TY  - THES
A1  - Almeling, Stefan
T1  - The use of aerosol-based detection systems in the quality control of drug substances
T1  - Die Verwendung von aerosol-basierten Detektionssystemen in der Qualitätskontrolle von Arneiwirkstoffen
N2  - The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs.
N2  - Die durchgeführten Arbeiten hatten zum Ziel, das Potential von evaporationsbasierten HPLC-Detektoren sowie weiterer moderner Techniken hinsichtlich ihrer Eignung zur Reinheitsprüfung von pharmazeutischen Wirkstoffen zu untersuchen. Im Zuge der Arbeiten wurden verschiedene neue Methoden zur Identifizierung, Verunreinigungskontrolle und zur Überprüfung der Zusammensetzung von pharmazeutischen Wirkstoffen entwickelt. Ein evaporationsbasierter Detektor, der in den letzten Jahren Einzug in die pharmazeutische Analytik gehalten hat, ist der Lichtstreudetektor (ELSD). Allerdings wurde berichtet, dass es im Zusammenhang mit der Injektion konzentrierter Testlösungen zum Auftreten nicht reproduzierbarer Spikes kam. In einer systematischen Studie wurden die Gründe hierfür ermittelt und gleichzeitig Möglichkeiten ihrer Vermeidung aufgezeigt. Darüber hinaus wurde die Abhängigkeit der Empfindlichkeit des Detektors von der Zusammensetzung der mobilen Phase, der LC-Flußrate und den Einstellungen des ELSD untersucht. Im Zuge der Revision der Monografien für Asparaginsäure und Alanin wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von 1 mmol/L Perfluorheptansäure und Detektion mittels eines geladenen Sprühnebeldetektors (Charged Aerosol Detector – CAD) für die Reinheitskontrolle von Asparaginsäure entwickelt und validiert. Mit Hilfe dieser Methode konnten sowohl organische Säuren als auch die wesentlichen Aminosäuren, die als prozessrelevante Verunreinigungen bekannt sind, abgetrennt werden. Nach geringfügiger Modifikation konnte diese Methode auch zur Reiheitskontrolle von Alanin eingesetzt werden. Basierend auf der HPLC-CAD-Methode für Alanin wurde eine vergleichende Studie der Leistungsfähigkeit verschiedener evaporationsbasierter HPLC-Detektoren durch-geführt. Untersucht wurden der ELSD, der CAD und der kürzlich entwickelte „Nano Quantity Analyte Detektor“ (NQAD). Weiterhin wurden ein massenspektrometrischer Detektor (MSD) sowie die Quantifizierung mittels NMR-Spektroskopie (qNMR) in die Untersuchung einbezogen. Im Ergebnis war die Reinheitskontrolle von Alanin auf einem ICH konformen Niveau unter Verwendung des CAD, NQAD und MSD sowie mittels qNMR möglich. Hinsichtlich der Kriterien Leistungsfähigkeit, Preis und Benutzerfreundlichkeit waren der CAD und der NQAD die geeignetsten Alternativen. Bezüglich Wiederholbarkeit und Empfindlichkeit war der CAD dem NQAD leicht überlegen. Die Qualität von Streptomycinsulfat wird von der aktuellen Arzneibuchmonografie mangels eines geeigneten Reinheitstests nicht ausreichend kontrolliert. Aus diesem Grund wurde eine C18-Ionenpaar-HPLC-Methode unter Verwendung von Perfluorpropionsäure und Detektion mittels CAD zur Identifizierung und Kontrolle der Verunreinigungen entwickelt. Mit dieser Methode konnten 21 Verunreinigungen von Streptomycin abgetrennt und nach massenspektormetrischer Kopplung identifiziert werden. Die Methode erwies sich als ausreichend empfindlich, um Verunreinigungen mit einer Ausschlussgrenze von 0.1%, wie sie im Europäischen Arzneibuch für Fermentationsprodukte üblicherweise angewandt wird, zu kontrollieren. Derzeit wird der Aescingehalt in standardisiertem Rosskastanien-Trockenextrakt mittels einer komplexen photometrischen Methode bestimmt. Für den entsprechen-den Entwurf einer Monografie des Europäischen Arzneibuchs wurde eine selektivere HPLC-UV-Methode vorgeschlagen. Die Möglichkeiten einer weiteren Verbesserung dieser Methode unter Verwendung des CAD wurden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine modifizierte HPLC-CAD-Methode geeignet ist, Probleme, die sich aus der unterschiedlichen UV-Absorption der im Aescingemisch enthaltenen Substanzen ergeben, zu eliminieren. Weiterhin wurde die vorgeschlagene Referenzstandard Strategie überprüft. Abschließend wurde am Beispiel von zwei Gruppen pharmakologisch wirksamer Peptide nachgewiesen, wie kollisionsinduzierte Massenspektrometrie (CID-MS) erfolgreich für die Identitätskontrolle in Arzneibuchmongrafien eingesetzt werden kann. Diesbezüglich erbrachte die Kombination der direkten Massenbestätigung mittels des m/z-Verhältnisses des Molekül-Ions mit den aus dem CID-MS-Experiment erhaltenen Informationen ein höheres Maß an Gewissheit hinsichtlich der Identitätsbestätigung als die derzeit beschriebenen Tests. Als weitere Vorteile dieses Ansatzes wurden ein wesentlicher Effizienzgewinn sowie eine erhebliche Reduktion des durch die Testung verbrauchten Probenmaterials identifiziert. Zusammenfassend zeigen die Arbeiten an verschiedenen Beispielen, wie aktuelle Entwicklungen im Bereich der analytischen Chemie dazu beitragen können, die Qualitätskontrolle von Arzneimittelwirkstoffen zu verbessern.
