TY - THES A1 - Deubner, Ralph T1 - Quantitative NMR-Spektroskopie zur Reinheitsbestimmung von Arzneistoffen T1 - Quantitative NMR spectroscopy for purity determination of active pharmaceutical ingredients N2 - Quantitative Bestimmungen Anhand verschiedener Substanzen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NMR-Spektroskopie in der Lage ist, Verunreinigungen von Arzneistoffen zu quantifizieren. Für das Antidepressivum Fluvoxamin ist im Arzneibuch eine Ionenpaarchroma-tographie vorgeschrieben, um die Verunreinigung des wirksamen E-Isomers durch das Z-Isomer zu quantifizieren. Ionenpaarchromatographischen Methoden mangelt es häufig an der Robustheit. Eine quantitative Auswertung der NMR-Spektren einer Mischung beider Isomere ist ohne aufwändige Probenvorbereitung möglich. In den 1H-NMR-Spektren der Mischung sind die Signale der Was-serstoffe beider Isomere an Position 2 gut voneinander getrennt. Werden diese quantitativ ausgewertet, dann ist es nach Optimierung insbesondere hinsichtlich der T1-Relaxationszeit möglich, den Anteil des Z-Isomers auf 0,2 % zu begrenzen. Auch für die Bestimmung der Abbauprodukte des Perphenazinenantats konnte gezeigt werden, dass die qNMR eine geeignete Methode darstellt. Perphenazine-nantat kann durch Esterhydrolyse gespalten werden. Zur Auswertung der 1H-NMR-Spektren wird der Vergleich der Integralflächen der Signale der Wasserstoffe an Position 21 des Perphenazins mit dem zusammenfallenden Signal der Wasserstoffe an Position 11 beider Substanzen herangezogen. Es konnte sowohl Perphenazin als Abbauprodukt des Esters als auch Perphena-zinenantat in Perphenazin quantifiziert werden. Zusätzlich kann der Bereich der aromatischen Wasserstoffe zu einer Aussage über die Oxidation genutzt werden. Bei der Oxidation des Schwefels im Phenothiazinring zum Sulfoxid und zum Sul-fon ändern sich die chemischen Verschiebungen der Wasserstoffkerne in diesem Ringsystem. Dadurch wird eine halbquantitative Aussage ermöglicht. Schließlich konnten die beiden Epimere Chinin und Chinidin jeweils als Verunrei-nigung des anderen Chinaalkaloides quantifiziert werden. Auch in diesem Fall lie-gen in den 1H-NMR-Spektren in DMSO-d6 von Mischungen dieser beiden Verbin-dungen Signale weit genug auseinander, um eine Quantifizierung zu ermöglichen. In beiden Fällen, der Bestimmung von Chinidin in Chinin und von Chinin in Chini-din konnte dies auf einem Niveau von 2,5% geschehen, was den Anforderungen der Arzneibücher entspricht. Gentamicinsulfat Die 1H-NMR-Spektroskopie wurde ebenfalls zur Charakterisierung der Zusam-mensetzung des Antibiotkums Gentamicin eingesetzt. Gentamicin, das fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen wird, besteht aus verschiedenen Haupt- und Nebenkomponenten, deren Zusammensetzung je nach Fermentationsbedingungen schwankt. Nach einer Reihe von Todesfällen im Zusammenhang mit der Anwendung des Antibiotikums Gentamicin in den USA wurde vermutet, dass diese auf verschiede-ne Verunreinigungen zurückzuführen sind. In der aktuellen Arzneibuch-Monographie wird eine HPLC-Methode beschrieben, die zwar die Hauptkomponenten quantifizieren kann, aber nicht alle Nebenkomponenten gut abtrennt. Auch ist die gesamte Elutionszeit sehr lang, so dass spät eluierende Substanzen breite Peaks zeigen. Außerdem ist der benutzte gepulste amperometrische Detektor sehr empfindlich und die Methode insgesamt daher wenig robust. Unter Zuhilfenahme von ein- und zweidimensionalen Standardmesstechniken sowie selektiver TOCSY-Messungen konnten alle Signale in den 1H- und 13C-NMR-Spektren der Haupt- und Nebenkomponenten von Gentamicin vollständig zugeordnet werden. Dabei zeigte sich, dass der Bereich der anomeren Wasserstoffe sehr gut geeignet ist, Aussagen über die Reinheit und über das Verhältnis der Hauptkomponenten zueinander treffen zu können. In dem in der Abbildung gezeigten Ausschnitt aus einem 400 MHz-1H-NMR-Spektrum ist eine Integration der H20-Signale der Hauptkomponenten aufgrund mangelnder Trennung nicht möglich. Diese ist jedoch in 600 MHz-Spektren möglich. Auf diese Weise können die Verhältnisse der Hauptkomponenten zueinander bestimmt werden. Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den aus einer MEKC-Trennung erhaltenen Daten. Das zeigt die sehr gute Ergänzung dieser beiden Methoden. Insgesamt wurden für diese Arbeit über 40 Gentamicin-Proben verschiedener Hersteller untersucht, miteinander verglichen und in verschiedene Gruppen einge-teilt. Als Leitverunreinigung hat sich dabei Sisomicin erwiesen. Daneben konnte der Vergleich der Verunreinigungsprofile Hinweise auf Handelswege geben. Unter den untersuchten Proben waren auch diejenigen, zu den Todesfällen führten. Die-se konnten den stark verunreinigten Gruppen zugeordnet werden. N2 - Quantitative analysis It could be shown on the basis of different substances that the NMR spectroscopy is able to quantify impurities of pharmaceuticals. For the quantification of impurities of the antidepressive drug fluvoxamine the pharmacopoeia describes an ion-pair chromatographic method. Since the antide-pressive activity resides on the E-isomer the content of the Z-isomer has to be lim-ited. Since ion-pair chromatography often lacks of robustness, qNMR is an alterna-tive. The quantitative evaluation of 1H NMR spectra of a mixture of the two isomers is possible without extensive sample preparation. The signals of the hydrogens at position 2 of both isomers are well separated in the spectrum. If these are quantitative evaluated, under optimized conditions, e.g. with respect to T1-relaxation time, it is possible to limit the content of the Z-isomer to 0.2%. For analysis of degradation products of perphenazine enantate qNMR is a suitable method. Perphenazine enantate can be cleaved by ester hydrolysis. Using the integral area of the signal of the hydrogens at position 21 of per-phenazine in comparison to the integral area of the overlapping signals of the hydrogens at position 11 of both substances perphenazine and perphenazine enan-tate it was possible to quantify perphenazine as a degradation product of per-phenazine as well perphenazine enantate in perphenazine. Additionally the area of the aromatic hydrogens can be used for the analysis of the oxidation. The oxidation of the sulfur of the the phenothiazine-moiety to the sulfoxide and the sulfone changes the chemical shifts of the corresponding hydrogens. This enables a half-quantitative assessment. Finally it was possible to quantify the two epimers quinine and quinidine as an impurity in either drug. Again signals of both substances could be identified to be used for quantification. In both cases quinine as impurity of quinidine and vice versa the impurity can be limited to 2.5 per cent as required by the pharmacopeias. Gentamicin sulfate 1H-NMR spectroscopy was also used as an analytical method to characterize the composition of gentamicin. Gentamicin is produced from Micromonospora purpurea by fermentation and consists of different main and side components. The composition varies when applying different fermentation conditions. A number of deaths in connection with the application of the antibiotic drug gen-tamicin in the USA were reported. Different impurities were suspected to be re-sponsible for these deaths. In the current pharmacopoeia monograph an HPLC method is described which is able to quantify all main components but does not separate all side components. In addition, the total elution time is long. Thus late eluting substances show very broad peaks. Furthermore the used pulsed am-perometric detector is very sensitive and the method is not