TY - THES A1 - Wobbe, Thomas T1 - Beeinflussung der Signaltransduktion des humanen Parathormon (PTH)-2 Rezeptors mittels Einzel- und Kombinationsmutationen T1 - Signaling characteristics of the human type 2 receptor for parathyroid hormone using receptor chimeras N2 - Parathormon (PTH) aktiviert am PTH-1 Rezeptor (P1R) mindestens zwei Signalwege: Über Guanosintriphosphat-bindende Proteine (Gs) kommt es intrazellulär zu einem Anstieg von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) und zu einer Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). Gq Protein-vermittelt erfolgt eine Aktivierung der Phospholipase C (PLC) und ein intrazellulärer Anstieg des Inositoltriphosphat (IP3). Der verwandte PTH-2 Rezeptor (P2R) wird einerseits durch seinen vermutlich physiologischen Liganden, das tuberoinfundibuläre Peptid (TIP39), und andererseits durch PTH aktiviert. Im Gegensatz zum P1R zeigt der P2R nur eine Ankopplung an den cAMP Signalweg und keine an den PLC Signalweg. Voruntersuchungen hatten gezeigt, dass intrazelluläre Abschnitte der zweiten und dritten Schleife sowie Bereiche des C-Terminus des P1R für die Aktivierung des PLC Signalweges verantwortlich sind. In der vorliegenden Dissertation erfolgte eine stufenweise Angleichung intrazellulärer Abschnitte des P2R an den P1R. Die generierten Hybridrezeptoren wurden hinsichtlich ihres Signaltransduktionsverhaltens untersucht. Mit der Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositole und des intrazellulären Calciums [Ca]i konnte gezeigt werden, dass trotz einer 95%-igen Übereinstimmung der intrazellulären Aminosäuresequenzen der P2R-Hybridrezeptoren mit denen des P1R, die Ankopplung an den PLC Signalweg nicht übertragen werden kann. Diese Ergebnisse wurden für Stimulationen mit PTH und TIP39 nachgewiesen. Durch Hemmung der Proteinkinasen A und C konnte, wie erwartet, am P1R ein verstärktes IP3 Signal beobachtet werden. Eine Aktivierbarkeit des PLC Signalweges wurde auch hierbei für die Hybridrezeptoren nicht gesehen. Für die Aktivierung des cAMP Signalweges der Hybridrezeptoren konnte beobachtet werden, dass diese sich weitestgehend in Anlehnung zum P2R verhalten. Außerdem konnte gezeigt werden, dass für eine effiziente Ankopplung an den cAMP Signalweg alle aus dem P1R in den P2R einfügten Teilabschnitte (zweite, dritte Schleife und C-Terminus) zusammenwirken. Der Hybridrezeptor, an dem alle drei Teilabschnitte ausgetauscht wurden, führte zu einer signifikant besseren Ankopplung an den cAMP Signalweg, als die Einzelmutation des C-Terminus. Die Messung zum cAMP Signalweg wurden mit den Liganden TIP39 und PTH durchgeführt. Für die Aktivierung des Gs Protein-vermittelten cAMP Signalweg am P1R oder P2R sind daher vermutlich Interaktionen verschiedener Rezeptorabschnitte verantwortlich. Insgesamt konnten in dieser Arbeit weitere wichtige Erkenntnisse bezüglich unterschiedlicher Aspekte der Signaltransduktion des P1R und des P2R gewonnen werden. N2 - Activation of the phospholipase C (PLC) pathway upon stimulation with PTH is unique to the PTH-1 receptor (P1R) and is virtually absent in the PTH-2 receptor (P2R). The sites of P1R mutations known to reduce PLC signaling may achieve this indirectly by disturbing coupling at other sites. We therefore chose a more stringent approach and attempt to reestablish PLC signaling in the closely (70%) related P2R by gradually adapting the P2Rs cytosolic interface to a P1R-like sequence by engineering hybrid P1R/P2R constructs. Key differing regions of the P1R´s second loop (DT272-273:EK), third loop (IW344-345:LR), and C-terminal tail (T440-end: K-end) were put into the P2R. A fourth chimeric P1R/P2R receptor, combining all these changes, thus had a > 90% sequence identity with the cytosolic interface of the P1R. All mutants were expressed on the cell surface of stably transfected HEK 293 cells, using a radioreceptor assay with [125I]-Nle8,21-Tyr34-rat PTH(1-34), with a similar density of 1.1 to 2.5 mio receptors/cell. Activation of the PLC pathway was assessed by: 1) accumulation of total inositol phosphates in myo[3H]-inositol-prelabeled cells. No increase was detectable in the P2R or any of the receptor chimeras, even after enhancing the possible response by blockade of protein kinases A and C, despite an up to 13-fold increase with the P1R upon PTH stimulation. 2) Similarly, a PTH-induced increase in intracellular calcium (detected by fluo-3) of the wildtype P1R with as little as 1 nM hPTH(1-34) was completely absent in all mutants as well as in the P2R. The PTH-induced max. response of the cyclic AMP pathway was virtually identical for the P1R and P2R. However, the max. response of the mutant with the P1R tail sequence was reduced to only 35% (PTH) and 26% (TIP39) of the P2R response. Surprisingly, this signaling loss could be overcome by introducing more P1R sequence into the second and third cytoplasmic loop of this P1R/P2R hybrid receptor thus regaining a max. cAMP response of 64% (PTH) and 85% (TIP39). Presumably, an interaction of P1R sequences seems to result in a more effective coupling to the cAMP signaling pathway. In conclusion, these results suggest that the activation of the IP / intracellular calcium signaling pathway by the P1R is highly dependent on a P1R-like intracellular contact interface, which can not be mimicked easily even in the presence of > 90% of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R. KW - Parathormon KW - Epithelkörperchen KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Inosittriphosphate KW - Ligand KW - Rezeptor-Kinasen KW - Wirkstoff-Rezep KW - PTH-1 Rezeptor KW - PTH-2 Rezeptor KW - TIP39 KW - Calcium KW - GPCR KW - PTH-1 receptor (P1R) KW - PTH-2 receptor (P2R) KW - PLC signaling KW - cAMP signaling pathway Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27880 ER - TY - THES A1 - Volpato, Daniela T1 - Bitopic Ligands and their molecular fragments for the study of the M1 Muscarinic Receptor T1 - Bitopische Liganden und ihre Molekülfragmente für die Untersuchung des M1 Muskarinischen Rezeptors N2 - The past decades have witnessed the development of new pharmaceutical compounds that modulate receptor function by targeting allosteric sites. Allosteric sites are, by definition, domains topographically distinct from the orthosteric binding pocket where the natural ligand binds. Exploring the possibilities of linking orthosteric and allosteric pharmacophores in one compound to yield ‘bitopic’ compounds is a strategy derived from the “message-address” concept by Schwyzer , first applied to GPCRs by Portoghese et al. This concept explicitly underlines the orthosteric/allosteric combination, in opposite to the more general umbrella term bivalent. The broad possibilities of bitopic ligands in the pharmaceutical field are under continuous study. Bitopic compounds are promising pharmaceutical tools for taking advantage of the allosteric binding to achieve subtype selectivity while preserving high affinity at the receptor. The development of bitopic ligands, based on the idea of combining high affinity (via orthosteric sites) with high selectivity (via allosteric sites), have led to the development of highly selective bivalent ligands for GPCRs , such as for the opioid receptors , muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs), serotonin receptors, cannabinoid receptors, and gonadotropin-releasing hormone receptors. This concept has even been extended to other receptors, for examples nicotinic receptors and other proteins, such as acetylcholinesterases and the tyrosine kinase receptors TrkA and TrkC. The reasons to pursue a bitopic ligand approach