KW  - Elektronensprayionisations-Massenspektrometrie
KW  - Qualitätskontrolle
KW  - Arzneimittel
KW  - Reinheitsanalytik
KW  - evaporationsbasierte Detektoren
KW  - Charged Aerosol Detektion
KW  - Streptomycin
KW  - Aminosäuren
KW  - Aescin
KW  - HPLC
KW  - Europäsches Arzneibuch
KW  - Purity control
KW  - evaporation based detectors
KW  - charged aerosol detector
KW  - Streptomycin
KW  - Amino acids
KW  - Aescin
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64722
ER  - 
TY  - THES
A1  - Beyer, Tanja
T1  - Quantitative NMR-Spektroskopie in der pharmazeutischen Analytik -- Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen
T1  - Quantitative NMR spectroscopy in pharmaceutical analysis -- Identity, purity and content of drugs
N2  - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Fragestellung, ob sich die quantitative NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen eignet, und wie sich Präzision und Empfindlichkeit dieser Methode im Vergleich zu etablierten chromatographischen Verfahren verhalten. Die quantitative Untersuchung der drei strukturell jeweils verwandten Mehrkomponentengemische Codergocrinmesilat, Clomifencitrat und Flupentixoldihydrochlorid bewies eindrucksvoll die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie als orthogonale, analytische Messmethode im Vergleich zu validierten HPLC-Arzneibuchmethoden. Die im Rahmen einer Validierung der 1H-NMR-Methode ermittelten Ergebnisse erfüllten bezüglich Präzision und Richtigkeit die an eine im pharmazeutischen Bereich eingesetzte analytische Methode gestellten Anforderungen; zudem wurden weitere Prüfparameter wie Selektivität, Linearität, Robustheit und Stabilität verifiziert. Externe-Standard-Experimente wie "Zwei-Röhrchen-Methode" und ERETIC-Verfahren bestätigten die quantitativen Ergebnisse der Internen Standardisierung; jedoch wurde hier -- insbesondere für die ERETIC-Technik -- eine höhere Fehleranfälligkeit und somit eine größere Streuung der Einzelergebnisse beobachtet. Am Beispiel von Codergocrinmesilat und Flupentixoldihydrochlorid konnte zudem die Eignung anderer NMR-aktiver Kerne wie 13C und 19F für die quantitative Analyse von komplexen Substanzgemischen aufgezeigt werden. Das Potential der 1H-NMR-Spektroskopie für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen wurde am Beispiel der Aminosäure L-Alanin aufgezeigt. Die zu erwartenden Verunreinigungen Glutamin-, Asparagin-, Äpfel- und Fumarsäure konnten im Gegensatz zu den "veralteten" Prüfmethoden des Europäischen Arzneibuches eindeutig identifiziert und quantifiziert werden; mit einer Bestimmungsgrenze von <= 0.03% wurden die Vorgaben der ICH-Richtlinie Q3A(R2) erfüllt. Die deutliche Übereinstimmung der NMR-spektroskopisch ermittelten Ergebnisse einer quantitativ untersuchten Alanin-Modellmischung mit einer für den Routinebetrieb geeigneten HPLC-Methode unter Einsatz verschiedener Detektoren wie CAD, NQAD, ELSD und MS, sowie der Vergleich wichtiger Prüfparameter wie Linearität und Nachweisgrenze bestätigten die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Qualitätskontrolle. Die Aufdeckung von Arzneimittelfälschungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der zwei aktuellen Fallbeispiele Heparin und Glycerin näher untersucht. Die in Zusammenhang mit dem Heparin-Skandal verantwortliche Kontaminante OSCS konnte neben Dermatansulfat und weiteren natürlich vorkommenden Glykosaminoglykan-Verunreinigungen im 1H-NMR-Spektrum eindeutig identifiziert und auf 0.1% OSCS bzw. 0.5% Dermatansulfat begrenzt werden. Eine präzise und richtige quantitative Bestimmung der beiden Glykosaminoglykane wurde über die N-Acetyl-Resonanzen mit Hilfe der Signalhöhenbestimmung und dem Standard-Additionsverfahren ermöglicht; deutliche Abweichungen vom "wahren" Gehalt wurden hingegen, bedingt durch starke Signalüberlagerungen, nach Flächenvergleich beobachtet. Weitere Verunreinigungen, insbesondere Lösungsmittelrückstände, die während des Extraktions- und Reinigungsprozesses des Heparins eingesetzt werden, konnten ebenfalls über charakteristische Resonanzen identifiziert und mit Hilfe der Internen-Standard-Methode quantitativ erfasst werden. Eine umfangreiche Untersuchung von 145 Heparin-API-Mustern mittels NMR-Spektroskopie und weiteren, neuentwickelten Verfahren wie HPLC, CE, IR- und Raman-Spektroskopie konnte die Eignung der entwickelten 1H-NMR-Methode bestätigen. Potentielle Glycerin-Kontaminanten wie Diethylenglycol und Ethylenglycol konnten ebenso wie eine weitere, natürlich vorkommende Verunreinigung, Propylenglycol, mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Beide Methoden erfüllten die in der USP beschriebenen Anforderungen, die für pharmazeutisch eingesetztes Glycerin jeweils höchstens 0.1% Diethylenglycol bzw. Ethylenglycol erlaubt. Während die quantitative Reinheitsprüfung beim Einsatz der 1H-NMR-Spektroskopie mit einer Messdauer im Bereich von etwa 30 min für den Routineeinsatz geeignet ist, ist die entwickelte quantitative 13C-NMR-Methode beim Einsatz von Spektrometern geringer Magnetfeldstärke aufgrund einer geringen Nachweisempfindlichkeit und der NOE-Problematik für den Routinebetrieb nur bedingt anwendbar. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die untersuchten Beispiele die NMR-Spektroskopie als in hohem Maße geeignet für die quantitative Analyse von Arzneimitteln ausweisen.
N2  - The main objective of the present thesis was the investigation of the suitability of quantitative NMR spectroscopy for identification, purity assay, and quantification of a given drug, as well as a comparison of precision and sensitivity of this method with well-established chromatographic routines. The quantitative analysis of the three multi-component drug mixtures codergocrine mesylate, clomiphene citrate, and flupentixol dihydrochloride strikingly demonstrates the suitability of the 1H NMR spectroscopy as an independent analytical measurement technique in comparison to validated HPLC methods of international pharmacopoeias. Concerning precision and accuracy, the results obtained from validation of the 1H NMR method met the requirements that are made on an analytical routine for pharmaceutical purposes; additionally, further validation parameters such as selectivity, linearity, robustness, and stability have been verified. Experiments like the "twin tube" and ERETIC techniques utilizing external standards confirm these results; however, in this context an increased error rate and therefore larger variance was observed, especially in the case of ERETIC. By means of codergocrine mesylate and flupentixol dihydrochloride, additionally the suitability of other NMR active nuclei as 13C or 19F for quantification of complex mixtures was shown. The potential of the 1H NMR spectroscopy for purity assays was demonstrated for the example of the amino acid L-alanin. Identification and quantification of the expected impurities glutamic acid, aspartic acid, malic acid, and fumaric acid was possible, in contrast to "out-dated" test methods of the European Pharmacopoeia; achieving a limit of quantification <= 0.03%, the demands of the ICH guideline Q3A(R2) have been met. Concerning the quantification of an alanine model mixture, the clear agreement between the results obtained by means of NMR spectroscopy and a HPLC method using various detectors like CAD, NQAD, ELSD, and MS, suited for routine analysis, as well as the comparison of various relevant parameters such as linearity and limit of quantification confirmed the qualification of 1H NMR spectroscopy in the field of routine quality assurance. Within the scope of this work, the disclosure of counterfeit drugs by means of NMR spectroscopy was investigated in detail utilizing two current case studies, namely heparin and glycerin. Besides dermatan sulfate and other natural occurrences of glycosaminoglycan impurities, the contaminant OSCS revealed in connection with the recent heparin affair was clearly identified in the 1H NMR spectrum and these contaminants could be limited to 0.1% OSCS and 0.5% dermatan sulfate, respectively. A precise and accurate quantification of these two glycosaminoglycanes was achieved using signal height and standard addition methods applied to the N-acetyl resonances; comparison of signal areas however yielded considerable deviations from the "true" content, which are due to strong signal overlap. Further contaminants, especially solvent residues originating from the extraction and purification processes of heparin, have been able to be identified with the help of characteristic resonances; their quantification was possible. An extensive study of 145 heparin API samples by means of NMR spectroscopy and other novel techniques such as HPLC, capillary electrophoresis, IR and Raman spectroscopy confirmed the qualification of the developed 1H NMR method. Potential contaminants in glycerin such as diethylene glycol and ethylene glycol have been able to be identified as well as quantified by means of 1H and 13C NMR spectroscopy, as was the case for propylene glycol, which is naturally present. Both methods met the requirements of the USP, limiting the amount of diethylene glycol and ethylene glycol for pharmaceutical purposes to 0.1%, respectively. While 1H NMR spectroscopy with a measurement time of about 30 min is well suited for routine application, the applicability of the 13C NMR method is limited due to the NOE effect and the low sensitivity at low field strengths. In conclusion, each of the attended topics showed, that NMR spectroscopy is a powerful tool within the framework of quantitative drug analysis.