very robust over all. Using one- and two-dimensional routine NMR techniques and selective TOCSY experiments it was possible to assign all signals in the 1H- and 13C-NMR spectra of all main and side components. The area of the anomeric hydrogens is appropriate to evaluate the purity of gentamicin and the proportions between the main compo-nents. In the part of the 400 MHz 1H-NMR spectrum integration of the H20 signals of the main components is impossible due to the missing baseline separation. However, using 600 MHz spectra integration is possible. In this way the proportions between the main components can be determined. The results achieved in this way show good accordance to the results obtained with an MEKC separation. More than 40 gentamicin samples from different manufactures were studied, com-pared and divided into several groups, based on their impurity profile. As a lead impurity sisimocin has been identified. Besides that, the comparison of the impurity profiles enables to trace the trade ways. Some of the samples which led to the deaths were among the samples being classified in the impure groups. KW - Arzneimittel KW - Qualitätskontrolle KW - NMR-Spektroskopie KW - Quantitative Analyse KW - NMR-Spektroskopie KW - quantitativ KW - Verunreinigungen KW - Arzneistoffe KW - NMR-spectroscopy KW - quantitative KW - impurities KW - active pharmaceutical ingredients Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8364 ER - TY - THES A1 - Eber, Marcus T1 - Wirksamkeit und Leistungsfähigkeit von nanoskaligen Fließregulierungsmitteln T1 - Effectiveness and efficiency of nanoscale glidants N2 - Zusammenfassend stellen sich die hydrophoben Nanomaterialien als die optimalen Fließregulierungsmittel dar (Ausnahme: Printex® G). Die Agglomerate des hochpotenten hydrophoben Ruß-Derivats Printex® 95 liegen von Herstellerseite bereits in genügend zerkleinerter Form vor, so daß keine weitere Zerkleinerung während des Mischvorganges erforderlich ist. Infolgedessen adsorbiert es mit höchster Geschwindigkeit an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und übernimmt dort die Funktion von Oberflächenrauhigkeiten. In der Folge der werden die interpartikulären Haftkräfte sehr schnell minimiert. Im Gegensatz zu den hydrophilen Nanomaterialien zeigt Printex® 95 keinen ausgeprägten Wiederanstieg der Zugspannungen selbst nach sehr langen Mischzeiten von 4320 Minuten. Durch die Verwendung des hydrophoben Ruß-Derivates Printex® 95 werden Pulvermischungen erhalten, die zudem weitestgehend unempfindlich sind gegenüber Kapillarkräften bei erhöhten Umgebungsfeuchten. Das hydrophobe Printex® 95 vereint damit praktisch alle gewünschten Eigenschaften eines optimalen Fließregulierungsmittels und es kann als Modellsubstanz für die Entwicklung noch potenterer Nanomaterialien dienen. Bisher stand das nicht abschließend beurteilte cancerogene Potential dieses Stoffes einer breiten Anwendung entgegen. N2 - Summing up it can be said that hydrophobic nanomaterials are highly potent glidants (with exception of Printex® G). The agglomerates of the top-rated hydrophobic Printex® 95 are already small enough because of the manufacturing process, so that they do not have to be broken up during the mixing process. As a consequence, Printex® 95 is adsorbed most quickly on the surface of corn starch to fulfill the function of surface asperities. Because of this increasing surface roughness the interparticle forces are rapidly diminished. In contrast to all the hydrophilic nanomaterials, Printex® 95 does not show a pronounced re-increase in tensile strength even after a blending time of 4320 minutes. Moreover the binary powder mixtures with Printex® 95 are very robust against capillary forces at higher moisture levels. Altogether, it can combine all the requested demands for