TY  - THES
A1  - Fischer, Stefan Martin
T1  - Regulation and functional consequences of MCP-1 expression in a model of Charcot-Marie-Tooth 1B disease
T1  - Regulation und funktionelle Relevanz von MCP-1 in einem Model der Charcot-Marie-Tooth 1B Erkrankung
N2  - Charcot-Marie-Tooth 1B (CMT1B) is a progressive inherited demyelinating disease of human peripheral nervous system leading to sensory and/or motor function disability and is caused by mutations in the P0 gene. Mice heterozygously deficient for P0 (P0+/-) are an adequate model of this human disorder showing myelin degeneration, formation of onion bulbs, remyelination and a reduced motor conduction velocity of around 30m/s similar to patients. Previously, it had been shown that T-lymphocytes and macrophages play a crucial role during pathogenesis in peripheral nerves of P0+/- mice. Both, T-lymphocytes and macrophages increase in number in the endoneurium and deletion of T-lymphocytes or deletion of a macrophage-directed cytokine ameliorates the disease. In this study the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) was identified as an early regulated cytokine before onset of disease is visible at the age of six months. MCP-1 mRNA and protein expression could be detected in femoral quadriceps and sciatic nerves of P0+/- mice already at the age of one month but not in cutaneous saphenous nerves which are never affected by the disease. MCP-1 was shown to be expressed by Schwann cells and to mediate the immigration of immune cells into peripheral nerves. Deletion of MCP-1 in P0+/- mice accomplished by crossbreeding P0 and MCP-1 deficient mice revealed a substantial reduction of immune cells in peripheral nerves of P0+/-/MCP-1+/- and P0+/-/MCP-1-/- mice at the age of six months. In twelve months old mice reduction of immune cells in peripheral nerves is accompanied by amelioration of demyelinating disease in P0+/-/MCP-1+/- and aggravation of demyelinating disease in lumbar ventral roots of P0+/ /MCP-1-/- mice in comparison to P0+/ /MCP 1+/+ mice. Furthermore, activation of the MEK1/2-ERK1/2 signalling cascade could be demonstrated to take place in Schwann cells of affected peripheral nerves of P0+/- mice overlapping temporarily and spatially with MCP-1 expression. An animal experiment using a MEK1/2-inhibitor in vivo, CI-1040, revealed that upon reduction of ERK1/2 phosphorylation MCP-1 mRNA expression is diminished suggesting that the activation of the MEK1/2-ERK1/2 signalling cascade is necessary for MCP-1 expression. Additionally, peripheral nerves of P0+/- mice showing reduced ERK1/2 phosphorylation and MCP-1 mRNA expression also show reduced numbers of macrophages in the endoneurium. This study shows a molecular link between a Schwann cell based mutation and immune cell function. Inhibition of the identified signalling cascade might be a putative target for therapeutic approaches.
N2  - Die humane Erkrankung Charcot-Marie-Tooth 1B (CMT1B) ist eine erbliche, chronisch fortschreitende Erkrankung des peripheren Nervensystems die durch Mutation des P0-Gens verursacht wird und zu motorischen und/oder sensorischen Defiziten führt. Sehr ähnlich der humanen Erkrankung weist das Mausmodell, eine für das Myelinprotein P0 heterozygot-defiziente Maus (P0+/-), Degeneration peripheren Myelins, aufeinanderfolgende Zyklen von De- und Remyelinisierung als auch reduzierte Nervenleitgeschwindigkeiten auf. Wissenschaftliche Untersuchungen am Mausmodell ergaben eine Beteiligung von T-Lymphozyten und Makrophagen an der Pathogenese. In dieser Studie wurde das Chemokin „Monocyte Chemoattractant Protein-1“ (MCP-1) als pathogen-relevant in P0+/- Mäusen identifiziert. MCP-1 mRNA und Protein wurden sowohl im Alter von sechs und zwölf Monaten nachgewiesen, Stadien, in denen morphologische Veränderungen peripherer Nerven von P0+/- Mäusen zu erkennen sind, aber auch im Alter von einen und drei Monaten, ein Alter bei dem pathologischen Veränderungen nicht zu finden sind. Mit Hilfe von MCP-1 defizienten Mäusen (MCP-1-/-) und Verpaarung mit P0-defizienten Mäusen konnten weiterführende Untersuchungen zur Rolle von MCP-1 im peripheren Nerv der Maus durchgeführt werden. So zeigte es sich mittels Transplantation von GFP-positivem Knochenmark, dass MCP 1 die Infiltration von Makrophagen aus dem Blut in periphere