are various. An improved affinity for the target GPCR and/or an improved selectivity either at the level of receptor subtype, or at the level of signaling pathway. Another advantage of bitopic ligands over purely allosteric ligands is that the former rely on the appropriate presence of endogenous agonist tone to mediate their effects, whereas a bitopic ligand would engage the orthosteric site irrespective of the presence or absence of endogenous tone. By way of introduction to the hybrid approach, a review of the concept of hybrids compounds targeting the cholinergic system is presented in section A of this thesis. Recent updates in hybrid molecule design as a strategy for selectively addressing multiple target proteins involved in Alzheimer's disease (AD) is here reported . This represents the potential and the growing interest in hybrid compound as pharmacological tools to achieve receptor subtype selectivity and/or, to study the overall functional activity of the receptor. Until now, muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) have proved to be a particularly fruitful receptor model for the development and characterization of bitopic ligands. In this thesis, several examples of new muscarinic bitopic approach are reported in the results section. A study of bipharmacophoric ligands composed of the muscarinic positive allosteric modulators (BQCAderived compounds) linked with chain of various lengths to different orthosteric building blocks is reported in the result part 1. Synthesis and examination of the potential pharmacological characteristic of Oxotremorine-BQCAd compounds and Xanomeline-BQCAd hybrid derivatives are described in results parts 2 and 4, respectively. Moreover, the bitopic concept has even been extended to other proteins, such as acetylcholinesterase. In the result part 5 an overview of the new Tacrine-Xanomeline hybrids aiming to improve the inhibitory potency of the acetylcholinesterase and simultaneously to increase the cholinergic tone, via the xanomelinic portion acting on the M1 receptor is given. A new trivalent approach is presented for the first time to deepen the study of the M1 muscarinic receptor in the result part 6. Moreover, the synthesis of a new series of iperoxo-derived alkane, bis(ammonio)alkane-type and rigidified chain ligands is given in the result part 7 together with some prospects for further research. N2 - Mit zunehmendem Alter der Bevölkerung werden altersbedingte Krankheiten, insbesondere neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Krankheit (AD), häufiger und stellen darüber hinaus ein soziales und wirtschaftliches Problem für die Gesellschaft dar1,2. AD ist eine schwere altersabhängige neurodegenerative Erkrankung des Gehirns, die mit Gedächtnisverlust und einer Abnahme der kognitiven Funktionen verbunden ist und immer weiter fortschreitet. Die Krankheit ist derzeit unheilbar und aufgrund des demographischen Wandels wird ein starker Anstieg an Betroffenen erwartet. Daher beschäftigt sich eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien mit der Prävention und der Behandlung von AD. Derzeit besteht das Hauptziel darin, die Ursachen und Mechanismen dieser Krankheit durch innovative Grundlagenforschung zu verstehen. AD ist ein komplexes Zusammenspiel verschiedener pathologischer Merkmale2,4. Diese besonderen Merkmale der Krankheit, die gleichzeitig auftreten, müssen untersucht und gleichzeitig untersucht werden, um wirksame und selektive Medikamente zu entwickeln. Diese Arbeit beschäftigt sich daher mit zwei Zielstrukturen der cholinergen Hypothese zur Entstehung von AD: dem muskarinischen M1-Rezeptor5,6 und der AChE7 unter Verwendung des Hybridisierungsansatzes. Zunächst wurden vermeintlich selektive M1 Agonisten entwickelt und synthetisiert. Diese sollten die cholinerge Transmission verstärken um die cholinerge Funktion in Alzheimer Patienten zu verbessern. Hierbei wurde die Hybridisierung durch die kovalente Verbindung einer allosterischen und einer orthosterischen Einheit in einem Molekül durchgeführt. ... KW - Ligand KW - Bitopic Ligands KW - Muscarinrezeptor KW - M1 Muscarinic Receptor KW - Bitopische Liganden Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248815 ER - TY - THES A1 - Kotzsch, Alexander T1 - BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB T1 - BMP ligand receptor complexes: Molecular recognition exemplified by the specific interaction between GDF-5 and BMPR-IB N2 - Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Proteinfaltung KW - Molekulare Erkennung KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor beta KW - Wachstumsfaktor KW - Strukturaufklärung KW - Dreidimensionale NMR-Spektroskopie KW - Protein-Serin-Threonin-Ki KW - Proteinkristallographie KW - GDF-5 KW - BMPR-IB KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - molecular recognition KW - signal transduction KW - ligand KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040 ER - TY - THES A1 - Cappel, Daniel T1 - Computersimulationen zur Untersuchung von Wassermolekülen in Protein-Ligand Komplexen am Beispiel einer Modellbindetasche T1 - Analysis of water molecules in protein-ligand complexes with the help of computer simulations using the example of a model binding site N2 - Wassermoleküle spielen oft eine entscheidende Rolle bei der Bindung von Liganden an Proteine. Zum einen ist dies in ihrer Eigenschaft als Wasserstoffbrückendonor und -akzeptor begründet, die es ermöglicht Wechselwirkung zwischen Ligand und Rezeptor zu vermitteln. Zum anderen stellen die Desolvatisierungsenthalpie und -entropie einer Bindetasche während der Ligandbindung einen entscheidenden Anteil der Bindungsaffinität dar. Obwohl man sich dieser Einflüsse seit langem bewusst ist, sind aktuelle Methoden des computerbasierten Wirkstoffdesigns nur in sehr begrenztem Umfang in der Lage, die entsprechenden Effekte zu erfassen und vorherzusagen. Da experimentelle Daten über die Effekte von Wassermolekülen in Protein-Ligand Komplexen von Natur aus schwierig zu erhalten sind, untersucht die vorliegende Arbeit eine Modellbindetasche einer Cytochrom c Peroxidase Mutante (CCP W191G) mit Hilfe von Molecular Modeling Techniken. Diese polare und solvatisierte Kavität ist strukturell sehr gut charakterisiert und bindet kleine, kationische Heterozyklen zusammen mit unterschiedlichen Mengen an Wassermolekülen. Für die Untersuchungen wurden strukturell ähnliche Liganden mit einem unterschiedlichen Wechselwirkungsmuster ausgewählt. Davon ausgehend wurde die Möglichkeit zweier Docking-Programme, den Grad der Wasserverdrängung durch den Liganden zusammen mit dem Bindungsmodus vorherzusagen, untersucht. Die dynamischen Eigenschaften der Bindetaschenwassermoleküle wurden mittels Molekulardynamiksimulationen studiert. Schließlich wurden diese rein strukturellen Betrachtungen durch eine energetische/thermodynamische Analyse komplettiert. Die Anwendung dieser unterschiedlichen Verfahren liefert einige neue Erkenntnisse über die untersuchte Modellbindetasche. Trotz der relativen Einfachheit der kleinen Kavität der CCP W191G Mutante war die vollständige Charakterisierung und eine korrekte (retrospektive) Vorhersage des Wasser-Wechselwirkungsmuster der Ligand-Komplexe nicht trivial. Zusammenfassend kann man festhalten, dass insgesamt eine gute Übereinstimmung zwischen den durch Computersimulationen erhaltenen Ergebnissen und den kristallographischen Daten erzielt wurde. Unerwartete Befunde, die auf den ersten Blick mit den kristallographischen Beobachtungen nicht übereinstimmen, können ebenso durch Limitationen in den Kristallstrukturen bedingt sein. Darüber