a top-rated glidant and may also serve as a model nanomaterial in order to develop further glidants. So far it could not be applied broadly since its cancerigenous potential has not been finally evaluated. KW - Nanostrukturiertes Material KW - Hydrophobe Wechselwirkung KW - Fließverhalten KW - Schüttgut KW - AFM KW - Fließfähigkeit KW - intermolekulare Kräfte KW - Nanopartikel KW - SPM KW - flowability KW - intermolecular forces KW - nanoparticles Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9026 ER - TY - THES A1 - Eckstein, Susanne T1 - Stimulation humaner V-Gamma-9-V-Delta-2-T-Lymphozyten : Untersuchungen zur Wirkung Stickstoff-haltiger Bisphosphonate und zu bakteriellen Phosphoantigenen T1 - Stimulation of human Vgamma9 Vdelta2 T Lymphocytes: Effects of Nitrogen Containing Bisphosphonates and Phosphoantigens N2 - In der vorliegenden Arbeit werden Studien zu verschiedenen Aspekten der Stimulation von humanen Vg9Vd2-T-Lymphozyten vorgestellt. Ein Schwerpunkt war die Charakterisierung der Erkennung von Bisphosphonaten durch Vg9Vd2-T-Zellen. Weder die Alkylmonophosphonate Ethyl- und Propylphosphonat noch 3-Aminopropylphosphonat bewirkten eine Stimulation von Vg9Vd2 T-Lymphozyten. Anscheinend ist also für die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität von Aminobisphosphonaten das Vorhandensein sowohl der Methylenbisphosphonat-Gruppe als auch des Amino-Stickstoffs entscheidend. Es wurden verschiedene Pamidronat-Derivate untersucht, die sich durch Substituenten am Stickstoffatom unterscheiden. Die meisten dieser Verbindungen konnten Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren, die Art der Substituenten hatte aber großen Einfluss darauf, welche Konzentration des jeweiligen Bisphosphonats für eine gd-T-Zell-Antwort nötig war. Besonders negativ auf die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität wirkte sich aus, wenn das Stickstoffatom Teil einer Säureamidbindung war. Das lässt darauf schließen, dass die Gegenwart einer positiven Ladung (durch Protonierung des Stickstoffatoms) von Bedeutung für die Bioaktivität dieser Verbindungen ist. Beim Vergleich verschiedener Bisphosphonate mit stickstoffenthaltenden Heteroaromaten (Fünfringe mit ein bis drei Stickstoffatomen) zeigte sich, dass sowohl die Position des basischen Stickstoffatoms im Ring als auch Art und Position von Ringsubstituenten Einfluss auf deren gd-T-Zell-stimulierende Aktivität haben. Es ergaben sich Hinweise, dass sich eine gesteigerte Neigung eine positive Ladung in der Seitenkette zu tragen bei diesen Verbindungen genau wie bei Aminobisphosphonaten günstig auf das gd-T-Zell-aktivierende Potential auswirkt. Durch Behandlung mit Zoledronat wurde die monozytäre Zelllinie THP-1 stimulierend für Vg9Vd2-T-Zellen. Auch weitere Zelllinien und Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) konnten nach Vorinkubation mit Zoledronat Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren. Dabei genügten bei den PBL deutlich geringere Zoledronat-Konzentrationen um einen Effekt zu erzielen als bei den untersuchten Zelllinien. Für die indirekte Stimulation von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat mittels THP-1 Zellen oder PBL war Zell-Zell-Kontakt zwischen den präsentierenden Zellen und den gd-T-Zellen Voraussetzung. Die Anwesenheit von alkalischer Phosphatase hatte keine Auswirkungen auf die gd-T-Zell-Aktivierung durch Zoledronat. Dies spricht dafür, dass Vg9Vd2-T-Zellen Oberflächenstrukturen auf anderen Zellen erkennen und dass freie Phosphoantigene bei der gd-T-Zell-Stimulierung durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate keine Rolle spielen. Wurde die Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat in Gegenwart von Saponin, einem Detergenz das die Durchlässigkeit der Zellmembran reversibel