vertreter dieser Stoffklasse nachgewiesen werden konnte [4, 5].    
Basierend auf dem Diphenylethergrundgerüst von Triclosan wurden Inhibitoren mit unterschiedlichen Substitutionsmustern bezüglich ihrer Bindungseigenschaften an die ENR-Enzyme von Burkholderia pseudomallei (bpFabI) und Mycobacterium tuberculosis (InhA) untersucht. Kritische Positionen dieses Grundgerüstes wurden mit verschiedenen, chemischen Gruppen versehen und die Bindung an diese beiden Enzyme anschließend strukturell, kinetisch und am lebenden Organismus charakterisiert. In beiden Fällen üben die Substitutionsmuster einen beträchtlichen Einfluss auf die Assoziations- und Dissoziationsgeschwindigkeiten der verschiedenen Inhibitoren im Rahmen des verlangsamten Zweischrittassoziationsmechanismus aus, welche wiederum die Verweildauer des Inhibitors am Enzym und dessen pharmakokinetische Eigenschaften bestimmen. Die Beschaffenheit der 2‘-Substituenten beeinflusst beispielsweise die Stabilität des Grund- sowie des Übergangszustandes im Bindungsgeschehen an bpFabI, wohingegen 4‘-Substituenten hauptsächlich zu Stabilitätsänderungen im Übergangszustand beitragen [6]. Die Einführung des Triazolsubstituenten an der 5-Position des Diphenylethergerüsts führt zu einer signifikanten Erhöhung der Energiebarriere des Übergangszustandes im Bindungsprozess an InhA [7], was im Rückschluss zu einer ebenfalls verlangsamten Dissoziation des Enzym-Inhibitor-Komplexes führt. Zusätzlich wird dieser Effekt durch die Beschaffenheit des entsprechenden Substituenten an der 2‘-Position noch verstärkt oder abgeschwächt. Dies erfolgt beispielsweise durch eine Stabilisierung des Grundzustandes und eine daraus resultierende, verlängerte Verweildauer des Inhibitors am Enzym. 
Weitere, strukturelle Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit konnten den vorgeschlagenen Bindungsmodus [8] des neuartigen, speziell auf das ENR-Enzym von Staphylococcus aureus (saFabI) zugeschnittenen Inhibitors „55JS“ (auch „SKTS1“) bestätigen. Dieser Diphenyletherinhibitor besitzt an der 4‘-Position einen Pyridonring, welcher die Wechselwirkungen mit dem Enzym verstärken soll. Aus den strukturellen und vorläufigen, kinetischen Daten geht hervor, dass dieser Inhibitor ebenfalls und in ähnlicher Weise an InhA bindet. Außerdem legt ein Vergleich mit Komplexstrukturen verschiedener ENRs in Verbindung mit AFN-1252 [9] die Vermutung nahe, dass auch 55JS an weitere ENR-Homologe binden könnte; denn jener Teil des AFN-1252-Inhibitors, der sich räumlich mit dem Pyridonring von 55JS überlagert, geht mit derselben Region im Protein ähnliche Wechselwirkungen ein. Es ist daher möglich, dass dieser Inhibitor das Potential birgt, durch entsprechende Optimierung als Wirkstoff gegen andere Pathogene zum Einsatz zu gelangen.    
Beide dieser neuartigen, funktionellen Gruppen, die Triazol- und die Pyridongruppe, stellen einen guten Ansatzpunkt für die Weiterentwicklung von Diphenylethern bezüglich verbesserter kinetischer Eigenschaften gegenüber ENR-Enzymen dar.
Ein weiterer, interessanter Ansatz für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung ist durch die Interaktionsfläche zwischen ENR-Enzymen und dem Acyl-Carrier-Protein (ACP) gegeben. ACP transportiert die naszierende Acylkette von einem zum nächsten Enzym des dissoziierten Fettsäurebiosynthesezyklus, welche es wahrscheinlich anhand elektrostatischer Interaktionen erkennt. Die Kontaktfläche zwischen saACP und saFabI wurde hier mittels verschiedener Ansätze untersucht, die sowohl Crosslinking-Experimente als auch die Generierung von Fusionsproteinen umfassten. In den verschiedenen Fusionskonstrukten wurden das ACP- und das ENR-Protein durch eine flexible Aminosäurekette unterschiedlicher Längen und Zusammensetzungen miteinander verbunden. Durch die Crosslinking-Experimente konnten Aminosäuren identifiziert werden, welche einen Teil einer vorgeschlagenen Interaktionsfläche [10] ausmachen und tatsächlich eine hohe Vernetzungseffizienz aufwiesen. Proteinkristalle des Komplexes, die entweder beide Einzelkomponenten oder das Fusionsprotein enthielten, zeigten jedoch nur schwache Beugungsmuster. Diese Beobachtung deckt sich mit der Annahme, dass die Komplexbildung äußerst kurzlebig ist. Die intrinsische Flexibilität beider Proteine erhöht zusätzlich die Schwierigkeit, wohlgeordnete Kristalle zu erhalten. Es wird deshalb notwendig sein, den Komplex in einem fixierten Zustand einzufangen. Die Verwendung eines hochaffinen Substrates, welches die Dissoziation des Komplexes unterbindet, beispielsweise ein acylgekoppelter Inhibitor [11] mit langer Verweildauer am Enzym, könnte hier von großem Nutzen sein und es damit erlauben eine detaillierte Kenntnis der ACP-FabI-Interaktionsfläche zu erhalten, die neue Perspektiven für eine gezielte Entwicklung von Inhibitoren der Fettsäurebiosynthese II eröffnen könnten.