hinaus gaben die Ergebnisse auch eine Hilfestellung, welches Verfahren zur Beantwortung einer Fragestellung im Rahmen von Wassermolekülen im Wirkstoffdesign geeignet sind. Schließlich wurden ebenso die Begrenzungen der jeweiligen Methoden aufgezeigt. N2 - Water molecules play an important role for the binding of small molecule ligands to proteins. One of the reasons for this is their ability to act as a hydrogen bond donor and acceptor at the same time. Additionally, the enthalpy and entropy of desolvation of the pocket is one large contribution to the overall binding affinity. Although this is long known, prediction of these effects by current methods of computer-aided drug design is rather limited. Since experimental information about water effects in protein-ligand complexes are inherently difficult to obtain, in the present work a well-suited model binding site of a mutant of the cytochrome c peroxidase (CCP W191G) is studied using molecular modeling techniques. This polar and solvated cavity is structurally very well characterized and several small, cationic heterocycles bind together with a different amount of water molecules. For this study structurally similar ligands which have a different interaction pattern where chosen. First, the ability of two docking programs to predict cavity desolvation upon ligand binding was investigated. The dynamic properties of the binding site water molecules where studied by means of molecular dynamic simulations. Ultimately, the pure structural considerations addressed in this work were complemented by an energetic/thermodynamic analysis. The application of the different methods offered some new insights into the studied model binding site. Despite the relative simplicity of the small cavity of the CCP W191G mutant, a complete characterization and a correct (retrospective) prediction of the water interaction network in ligand complexes of this model binding site is not trivial. In summary, an overall good agreement between computational results and crystallographic data is obtained. Unexpected findings, which at first sight disagree with crystallographic observations, may also be due to limitations of the crystal structures. In addition, the results help to decide which method is appropriate to address a certain question in the context of water molecules in drug design. Also, the limitations of the respective methods are exposed. KW - Cytochromperoxidase KW - Molekulardynamik KW - Docking protein KW - Statistische Thermodynamik KW - Ligand KW - Modellbindetasche KW - Freie Energierechnungen KW - Wassereinflüsse KW - Protein-Ligand Bindung KW - model binding site KW - free energy calculations KW - influences of water KW - protein ligand interactions Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55003 ER - TY - THES A1 - Dolles, Dominik T1 - Development of Hybrid GPCR Ligands: Photochromic and Butyrylcholinesterase Inhibiting Human Cannabinoid Receptor 2 Agonists T1 - Entwicklung von hybriden GPCR Liganden: Photochrome und Butyrylcholinesterase-inhibierende Cannabinoid Rezeptor 2 Agonisten N2 - While life expectancy increases worldwide, treatment of neurodegenerative diseases such as AD becomes a major task for industrial and academic research. Currently, a treatment of AD is only symptomatical and limited to an early stage of the disease by inhibiting AChE. A cure for AD might even seem far away. A rethinking of other possible targets is therefore necessary. Addressing targets that can influence AD even at later stages might be the key. Even if it is not possible to find a cure for AD, it is of great value for AD patients by providing an effective medication. The suffering of patients and their families might be relieved and remaining years may be spent with less symptoms and restrictions. It was shown that a combination of hCB2R agonist and BChE inhibitor might exactly be a promising approach to combat AD. In the previous chapters, a first investigation of dual-acting compounds that address both hCB2R and BChE was illustrated (figure 6.1). A set of over 30 compounds was obtained by applying SARs from BChE inhibitors to a hCB2R selective agonist developed by AstraZeneca. In a first in vitro evaluation compounds showed selectivity over hCB1R and AChE. Further investigations could also prove agonism and showed that unwanted off-target affinity to hMOP receptor could be designed out. The development of a homology model for hCB2R (based on a novel hCB1R crystal) could further elucidate the mode of action of the ligand binding. Lastly, first in vivo studies showed a beneficial effect of selected dual-acting compounds regarding memory and cognition. Since these first in vivo studies mainly aim for an inhibition of the BChE, it should be the aim of upcoming projects to proof the relevance of hCB2R agonism in vivo as well. In addition, pharmacokinetic as well as solubility studies may help to complete the overall picture. Currently, hybrid-based dual-acting hCB2R agonists and selective BChE inhibitors are under investigation in our lab. First in vitro evaluations showed improved BChE inhibition and selectivity over AChE compared to tacrine.78 Future in vitro and in vivo studies will clarify their usage as drug molecules with regard to hepatotoxicity and blood-brain barrier penetration. Since the role of hCB2R is not yet completely elucidated, the use of photochromic toolcompounds becomes an area of interest. These tool-compounds (and their biological effect) can be triggered upon irradiation with light and thus help to investigate time scales and ligand binding. A set of 5-azobenzene benzimidazoles was developed and synthesized. In radioligand binding studies, affinity towards hCB2R could be increased upon irradiation with UV-light (figure 6.2). This makes the investigated compounds the first GPCR ligands that can be activated upon irradiation (not vice versa). The aim of upcoming research will be the triggering of a certain intrinsic activity by an “efficacy-switch”. For this purpose, several attempts are currently under investigation: an introduction of an azobenzene moiety at the 2-position of the benzimidazole core already led to a slight difference in efficacy upon irradiation with UV light. Another approach going on in our lab is the development of hCB1R switches based on the selective hCB1R inverse agonist rimonabant. First in vitro results are not yet available (figure 6.3). N2 - Durch die weltweit steigende Lebenserwartung rückt die Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, wie der Alzheimer’schen Krankheit, immer mehr in den Fokus der industriellen und akademischen Forschung. Momentan erfolgt die Behandlung der Alzheimer’schen Krankheit durch die Blockade der AChE nur symptomatisch und in einem Frühstadium. Eine Heilung scheint dabei in weiter Ferne zu liegen, weshalb ein Umdenken nach neuen Ansätzen stattfinden sollte. Der Schlüssel könnte darin liegen, dass man biologischen Funktionen adressiert, die den Verlauf der Alzheimer’schen Krankheit auch in einem späteren Stadium beeinflussen. Selbst wenn eine Heilung in absehbarer Zeit unmöglich bleibt, ist es für die betroffenen Patienten eine erhebliche Erleichterung auf eine effektive Medikation zurückgreifen zu können. Das Leid der Patienten und ihrer Familien könnte dadurch gelindert und die verbleibenden Lebensjahre ohne Symptome und Einschränkungen genossen werden. In den vorangegangenen Kapiteln wurde bereits gezeigt, dass die Kombination aus einem hCB2R Agonisten und einem BChE Hemmer genau diesen vielversprechenden Ansatz verfolgt. Ein erster Entwicklungsansatz von dual-aktiven hCB2R