erhöht, durchgeführt, reichten deutlich niedrigere Konzentrationen des Bisphosphonats aus, um die THP-1 Zellen stimulierend für gd-T-Lymphozyten zu machen. Das ist ein Hinweis darauf, dass für die Aktivierung von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat intrazelluläre Vorgänge in den „antigenpräsentierenden“ Zellen verantwortlich sein könnten. Beim Vergleich verschiedener N-BPs hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber gd-T-Zellen und ihrer antiresorptiven Potenz ergab sich eine erstaunlich gute Korrelation. Dies könnte darauf hinweisen, dass beide Effekte durch den gleichen Mechanismus – die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase – zustande kommen. Die Gegenwart von Farnesol oder Geranylgeraniol während der Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat verringerte deren gd-T-Zell-stimulierendes Potential nicht, so dass vielleicht nicht die Verarmung an längerkettigen Isoprenoiden sondern die Anreicherung von Vorläufern zu Veränderungen in den Zellen führt, die diese schließlich erkennbar für Vg9Vd2-T-Zellen machen. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit einige Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen durchgeführt. Mittels einer selektiven HPLC-MS/MS-Methode gelang uns in einer E. coli-Probe der Nachweis eines Vg9Vd2-T-Zell-stimulierenden Pyrophosphats mit der molekularen Masse von 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat, einem Phosphoantigen das in Mykobakterien gefunden worden war (Belmant und Mitarbeiter, 1999). Eine weitere Strukturaufklärung war aufgrund der äußerst geringen Konzentration des Phosphoantigens nicht möglich. 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP) ist ein Zwischenprodukt des 2-C-Methylerythritol-4-phosphat- (MEP) Wegs der Isoprenoidbiosynthese. Es wird in manchen Bakterien – z. B. Corynebacterium ammoniagenes – bei oxidativem Stress verursacht durch Benzylviologen (BV) akkumuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Extrakte aus C. ammoniagenes, die in Gegenwart von BV kultiviert wurden, in einem höherem Maße Vg9Vd2-T-Zellen stimulieren als Proben von Bakterien, die ohne BV-Zusatz wuchsen; MEcPP wirkte selbst nicht als Phosphoantigen. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass bakterielle Phosphoantigene mit dem MEP-Weg assoziiert sind. N2 - The present work focuses on different aspects of human Vg9Vd2 T lymphocyte stimulation. A main focus of this work was the characterisation of bisphosphonate recognition by Vg9Vd2 T cells. Neither the alkyl monophosphonates ethyl and propyl phosphonate nor 3-aminopropylphosphonate were able to stimulate Vg9Vd2 T lymphocytes. Apparently both the methylene bisphosphonate group and the amino group are crucial for the Vg9Vd2 T cell stimulating ability of aminobisphosphonates. We examined pamidronate derivates bearing different substituents at the nitrogen atom. Most of these compounds activated Vg9Vd2 T cells. But the nature of the substituent greatly influenced the bisphosphonate concentration necessary for gd T cell stimulation. When the nitrogen was part of an amide bond, there was a pronounced negative effect on the Vg9Vd2 T cell stimulating capacity. It can be concluded that the bioactivity of bisphosphonates depends on the presence of a positive charge (through protonation of the nitrogen atom). Comparing different bisphosphonates with nitrogen containing heteroaromatic side chains (five membered rings containing one to three nitrogen atoms) we found that the position of the basic nitrogen in the ring as well as the nature and position of ring substituents influenced their gd T cell stimulating activity. There was evidence that a higher tendency towards a positive charge in the side chain had a positive effect on the Vg9Vd2 T cell activating potential of