KW  - Fettsäurestoffwechsel
KW  - Diphenylether
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Verweildauer
KW  - bacterial fatty-acid biosynthesis
KW  - enoyl-ACP reductase
KW  - structure-based drug design
KW  - inhibitor residence time
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156643
ER  - 
TY  - THES
A1  - Eckstein, Marie-Therese
T1  - Exploring the biology of the fungus Candida albicans in the gut of gnotobiotic mice
T1  - Untersuchung der Biologie des Hefepilzes Candida albicans im Verdauungstrakt gnotobiotischer Mäuse
N2  - The human body is colonized by trillions of microbes from all three domains of life – eukaryotes, bacteria and archaea. The lower gastrointestinal tract is the most densely colonized part of the body, harbouring a diverse and dynamic community of microbes. While the importance of bacteria in this so-called microbiota is well acknowledged, the role of commensal fungi remains underexplored. The most prominent fungus of the human gastrointestinal microbiota is Candida albicans. This fungus occasionally causes life-threatening disseminated infections in individuals with debilitated immune defences. It is this “pathogenic” facet that has received the most attention from researchers in the past, leaving many aspects of its “commensal” lifestyle understudied. Using gnotobiotic mice as a model system to explore the biology of C. albicans in the mammalian gut, in this dissertation I establish the global response of the host to C. albicans monocolonization as well as the spatial distribution of the fungus in the intestine in the context of co-colonization with single gut bacterial species. The fungus elicited transcriptome changes in murine intestinal tissue, which included the activation of a reactive oxygen species-related defence mechanism and the induction of regulators of the circadian clock circuitry. Both responses have previously been described in the context of a complete bacterial microbiota. Imaging the intestine of animals monocolonized with the fungus or co-colonized with C. albicans and the gut bacteria Bacteroides thetaiotaomicron or Lactobacillus reuteri revealed that the fungus was embedded in a B. thetaiotaomicron-promoted outer mucus layer in the murine colon. The gel-like outer mucus constitutes a unique microhabitat, distinct in microbial composition from the adjacent intestinal lumen. This finding indicates that bacteria can shape the specific microhabitat occupied by the fungus in the intestine. Overall, the results described in this dissertation suggest that gnotobiotic mice constitute a valuable tool to dissect multiple aspects of the interactions among host, commensal fungi and cohabiting bacteria.
N2  - Der menschliche Körper beheimatet Billionen von Mikroorganismen aus allen drei Domänen des Lebens – Eukaryoten, Bakterien und Archaeen. Der menschliche Dickdarm ist dabei das am dichtesten besiedelte Organ des Körpers. Er beherbergt eine sehr diverse und dynamische Gemeinschaft von Mikroorganismen. Während die Relevanz der so genannten Mikrobiota weitreichend anerkannt ist, wurde die Bedeutung der kommensalen Pilze bisher noch vernachlässigt. Der am häufigsten vorkommende Pilz im menschlichen Gastrointestinaltrakt ist Candida albicans. Der Hefepilz kann vor allem in Patienten mit geschwächtem Immunsystem zum Ursprung lebensbedrohlicher Krankheiten werden. Diese Pathogenität des Pilzes wurde in den letzten Jahren ausführlich beleuchtet, wohingegen die kommensalen Aspekte des Pilzes vernachlässigt wurden. In dieser Dissertation habe ich, mit Hilfe von gnotobiotischen Mausmodellen, (i) das Leben von C. albicans im Säugetierdarm untersucht, (ii) die Reaktion des Wirts auf diese Kolonisierung ermittelt, (iii) sowie das Kolonisierungsverhalten und die Interaktionen von verschiedenen Darmbakterienspezies und C. albicans erforscht. Durch die alleinige Kolonisierung des Darms mit Candida albicans konnte ich Veränderungen im Transkriptom der Darmepithelzellen nachweisen, wie etwa die Aktivierung einer reaktiven Sauerstoffspezies-vermittelten Wirtsantwort und die Induktion von mehreren Regulatoren des zirkadianen Rhythmus. Beide dieser Wirtsreaktionen wurden zuvor nur in der Anwesenheit einer bakteriellen Mikrobiota nachgewiesen. Durch die Visualisierung der Pilzzellen im Darm während der Monokolonisierung, sowie während der Kolonisierung des Darms mit dem Pilz und den Darmbakterien, Bacteroides thetaiotaomicron oder Lactobacillus reuteri, konnten wir zeigen, dass der Pilz den von B. thetaiotaomicron neu geschaffenen Lebensraum, die äußere Mukusschicht, besiedeln kann. Diese äußere gelartige Mukusschicht ist ein einzigartiger Lebensraum, welcher sich stark von der inneren, sterilen Mukusschicht unterscheidet. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, dass einzelne Bakterienspezies den Lebensraum des Pilzes verändern können. Zusammenfassend konnte ich feststellen, dass die gnotobiotischen Mausmodelle sich sehr gut eignen, um die unterschiedlichen Aspekte der kommensalen Kolonisierung des Darms durch C. albicans, sowie dessen Interaktionen mit dem Wirt und den anwesenden Bakterien zu untersuchen.
KW  - Candida albicans
KW  - microbiota
KW  - Bacteroides thetaiotaomicron
KW  - spatial organization
KW  - Lactobacillus reuteri
KW  - intestinal mucus
KW  - gastronintestinal microbiota
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218705
ER  - 
TY  - THES
A1  - Yurdadogan, Tino
T1  - Endorganschaden und Gefäßalter bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit
T1  - End organ damage and vascular age in patients with coronary artery disease
N2  - Die nicht-invasive Gefäßdiagnostik stellt einen wichtigen Pfeiler in der Prävention von Herz-Kreislauferkrankungen dar. Während lange Zeit die sonographische Messung der cIMT, als morphologisches Korrelat der Gefäßalterung, als Goldstandard galt, ist in den letzten Jahren in Gestalt der Pulswellenanalyse/PWV-Messung eine Technik weiterentwickelt worden, die, als funktionelles Korrelat der Gefäßalterung, aufgrund der leichteren Durchführbarkeit und geringerer Untersucherabhängigkeit und Kosten vielversprechend ist. So erlaubt die Messung der Pulswelle mittels gewöhnlicher Blutdruckmanschetten, genau wie die cIMT, die Berechnung des individuellen Gefäßalters und die Diagnostik für das Vorliegen eines Endorganschadens der Blutgefäße. 
Um die Messergebnisse der beiden Untersuchungen miteinander zu vergleichen, wurden beide in der EUROASPIRE-IV Studie an Patienten mit koronarer Herzkrankheit durchgeführt. Die Auswertung der Messergebnisse der mit dem Vascular Explorer durchgeführten Pulswellenanalyse/PWV-Messung ergab überraschenderweise, dass die Mehrheit der herzkranken Patienten weder eine vaskuläre Voralterung noch einen Endorganschaden der Blutgefäße aufweisen. Im Falle der cIMT-Messung war Gegenteiliges der Fall, was trotz der medikamentösen Therapie der Patienten so zu erwarten war. Weiterhin zeigte sich lediglich eine geringe Korrelation zwischen den Messergebnissen beider Untersuchungen. Die Determinanten der einzelnen Messwerte aus cIMT und Pulswellenanalyse/PWV-Messung waren deckungsgleich mit den in der Literatur beschriebenen Faktoren, wenn auch viele der sonst signifikanten Regressoren das Signifikanzniveau in unserer Auswertung nicht unterschritten.
Eine Limitation der funktionellen Gefäßdiagnostik liegt derzeit darin, dass die Messergebnisse stark von dem verwendeten Messgerät abhängen. Es liegen noch zu wenig Vergleichsstudien vor, um die Messergebnisse, speziell von neueren Geräten wie dem Vascular Explorer, auf andere zu übertragen. Bei der Berechnung des Gefäßalters sollten daher optimalerweise gerätespezifische Normwerte vorliegen, was beim Vascular Explorer nicht der Fall ist. Gleiches gilt für die Verwendung des PWVcf-Grenzwerts für die Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße.
