TY  - THES
A1  - Staib, Peter
T1  - Analyse der Expression einer Virulenzgenfamilie von Candida albicans während der Infektion
T1  - Analysis of the expression of a Candida albicans virulence gene family during infection
N2  - Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können.
N2  - The opportunistic human pathogenic yeast Candida albicans is a member of the microflora on mucosal surfaces of many healthy people but can cause superficial infections as well as life-threatening deep organ mycoses in immunocompromised patients. Although the ability of C. albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, it is generally assumed that a number of virulence factors also contribute to the pathogenicity of C. albicans, thereby supporting colonization, distribution and multiplication of the fungal cells and allowing an adaption to various host niches. The production of secreted aspartic proteases (SAPs), encoded by a large family of homologous genes, plays an important role in C. albicans pathogenicity. It is likely that the individual proteases fullfill various functions during infection or are optimally adapted to different host niches. However, the contribution of single SAP genes to pathogenicity is not well understood. Because the host-induced activation of these virulence genes at a certain infection stage might give clues to their specific role in pathogenicity, an in vivo-expression technology (IVET) was developed in this work that allows the detection of gene activation in C. albicans during infection. The method is based on genetic recombination as a reporter of gene expression, resulting in the specific excision of a mycophenolic acid resistance marker from the genome by a site-specific recombinase after induction of the target gene. Because deletion of the marker represents an irreversible event that is inherited by the progeny of the corresponding cell, even a transient gene expression at a certain infection stage or in specific organs can be detected in single cells recovered from infected tissue by plating on appropriate indicator medium. The suitability of the reporter system for detecting a biologically meaningful gene activation in C. albicans was confirmed by analyzing expression of the SAP2 gene, which is induced in vitro during growth in a medium containing bovine serum albumin as the sole nitrogen source, but repressed in other commonly used laboratory media. IVET was then used to analyze the in vivo expression of six different SAP genes of C. albicans, SAP1-SAP6, in various animal models. It could be demonstrated that the individual protease genes are indeed differentially regulated, depending on the type of the infection, i.e. locally restricted mucosal infection or systemic infection, and the stage of an infection. Even the highly homologous SAP4-SAP6 genes, which from the results of in vitro experiments had been supposed to be hyphae-specific genes, were differentially regulated in vivo. SAP5 and SAP6, but not the other SAP genes, were significantly activated in a mouse model of oesophageal candidiasis when C. albicans hyphae invaded into the epithelium. A stage-specific expression of SAP genes was observed in a mouse model of Candida peritonitis. Soon after inoculation of C. albicans yeasts into the peritoneal cavity, before hyphae formation was observed, SAP5 but not SAP6 or any of the other SAP genes analyzed was activated in a significant part of the infecting cell population. Therefore, SAP5 seems to be important for tissue invasion during mucosal infection and also during the initial steps of a disseminated infection. By intravenous inoculation of C. albicans into mice, thereby bypassing the early infection stages, it was demonstrated that expression of SAP5 and SAP6, but also SAP4, continued into the later stages of a disseminated infection. In contrast, an induction of the SAP2 gene was observed predominantly in the late stages of a systemic infection, when the fungal cells had spread to deep organs. Hence, SAP2 presumably supports the multiplication of the fungal cells within the infected organs, perhaps by providing nutrient supply, rather than the invasion into host tissues. The in vivo regulation of SAP2 was shown to be influenced by certain repeat structures in the promotor region of this gene. In the C. albicans model strain CAI4 that was used in this study even the two SAP2 alleles, which differed in this repeat region, were differentially regulated during the course of a systemic infection, the SAP2-2 allele being induced at an earlier infection stage than the SAP2-1 allele. In contrast to the other SAP genes, expression of SAP1 and SAP3 could be detected in only few infecting cells, and a role in pathogenicity could not be attributed to these genes in the infection models used in this work. During the course of an infection C. albicans presumably employs many different virulence factors at the same time in order to achieve the best possible adaptation to the corresponding host niche. Yet, a question that has hardly been addressed but may enhance our understanding of the host-microbe interactions is whether different properties of the fungal cell are regulated in a coordinated fashion by specific host signals. At least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators CPH1 and EFG1, respectively, control hyphae formation in C. albicans. As dimorphic growth is important for infection and because expression of the genes SAP4-SAP6 is linked to the hyphal growth form in vitro, a possible dependence of hyphae-associated SAP gene expression on these regulators was analyzed by studying SAP5 expression in corresponding signal transduction mutants. SAP5 activation in vivo was reduced in cph1 as well as in efg1 single mutants. Therefore, both CPH1 and EFG1 contribute to SAP5 activation during infection. Since the cph1 mutant formed hyphae in infected tissue as efficiently as the wild-type strain, hyphae formation alone evidently was not sufficient for full SAP5 induction in vivo. On the other hand, induction of SAP5 in vivo did not depend on the hyphal growth form, because a reduced but still significant SAP5 expression was also detected in the efg1 mutant that grew only in the yeast form in the infected animals. In cells defective in both of the regulators an induction of SAP5 was hardly detectable. Therefore, these signalling pathways are important for the control of various cellular programs during infection and coordinate the expression of different virulence genes in C. albicans. The in vivo analysis of virulence gene expression of C. albicans provided insights into regulatory adaptation mechanisms of the pathogen in various host niches. The individual members of a virulence gene family of this fungus are differentially and stage-specifically regulated during infection and thus presumably contribute very specifically to pathogenesis. Moreover, various virulence traits can be regulated in a coordinated fashion during infection and in this way together support the adaptability of C. albicans to the host. Overall, these findings enhance our understanding of the pathogenicity of this important opportunistic fungal pathogen.