KW  - NMR-Spektroskopie
KW  - Protonen-NMR-Spektroskopie
KW  - Quantitative Analyse
KW  - Qualitätskontrolle
KW  - Arzneimittel
KW  - Heparin
KW  - Aminosäuren
KW  - qNMR
KW  - Gehaltsbestimmung
KW  - Reinheitsanalytik
KW  - Arzneimittelfälschungen
KW  - Mehrkomponentengemische
KW  - quantitative analysis
KW  - purity control
KW  - counterfeit drugs
KW  - quantitative NMR spectroscopy
KW  - multicomponent drugs
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65091
ER  - 
TY  - THES
A1  - Borst, Claudia
T1  - Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europäischen Arzneibuchs
T1  - Capillary electrophoretic impurity analysis of different drugs of the European Pharmacopoeia
N2  - Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte.
N2  - The separation mechanism of capillary electrophoresis (CE) is based on the mobility of ions in an electric field. CE is a versatile technique, which can be operated in different modes. In this work, both aqueous capillary zone electrophoresis (CZE) and nonaqueous CE (NACE) and microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC) were investigated. Using these CE methods, impurity analysis was accomplished for serveral pharmaceuticals, which are described in the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.): ethambutol, quetiapine, ephedrine, levodopa and correspondingly related substances. The active agent ethambutol is used in the (S,S)-configuration and in Ph. Eur. 7 the monograph describes the dichloride of the substance. In order to develop a separation method for (S,S)-ethambutol, its enantiomer and the achiral meso-compound were synthesized by the reaction of 2-amino-1-butanol and diethyloxalate. For the separation of these ethambutol compounds the CZE technique was chosen. After using an acid phosphate buffer, the concentration of the sample solution had to be set at 1 mg/ml for an sufficient UV adsorption (λ: 200 nm). After using a basic tetraborate buffer, the chromophore was more sensitive due to the electron pair of the nitrogen molecule, which led to higher peak intensity. Native α-, β- and γ-cyclodextins (CDs) and some derivatives of β-CD were added to the background electrolyte (BGE) as chiral selectors. The CZE method was modified in many ways, e. g. in molarity and pH value of the BGE, in concentration of the chiral selectors, in voltage and in temperature. In spite of various variations, the separation of the stereoisomers was not successful. A CD-modified MEEKC method was applied to separate the racemates of dopa, methyldopa, tyrosine and phenylalanine. For this purpose, a microemulsion (ME) was employed, which consisted of ethyl acetate, SDS, 1-butanol, phosphate buffer, sulf. β-CD and 2-propanol, used as an organic modifier, if necessary. For each DL-amino acid the composition of the ME and the instrument settings (voltage, temperature) were optimized. The separation of DL-dopa was accomplished without an organic modifier. Based on the methods evolved individually, two CD-modified MEEKC methods were developed to separate all four racemates. The concluding validation of these methods with respect of repeatability (resolution, migration time, ratio of the corrected peak areas, and number of theoretical plates) and limit of detection showed that the methods give precise results. The technique of MEEKC was also used for the separation of ephedrine derivatives. By means of a HDAS-β-CD-modified CZE method, Wedig et al. achieved baseline separation of racemic ephedrine, pseudoephedrine, N-methylephedrine and norephedrine in one run. In their experiment the BGE consisted of 50 mM phosphate buffer, pH 3.0. An ME was composed of this buffer as aqueous phase and the organic compounds, which formed the oil-phase of the ME for the amino acids. Contrary to the CZE method of Wedig et al., who used HDAS-β-CD, no satisfying resolution was observed. Replacing the chiral selector HDAS-β-CD with sulf. β-CD and modifying the phosphate buffer in ionic strength and pH value, led to baseline separation of the four mentioned ephedrine derivatives eventually. This MEEKC method was subjected to the separation of other ephedrine derivatives. So racemic 2-(dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol could partly be separated, whereas complete separation could be observed for racemic adrenaline, 2-amino-1-phenylethanol and