Analog hat auch die Messung der cIMT gewisse Einschränkungen. So wäre eine weitere Standardisierung der Messorte (A. carotis communis vs Bulbus vs A. carotis interna), zwischen denen sich die durchschnittliche cIMT erheblich unterscheidet, sowie der Messparameter (Minimal- vs Maximal- vs Mittelwert) wünschenswert. Die universelle Anwendung eines cIMT-Grenzwerts zur Diagnose eines Endorganschadens der Blutgefäße ist daher kritisch zu sehen. Dies zeigt sich auch darin, dass in den neuesten Leitlinien der bislang geltende Grenzwert angezweifelt und kein aktuell gültiger Grenzwert mehr genannt wird. 
Wir interpretieren unsere Ergebnisse dahingehend, dass unsere Messung der cIMT die zu erwartende pathologische Gefäßalterung bei Patienten mit koronarer Herzkrankheit besser widerspiegelt als die Messung der Pulswelle mit dem Vascular Explorer. Welche der beiden Untersuchungen hinsichtlich der prognostischen Wertigkeit überlegen ist, muss im Rahmen von Längsschnittstudien geklärt werden.
N2  - Non-invasive vascular diagnostics play an important role in the prevention of cardiovascular diseases. For a long time, sonographic measurement of the cIMT was considered the gold standard. Yet, by continually developing the PWA/PWV measurement, a promising technique is available, that is easy to handle and has better inter-examiner reproducibility at lower costs. Just like the cIMT examination, recording and analysing the pulse wave via blood pressure cuffs allows the determination of the individual vascular age and to diagnose end organ damage of the arteries.
In order to compare the results of both examinations, they were performed during the EUROASPIRE IV-study in patients with coronary artery disease. Despite being under medication, we expected to find early vascular aging in most patients. Surprisingly, according to the results of the PWA/PWV measurement with the Vascular Explorer device, most of the study population neither showed early vascular aging nor met the criteria for end organ damage of the arteries. cIMT measurements delivered the opposite results. Moreover, we found only poor correlation between the measured values of both examinations. Regression analysis yielded determinants of cIMT and PWA/PWV measurement, which were largely congruent with those described in literature. 
The most apparent weakness of evaluating the vascular status by means of PWA/PWV measurement lies in the poor inter-device comparability. Due to a lack of comparative studies with large sample sizes, measured values of different devices are currently not transferable. Nonetheless, reference values used for vascular age determination with the Vascular Explorer are available in a study using a different device. Furthermore, the PWV threshold for diagnosing end organ damage is applied regardless of the technique/device used for measurement, although an adjustment is urgently needed.
Similarly, the cIMT measurement has certain limitations as efforts can still be made to better standardise examination protocols (e.g. sites of measurement (Common Carotid Artery vs Bulb vs Internal Carotid artery), obtained values (minimum vs maximum vs mean)). The formerly valid cIMT threshold is currently being called into question by the latest guidelines, as there is evidence of its underestimation. 
Ultimately, cIMT measurement better reflects the expected early vascular aging in patients with coronary artery disease than PWA/PWV measurement with the Vascular Explorer. However, longitudinal studies are necessary to further evaluate the prognostic value of both examinations.
KW  - Arteriosklerose
KW  - Pulswelle
KW  - Koronare Herzkrankheit
KW  - Endorganschaden
KW  - Gefäßalter
KW  - Carotis Intima Media Dicke
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218469
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ehebauer, Franziska
T1  - Regulation of Nicotinamide N-methyltransferase Expression in Adipocytes
T1  - Regulation der Nicotinamide N-methyltransferase Expression in Adipozyten
N2  - Nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) is a new regulator of energy homeostasis. Its expression is increased in models of obesity and diabetes. An enhanced NNMT level is also caused by an adipose tissue-specific knockout of glucose transporter type 4 (GLUT4) in mice, whereas the overexpression of this glucose transporter reduced the NNMT expression. Furthermore, the knockdown of the enzyme prevents mice from diet-induced obesity (DIO) and the recently developed small molecule inhibitors for NNMT reverses the DIO. These previous findings demonstrated the exclusive role of NNMT in adipose tissue and further make it to a promising target in obesity treatment. However, the regulation mechanism of this methyltransferase is not yet clarified. 
The first part of the thesis focus on the investigation whether pro-inflammatory signals are responsible for the enhanced NNMT expression in obese adipose tissue because a hallmark of this tissue is a low-level chronic inflammation. Indeed, the NNMT mRNA in our study was elevated in obese patients compared with the control group, whereas the GLUT4 mRNA expression does not differ between lean and obese humans. To analyze whether pro inflammatory signals, like interleukin (IL 6) and tumor necrosis factor α (TNF-α), regulate NNMT expression 3T3-L1 adipocytes were treated with these cytokines. However, IL 6, TNF α, and leptin, which is an alternative activator of the JAK/STAT pathway, did not affect the NNMT protein or mRNA level in differentiated 3T3-L1 adipocytes. The mRNA and protein levels were measured by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and western blotting.
In the second part of this study, 3T3-L1 adipocytes were cultivated with varying glucose concentrations to show whether NNMT expression depends on glucose availability. Further studies with activators and inhibitors of AMP-activated protein kinase (AMPK) and mechanistic target of rapamycin (mTOR) signaling pathways were used to elucidate the regulation mechanism of the enzyme. 
The glucose deprivation of differentiated 3T3-L1 adipocytes led to a 2-fold increase in NNMT expression. This effect was confirmed by the inhibition of the glucose transports with phloretin as well as the inhibition of glycolysis with 2-deoxyglucose (2-DG). AMPK serves as an intracellular energy sensor and the pharmacological activation of it enhanced the NNMT expression. This increase was also caused by the inhibition of mTOR. Conversely, the activation of mTOR using MHY1485 prevented the effect of glucose deprivation on NNMT. Furthermore, the NNMT up-regulation was also blocked by the different autophagy inhibitors. 

Taken together, NNMT plays a critical role in autophagy in adipocytes, because an inhibition of this process prevented the augmented NNMT expression during glucose starvation. Moreover, the effect on NNMT protein and mRNA level depends on AMPK and mTOR. However, pro-inflammatory signals did not affect the expression. Further in vivo studies have to clarify whether AMPK activation and mTOR inhibition as well as autophagy are responsible for the increased NNMT levels in obese adipose tissue. In future this methyltransferase emerges as an awesome therapeutic target for obesity.