Agonisten / BChE Hemmern wurde in den Kapiteln 3 und 4 ausführlich dargestellt (Abb. 7.1). Ein Set von 30 verschiedenen Verbindungen wurde synthetisiert, indem die Erkenntnisse der Struktur-Wirkungsbeziehungen von anderen BChE Hemmern auf einen von AstraZeneca entwickelten selektiven hCB2R Agonisten angewendet wurden. Erste in vitro Untersuchungen zeigten eine hohe Selektivität gegenüber hCB1R und AChE auf. Desweiteren verhielten sich alle getesteten Substanzen wie Agonisten. Nachdem ausgewählte Substanzen auf ihre „off-target“ Wechselwirkung mit dem hMOP Rezeptor untersucht wurden, konnten diese strukturellen Merkmale in nachfolgenden Entwicklungsbemühungen berücksichtigt werden. Die Entwicklung eines hCB2R Homologiemodells (basierend auf einer erst kürzlich veröffentlichten hCB1R Kristallstruktur) lieferte wertvolle Informationen zum Bindemodus und der Wirkweise der Liganden am Rezeptor. Schlussendlich konnte in einer ersten in vivo Studie bewiesen werden, dass ausgewählte dual-aktive Substanzen eine positive Auswirkung auf das Gedächtnis und die kognitiven Eigenschaften haben. Da diese in vivo Untersuchungen hauptsächlich die Hemmung der BChE berücksichtigen, wäre es sinnvoll, in zukünftigen Studien den Einfluss der hCB2R Agonisten zu untersuchen. Pharmakokinetik- und Löslichkeitsstudien könnten zudem helfen, das Gesamtbild zu komplettieren. Im Moment befinden sich auch dual-aktive hCB2R Agonisten / BChE Hemmer in der Entwicklung, die den Hybrid-Ansatz verfolgen. Erste in vitro Untersuchungen dazu ergaben vielversprechende Ergebnisse mit einer guten Selektivität gegenüber AChE und einer erhöhten Hemmung der BChE verglichen mit Tacrin.78 Es wird Gegenstand zukünftiger in vitro und in vivo Untersuchungen sein, herauszufinden, ob sich diese Hybride mit Hinblick auf Hepatotoxizität und Blut-Hirnschrankengängigkeit als Wirkstoffe eignen. Da die Rolle des hCB2R noch nicht komplett erforscht ist, erfreut sich die Entwicklung von sog. „tool-compounds“ großen wissenschaftlichen Interesses. Durch die Bestrahlung mit Licht können diese „tool-compounds“ (und ihr nachgeschalteter biologischer Effekt) gesteuert werden. Eine genauere Untersuchung von Zeitskalen und Ligandbindung an den Rezeptor wird dadurch ermöglicht. Ein Set von 5-Azobenzolbenzimidazolen wurde zu diesem Zwecke entwickelt und synthetisiert. In Radioligandbindungsstudien konnte gezeigt werden, dass sich die Affinität gegenüber dem hCB2R durch die Bestrahlung mit UV-Licht erhöhen lässt (Abb. 7.2). Diese Eigenschaft macht die entwickelten Substanzen zu den ersten GPCR-Liganden, die durch Licht aktiviert werden können (nicht umgekehrt wie bei den bisher beschriebenen photochromen GPCR-Liganden). Ziel zukünftiger Forschungsbemühungen wird die Steuerung einer bestimmten intrinsischen Aktivität / Effekts durch die Bestrahlung mit Licht sein. Zu diesem Zwecke werden aktuell mehrere Herangehensweisen untersucht: die Einführung eines Azobenzol-Strukturelements an Position 2 des Benzimidazol-Grundgerüsts zeigte in ersten in vitro Untersuchungen bereits Unterschiede bei Bestrahlung mit UV-Licht. Eine weitere Herangehensweise ist die Entwicklung von „Photo-Schaltern“ auf Basis von Rimonabant, einem selektiven hCB1R inversen Agonisten. Hier stehen erste in vitro Ergebnisse jedoch noch aus (Abb. 7.3). KW - Ligand KW - Hybrid KW - GPCR KW - Cannabinoid Receptor KW - Butyrylcholinesterase KW - Agonist KW - Agonist KW - Cholinesterase KW - G-Protein gekoppelte Rezeptor KW - Hybrid GPCR Ligands Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-163445 ER - TY - THES A1 - Düchs, Matthias T1 - Effects of Toll-like receptor agonists on the pathogenesis of atopic asthma in mice T1 - Effekte von Toll-like Rezeptor Agonisten auf den Krankheitsverlauf von atopischen Asthma im Mausmodell N2 - In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account. N2 - In den letzten Jahrzehnten wurde für Asthma ein Anstieg der Neuerkrankungen und der schweren Krankheitsverläufe verzeichnet. Des Weitern kontrollieren angewandte Therapien zwar Symptome, bieten aber keine Heilung. Ein vielversprechender Ansatz, mit dem Ziel den ursächlichen Krankheitsmechanismus zu inhibieren, ist die TLR Agonisten induzierte Immunmodulation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung von immunstimulatorischen Toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten für neue Therapieansätze in allergischen Entzündungsmodellen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf verschiedene TLR Agonisten in murinen Modellen von akutem oder chronischem Asthma, sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verabreicht. Als erstes wurden in einem Modell mit akuter Entzündungsreaktion verschiedene Konzentrationen der Agonisten für TLR 2, 3, 4, 7 und 9, vor der pulmonalen Allergenexposition intratracheal appliziert. Hier verminderten TLR9 Agonist CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG) > TLR7 Agonist Resiquimod (R848) > TLR3 Agonist poly(I:C) konzentrationsabhängig die allergen-induzierte Eosinophilie in den Atemwegen. Alle TLR Agonisten erhöhten die Anzahl an Neutrophilen, am stärksten TLR4 Agonist Lipopolysaccharid (LPS) > TLR2 Agonist Lipoteichon Säure (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848. Weiterhin erhöhten, bis auf R848, alle TLR Agonisten die Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen in den Atemwegen. Die hierbei beobachteten suppressiven Effekte waren weder IFN-γ noch IL-10 abhängig und korrelierten auch nicht mit einer Erhöhung der pulmonalen regulatorischen T Zellen. Die therapeutische Gabe von TLR Agonisten nach Allergenexposition reduzierte ebenfalls die Eosinophilie sowie IL-4 in den Atemwegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die TLR Agonisten in ihrer suppressiven Wirkung stark unterscheiden, und dass ihre Wirkung zum einen von der verabreichten Konzentration und zum anderen von dem experimentellen Aufbau abhängig ist. Auffällig war, dass alle Agonisten, wenngleich in unterschiedlicher Ausprägung, eine Neutrophilie in den Atemwegen induzierten. Dies wirft die Frage auf, ob eine wiederholte pulmonale Gabe für den Menschen verträglich wäre. Ein anderer Ansatz verwendet TLR Agonisten als Adjuvanzien für die Kombination mit Allergenen in der spezifischen Immuntherapie. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TLR vermittelte Erhöhung der allergen-spezifischen TH1Antwort die Effektivität der Therapie steigern kann. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit die verschieden TLR Agonisten auf ihre Fähigkeit hin untersucht allergen-spezifische TH1 Antworten auszulösen und allergen-spezifische TH2 Antworten zu unterdrücken. Hierfür wurde Allergen zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der TLR Agonisten appliziert und anschließend die Mäuse Allergen-Aerosol ausgesetzt. Hier konnte eine starke, konzentrationsabhängige Unterdrückung der Atemwegseosinophilie, begleitet von einer Neutrophilie, bei CpG > LPS >LTA beobachten werden. Poly(I:C) und R848 zeigten keine Effekte. Auch wurde die Menge von IL-4 und IL-5 in der bronchoalveolaren Lavage durch poly(I:C), LPS, und CpG erniedrigt. Weiterhin reduzierten alle TLR Agonisten, mit der Ausnahme von poly(I:C), die Menge an allergen-spezifischem IgE im Serum. Die kutane anaphylaktische Reaktion gegen das Allergen wurde durch CpG- oder LPS-Adjuvans komplett verhindert. Die stärkste TH1 Antwort, charakterisiert durch erhöhtes IFN-γ in der Lavage und die größte Menge an allergen-spezifischem IgG2a, wurde durch CpG und poly(I:C) ausgelöst. Diese Resultate unterstützen den klinischen Ansatz CpG als erfolgsversprechenden Adjuvants-Kandidaten