KW  - Candida albicans
KW  - Virulenz
KW  - Genexpression
KW  - Pilzinfektionen
KW  - Virulenzmechanismen
KW  - Genregulation
KW  - Reportergene
KW  - In Vivo Expressionstechnologie
KW  - Proteasen
KW  - Candida albicans
KW  - fungal infections
KW  - virulence mechanisms
KW  - gene regulation
KW  - reporter genes
KW  - in vivo expression technology
KW  - Candida albicans
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179875
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TY  - THES
A1  - Piechaczek, Katharine
T1  - Untersuchungen zum Einfluß der Pathogenitätsinseln I536 und II536 auf die Genexpression des uropathogenen Escherichia coli Stammes 536
T1  - Studies on the influence of the pathogenicity islands I536 and II536 on the gene expression of the gene expression of the uropathogenic Escherichia coli strain 536
N2  - Escherichia coli wird als der häufigste Erreger von Harnwegsinfektionen des Menschen beschrieben. Um die Krankheit auslösen zu können, benötigen die Bakterien ganz bestimmte Eigenschaften, die als Virulenzfaktoren bezeichnet werden und durch die sie sich von apathogenen Stämmen unterscheiden. Der uropathogene E. coli Stamm 536 (O6:K15:H31) exprimiert verschiedene Virulenzfaktoren wie a-Hämolysin, die Adhäsine S-, P-related (Prf) und Typ 1-Fimbrien sowie das Kapselantigen K15. Außerdem wurden auch Enterobaktin- und Yersiniabaktin-Produktion sowie Serumresistenz nachgewiesen. Die Ausprägung der Virulenz hängt unter anderem mit dem Vorhandensein von Pathogenitätsinseln (PAI I536-V536) zusammen, die mit seltenen tRNA-Genen assoziiert sind. Die Deletion der Inseln PAI I536 und PAI II536 führt zum Verlust der Virulenz und zur Zerstörung der entsprechenden tRNA Gene. Es wurde festgestellt, daß die leuX-kodierte tRNA5Leu, die mit der PAI II536 assoziiert ist, einen Einfluß auf die Expression von Typ 1-Fimbrien sowie auf die Serumresistenz, Motilität und die Enterobaktin- und a-Hämolysin-Produktion hat. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Bedeutung der leuX-kodierten tRNA5Leu und der Pathogenitätsinseln I536 und II536 für die Expression von Proteinen sowie Typ 1-Fimbrien bei dem E. coli Stamm 536. Dazu wurde zunächst eine Proteomanalyse durchgeführt. Mit der Hilfe von 2D-Gelen wurde der Einfluß von leuX-kodierten tRNA5Leu und PAI I536 und PAI II536 auf die Expression verschiedener Proteine im E. coli Stamm 536 (PAI I536+, PAI II536+, leuX+) und seinen Mutanten: 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) und 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) untersucht. Mit Hilfe von präparativen Gelen konnten in den zytosolischen Fraktionen 39 Unterschiede in der Expression von Proteinen nachgewiesen werden. Von diesen differentiell exprimierten Proteinen wurden 37 mit Hilfe von MALDI-TOF-MS identifiziert. Die zwei weiteren Proteine konnten nicht identifiziert werden. In den Kulturüberstandsfraktionen der untersuchten Stämme konnten drei Unterschiede in der Expression von Proteine nachgewiesen werden. Außerdem wurde der Einfluß der leuX-kodierten tRNA5Leu auf die Expression der Membranproteine der jeweiligen Stämme untersucht. Zu diesem Zwecke wurden sowohl ein- wie auch zweidimensionale Gele durchgeführt. Mit Hilfe von zweidimensionalen Gelen konnten zwischen den untersuchten Stämmen mehrere Unterschiede in der Expression von Proteinen festgestellt werden. Dabei konnten vier Unterschiede in der Proteinexpression detektiert werden. Mit Hilfe der 2 D-Gelelektrophorese wurde ein leuX-abhängiges Protein (YgaG), das ein Analogon des LuxS-Proteins ist, gefunden. Das LuxS-Protein ist ein Bestandteil des "Quorum sensing"-Systems von Vibrio harveyi und wird in ähnlicher Form bei vielen Bakterien beschrieben. Sein Einfluß auf die Pathogenität wurde bei vielen Bakterien beschrieben. Aus diesem Grund wurde eine ygaG-Mutante im E. coli Stamm 536 hergestellt. Anschließend wurde der Einfluß des YgaG-Proteins auf die Expression von Virulenzfaktoren überprüft und ein Proteomvergleich zwischen dem Wildtyp Stamm E. coli 536 und der ygaG-Mutante wurde durchgeführt. Die Expression der bekannten Virulenzfaktoren wurde von YgaG nicht beeinflußt. Weiterhin wurden Transkriptionsfusionen zwischen den Promotoren der fimB- und fimE-Gene mit dem promotorlosen ß-Galaktosidase-Gen (lacZ) konstruiert. Es sollte damit die Frage beantwortet werden, ob die leuX-kodierte tRNA5Leu als potentieller Regulator die Transkription von Typ 1-Fimbrien beeinflußt. Es konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Transkription von fimB und fimE zwischen dem Wildtyp Stamm 536 und der leuX-Mutante 536D102 festgestellt werden.