N2  - NNMT ist ein neuer Regler der Energiehomöostase. Seine Expression ist in Adipositas- und Diabetesmodellorgansimen erhöht. Ein verstärktes NNMT Level wird auch durch einen fettgewebs-spezifischen GLUT4 Knockout in Mäusen hervorgerufen, wobei die Überexpression des Glukosetransporters die NNMT Expression reduziert. Des Weiteren schützt der Knockdown von NNMT die Mäuse vor Diät-induzierter Adipositas und die kürzlich entwickelten kleinen Molekülinhibitoren gegen NNMT kehren eine durch die Ernährung bedingte Adipositas wieder um. Neuere Erkenntnisse zeigen die exklusive Rolle von NNMT im Fettgewebe auf und machen das Enzym so zu einem vielversprechenden Target für die Adipositastherapie. Jedoch ist der Regulationsmechanismus dieser Methyltransferase noch nicht geklärt.
Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Untersuchung, ob pro-inflammatorische Signale verantwortlich sind für die erhöhten NNMT Expression im adipösen Fettgewebe, da sich dieses Gewebe durch eine chronische Inflammation auszeichnet. Tatsächlich war die mRNA in unserer Studie verstärkt exprimiert in adipösen Patienten im Vergleich zur Kontrollgruppe, wobei die GLUT4 mRNA Expression zwischen Schlanken und Adipösen nicht verändert war. Um zu untersuchen, ob pro-inflammatorische Signale, wie IL 6 und TNF α, die NNMT Expression regulieren, wurden 3T3-L1 Adipozyten mit diesen Zytokinen behandelt. Jedoch beeinflussten IL 6, TNF α und Leptin, welches ein weiterer Aktivator des JAK/STAT Signalweges ist, NNMT Protein oder mRNA Level in differenzierten 3T3 L1 Adipozyten nicht. Die mRNA und Protein Level wurden mittels qPCR und Western Blot analysiert.
Im zweiten Teil dieser Studie wurden 3T3 L1 Adipozyten mit unterschiedlichen Glukosekonzentrationen kultiviert, um zu zeigen, ob die NNMT Expression von der Glukoseverfügbarkeit abhängig ist. Für die Untersuchung des genauen Regulationsmechanismus von NNMT, wurden weitere Studien mit Aktivatoren und Inhibitoren der AMPK und mTOR Signalwege durchgeführt. 
Der Glukosemangel führte zu einem 2-fachen Anstieg der NNMT Expression in differenzierten 3T3-L1 Adipozyten. Dieser Effekt wurde bestätigt durch die Inhibierung der Glukosetransporter mit Phloretin sowie durch die Inhibierung der Glykolyse mit 2-DG. AMPK ist ein intrazellulärer Energiesensor und dessen pharmakologische Aktvierung erhöhte die NNMT Expression. Dieser Anstieg wurde auch verursacht durch die Inhibierung von mTOR. Hingegen verhinderte die Aktivierung von mTOR mithilfe von MHY1485 den Effekt auf NNMT während des Glukoseentzugs. Des Weiteren wurde die Auswirkungen auf NNMT durch  Autophagieinhibitoren unterbunden. 
Zusammenfassend spielt NNMT eine kritische Rolle für die Autophagie in Adipozyten, da eine Inhibierung des Prozesses die erhöhte NNMT Expression während eines Glukoseentzugs verhinderte. Darüber hinaus ist der Effekt auf die NNMT Protein und mRNA Level abhängig von AMPK and mTOR. Jedoch beeinflussten pro-inflammatorische Signale die Expression nicht. Weitere in vivo Studien müssen klären, ob eine AMPK Aktivierung und eine mTOR Inhibierung sowie die Autophagie in Adipozyten verantwortlich sind für die verstärkte NNMT Expression im adipösen Fettgewebe. Zukünftig wird sich NNMT als ein beeindruckendes Target für die Adipositastherapie herausstellen.
KW  - Fettzelle
KW  - Fettsucht
KW  - Methyltransferase
KW  - NNMT
KW  - adipocytes
KW  - mTOR
KW  - AMPK
KW  - autophagy
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217645
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gotru, Sanjeev Kiran
T1  - Cation Homeostasis in Platelets
T1  - Kationen-Homöostase in Thrombozyten
N2  - Divalent cations are important second messengers triggering various signal transduction events in platelets. Whereas calcium channel blockers have an established antithrombotic effect and the regulation of Ca2+ homeostasis has been elucidated in platelets, the molecular regulation of Mg2+ and Zn2+ homeostasis has not been investigated so far.
In the first part of the thesis, the role of -type serine-threonine kinase linked to transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 7 (TRPM7) in platelets was investigated. Using Trpm7R/R mice with a point mutation deleting the kinase activity, we showed that the TRPM7 kinase regulates platelet activation via immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM), hem(ITAM) and protease-activated receptor (PAR) signaling routes. Furthermore, Trpm7R/R mice were protected from in vivo thrombosis and stroke, thus establishing TRPM7 kinase as a promising anti-thrombotic target.
In the second part of the thesis, the role of TRPM7 channel in a megakaryocyte (MK) and platelet-specific knockout mouse, Trpm7fl/fl-Pf4Cre, was investigated. Here, we observed that depending on the type of stimulation, Trpm7fl/fl-Pf4Cre platelets showed either enhanced or inhibited responses. Although Trpm7fl/fl-Pf4Cre mice were thrombocytopenic, no differences to wildtype mice were observed in models of in vivo thrombosis and stroke. The above two studies highlight that inhibition of TRPM7 kinase but not the channel itself (in MKs and platelets) may be a promising anti-thrombotic strategy.
Besides TRPM7, we investigated the role of magnesium transporter 1 (MAGT1) in platelet Mg2+ homeostasis and found that MAGT1 primarily regulates receptor-operated calcium entry (ROCE) in platelets specifically upon GPVI activation. This physiological crosstalk is triggered by protein kinase C (PKC) isoforms. Platelets from Magt1-/y mice hyper-reacted to GPVI and thromboxane A2 (TXA2) receptor stimulation in vitro. Consequently, Magt1-/y platelets were found to be pro-thrombotic in disease models of thrombosis and stroke.
To compare platelet ITAM-signaling to the immune system, we further investigated the role of MAGT1 in T and B cells. We described the primary role of MAGT1 in mice under pathogen-free conditions. Magt1-/y B cells showed dysregulated Mg2+ and Ca2+ homeostasis upon B-cell receptor activation, thereby altering Syk, LAT, phospholipase C (PLC)2 and PKC phosphorylation. In contrast to human MAGT1-deficient T cells, development and effector functions of mouse Magt1-/y T cells showed no alterations.