these compounds, as we also found for aminobisphosphonates. Zoledronat pulsed cells of the monocytic cell line THP-1 stimulated Vg9Vd2 T cells. Other cell lines and peripheral blood lymphocytes (PBL) also activated Vg9Vd2 T cells after incubation with zoledronate. There was a distinctly lower concentration of zoledronate needed for PBL to become stimulatory as for the analyzed cell lines. Cell-cell-contact between the presenting cells and the Vg9Vd2 T cells was necessary for the indirect stimulation by zoledronate pulsed THP-1 cells or PBL. Alkaline phosphatase did not abolish the gd T cell activation by zoledronate. That points to the possibility that Vg9Vd2 T cells recognize surface structures on other cells and that free phosphoantigens are not involved in gd T cell stimulation by nitrogen containing bisphosphonates. When THP-1 cells were incubated with zoledronic acid in the presence of saponin, a detergent that reversibly enhances the permeability of the cell membrane, the bisphosphonate concentration needed for rendering THP-1 cells gd T cell stimulating was clearly reduced. That indicated that intracellular events caused by zoledronate (and other nitrogen containing bisphosphonates) in the “antigen presenting cells” could result in their stimulating activity. Comparing the gd T cell stimulating activity of various N-BPs with their antiresorptive potency produced an amazingly good correlation. This could indicate that both effects are based on the same mechanism – the inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase. The presence of farnesol or geranylgeraniol during the incubation of THP-1 cells with zoledronate did not diminish their gd T cell stimulating potential. So maybe not the depletion of longer chain isoprenoids but the accumulation of precursors results in changes that finally render the cells recognisable by Vg9Vd2 T lymphocytes. Within the scope of this work we also conducted experiments concerning bacterial phosphoantigens. Using a selective HPLC-MS/MS method we detected in Escherichia coli a Vg9Vd2 T cell stimulating pyrophosphate with the molecular mass of 3-Formyl-1-butyl pyrophosphate, a phopsphoantigen found in mycobacteria (Belmant et al., 1999). Due to the exceedingly low concentration of the phosphoantigen no further structure determination was possible. 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) is an intermediate of the 2-C-Methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway of isoprenoid biosyntheses. In some bacteria like Corynebacterium ammoniagenes this compound is accumulated under conditions of oxidative stress caused by benzyl viologen (BV). We showed that C. ammoniagenes extracts from bacteria cultivated in the presence of BV had a higher Vg9Vd2 T cell stimulating capacity than from bacteria growing without addition of BV. MEcPP itself was not a phosphoantigen. That was further evidence for the association of bacterial phosphoantigens with the MEP-pathway. KW - T-Lymphozyt KW - Diphosphonate KW - Antigen KW - gamma delta KW - T-Zellen KW - T-Lymphozyten KW - Bisphosphonate KW - Phosphoantigene KW - gamma delta KW - T cells KW - T lymphocytes KW - bisphosphonates KW - phosphoantigens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12140 ER - TY - THES A1 - Heckel, Frank T1 - Biokatalytische enantioselektive Sulfoxidation T1 - Biocatalytic enantioselective sulfoxidation N2 - Das Ziel dieser Arbeit war die Anwendung intakter Mikroorganismen auf organische Sulfide zur asymmetrischen Synthese von optisch aktiven Sulfoxiden. Die im Vergleich zu den aufwendigen und teueren Reaktionen mit isolierten Enzymen besonders effizienten Rahmenbedingungen bei sogenannten `whole-cell´-Umsetzungen stellten den Grund für die Bemühungen in dem stetig an Bedeutung gewinnenden Arbeitsfeld der Bioorganischen Chemie dar. Die wesentlichen Ergebnisse dieser Studien sind im Folgenden zusammengefasst: 1. Die Mikroorganismen wurden isoliert, singularisiert und kultiviert. Eine Bodenprobe diente als Quelle für eine Vielzahl an Bakterien, Hefen und Pilzen, die mit dem Standardsubstrat Thioanisol auf ihre Fähigkeit zur enantioselektiven Sulfoxidation überprüft wurden. 