N2  - Escherichia coli is one of the common causes of urinary tract infections. Pathogenic E. coli differ from non-pathogenic E. coli variants by the presence of certain virulence factors which contribute to their ability to cause disease. The uropathogenic E. coli strain 536 (O6:K15:H31) is able to produce different virulence factors such as a-hemolysin, fimbrial adhesins (P-, type 1 and S-fimbriae) and specific capsules. Furthermore the bacteria produce iron uptake systems like enterobactin and yersiniabactin and have the capacity to survive in human serum. The development of pathogenicity is connected to pathogenicity islands (PAI I536-V536). All four PAIs are associated with tRNA genes. The deletion of PAI I536 and PAI II536 results in the truncation of the associated tRNA gene and loss of virulence. The deletion of PAI II536 results in the truncation of the leuX gene. PAI II536 as well as leuX deletion mutants show a reduced production of type 1 fimbriae, flagellae and of the iron uptake system enterobactin. Furthermore, they show delayed hemolysin production and a reduced serum resistance. Additionally, the leuX-encoded tRNA5Leu may also regulate the expression of various other genes. The aim of this work was the further characterization and analysis of the role of PAI I536/II536 and of the tRNA5Leu for protein expression as well as for the regulation and expression of two site-specific recombinases, FimB and FimE, of the E. coli strain 536. Firstly, the protein expression patterns of E. coli 536 and different derivatives were studied. Differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536, its mutants 536-21 (PAI I536-, PAI II536-, leuX-), 536D102 (PAI I536+, PAI II536+, leuX-) and strain 536R3 (PAI I536-, PAI II536-, leuX+) were analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis. With the help of preparative 2 D-gel electrophoresis 39 differentially expressed intracellular proteins could be identified. The identities of 37 proteins have been determined by MALDI-TOF mass spectrometry in Halle. Two of these proteins show no matches in sequence databases. The preparations of the culture supernatants resulted in 2 D proteinpatterns from which three protein spots whose expression is markedly altered in the different strains are identified. The influence of the tRNA5Leu on the expression of outer membrane proteins was also studied. Differences in the protein expression patterns of the wild-type strain 536 and the mutants were analyzed by one- and two-dimensional gel electrophoresis. The analysis of 2 D protein patterns of outer membrane preparation resulted in the detection of some proteinspots whose expression was altered in the different strain backgrounds. It was identified during the proteom analysis that tha expression of the YgaG protein was shown to be reduced in a leuX-negative background. This protein shows a strong homology to the LuxS protein of Vibrio harveyi. The LuxS protein is a component of the quorum sensing system. It has been shown that many bacteria express proteins similar to LuxS of V. harveyi and that quorum sensing may play a role in pathogenicity. To investigate whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli strain 536, a ygaG deletion mutant was made. In addition, differences in the protein expression pattern of the wild-type strain E. coli 536 and the ygaG mutant were analyzed by 2 D gel electrophoresis. Whether YgaG contributes to the virulence of the E. coli Strain 536 has not be investigated. In order to get a deeper insight into the role of the tRNA5Leu as a potential regulator of the expression of the typ 1-fimbriae, a transcriptional fusion between the promotor area of fimB and fimE and the lacZ gene lacking its own promotor was constructed. However the transcription of fimB and fimE did not show any significant differences between the wild-type strain 536 and the leuX-mutant 536D102.