diethylnorephedrine. Whereas the MEEKC method is much cheaper by using sulf. β-CD, the application of the HDAS-modified CZE method resulted in the separation of all four racemic ephedrine alkaloids in one run. Finally, an impurity analysis of quetiapine and its related compounds quetiapine desethanol, quetiapine-N-oxide and quetiapine lactam was develop. The molecular structure of quetiapine lactam needed to be clarified, as this compound had not been described before. By using mass spectrometric (MS) as well as infrared (IR) and NMR investigations, the substance could be identified: Dibenzo[b,f][1,4]thiazepine-11(10H)one. As quetiapine lactam was found to be nearly insoluble in water and aqueous solutions, an NACE method had to be applied. Indeed, a method was developed with a BGE consisting of methanol, acetonitril, ammonium acetate and acetic acid. Thereby, the separation of quetiapine and its three mentioned impurities was observed with high resolution values. However, validation was impossible, because of numerous aborts of the current. Alternatively, an aqueous and highly reproducible CZE method was found with a BGE composed of 80 mM phosphate buffer, pH 4.0. Due to the water insolubility of quetiapine lactam, only quetiapine desethanol and quetiapine-N-oxide could be analysed as impurities. Finally, the aqueous CZE method was validated; the high precision of the results could be verified.
KW  - Kapillarelektrophorese
KW  - Arzneimittel
KW  - Verunreinigung
KW  - Qualitätskontrolle
KW  - Europäisches Arzneibuch
KW  - chirale Trennung
KW  - Ethambutol
KW  - Aminosäuren
KW  - Ephedrin
KW  - Quetiapin
KW  - MEEKC
KW  - CZE
KW  - NACE
KW  - Cyclodextrine
KW  - capillary electrophoresis
KW  - chiral separation
KW  - cyclodextrin
KW  - amino acids
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56243
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TY  - THES
A1  - Freitag, Claudia
T1  - Quantifizierung von Aminosäuren in Infusionslösungen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(Tandem) - Massenspektrometrie(HPLC-[MS/]MS) Methodenentwicklung und Validierung
T1  - Quantitation of amino acids in infusion solutions by high performance liquid chromatography - (tandem) - mass spectrometry (HPLC-[MS/MS]) - method development and validation
N2  - Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminosäuren (AS) in Infusionslösungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der für die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminosäuren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminosäuren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminosäuren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ansätze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptansäure), führte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Spülzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Gerät stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich störte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle schwer validierbar wäre. Weiterführende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der Säule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-Säule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. ähnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode über einen weiten Bereich eine lineare Abhängigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. Für drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-Lösung der Infusionslösung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS führte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung über reine Standardlösungen nicht möglich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixlösung durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminosäuren in Infusionslösungen mit hoher Präzision und Richtigkeit bestimmt werden können. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30% - 350%, zehn weitere im Bereich von 50% - 350% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98% -102.0%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5% – 101.5%) quantifiziert werden. Für His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierfür in weiteren Studien geklärt werden müsste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionslösungsformulierungen möglich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschränkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionslösung und einen Verdünnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt über eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode beträgt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich kürzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebräuchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung anzusetzen sind.