Nerven vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass periphere Nerven von sechs Monate alten P0+/-/MCP-1+/- und P0+/-/MCP-1-/- Mäusen trotz signifikant niedrigerer Anzahl von Immunzellen keine Milderung der Demyelinisierung zeigen. Hingegen weisen periphere Nerven von zwölf Monate alten P0+/ /MCP-1+/- Mäusen sowohl weniger Makrophagen und T-Lymphozyten als auch wesentlich weniger pathologische Veränderungen auf. Periphere Nerven von P0+/-/MCP-1-/- Tieren dagegen zeigen nur eine nicht signifikante Reduktion von Immunzellen und sogar eine Verschlechterung des Phänotyps im Vergleich zu ventralen Spinalwurzeln von P0+/-/MCP-1+/+ Mäusen. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass eine Aktivierung der MEK1/2-ERK1/2 Signalkaskade sowohl in peripheren Nerven von drei und sechs Monate alten P0+/- Mäusen zu finden ist, allerdings, ähnlich der Expression von MCP-1, nur in peripheren Nerven, die von der Demyelinisierung betroffen sein können. Unter Verwendung eines Inhibitors der Kinasen MEK1 und 2 konnte in vivo gezeigt werden, dass Phosphorylierung von ERK1/2 für die erhöhte MCP-1 Expression in peripheren Nerven von P0+/- Mäusen notwendig ist. Darüber hinaus wurde durch Verminderung der ERK1/2-Phosphorylierung eine Reduktion von Makrophagen im Endoneurium von P0+/- Tieren erzielt.
KW  - Schwann-Zelle
KW  - Peripheres Nervensystem
KW  - Charcot-Marie-Syndrom
KW  - Makrophage
KW  - Entmarkung
KW  - Myelin
KW  - Chemokine
KW  - Schwann cell
KW  - Peripheral nervous system
KW  - Charcot-Marie-Tooth syndrom
KW  - Macrophage
KW  - Demyelination
KW  - Myelin
KW  - Chemokine
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29189
ER  - 
TY  - THES
A1  - İşbilir, Ali
T1  - Localization and Trafficking of CXCR4 and CXCR7
T1  - Lokalisation und Verteilung von CXCR4 und CXCR7
N2  - G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest class of membrane proteins, and are the master components that translate extracellular stimulus into intracellular signaling, which in turn modulates key physiological and pathophysiological processes. Research within the last three decades suggests that many GPCRs can form complexes with each other via mechanisms that are yet unexplored. Despite a number of functional evidence in favor of GPCR dimers and oligomers, the existence of such complexes remains controversial, as different methods suggest diverse quaternary organizations for individual receptors. Among various methods, high resolution fluorescence microscopy and imagebased fluorescence spectroscopy are state-of-the-art tools to quantify membrane protein oligomerization with high precision. This thesis work describes the use of single molecule fluorescence microscopy and implementation of two confocal microscopy based fluorescence fluctuation spectroscopy based methods for characterizing the quaternary organization of two class A GPCRs that are important clinical targets: the C-X-C type chemokine receptor 4 (CXCR4) and 7 (CXCR7), or recently named as the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3). The first part of the results describe that CXCR4 protomers are mainly organized as monomeric entities that can form transient dimers at very low expression levels allowing single molecule resolution. The second part describes the establishment and use of spatial and temporal brightness methods that are based on fluorescence fluctuation spectroscopy. Results from this part suggests that ACKR3 forms clusters and surface localized monomers, while CXCR4 forms increasing amount of dimers as a function of receptor density in cells. Moreover, CXCR4 dimerization can be modulated by its ligands as well as receptor conformations in distinct manners. Further results suggest that antagonists of CXCR4 display distinct binding modes, and the binding mode influences the oligomerization and the basal activity of the receptor: While the ligands that bind to a “minor” subpocket suppress both dimerization and constitutive activity, ligands that bind to a distinct, “major” subpocket only act as neutral antagonists on the receptor, and do not modulate neither the quaternary organization nor the basal signaling of CXCR4. Together, these results link CXCR4 dimerization to its density and to its activity, which may represent a new strategy to target CXCR4.