KW  - Escherichia coli
KW  - Harnwegskrankheit
KW  - Virulenzfaktor
KW  - Proteom
KW  - Proteom
KW  - Pathogenitätsinseln
KW  - leuX-tRNA
KW  - uropathogener E. coli Stamm 536
KW  - Proteomics
KW  - Pathogenicity islands
KW  - leuX-tRNA
KW  - uropathogenic E. coli strain 536
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1862
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TY  - THES
A1  - Kemmer, Gabriele
T1  - Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae
T1  - Characterization of the initial uptake of the cofactor V (NAD) in Haemophilus influenzae
N2  - H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien für Hämin unter aeroben Bedingungen und für Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es können zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten Stämme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren Stämme, die für Oberflächeninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig über die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des Häminaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der Hämin-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) für die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht fähig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, während die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu klären, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig für die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivität. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivität die einzige für die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminosäureaustausch die Phosphatase-Aktivität verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Phänotypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die Fähigkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Phänotypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die fähig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivität nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN für die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht fähig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschränkt, während mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR über einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der äußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren.
N2  - H. influenzae is a facultativ anaerobic, Gram-negative bacterium and belongs to the familiy of Pasteurellaceae. This bacterium shows auxotrophies for hemin under aerobic conditions and for nicotinamid adenine dinucleotide (NAD) at aerobic and anaerobic growth. Two subspecies are distinguishable: the encapsulated strains, the causative agents for systemic and invasive diseases and the unencapsulated or nontypeable strains, responsible for inflammation of the respiratory tract. In H. influenzae little is known about the utilization of NAD, therefore this work was aimed to identify and characterize gene products which are involved in the uptake of NAD. The outer membrane protein e(P4), encoded by the gene hel, was described as a component of the hemin uptake system. In this work a hel deletion mutant was constructed to proof that the acid phosphatase e(P4) is not involved in the uptake of hemin but in the uptake of NAD. With the aid of different phosphatase assays and the maleic enzyme assay NADP and NMN could be identified as the physiological relevant substrates. The biological relevance of e(P4) was proofed by mutant analysis in growth tests and transport assays. It was shown that the hel deletion mutant had a significant growth deficiency with NAD and NMN and was not able to take up both nicotinamide nucleotide sources, whereas the utilization of nicotinamide ribosyl (NR) showed no difference compared to the wildtype. To address the question, wether the localization of the lipoprotein e(P4) at the outer membrane is important for the hydrolysis of NMN, two mutants were constructed which had a Cystein-Glycin replacement in the lipid anchor of the hel gene to express the protein in the periplasm. The periplasm extracts of these Cystein mutants showed no activity in phosphatase assays. To investigate wether the phosphatase acitivty of e(P4) is the only relevant function for the uptake of NAD, phosphatase mutants were constructed and characterized. They expressed a mutated e(P4) protein which had lost the phosphatase activity by an amino acid replacement. The phenotypes of the phosphatase mutants correlated exactly with the phenotype of the deletion mutant concerning the ability to cleave NMN, to take up NAD and NMN and to use them as factor V sources. The periplasmic protein NadN was described as a pyrophosphatase which is able to hydrolase NAD to NMN. Further a 5´-nucleotidase function was identified enabling NadN to dephosphorylate NMN to NR. The relevance of NadN for the utilization of NAD was investigated with a nadN knockout mutant. Growth curves and transport assays revealed that the nadN mutant was not able to take up NAD and to use it for growth. The utilization of NMN was reduced, whereas the utilization of NR showed no difference compared to the wildtype. By characterizing a hel nadN double mutant it was shown that no further enzymes than e(P4) and NadN are involved in the processing of NAD to NR and that only NR is taken up into the cytoplasm through a putativ transporter. The protein OmpP2 is the major porin of the outer membrane. Growth curves and transport assays with an ompP2 deletion mutant revealed that NAD, NMN and NR diffuse through this porin into the periplasm.