Finally, in the last part of the thesis, we described methods to measure intracellular free zinc [Zn2+]i in human and mouse platelets with storage pool disease (SPD). We propose to measure the [Zn2+]i status in SPD platelets as a relatively easy diagnostic to screen platelet granule abnormalities.
N2  - Zweiwertige    Kationen    sind    wichtige    sekundäre    Botenstoffe,    welche    verschiedene Signaltransduktionsereignisse in Thrombozyten initiieren. Zwar wurde die Regulation der Ca2+Homöostase in Blutplättchen bereits aufgeklärt und der Einsatz von Calciumkanalblockern zur antithrombotischen Therapie ausführlich diskutiert,  die molekulareRegulation der Mg2+und Zn2+Homöostase  in  Thrombozyten  und  Megakaryozyten  (MK)  wurdebisher  jedoch  nicht untersucht.Im ersten Teil dieser Thesis wurde die Rolle der -Typ Serin-Threonin Kinase des transienten Rezeptortyp  Kation  Kanals,  Unterfamilie  M,  7  (TRPM7)  in  Thrombozyten  untersucht.  Unter Verwendung von Trpm7R/RMäusen mit einer Punktmutation in der Kinasedomäne, welche die Aktivität   der   Kinase   blockiert,   konnten   wir   zeigen,   dass   die   TRPM7-Kinase   die Thrombozytenaktivierung  über  Immunorezeptor-Tyrosin-basierte  Aktivierungsmotive  (ITAM), Hem(ITAM) und Protease-aktivierte Rezeptoren (PAR) reguliert. Trpm7R/RMäuse waren vor in vivoThrombose und Schlaganfall geschützt, was die TRPM7 Kinase als vielversprechendes antithrombotisches Zielprotein etabliert.Im  zweiten  Teil  wurde  die  Rolle  des  TRPM7  Kanals  in  einer  Megakaryozyten  (MK)-und Plättchen-spezifischen Knockout Maus(Trpm7fl/fl-Pf4Cre) untersucht. Wir konnten zeigen, dass Trpm7fl/fl-Pf4CrePlättchen  je  nach  Art  der  Stimulation  entweder  erhöhte  oder  verminderte Reaktionen  zeigten.  Obwohl Trpm7fl/fl-Pf4Cre-Mäuse  thrombozytopen  waren,  wurden  keine Unterschiede  in in  vivoThrombosemodellen  und  Schlaganfall  beobachtet.  Diese  Studien heben hervor, dass die Hemmung der TRPM7 Kinase, aber nicht die des Kanal selbst (inMKs und Plättchen), eine vielversprechende anti-thrombotische Therapie sein könnte. Neben TRPM7 untersuchten wir die Rolle von Magnesium Transporter 1 (MAGT1)in der Mg2+-Homöostase  in  Thrombozyten  und  konnten  zeigen, dass  MAGT1  primär  den  Rezeptor-gesteuerten   Calciuminflux   (ROCE)   spezifisch   nach   GPVI   Aktivierung   reguliert.   Dieser physiologische    Crosstalk    wird    durch    Proteinkinase    C    (PKC)    Isoformen    vermittelt. Thrombozyten von Magt1-/yMäusen reagierten in vitrohyperreaktiv auf GPVI und ThromboxanA2(TXA2) Rezeptor Stimulation. Dementsprechend konnte auch gezeigt werden, dass Magt1-/yPlättchen in Modellen von Thrombose und Schlaganfall pro-thrombotisch wirkten.Um die ITAM-Signalübertragung in Thrombozyten mit der in T und B Zellen zu vergleichen, untersuchten wir die Rolle von MAGT1 in Immunzellen. Wir überprüften die Rolle von MAGT1 in  Mäusen  unter  pathogen-freien  Bedingungen. Magt1-/yB  Zellen  zeigten  eine  dysregulierte Mg2+und Ca2+Homöostase nach Aktivierung des B Zell Rezeptors, wodurch Syk, LAT, PLCγ2 und  PKC  Phosphorylierung  beeinflusst  wurde.  Im Gegensatz  zu  menschlichen  MAGT1-defizienten  T  Zellen,  zeigten Magt1-/yT  Zellen  keine  Veränderungen  in  Entwicklung  und Effektorfunktion.
Schließlich   beschrieben   wir   im   letzten   Teil   der   Arbeit   Methoden   zur   Messung   des intrazellulären freien Zinks [Zn2+]iin humanen und murinen Thrombozyten mit Storage-Pool-Defekt (SPD). Wir unterbreiten in dieser Thesis, den [Zn2+]iStatus in SPD Thrombozyten zu messenum nachAnomalien in den Thrombozyten-Granula zu suchen.
KW  - Thrombozyt
KW  - Kationen-Homöostase
KW  - Homöostase
KW  - Cation Homeostasis
KW  - Platelets
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176616
ER  - 
TY  - THES
A1  - Volz, Julia
T1  - Studies on the influence of platelets on vascular integrity in primary tumors and the role of BIN2 in platelet calcium signaling
T1  - Studien zum Einfluss von Thrombozyten auf die Gefäßintegrität im Primärtumor und zur Rolle von BIN2 im Calcium-Signalweg von Thrombozyten
N2  - Maintenance of tumor vasculature integrity is indispensable for tumor growth and thus affects tumor progression. Previous studies have identified platelets as major regulators of tumor vascular integrity, as their depletion selectively renders tumor vessels highly permeable, causing massive intratumoral hemorrhage. While these results establish platelets as potential targets for anti-tumor therapy, depletion is not a treatment option due to the essential role of platelets for hemostasis. This thesis demonstrates for the first time that functional inhibition of glycoprotein (GP) VI on the platelet surface rapidly induces tumor hemorrhage and diminishes tumor growth similar to complete platelet depletion but without inducing systemic bleeding complications. Both, the intratumoral bleeding and tumor growth arrest could be reverted by depletion of Ly6G+ cells confirming them to be responsible for the induction of bleeding and necrosis within the tumor. In addition, GPVI inhibition increased intra-tumoral accumulation of co-administered chemotherapeutic agents, thereby resulting in a profound anti-tumor effect. In summary, this thesis manifests platelet GPVI as a key regulator of vascular integrity specifically in growing tumors, serving as a potential basis for the development of anti-tumor strategies.
In the second part of this thesis, light is shed on the modulating role of bridging integrator 2 (BIN2) in platelet Ca2+ signaling. Stromal interaction molecule 1 (STIM1) mediated store-operated calcium entry (SOCE) is the major route of Ca2+ influx in platelets, triggered by inositol trisphosphate receptor (IP3R)-dependent Ca2+ store release. In this thesis, the BAR domain superfamily member BIN2 was identified as the first Ca2+ signaling modulator, interacting with both, STIM1 and IP3R in platelets. Deletion of BIN2 resulted in reduced Ca2+ store release and Ca2+ influx in response to all tested platelet agonists. These defects were a consequence of impaired IP3R function in combination with defective STIM1-mediated SOC channel activation, while Ca2+ store content and agonist-induced IP3 production were unaltered. These results establish BIN2 as a central regulator of platelet Ca2+ signaling.