N2  - G protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Klasse der Membranproteine und sind entscheidend an der Übersetzung extrazellulärer Reize in intrazelluläre Signale beteiligt, welche wiederum unzählige physiologische und pathophysiologische Prozesse regulieren. Die Forschungsergebnisse der letzten drei Jahrzehnte deutet darauf hin, dass viele GPCRs mittels noch weitgehend unbekannter Mechanismen miteinander Komplexe bilden können. Trotz vielfältiger Beobachtungen, die für die funktionelle Relevanz von GPCR-Dimeren und -Oligomeren sprechen, ist deren Existenz dennoch weiterhin umstritten, vor allem da verschiedene Methoden auf unterschiedliche quaternäre Anordnungen derselben Rezeptoren hinweisen. Von den derzeit verfügbaren Methoden zur genauen Untersuchung der GPCR Dimerisierung/-Oligomerisierung, stellen die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie sowie die bildbasierte Fluoreszenzspektroskopie die Techniken der Wahl dar. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung der Einzelmolekül Fluoreszenzmikroskopie sowie zweier konfokalmikroskopischer
Methoden zur Messung der Fluoreszenzfluktuation, mit deren Hilfe die quaternäre Anordnung zweier klinisch hochattraktiver Klasse A GPCRs untersucht wurde: der C-X-C Typ Chemokinrezeptoren 4 (CXCR4) und 7 (CXCR7), letzterer auch bekannt als atypischer Chemokinrezeptor 3 (ACKR3). Der erste Teil der Ergebnisse legt anhand Untersuchungen an einzelnen Molekülen dar, dass CXCR4 überwiegend in Form monomerer Einheiten auftritt, die bei sehr geringen Expressionsleveln kurzlebige Dimere bilden können. Der zweite Teil beschreibt die Etablierung und Anwendung räumlicher und zeitlicher Brillanzmethoden, die auf der spektroskopischen Untersuchung der Fluoreszenzfluktuation beruhen. Die Ergebnisse dieses Abschnitts deuten darauf hin, dass ACKR3 sowohl in Form beständiger Rezeptor-Cluster, und monomere Einheit an der Oberfläche lebender Zellen auftritt. CXCR4 ist bei zunehmender Rezeptordichte hingegen vermehrt in Form von Dimeren zu finden. Zudem kann die Dimerisierung von CXCR4 von dessen Liganden, als auch von der drei dimensionalen Anordnung der Rezeptorteilstrukturen (Rezeptorkonformation)auf unterschiedliche Weise reguliert werden. Die weiteren Ergebnisse legen nahe, dass Antagonisten auf unterschiedliche Weise an CXCR4 binden können und dass der jeweilige Bindungsmodus entscheidend für den Einfluss des Liganden auf Oligomerisierung und basale Aktivität von CXCR4 ist: Während Liganden, die an eine kleinere Untertasche des Rezeptors binden, sowohl die Dimerisierung als auch die Basalaktivität unterdrücken, fungieren Verbindungen, die an eine andere, größere Untertasche binden, lediglich als neutrale Antagonisten und zeigen keinerlei Einfluss auf die quaternäre Anordnung und basale Aktivität von CXCR4. Zusammenfassend verknüpfen diese Ergebnisse CXCR4-Dimerisierung mit der Rezeptordichte in Zellen und seiner Aktivität, was die Grundlage für neue Strategien zur phamakologischen Modulation von CXCR4 darstellen könnte.
KW  - G-Protein gekoppelter Rezeptor
KW  - GPCR
KW  - Receptor
KW  - Chemokine
KW  - oligomerization
KW  - CXCR4
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249378
ER  -