KW  - Haemophilus influenzae
KW  - NAD
KW  - Haemophilus influenzae
KW  - NAD
KW  - Pyrophosphatase
KW  - 5`-Nukleotidase
KW  - Haemophilus influenzae
KW  - NAD
KW  - pyrophosphatase
KW  - 5`-nucleotidase
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548
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TY  - THES
A1  - Maldeghem, Jeannette ¬von¬
T1  - Charakterisierung und Antibiotika-Resistenzprofil von Shiga Toxin-produzierenden Escherichia coli Isolaten von Patienten und Ausscheidern
T1  - Antimicrobial Resistance of Shiga Toxin-producing Escherichia coli O157 and non-O157 Strains isolated from Patients and Healthy Subjects
N2  - Einhundertvierundvierzig STEC-Stämme von Patienten mit hämolytisch-urämischem Syndrom (68 Stämme), von Durchfallpatienten (42 Stämme) und von asymptomatischen Ausscheidern (44 Stämme) wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Antibiotika-empfindlichkeit hin untersucht. Zu den insgesamt 13 getesteten Antibiotika zählten die ß-Laktam Antibiotika Ampicillin, Piperacillin, Cefotaxim, Ceftazidim, Cefotiam und Imipenem, die Aminoglykoside Gentamicin und Streptomycin, die Gyrasehemmer Ofloxacin und Ciprofloxacin sowie Tetracyclin, Chlorampenicol und die Sulfamethoxazol/Trimethoprim-Kombination Cotrimoxazol. Alle E. coli O157 Stämme, die von Patienten mit HUS isoliert wurden, waren sensibel gegen die getesteten Antibiotika. Lediglich ein E. coli O157 Stamm, der von einem Durchfall-Patienten isoliert wurde, zeigte eine Resistenz gegen Tetracyclin. Allgemein häufiger wurden Antibiotikaresistenzen bei non-O157 Stämmen gefunden. Fünf von 22 non-O157 Stämmen, die von HUS-Patienten isolierten wurden, zeigten mindestens eine Resistenz gegen die getesteten Antibiotika. Vierzehn von fünfunddreißig non-O157 E. coli Stämmen, die sowohl von Durchfall-Patienten als auch von asymptomatischen Ausscheidern stammten, konnten sowohl Einfachresistenzen als auch Multiresistenzen aufweisen. Die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) zeigte, daß alle resistente Stämme einen extrem hohen Resistenzstatus besitzen. Sowohl ß-Laktam als auch Tetracyclin Resistenzen konnten mittels Konjugation auf einen E. coli-Laborstamm übertragen werden. Dies läßt die Anwesenheit von R-Plasmiden vermuten. Die Tatsache, daß über 12 Prozent Shigatoxin produzierender E. coli Stämme aus humanen Stuhlproben Antibiotikaresistenzen aufweisen, hat klinische und epidemiologische Bedeutung. Resistente STEC-Stämme hätten einen selektiven Vorteil gegenüber anderen koliformen Bakterien in Mastbetrieben, die Antibiotika dem Futtermittel beimengen. Hieraus wiederum steigt die Gefahr einer potentiellen Übertragung resistenter Pathogene auf den Menschen. Auf der anderen Seite könnte die ansteigende Anzahl Antibiotika-resistenter Stämme zu einer rasch durchführbaren epidemiologischen Nachweismethode führen.
N2  - The resistance to antibiotics of 144 Shiga Toxin-producing E. coli (STEC) strains isolated from patients with haemolytic-uremic syndrome (HUS) (68 strains), diarrhoea (42 strains) and from healthy subjects (44 strains) was examined using ampicillin, piperacillin, cefotaxime, ceftazidime, gentamicin, tetracycline, trimethoprimsulfamethoxazole, ofloxacin, ciprofloxacin, chloramphenicol, imipenem and streptomycin and resistant strains were characterised. All E. coli O157 isolates from patients with HUS were sensitive to the antibiotics tested. Only one E. coli O157 strain, obtained from patient with diarrhoea, was resistant against tetracycline. However, resistance in non-O157 strans occurred more frequently. 5 of 22 non-O157 strains from HUS-patients were resistant to between one and six of the antibiotics tested. Fourteen of 35 non-O157 strains from patients with diarrhoea and healthy individuals were also resistant against at least one of the antibiotics tested. Determination of minimal inhibitory concentrations (MIC) revealed that all strains expressed highly resistance phenotypes. ß-Lactam and tetracycline resistance phenotypes could be transferred by conjugation to E. coli laboratory strains, suggesting the presence of R-plasmids in STEC. The observation that > 12 per cent of STEC strains in human stool samples are resistant to antibiotics has clinical and epidemiological implications.