The third part of this thesis focuses on the effect of the soluble neuronal guidance protein Sema7A on platelet function. Rosenberger et al. discovered that Sema7A cleavage from red blood cells increases the formation of platelet-neutrophil complexes, thereby reinforcing thrombo-inflammation in myocardial ischemia-reperfusion injury (MIRI). This thesis establishes soluble Sema7A as a stimulator of platelet thrombus formation via its interaction with platelet GPIbα, thereby reinforcing PNC formation. Thus, interfering with the GPIb-Sema7A interaction during MIRI represents a potential strategy to reduce cardiac damage and improve clinical outcome following MI.
N2  - Die Aufrechterhaltung einer intakten Gefäßstruktur im Primärtumor ist unerlässlich für dessen Wachstum und beeinflusst dadurch die Tumorentwicklung. Es wurde bereits gezeigt, dass Thrombozyten bei diesem Prozess eine große Rolle spielen, da ihre experimentelle Depletion in Mäusen zu extrem durchlässigen Gefäßen und in Folge dessen zu starken Blutungen im Tumor führt. Diese Ergebnisse machen Thrombozyten zu potentiellen Angriffspunkten in der Krebstherapie, eine komplette Depletion ist dabei jedoch auf Grund ihrer essentiellen Funktion bei der Hämostase nicht denkbar. In dieser Thesis wurde zum ersten Mal gezeigt, dass auch die Blockade des Glykoproteins (GP) VI auf der Thrombozytenoberfläche zu vergleichbaren Blutungen im Tumor und zur Hemmung des Tumorwachstums führt, ohne jedoch das generelle Blutungsrisiko zu beeinflussen. Die durch die GPVI Blockade induzierten Effekte können durch eine gleichzeitige Depletion von Ly6G+ Zellen verhindert werden, was zeigt, dass dieser Zelltyp ursächlich an der Entstehung der Blutung beteiligt ist. Des Weiteren führt die Blockade von GPVI in Kombination mit einem Chemotherapeutikum zu einer Erhöhung dessen Konzentration im Tumorgewebe und damit zu einer verstärkten antitumoralen Wirkung. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass GPVI ein wichtiger Regulator der Gefäßintegrität im wachsenden Tumor ist, was als Grundlage für die Entwicklung von Krebstherapien genutzt werden könnte.
Im zweiten Teil dieser Thesis wurde die Rolle des bridging integrator 2 (BIN2) im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten untersucht. Der STIM1 abhängige „store operated calcium entry“ (SOCE) vermittelt den größten Ca2+-Einstrom in Thrombozyten. SOCE wird durch den inositol trisphosphate receptor (IP3R)-abhängigen Ca2+ Ausstrom aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir aktiviert. In dieser Thesis wurde BIN2 als erstes Adapterprotein im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten identifiziert, das sowohl mit STIM1 als auch mit IP3R interagiert. Das Fehlen von BIN2 führt zu einer Reduktion des Ca2+ Ausstroms aus dem zelleigenen Ca2+ Reservoir und eine Verminderung des Einstroms von extrazellulärem Ca2+. Diesen Defekten liegen die Beeinträchtigungen der Funktion sowohl des IP3R als auch von STIM1 zugrunde, während die Ca2+ Menge im Reservoir und die Agonisten-induzierte IP3 Produktion unverändert bleiben. Zusammenfassend konnte BIN2 als zentrales Molekül im Ca2+ Signalweg von Thrombozyten etabliert werden.
Der dritte Teil der Thesis befasst sich mit dem Effekt des löslichen „neuronal guidance protein“ Sema7A auf Thrombozyten. Die Arbeitsgruppe um Prof. Rosenberger konnte bereits zeigen, dass das von Erythrozyten abgespaltene Sema7A die Bildung von Komplexen aus Thrombozyten und Neutrophilen (PNC) fördert und damit die Thrombo-Inflammation während
Zusammenfassung
III
des Ischämie/Reperfusionsschadens des Myokards (MIRI) begünstigt. In dieser Thesis konnte gezeigt werden, dass die Interaktion des löslichen Sema7A mit GPIbα auf der Thrombozytenoberfläche die Thrombenbildung fördert und über diesen Mechanismus auch die PNC Bildung und somit Thrombo-Inflammation verstärkt. Aufgrund dessen stellt der Eingriff in die GPIbα-Sema7a Interaktion eine potentielle Strategie dar, den Gewebeschaden während des MIRI zu reduzieren und damit den Schaden nach einem Myokardinfarkt einzugrenzen.
KW  - Thrombozyt
KW  - Primärtumor
KW  - Maus
KW  - GPVI
KW  - Vaskuläre Integrität
KW  - Calcium signalling
KW  - BIN2
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217427
ER  - 
TY  - THES
A1  - Misra, Mohit
T1  - Knowing then defeating: The Ubiquitin activating enzyme, a promising target for cancer therapy
T1  - Erst verstehen, dann besiegen: Das Ubiquitin-aktivierende 
Enzym, ein vielversprechender Kandidat in der Krebstherapie
N2  - Ubiquitin is a 76 amino acid long polypeptide, which is present throughout eukaryotes in a highly conserved fashion. Ubiquitin can modify proteins by becoming covalently attached to them. Eukaryotic cells employ ubiquitin to maintain and regulate fundamental cellular processes like protein degradation, the immune response and transcriptional and translational regulation. Transfer of ubiquitin to the substrate is achieved by the catalysis of three classes of enzymes namely E1, E2 and E3. Together these enzymes form a pyramidal hierarchy, where E1 stands at the apex and E3 enzymes form the base of the pathway. 
The ubiquitin activating enzyme 1 (UBA1) plays a major role in ubiquitylation being the ubiquitin-dedicated E1 enzyme. In addition, it is the only enzyme in this pathway to use ATP as an energy source to catalyze two important reactions. The products of these reactions, ubiquitin adenylate and ubiquitin thioester, are the essential intermediate states of ubiquitin, for being conjugated to the target protein. With the help of X-ray crystallography and biochemical approaches, snapshots of multiple catalytic states of UBA1, where it is bound to Mg-ATP, ubiquitin and the E2 Ubc13 as substrates could be captured. With the help of these high-resolution crystal structures, deeper insights into the enzymatic mechanism of UBA1 could be attained. The resulting insights into the catalytic cycle were further validated by biochemical assays. It could be shown that ATP acts as a molecular switch to induce the enzyme’s open conformation. Ubiquitin-binding to the enzyme leads to domain rotations, which facilitate the recruitment of a cognate E2 enzyme. The interdomain communication as well as the cross-talk with the substrates and the products fuel the enzymatic cycle of UBA1.