für die Kombinationstherapie mit Allergen in der spezifischen Immuntherapie einzusetzen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob die Aktivierung von TLRs auch den Krankheitsverlauf von schwerem chronischem Asthma beeinflussen kann. Die beiden TLR Agonisten CpG und R848 reduzierten Faktoren des Atemwegumbaus und der Entzündung effektiver als das Steroid Dexamethasone, wobei CpG die höchste Effektivität aufwies. Dieses Ergebnis unterstützt ebenfalls eine auf TLR9 Agonisten basierende Therapie als einen vielverspechenden Ansatz für die Behandlung von schwerem chronischem Asthma auch als eine potentielle Alternative zur antiinflammatorischen Therapie mit Steroiden. Zusammenfassend unterstützen die Resultate die Verwendung von TLR Agonisten für die Behandlung von Asthma. Die höchste Effektivität und Verträglichkeit ist für eine TLR Allergen Kombinationstherapie mit TLR4 oder TLR9 Agonisten in der spezifischen Immuntherapie zu erwarten. Für eine mögliche TLR Monotherapie zeigten R848 und CpG die besten Wirkungsprofile, für schwereres chronisches Asthma bevorzugt CpG. Hierbei muss jedoch stets berücksichtigt werden, dass TLR Agonisten auch selbst entzündliche Reaktionen hervorrufen können. KW - Toll-like Rezeptor KW - Ligand KW - Bronchialasthma KW - Hypersensibilität KW - Toll-like receptor KW - Asthma KW - allergy KW - mouse model KW - Maus KW - Allergie KW - Maus Modell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66369 ER - TY - THES A1 - Wyzgol, Agnes T1 - Generierung und Charakterisierung rekombinanter TNF-Liganden T1 - Generation and characterisation of recombinant TNF-ligands N2 - Liganden und Rezeptoren der TNF-Familie regulieren eine Vielzahl zellulärer Prozesse, darunter Apoptose und Immunprozesse. TNF-Liganden kommen in Form löslicher und membranständiger trimerer Moleküle vor, wobei die trimere Organisation durch die konservierte THD vermittelt wird. Im Gegensatz zu den membranständigen Molekülen können lösliche TNF-Liganden nicht immer an ihren TNF-Rezeptor binden oder ihn effektiv aktivieren. Für zwei solcher inaktiven TNF-Liganden, nämlich TRAIL und CD95L, konnte gezeigt werden, dass durch sekundäre Oligomerisierung oder durch artifizielle Herstellung einer Membranständigkeit mittels Antikörperdomänen gegen zelloberflächenexprimierte Proteine hochaktive Ligandenvarianten generiert werden können. Inwieweit sich diese Verfahren auf die T-Zell-kostimulatorischen TNF-Liganden OX40L, 41BBL und CD27L übertragen lassen, wurde in dieser Arbeit untersucht. Lösliche Flag- und Flag-TNC-Varianten von OX40L und 41BBL zeigten eine gute Bindung an die Rezeptoren OX40 und 41BB. Die lösliche Variante Flag-CD27L konnte nicht an ihren Rezeptor CD27 binden. Dies war aber nach Einführung der trimerstabilisierenden TNC-Domäne möglich. Eine effektive Aktivierung ihres Rezeptors, nachgewiesen durch Analyse der IL8-Induktion, bewirkten die löslichen TNF-Ligandenvarianten nur nach sekundärer Oligomerisierung mittels des Flag-spezifischen Antikörpers M2. Eine ähnlich gute TNFR-Aktivierung ließ sich durch Einführung der hexamerisierenden Fc-Domäne erzielen. Fc-Flag-OX40L und Fc-Flag-41BBL induzierten bereits ohne sekundäre Quervernetzung effektiv IL8. Die Hexamerisierung alleine reichte für die lösliche CD27L-Variante nicht aus, hier war zusätzlich zur Fc- wiederum auch die TNC-Domäne erforderlich, um die Bindung an CD27 und eine schwache IL8-Induktion zu erzielen. Für die FAP-bindenden Fusionsproteine antiFAP-Flag- OX40L, antiFAP-Flag-41BBL und antiFAP-Flag-TNC-CD27L war die Bindung an OX40, 41BB und CD27 sowie an FAP nachweisbar. Erst durch die artifizielle Membranständigkeit nach Bindung an FAP konnten diese Fusionsproteine über ihren Rezeptor effektiv IL8 induzieren. Zusammenfassend ließ sich somit zeigen, dass sich schwach oder nicht aktive lösliche Ligandenvarianten von OX40L und 41BBL durch sekundäre Oligomerisierung, durch die Fc-Hexamerisierungsdomäne und durch artifizielle Membranständigkeit in hochaktive Liganden verwandeln lassen. Lösliche CD27L-Varianten benötigen zusätzlich die trimerstabilisierende TNC-Domäne, um CD27 binden und aktivieren zu können. Für das bessere Verständnis der Ligand-Rezeptor-Interaktionen wurden zusätzlich OX40L-, 41BBL- und CD27L-Fusionsproteine mit der hochaktiven Gaussia princeps Luziferase (GpL) generiert, um Gleichgewichtsbindungs-, Dissoziationsstudien und homologe Kompetitionsassays durchführen zu können. Für die Fusionsproteine GpL-Flag-TNC-OX40L, GpL-Flag-TNC-41BBL und GpL-Flag-TNC-CD27L konnte gezeigt werden, dass die IL8-Induktion nicht von der Rezeptorbelegung abhängt, sondern von der sekundären Oligomerisierung, da bei gleicher Rezeptorbelegung durch sekundär quervernetzte TNF-Liganden mehr IL8 induziert wird, die Rezeptoraktivierung also qualitativ besser sein muss. N2 - Ligands and receptors of the TNF family regulate diverse cellular processes such as apoptosis and immune processes. TNF ligands are soluble or membrane-bound molecules with a trimeric organization mediated by the conservative THD. Unlike the membrane-bound molecules soluble TNF ligands may fail in binding or in activating their receptor efficiently. It was shown for two such inactive TNF ligands, namely TRAIL and CD95L that highly active ligand variants could be generated with secondary oligomerization or artificial cell surface immobilization through antibody domains recognizing cell surface expressed proteins. In this work it was examined if these procedures are also applicable to the T cell costimulating TNF ligands OX40L, 41BBL and CD27L. Soluble Flag- and Flag-TNC-variants of OX40L and 41BBL showed good binding to their receptors OX40 and 41BB. The soluble variant Flag-CD27L did not bind its receptor CD27 while that was possible after introduction of the trimer stabilizing TNC-domain. An effective receptor-activation proved by analysis of the induction of IL8 was gained by soluble TNF ligand variants only after secondary oligomerization with the Flag-specific antibody M2. A similar efficient TNFR-activation was achieved by introduction of a hexamerizing Fc-domain. Fc-Flag-OX40L and Fc-Flag-41BBL induced already without secondary cross-linking efficiently IL8. For the soluble CD27L-variant hexamerization alone was not sufficient, but the Fc-domain was necessary in addition to the TNC-domain to enable binding to CD27 and weak induction of IL8. For the FAP-binding fusion proteins antiFAP-Flag-OX40L, antiFAP-Flag-41BBL and antiFAP-Flag-TNC-CD27L binding to OX40, 41BB and CD27 as well as to FAP was detectable. These fusion proteins were able to induce IL8 efficiently via their receptor only as artificial membrane-bound molecules after binding to FAP. In summary, it has been shown that poorly or not active soluble ligand-variants of OX40L and 41BBL can be turned into highly active ligands by secondary oligomerization, by the hexamerizing Fc-domain and by artificial immobilization on the cell surface. Soluble CD27L variants additionally need the trimer-stabilizing TNC-domain to bind and activate CD27. For better understanding of ligand-receptor-interactions additionally OX40L-, 41BBL- and CD27L-fusion proteins with the highly active Gaussia princeps luciferase (GpL) were generated to enable equilibrium binding and dissociation studies as well as homologous competition assays. It was shown here with the fusion proteins GpL-Flag-TNC-OX40L, GpLFlag-TNC-41BBL and GpL-Flag-TNC-CD27L that induction of IL8 is independent of receptor occupancy, but depends on secondary oligomerization. Secondary cross-linked TNF ligands induced more IL8 with equal receptor occupancy. Therefore a qualitative better receptor activation has to be assumed. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Ligand KW - TNF KW - Kostimulatorische Faktoren KW - TNF KW - costimulatory factors Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76449 ER - TY - JOUR A1 - Winkler, Christoph A1 - Wittbrodt, Joachim A1 - Lammers, Reiner A1 - Ullrich, Axel A1 - Schartl, Manfred T1 - Ligand-dependent tumor induction in medakafish embryos by a Xmrk receptor tyrosine kinase transgene N2 - Xmrk encodes a subclass 1 receptor tyrosine kinase (RTK) which has been cloned from the melanomainducing locus Tu of the poeciliid fish Xiphophorus. To demonstrate a high oncogenic potential in vivo we transferred the gene into early embryos of the closely related medakafish. Ectopic expression of the Xmrk oncogene under the control of a strong, constitutive promoter (CMVTk) led to the induction of embryonic tumors with high incidence, after short latency periods, and with a specific pattern of affected tissues. We demonstrate ligand-dependent transformation in vivo using a chimeric receptor consisting of the extracellular and transmembrane domains of the human EGF receptor (HER) and the cytoplasmatic domain of Xmrk. Expression of the chimeric receptor alone does not lead to ldnase activation or induction of tumors. Coexpression of the chimera with its corresponding ligand, human transforming growth factor alpha (bTGF(X), however, results in the activation of the chimeric RTK. In injected fish embryos the induction of the neoplastic growth is observed with similar incidence and tissue distribution as in embryos carrying the native Xmrk oncogene suggesting that the ligand as well as factors downstream of tbe RTK are required for tumor formation. In this study we show single-step induction of tumors by ectopic expression of RTKs in vivo substantiating tbe significance of autocrine stimulation in RTK induced tumors in vertebrales. KW - Japankärpfling KW - Ligand KW - Tumor Y1 - 1994 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87107 ER - TY - THES A1 - Harth, Stefan T1 - Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions T1 - Molekulare Erkennung in BMP Ligand-Rezeptor Interaktionen N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand’s point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors’ point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability. N2 - „Bone Morphogenetic Proteins” (BMPs) sind sezernierte multifunktionelle Signalproteine, die eine wichtige Rolle während der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration von Geweben und Organen in fast allen Vertebraten und wirbellosen Tieren spielen. Die BMP-Signalgebung wird durch die Bindung an zwei Typen von Serin/Threonin Rezeptorkinasen eingeleitet. Hierbei binden BMPs zuerst an ihren hochaffinen Rezeptor, bevor der niederaffine Rezeptor in den Komplex eingefügt wird. Durch das Zusammenfügen beider Rezeptortypen wird eine von Smad (Small mothers against decapentaplegic)-Proteinen gesteuerte Signalkaskade gestartet, die letztendlich die Transkription responsiver Gene reguliert. Aktuell sind nur sieben Typ I und fünf Typ II Rezeptoren für mehr als 30 Liganden bekannt. Viele BMP-Liganden können demzufolge mehr als einen Rezeptorsubtyp rekrutieren. Umgekehrt jedoch können auch Rezeptoren an unterschiedliche Liganden binden, was auf eine im hohen Maße promiske Ligand-Rezeptor-Interaktion hinweist. Dabei stellen sich folgende Fragen: (i) Wie können BMPs ligandspezifische Signale erzeugen, obwohl sie dafür die gleichen Rezeptoren benutzen? (ii) Und wie können BMPs unterschiedliche Bindungspartner erkennen und trotzdem hochspezifisch an diese binden? Von Blickwinkel der Liganden aus betrachtet stellen heterodimere BMPs wertvolle Hilfsmittel dar, um das Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Rezeptortypen zu studieren. Darüber hinaus können sie neue Einblicke in die Entstehung von unterschiedlichen BMP-Signalen gewähren. In dieser Doktorarbeit wird die Expression und Aufreinigung von heterodimeren BMP-2/6 und -2/7 aus E.coli Zellen beschrieben. Mittels BIAcore Interaktionsstudien und in vitro Aktivitätsassays in Säugerzellen konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Heterodimere biologisch aktiv sind. Darüber hinaus zeigen BMP-2/6 and -2/7 in den meisten Zellassays eine höhere biologische Aktivität als ihre homodimeren Gegenstücke. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA an der Signalgebung von heterodimeren BMPs involviert ist. Eine Beteiligung weiterer Typ I Rezeptoren (wie z.B. die von ActR-I), die einen heteromeren Ligand-Rezeptor Typ I Signalkomplex bilden, wie es bereits in früheren Studien gezeigt wurde, konnte jedoch experimentell nicht eindeutig belegt werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass heterodimere BMPs für eine erfolgreiche Signalweiterleitung nur die Präsenz eines einzelnen Typ I Rezeptors benötigen. Von Blickwinkel der Rezeptoren aus betrachtet, ist der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA ein Paradebeispiel für promiskes Bindeverhalten an verschiedene BMP-Liganden. Das extra-zelluläre Kontaktepitop von BMPR-IA ist im Wesentlichen ungefaltet, wenn BMPR-IA in freier ungebundener Form vorliegt. Infolge dessen durchläuft die Binderegion in BMPR-IA weit reichende strukturelle Veränderungen, um die erforderliche Konformation auszubilden, die für die Bindung an BMP-2 essentiell ist. Um herauszufinden, ob das promiske Binde-verhalten von BMPR-IA mit einer strukturellen Plastizität seiner Binderegion einhergeht, wurde die Interaktion zwischen BMPR-IA und einem Antikörper Fab Fragment experimentell untersucht. Das Fab Fragment wurde aufgrund folgender Eigenschaft ausgewählt, nämlich an das BMP-2 Bindeepitop des Rezeptors anzudocken, um so eine BMP-2 vermittelte Rezeptoraktivierung zu verhindern. In dieser Doktorarbeit wird die Kristallstruktur des Komplexes, bestehend aus der extrazellulären Domäne von BMPR-IA und dem Antikörper Fab Fragment AbyD1556 beschrieben. Die Kristallstruktur zeigt, dass die Kontaktoberfläche von BMPR-IA zu einem sehr großen Teil mit der Kontaktoberfläche bei der Interaktion mit BMP-2 übereinstimmt. Obwohl das Kontaktepitop von BMPR-IA zu beiden Bindungspartnern weitestgehend deckungsgleich ist, unterscheiden sich die dreidimensionalen Strukturen von BMPR-IA in beiden Komplexen sehr stark voneinander. Im Gegensatz zu den strukturellen Differenzen zeigt jedoch eine Mutationsanalyse, bei der wichtige Aminosäuren mit Alanin ausgetauscht wurden, dass die funktionellen Determinanten, die die Bindung an den Antikörper und an BMP-2 bestimmen, beinahe die gleichen sind. Wenn man die Strukturen von BMPR-IA, das an BMP-2 bzw. an das Fab Fragment AbyD1556 gebunden ist, mit der Struktur von ungebundenem BMPR-IA vergleicht, so fällt auf, dass die Bindung von BMPR-IA an seine Bindungspartner einem sog. „Selektions-Anpassungsmechanismus“ folgt, was möglicherweise zeigt, dass das promiske Ligand-Bindeverhalten von BMPR-IA von Natur aus durch seine strukturelle Anpassungsfähigkeit festgelegt wird. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Molekulare Erkennung KW - Transforming Growth Factor beta KW - Strukturaufklärung KW - Proteinfaltung KW - Proteinkristallographie KW - Heterodimer KW - BMP-2/6 KW - BMP-2/7 KW - BMPR-IA KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - signal transduction KW - heterodimer Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797 ER - TY - THES A1 - Zilian, David T1 - Neuartige, empirische Scoring-Modelle für Protein-Ligand-Komplexe und computergestützte Entwicklung von Hsp70-Inhibitoren T1 - Novel empirical scoring-functions for protein-ligand complexes and computer-aided development of Hsp70 inhibitors N2 - Techniken des computergestützten Wirkstoffdesigns spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung neuer Wirkstoffe. Die vorliegende Arbeit befasst sich sowohl mit der Entwicklung als auch mit der praktischen Anwendung von Methoden des strukturbasierten Wirkstoffdesigns. Die Arbeit glieder sich daher in zwei Teile. Der erste Teil beschäftigt sich mit der Entwicklung von empirischen Scoring-Funktionen, die eine Schlüsselrolle im strukturbasierten computergestützen Wirkstoffdesign einnehmen. Grundlage dieser Arbeiten sind die empirischen Deskriptoren und Scoring-Funktionen aus dem SFCscore-Programmpaket. Dabei wurde zunächst untersucht, wie sich die Zusammensetzung der Trainingsdaten auf die Vorhersagen von empirischen Scoring-Funktionen auswirkt. Durch die gezielte Zusammenstellung eines neuen Trainingsdatensatzes wurde versucht, die Spannweite der Vorhersagen zu vergrößern, um so vor allem eine bessere Erkennung von hoch- und niedrig-affinen Komplexen zu erreichen. Die resultierende Funktion erzielte vor allem im niedrig-affinen Bereich verbesserte Vorhersagen. Der zweite Themenkomplex beschäftigt sich ebenfalls mit der verbesserten Separierung von aktiven und inaktiven Verbindungen. Durch den Einsatz der Machine Learning-Methode RandomForest wurden dazu Klassifizierungsmodelle abgeleitet, die im Unterschied zu den klassischen Scoring-Funktionen keinen genauen Score liefern, sondern die Verbindungen nach ihrer potentiellen Aktivität klassifizieren. Am Beispiel des mykobakteriellen Enzyms InhA konnte gezeigt werden, dass derartige Modelle den klassischen Scoring-Funktionen im Bezug auf die Erkennung von aktiven Verbindungen deutlich überlegen sind. Der RandomForest-Algorithmus wurde im nächsten Schritt auch verwendet, um eine neue Scoring-Funktion zur Vorhersage von Bindungsaffinitäten abzuleiten. Diese Funktion wurde unter dem Namen SFCscoreRF in das SFCscore-Programmpaket implementiert. Die Funktion unterschiedet sich in einigen wesentlichen Punkten von den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Zum einen handelt es sich beim RF-Algorithmus um eine nicht-lineare Methode, die im Unterschied zu den klassischen Methoden, die zur Ableitung von Scoring-Funktionen eingesetzt werden, nicht von der Additivität der einzelnen Deskriptoren ausgeht. Der Algorithmus erlaubt außerdem die Verwendung aller verfügbaren SFCscore-Deskriptoren, was eine deutlich umfassendere Repräsentation von Protein-Ligand-Komplexen als Grundlage des Scorings ermöglicht. Für die Ableitung von SFCscoreRF wurden insgesamt 1005 Komplexe im Trainingsdatensatz verwendet. Dieser Datensatz ist somit einer der größten, die bisher für die Ableitung einer empirischen Scoring-Funktion verwendet wurden. Die Evaluierung gegen zwei Benchmark-Datensätze ergab deutlich bessere Vorhersagen von SFCscoreRF im Vergleich zu den ursprünglichen SFCscore-Funktionen. Auch im internationalen Vergleich mit anderen Scoring-Funktion konnten für beide Datensätze Spitzenwerte erreicht werden. Weitere ausgiebige Testungen im Rahmen einer Leave-Cluster-Out-Validierung und die Teilnahme am CSAR 2012 Benchmark Exercise ergaben, dass auch SFCscoreRF Performanceschwankungen bei der Anwendung an proteinspezifischen Datensätzen zeigt - ein Phänomen, dass bei Scoring-Funktionen immer beobachtet wird. Die Analyse der CSAR 2012-Datensätze ergab darüber hinaus wichtige Erkenntnisse im Bezug auf Vorhersage von gedockten Posen sowie über die statistische Signifikanz bei der Evaluierung von Scoring-Funktionen. Die Tatsache, dass empirische Scoring-Funktionen innerhalb eines bestimmten chemischen Raums trainiert wurden, ist ein wichtiger Faktor für die protein-abhängigen Leistungsschwankungen, die in dieser Arbeit beobachtet wurden. Verlässliche Vorhersagen sind nur innerhalb des kalibrierten chemischen Raums möglich. In dieser Arbeit wurden verschiedene Ansätze untersucht, mit denen sich diese ``Applicability Domain'' für die SFCscore-Funktionen definieren lässt. Mit Hilfe von PCA-Analysen ist es gelungen die ``Applicability Domain'' einzelner Funktionen zu visualisieren. Zusätzlich wurden eine Reihe numerischer Deskriptoren getestet, mit den die Vorhersageverlässlichkeit basierend auf der ``Applicability Domain'' abgeschätzt werden könnte. Die RF-Proximity hat sich hier als vielversprechender Ausgangspunkt für weitere Entwicklungen erwiesen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung neuer Inhibitoren für das Chaperon Hsp70, welches eine vielversprechende Zielstruktur für die Therapie des multiplen Myeloms darstellt. Grundlage dieser Arbeiten war eine Leitstruktur, die in einer vorhergehenden Arbeit entdeckt wurde und die vermutlich an einer neuartigen Bindestelle in der Interface-Region zwischen den beiden großen Domänen von Hsp70 angreift. Die Weiterentwicklung und Optimierung dieser Leitstruktur, eines Tetrahydroisochinolinon-Derivats, stand zunächst im Vordergrund. Anhand detaillierter Docking-Analysen wurde der potentielle Bindemodus der Leitstruktur in der Interfaceregion von Hsp70 untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine Substanzbibliothek erstellt, die von Kooperationspartnern innerhalb der KFO 216 synthetisiert und biologisch getestet wurde. Die Struktur-Wirkungsbeziehungen, die sich aus diesen experimentellen Daten ableiten lassen, konnten teilweise gut mit den erstellten Docking-Modellen korreliert werden. Andere Effekte konnten anhand der Docking-Posen jedoch nicht erklärt werden. Für die Entwicklung neuer Derivate ist deswegen eine umfassendere experimentelle Charakterisierung und darauf aufbauend eine Verfeinerung der Bindungsmodelle notwendig. Strukturell handelt es sich bei Hsp70 um ein Zwei-Domänen-System, dass verschiedene allostere Zustände einnehmen kann. Um die Auswirkungen der daraus folgenden Flexibilität auf die Stabilität der Struktur und die Bindung von Inhibitoren zu untersuchen, wurden molekulardynamische Simulationen für das Protein durchgeführt. Diese zeigen, dass das Protein tatsächlich eine überdurchschnittlich hohe Flexibilität aufweist, die vor allem durch die relative Bewegung der beiden großen Domänen zueinander dominiert wird. Die Proteinkonformation die in der Kristallstruktur hscaz beobachtet wird, bleibt jedoch in ihrer Grundstruktur in allen vier durchgeführten Simulationen erhalten. Es konnten hingegen keine Hinweise dafür gefunden werden, dass die Mutationen, welche die für die strukturbasierten Arbeiten verwendete Kristallstruktur im Vergleich zum Wildtyp aufweist, einen kritischen Einfluss auf die Gesamtstabilität des Systems haben. Obwohl die Interface-Region zwischen NBD und SBD also in allen Simulationen erhalten bleibt, wird die Konformation in diesem Bereich doch wesentlich durch die Domänenbewegung beeinflusst und variiert. Da dieser Proteinbereich den wahrscheinlichsten Angriffspunkt der Tetrahydroisochinolinone darstellt, wurde der Konformationsraum detailliert untersucht. Wie erwartet weist die Region eine nicht unerhebliche Flexibilität auf, welche zudem, im Sinne eines ``Induced-Fit''-Mechanismus, durch die Gegenwart eines Liganden (Apoptozol) stark beeinflusst wird. Es ist daher als sehr wahrscheinlich anzusehen, dass die Dynamik der Interface-Region auch einen wesentlichen Einfluss auf die Bindung der Tetrahydroisochinolinone hat. Molekuardynamische Berechnungen werden deswegen auch in zukünftige Arbeiten auf diesem Gebiet eine wichtige Rolle spielen. Die Analysen zeigen zudem, dass die Konformation der Interface-Region eng mit der Konformation