KW  - STEC
KW  - Antibiotika
KW  - Resistenzen
KW  - STEC
KW  - Antibiotics
KW  - Resistance
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181990
ER  - 
TY  - THES
A1  - Cho, Seung-Hak
T1  - Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus
T1  - Epidemiological and molecular investigations of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus
N2  - Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht.
N2  - Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly biofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression.
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Staphylococcus epidermis
KW  - Biofilm
KW  - Molekulargenetik
KW  - Staphylokokken
KW  - nosokomiale Infektionen
KW  - Biofilmbildung
KW  - ica-Operon
KW  - Insertionssequenzen
KW  - Phasenvariation
KW  - Regulatorgene
KW  - staphylococci
KW  - nosocomial infections
KW  - biofilm formation
KW  - ica Operon
KW  - insertion sequences
KW  - phase variation
KW  - regulator genes
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181296
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kalk, Andreas
T1  - Die Dezentralisierung im Gesundheitswesen Kolumbiens und Brasiliens und ihre Auswirkungen auf die Leprakontrolle
T1  - The decentralization of the health system in Colombia and Brazil and its impact on leprosy control
N2  - Pläne zur Dezentralsierung sind ein integrierter Bestandteil der Gesundheitssektorreform in einer zunehmenden Anzahl von Ländern. Die Fähigkeit derartiger Reformen, die Qualität und Effizienz des Gesundheitssystem zu verbessern, ist nur durch begrenzte wissenschaftliche Evidenz untermauert. Diese Studie beabsichtigt die Auswirkungen der Dezentralisierung auf ein spezielles Feld der Seuchenkontrolle, die Leprakontrolle, in Kolumbien und Brasilien zu untersuchen. Sie analysiert die zuzuordnende Gesetzgebung, epidemiologische Indikatoren und lokale Publikationen. Zudem wurden 39 semi-strukturierte Interviews mit Schlüsselinformanten durchgeführt. In beiden Ländern stellte die Devolution der technischen Verantwortlichkeit und der finanziellen Ressourcen die implementierte Form der Dezentralisierung dar. Der Zugang zu präventiven und kurativen Diensten wie auch die Einbindung der Bevölkerung in Entscheidungsprozesse verbesserten sich nur in Brasilien eindeutig. Die Dezentralisierung zu privaten Gesundheitsdiensten in Kolumbien hatte zweifelhafte Auswirkungen auf die Qualität der Leistungen und mehr noch auf die öffentliche Gesundheitsvorsorge (Public Health). Der Finanzfluss (einschließlich der Finanzadquisition durch staatliche Steuern statt durch Versicherungsgesellschaften) schien in Brasilien besser kontrolliert zu sein. Leprakontrolle in Brasilien profitierte von der Dezentralisierung, in Kolumbien nahm sie massiven Schaden.
N2  - Decentralization policies are an integrated component of health sector reform in an increasing number of countries. The ability of such policies to improve the health system’s quality and efficiency is backed up by limited scientific evidence. This study intends to evaluate the impact of decentralization on a specialized field of disease control (leprosy control) in Colombia and Brazil. It analyzes the respective juridical base, epidemiological indicators and local publications. Furthermore, 39 semi-structured interviews with key informants were conducted. In both countries, the devolution of technical responsibility and financial resources to the municipalities was the implemented form of decentralization. Access to preventive and curative health care and the community participation in decision-making improved clearly only in Brazil. The decentralization to private providers in Colombia had dubious effects on service quality in general and still more on Public Health. The flow of finances (including finance collection through state-owned taxes instead of insurance companies) seemed to be better controlled in Brazil. Leprosy control in Brazil took advantage of the decentralization process; in Colombia, it came close to a collapse.
KW  - Dezentralisierung
KW  - Lepra
KW  - Gesundheitssektorreform
KW  - Privatisierung
KW  - Seuchenkontrolle
KW  - decentralization
KW  - leprosy
KW  - health sector reform
KW  - privatization
KW  - disease control
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-828
ER  -