N2  - The aim of this study was to develop an HPLC-MS(/MS) method to be used within pharmaceutical quality control for the direct quantitation of amino acids (AS) in infusion solutions. The validation within the limits of the intended purpose was part of the objective. In the course of the method development the ESI-MS/MS fragmentation pattern of 21 amino acids, 20 stable isotope labelled amino acids, which were used as internal standards, and some further substances were determined. By knowing precursor- and product ions a SRM-method for specific MS/MS analysis was created. Interferences due to the respective fragmentation pattern within the analytes were detected, which had to be considered during the following HPLC-MS method development. The HPLC-MS method development for the analysis of underivatized AS comprised two different approaches: the RP-HPLC using an ion-pair reagent (IP) und the hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Problems occurred using the RP-HPLC. Due to the IP, in this study TDFHA (tridecafluoroheptanoic acid), long equilibration-, re-equilibration and rinsing-times were necessary so that this method is very time consuming despite short HPLC run times. Because of the contamination with TDFHA the use of the LC-MS system was limited. Furthermore, despite long equilibration times, retention times of the analytes were poorly reproducible. A validation of the method within the requirements of the pharmaceutical quality control would be therefore hardly to perform. Thus, further studies were not carried out. The following studies were focused on HILIC. Different parameters (percentage of organic solvent in the eluent, pH of the eluent, column temperature, buffer concentration in the eluent, gradient elution) were checked concerning their effects on the separation of AS on a ZIC®-HILIC column. By optimizing the parameters, a HILIC-HPLC method was developed, by which 21 AS and 20 of their stable labelled isotopes were eluted within 20 min. All AS, which interfered with other AS due to their fragmentation pattern, were chromatographically separated. Moreover, the SIM mode was found to be suitable for the separation of AS, thus avoiding SRM mode and tandem mass spectrometry. During the validation studies the HILIC-HPLC-MS method showed linear relation between AS-concentration and measured value over a wide range. Linearity was tested with the Mandel test revealing better fit by quadratic regression for three of 21 AS (NAcCys, NAcTyr and Pro). Recovery studies showed an influence of the matrix of the infusion solution, which led to deviations in the quotients areaAS / areaIS. As a result, quantitation by calibration with pure AS standard solutions was not possible within the given limits. Thus, validation was performed with matrix solution. Thereby it was shown that with the developed HPLC-MS method AS could be deter-mined in infusion solutions with high precision and accuracy. Nine of 21 AS were quantified in the range of 30%-350%, ten AS in the range of 50%-350% within the given requirements of pharmaceutical quality control (individual recovery value: 98% -102.0%, mean recovery value (threefold determination): 98.5% – 101.5%). His and Phe could not be quantified within the acceptance criteria; the reason for this would have to be found out in further studies. With the developed method the simultaneous quantitation of different AS infusion solutions, which differ in analytes concentrations with constant matrix concentration, can be realized. For instance, the formulations „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ can be mentioned, which could be determined by using the validated method. Sample preparation is fast and simple, consisting in addition of IS-formulation to the infusion solution and a single dilution step. Quantitation is performed by external standard calibration; the 5-point-regression-line is made by analyzing AS- and IS-standard solution after adding the electrolyte matrix solution, which is easily to produce. HPLC-MS analysis time is 35 min (including equilibration time), thus considerably shorter than the approximately 120 min required with the still common AS analytical method (ion exchange chromatography with postcolumn ninhydrin derivatization).
KW  - Aminosäuren
KW  - Qualitätskontrolle
KW  - HPLC-MS
KW  - Aminosäuren
KW  - hydrophile Interaktionschromatographie
KW  -   HILIC
KW  - Validierung
KW  - Methodenentwicklung
KW  - Infusionslösungen
KW  - amino acids
KW  - hydrophilic interaction chromatography
KW  - HILIC
KW  - HPLC-MS
KW  - validation
KW  - method development
KW  - infusion solutions
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65198
ER  -