des gesamten Proteins - vor allem im Bezug auf die relative Stellung von SBD und NBD zueinander - verknüpft ist. Das untermauert die Hypothese, dass die Interface-Bindetasche einen Angriffspunkt für die Inhibtion des Proteins darstellt. N2 - Methods of computational drug design play a crucial role in the development of new pharmaceutical drugs. The work presented here comprises the methodological development and the practical application of structure-based techniques in computational drug design. The first part of this dissertation focuses on the development of empirical scoring functions, which play an essential part in structure-based computer-aided drug design. The basis for this work are the empirical descriptors and scoring functions of the SFCscore software package. First, the influence of the training data composition on the prediction of empirical scoring functions was analyzed. A new training data set was created to spread the prediction range of the function and thus achieve a better separation of high and low affinity binders. The resulting function indeed yielded better predictions in the low affinity area compared to the original functions. In another approach, which also addresses the issue of discriminating active and inactive compounds, the Machine Learning method RandomForest (RF) was used to derive a classification model. Different to classical empirical scoring functions, this model no longer predicts a precise value but classifies the compounds according to their potential affinity as 'active' or 'inactive'. The example of the mycobacterial enzyme InhA showed that such models are clearly superior to different classical scoring function in terms of separating active and inactive compounds. The RandomForest algorithm was also used to derive a new scoring function for the prediction of binding affinities. This new function was implemented into the SFCscore software package under the name SFCscoreRF. This new function differs from the original SFCscore functions in several essentials points. On the one hand, the RF-algorithm is a non-linear method, which - in contrast to classical methods used for the derivation of empirical scoring functions - does not assume the additivity of the single descriptors. On the other hand, the algorithm allowes for using the whole set of available SFCscore descriptors and is therefore able to utilize a more comprehensive representation of a protein ligand complex as the basis for the prediction. Additionally, the training data set used to derive SFCscoreRF comprised 1005 complexes. This training set is one of the largest data sets used to train an empirical scoring function. The evaluation against two widely-used benchmark sets confirmed that SFCscoreRF yields superior predicitons as compared to the original functions. The comparison with other functions tested for these benchmarks shows that SFCscoreRF also achieves top results on an international level. Further analyses using a leave-cluster-out validation scheme and the participation in the CSAR 2012 Benchmark Exercise revealed that - similar to other scoring functions - SFCscoreRF shows varying performances when applied to protein-specific data sets. Additionally, by analysing the results of the CSAR 2012 data sets, valuable insight were gained regarding the prediction of docking poses and the statistical significance for the evaluation and comparison of scoring functions. The fact that empirical scoring functions are trained within a certain chemical space, is an important reason for the target-dependent performance observed in this work. Reliable predictions can only be expected within the calibrated area. Different approaches for the definition of this ``applicability domain'' are presented in this work. PCA analyses have been used to create a two dimensional representation of the ``applicability domain''. Additionally, different numerical descriptors have been tested to estimate the reliability of SFCscore predicitons. The RF-proximity has been found to be a promising starting point for future research. The development of new inhibitors for the molecular chaperone Hsp70 - a promising target in the therapy of multiple myeloma - comprises the second part of this dissertation. The basis for this work was a lead structure that was found in a previous work and attacks a novel binding pocket in the interface between the two domains of the Hsp70 protein. The optimization and development of that lead structure - a tetrahydroisochinolinone - was the primary focus of the present work. Potential binding poses in the interface were elucidated by detailed docking analyses. Based on that information, a compound library was compiled, which was synthezised and biologically analyzed by cooperation partners within the CRU 216. The resulting structure activity relationships can partially be explained on the basis of the corresponding docking poses. However, some of the effects remain unexplained. For the further development of new derivatives a comprehensive experimental characterization of the current compounds is needed. This information can be used as a basis for the refinement of the existing binding models. Hsp70 is a two-domain system, which can visit different allosteric states. To further investigate the effects of the resulting flexibility on the stability of the structure and on inhibitor binding, molecular dynamics simulations were conducted. These simulations show an above-average felxibility of the protein, which is primarily dominated by the movement of the two domains NBD and SBD relatively to each other. However, the basic conformation that is observed in the crystal structure hscaz, which was used in this work, remains stable in all simulations. Furthermore, the trajectories showed no evidence that the mutations, in which hscaz differs from the wild type protein, have a significant effect on the overall protein conformation. Although, the overall conformation of the interface between NDB and SBD remains stable, the exact conformation in this area is signficantly influenced by the domain movement. As this region includes the binding pocket of the tetrahydroisochinolinones, the conformational space of this area was analyzed in detail. The analyses expectedly reveal a high flexibility in the interface area that is dominated by the SBD-NBD movement. Furthermore, it could be shown that the conformation and dynamics can be influenced by a bound ligand (apoptozole), in terms of an induced fit mechanism. It is highly probable that the binding of the tetrahydroisochinolinones trigger similar effects, influencing the binding mechanism of this compound class. Thus, molecular dynamics simulations should play a crucial role in the future development of new compounds. The analyses also show that the dynamics of the interface region have large effects on the overall structure of the protein and vice versa. Especially, the relative orientation of NBD and SBD has a large impact on the binding pocket. This underlines the hypothesis that the interface region constitutes a promising target area for the inhibition of Hsp70. KW - Arzneimittelforschung KW - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign KW - Structure-based drug design KW - Computational chemistry KW - Molekulardesign KW - Proteine KW - Hitzeschock-Proteine KW - Scoring-Funktionen KW - Docking KW - molekulardynamische Simulationen KW - Hsp70 KW - Strukturoptimierung KW - scoring functions KW - molecular dynamics KW - lead structure optimization KW - Ligand KW - Maschinelles Lernen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105055 ER -