Due to the proven efficacy of proteasome inhibitors for cancer treatment, which block degradation of proteins labeled with ubiquitin, enzymes participating in the ubiquitylation cascade have been targeted by researchers for the development of novel anti-cancer therapeutics. UBA1 inhibition has been shown to preferentially induce cell death in malignant cells, and it can also be used as a strategy to overcome resistance against proteasome inhibitors. MLN7243, an adenosyl sulfamate inhibitor developed by Millenium Pharmaceutical to specifically target UBA1, is currently in Phase-I clinical trials for the treatment of solid tumors. UBA1 could be crystallized in complex with three adenosyl sulfamate inhibitors covalently linked to ubiquitin, which are promising drug candidates for cancer therapy. The inhibitors employed, MLN7243, MLN4924 and ABPA3, show distinct specificities towards different E1 enzymes. With the help of crystal structures the specificity determinants of these inhibitors could be deciphered, which were further confirmed by inhibition assays as well as molecular dynamics simulations. Together these crystal structures provide a starting point for developing E1-specific inhibitors, which, besides their potential for medicinal purposes, are important tools to better understand the function of the ubiquitin system as well as the action of ubiquitin-like proteins.
N2  - Ubiquitin ist ein 76 Aminosäuren langes Polypeptid, das in allen Eukaryoten vorkommt und hoch konserviert ist. Ubiquitin kann Proteine modifizieren indem es mittels einer kovalente Bindung an diese angeheftet wird. Eukaryotische Zellen nutzen Ubiquitin, um fundamentale zelluläre Prozesse wie den Proteinabbau, die Immunantwort sowie die Regulation der Transkription und Translation aufrecht zu erhalten. Der Transfer von Ubiquitin auf das Substrat wird durch die Katalyse von drei Enzymklassen E1, E2 und E3 erreicht. Zusammen bilden diese Enzyme eine pyramidale Hierarchie in der das E1 an der Spitze steht und die E3 Enzyme die Basis bilden.
Das Ubiquitin-aktivierende Enzym 1 (UBA1) ist das E1 Enzym für Ubiquitin und spielt somit eine Hauptrolle in der Ubiquitinierung. Weiterhin ist es das einzige Enzym dieses Stoffwechselweges, das ATP als Energie nutzt, um zwei wichtige Reaktionen zu katalysieren. Die Produkte dieser Reaktionen, Ubiquitin-Adenylat und thioesterifiziertes Ubiquitin, sind die essentiellen Ubiquitinintermediate für die Konjugation an das Zielprotein. Mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse und biochemischer Ansätze konnten für UBA1 Momentaufnahmen multipler katalytischer Zustände erfasst werden, in denen es an die Substrate Mg-ATP, Ubiquitin und dem E2 Enzym Ubc13 gebunden vorliegt. Mit Hilfe dieser hochaufgelösten Kristallstrukturen konnten tiefere Einblicke in den enzymatischen Mechanismus des Enzyms erzielt werden. Die gesammelten Erkenntnisse zum katalytischen Zyklus wurden mittels biochemischer Methoden validiert. Es konnte gezeigt werden, dass ATP als molekularer Schalter fungiert, um das Enzym in seine offene Konformation zu überführen. Die Bindung von Bindung an das Enzym führt zur Rotation einzelner Domänen welche die Rekrutierung des E2 Enzymes erleichtern. Die Interdomänen-Interaktion sowie molekulare Wechselwirkungen mit den Substraten und Produkten treiben den enzymatischen Zyklus von UBA1 an.
Die Einsatz von Proteasominhibitoren, die den Abbau von Ubiquitin-markierten Proteinen blockieren, in der Krebstherapie weckte das Interesse von Forschern Enzyme, die an der Ubiquitinierungs-Kaskade beteiligt sind, als neue therapeutische Ziele zur Bekämpfung von Krebserkrankungen zu erschließen. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibierung von UBA1 bevorzugt den Tod maligner Zellen induziert und als Strategie für die Überwindung der Resistenz von Proteasominhibitoren genutzt werden kann. MLN7243, ein Adenosyl-Sulfamat Inhibitor, der von Millenium Pharmaceuticals entwickelt wurde und spezifisch UBA1 angreift, befindet sich gegenwärtig in klinischen Studien der Phase I mit dem Ziel einer Behandlung von soliden Tumoren. UBA1 konnte im Komplex mit drei an Ubiquitin gekoppelten Adenosyl-Sulfamat Inhibitoren, die vielversprechende Wirkstoffe in der Krebstherapie
 
sind, kristallisiert werden. Die Inhibitoren MLN7243, MLN4924 und ABPA3 besitzen unterschiedliche Spezifitäten für verschiedene E1 Enzyme. Mit Hilfe von Kristallstrukturen konnten Spezifitätsfaktoren dieser Inhibitoren entschlüsselt werden, die im Weiteren mittels Inhibierungstests und molekulardynamischer Simulationen bestätigt werden konnten. Diese Kristallstrukturen lieferten ein klareres Bild für die Entwicklung E1-spezifischer Inhibitoren mit deren Hilfe, neben ihrer potentiellen medizinischen Anwendung, ein besseres Verständnis des Ubiquitinsystems und Ubiquitin-ähnlicher kovalenter Verknüpfungen gewonnen werden kann.
KW  - Ubiquitin-aktivierende Enzym 1
KW  - E1 inhibitoren
KW  - Ubiquitin activating eznyme 1
KW  - E1 inhibitors
KW  - MLN7243
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-167227
ER  - 
TY  - THES
A1  - Perpiñá Viciano, Cristina
T1  - Study of the activation mechanisms of the CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3)
T1  - Untersuchung zum Aktivierungsmechanismus des CXC Chemokin‐Rezeptor 4 (CXCR4) und des atypischen Chemokin‐Rezeptor 3 (ACKR3)
N2  - The CXC chemokine receptor 4 (CXCR4) and the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3) are seven transmembrane receptors that are involved in numerous pathologies, including several types of cancers. Both receptors bind the same chemokine, CXCL12, leading to significantly different outcomes. While CXCR4 activation generally leads to canonical GPCR signaling, involving Gi proteins and β‐arrestins, ACKR3, which is predominantly found in intracellular vesicles, has been shown to signal via β‐arrestin‐dependent signaling pathways. Understanding the dynamics and kinetics of their activation in response to their ligands is of importance to understand how signaling proceeds via these two receptors.
In this thesis, different Förster resonance energy transfer (FRET)‐based approaches have been combined to individually investigate the early events of their signaling cascades. In order to investigate receptor activation, intramolecular FRET sensors for CXCR4 and ACKR3 were developed by using the pair of fluorophores cyan fluorescence protein and fluorescence arsenical hairpin binder. The sensors, which exhibited similar functional properties to their wild‐type counterparts, allowed to monitor their ligand-induced conformational changes and represent the first RET‐based receptor sensors in the field of chemokine receptors. Additional FRET‐based settings were also established to investigate the coupling of receptors with G proteins, rearrangements within dimers, as well as G protein activation. On one hand, CXCR4 showed a complex activation mechanism in response to CXCL12 that involved rearrangements in the transmembrane domain of the receptor followed by rearrangements between the receptor and the G protein as well as rearrangements between CXCR4 protomers, suggesting a role of homodimers in the activation course of this receptor. This was followed by a prolonged activation of Gi proteins, but not Gq activation, via the axis CXCL12/CXCR4. In contrast, the structural rearrangements at each step of the signaling cascade in response to macrophage migration inhibitory factor (MIF) were dynamically and kinetically different and no Gi protein activation via this axis was detected. These findings suggest distinct mechanisms of action of CXCL12 and MIF on CXCR4 and provide evidence for a new type of sequential signaling events of a GPCR. Importantly, evidence in this work revealed that CXCR4 exhibits some degree of constitutive activity, a potentially important feature for drug development. On the other hand, by cotransfecting the ACKR3 sensor with K44A dynamin, it was possible to increase its presence in the plasma membrane and measure the ligand‐induced activation of this receptor. Different kinetics of ACKR3 activation were observed in response to CXCL12 and three other agonists by means of using the receptor sensor developed in this thesis, showing that it is a valuable tool to study the activation of this atypical receptor and pharmacologically characterize ligands. No CXCL12‐induced G protein activation via ACKR3 was observed even when the receptor was re-localized to the plasma membrane by means of using the mutant dynamin. Altogether, this thesis work provides the temporal resolution of signaling patterns of two chemokine receptors for the first time as well as valuable tools that can be applied to characterize their activation in response to pharmacologically relevant ligands.
N2  - Der CXC Chemokin‐Rezeptor 4 (CXCR4) und der atypische Chemokin‐Rezeptor 3 (ACKR3) sind heptatransmembranäre
Rezeptoren, die in zahlreichen Krankheitsbildern eine Rolle spielen, wie in einigen Krebsarten. Beide Rezeptoren werden zwar von dem gleichen Chemokin CXCL12 aktiviert, allerdings mit unterschiedlichen Signalweiterleitungsmustern. Die Aktivierung von CXCR4 führt zu kanonischer GPCR Signaltransduktion über Gi‐Proteine und β‐Arrestine. Die Signalweiterleitung des Rezeptors ACKR3 hingegen, welcher hauptsächlich in intrazellulären Vesikeln vorliegt, erfolgt über ß‐Arrestinabhängige Signalwege. Es ist von großer Wichtigkeit die Dynamik und Kinetik dieser beiden Rezeptoren hinsichtlich der Aktivierung durch ihre Liganden und der Signalweiterleitung zu verstehen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Förster‐Resonanzenergietransfer (FRET) Anwendungen kombiniert, um
die frühen Phasen der Signal‐Kaskade von CXCR4 und ACKR3 zu untersuchen. Zur genaueren Aufklärung der Rezeptoraktivierung wurden intramolekulare FRET‐Sensoren entwickelt, hierzu wurden die Fluorophore Cyan‐fluoreszierendes Protein und engl. fluorescence arsenical hairpin binder verwendet. Die generierten Sensoren zeigten ähnliche funktionelle Eigenschaften wie die
unveränderten Rezeptoren. Liganden‐induzierte Änderungen der Rezeptorkonformation können mittels dieser Sensoren beobachtet werden und stellen die ersten RET‐basierten Sensoren auf dem Forschungsgebiet der Chemokin‐Rezeptoren dar. Weitere FRET‐basierte Methoden wurden zur
Untersuchung von Interaktionen zwischen Rezeptor und G‐Protein, Neuanordnung von Dimeren, sowie der G‐Protein Aktivierung eingesetzt und für beide Chemokin‐Rezeptoren etabliert. CXCR4 zeigte einen komplexen Aktivierungsmechanismus nach Stimulation durch CXCL12, bei welchem zunächst eine Neuordnung der Rezeptor‐Transmembrandomäne gefolgt von Neuordnungen zwischen
Rezeptor und G‐Protein und zuletzt eine Neuordnung zwischen CXCR4 Protomeren erfolgte. Dies
impliziert, dass im Aktivierungsprozess des Rezeptors Homodimere eine Rolle spielen. Zudem wurde
eine verlängerte Gi ‐Protein Aktivierung gegenüber der Gq‐Protein Aktivierung bei CXCL12 stimuliertem CXCR4 beobachtet. Hingegen zeigte eine Stimulierung mit dem Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) bei jedem Schritt der frühen Singal‐Kaskade veränderte Dynamiken und
Kinetiken im Vergleich zu CXCL12. Darüber hinaus konnte keine Gi ‐Protein Aktivierung festgestellt werden. Dieser Befund zeigt individuelle Mechanismen für MIF und CXCL12 am CXCR4‐Rezeptor und liefert Belege für eine neuer Art von sequenziellen Signalweiterleitungen an GPCRs. Eine wichtige Beobachtung dieser Arbeit für eine potentielle Medikamentenentwicklung ist das CXCR4 ligandenunabhängige
Aktivität zeigt. Um die Aktivierung des ACKR3 Sensors messen zu können wurde durch eine Co‐Transfektion mit K44A Dynamin eine höhere Membranständigkeit erreicht. CXCL12 und drei weiteren Agonisten zeigten am hier entwickelten ACKR3‐Sensor unterscheidbare Kinetiken. Mit diesem wertvollen Werkzeug können Liganden an diesem atypischen Rezeptor pharmakologisch charakterisiert werden. Es konnte keine CXCL12‐induzierte G‐Protein Aktivierung gemessen werden, trotz der stärkeren Präsenz an der Plasmamembran mit Hilfe der Dynamin‐Mutante. In Summe liefert
diese Arbeit zum ersten Mal eine zeitliche Auflösung von Signalweiterleitungsmustern von zwei 
Chemokin‐Rezeptoren sowie wertvolle Werkzeuge zur Charakterisierung der frühen Phase der Signal‐Kaskade durch andere pharmakologisch relevanten Liganden.
KW  - G protein-coupled receptors
KW  - Chemokine receptors
KW  - GPCR signaling
KW  - Förster Resonance Energy Transfer
KW  - FRET sensors
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192371
ER  -