2. Insgesamt sind sechs Keime nach standardisierten Methoden genotypisch charakterisiert und den entsprechenden Spezies zugeordnet worden. Die beiden Bakterienstämme mit den bei der Sulfoxidation höchsten Enantiomeren-überschüssen (ee-Werten), nämlich Arthrobacter aurescens (bildete das S-Enantiomer) und Pseudomonas frederiksbergensis (lieferte das R-Enantiomer), wurden für nachfolgende Biosynthesen verwendet. Pseudomonas frederiksbergensis war der einzige Stamm, der das R-Enantiomer im Überschuss produzierte. 3. Durch direkte Vergleiche der Biosyntheseleistung der isolierten Bakterien mit kommerziell erhältlichen Referenzstämmen wurde im Fall von Pseudomonas frederiksbergensis gezeigt, dass sich Bodenisolat und zugeordneter Referenz-stamm gegensätzlich enantioselektiv verhalten. Weitere Charakterisierungs-sonden (Farb- und Assimilationsreaktionen, Oberflächenfettsäureverteilung, „Siderophore-Typing“ und direkter rRNA Vergleich) sicherten die Zugehörigkeit beider Bakterienstämme als Pseudomonas frederiksbergensis-Spezies; keinerlei Unterschiede wurden zwischen den beiden Stämmen festgestellt. Zum ersten Mal werden somit zwei natürliche, nicht genetisch manipulierte Stämme von Pseudomonas frederiksbergensis beschrieben, deren Enzymaktivität eine entgegengesetzte Enantioselektivität in der mikrobiellen `whole-cell´ asym-metrischen Sulfoxidation aufweist. 4. In einem umfangreichen Substratscreening sind strukturvariierte organische Sulfide als Substrate zur bakteriellen Sulfoxidation eingesetzt worden. Anhand der ee-Werte wurde der Einfluss der Sulfidstruktur auf den Reaktionsverlauf bestimmt. Generell erwiesen sich Arylalkylsulfide als optimale Substrate für die bakterielle Sulfoxidation mit den isolierten und kommerziell erworbenen Stämmen von Arthrobacter aurescens und Pseuodomonas frederiksbergensis; aliphatische Sulfide wurden zur biokatalytischen Umsetzung nicht akzeptiert. 4a. Elektronenreiche para-Substituenten am Arylsystem ergaben teilweise enantio-merenreine Sulfoxide. 4b. Eine zunehmende Anzahl an Stickstoffatomen im Arylring (N-heterozyklische Grundstruktur) führte zu einer dramatischen Verringerung des ee-Wertes. 4c. Schwefelhaltige Furfuryle und Thiophene wurden nicht als Substrate für die enantioselektive Sulfoxidation akzeptiert. 4d. Der Einsatz schwefelhaltiger Pestizide in der Biokatalyse verlief erfolglos, allerdings wurden die Organophosphorpestizide Fenamiphos® und Fenthion® mit dem aus Sulfoxidationsreaktionen lange bekannten Enzym Chlorperoxidase (CPO) enantiomerenangereichert umgesetzt. 4e. Die biotechnologisch wichtige Anwendung der asymmetrischen Sulfoxidation in der Arzneistoffsynthese -hier versucht mit den Wirkstoffen Omeprazol® und Modafinil®- schlug fehl. 5. Der Einsatz eines Bioreaktors (Fermenter) schuf die Grundlage für künftige asymmetrrische Sulfoxidationen in präparativem Maßstab. Eine Zellzahlstudie mit Pseudomonas frederiksbergensis wurde durchgeführt; ferner erfolgten Bestimmungen der optimalen Fermentationsparameter am Beispiel einfach strukturierter, organischer Sulfide inklusive Blindwerts- und Hemmversuchen. Die toxischen Einflüsse auf die bakteriellen `whole-cell´-Systeme, die vom eingesetzten Sulfid sowohl als auch vom produzierten Sulfoxid verursacht werden, bedürfen besonderer Beachtung bei einer weiteren Bearbeitung dieses Themas. Das vorgestellte, neue Phänomen der asymmetrischen Sulfoxidation mit entgegenge-setzter Enantioselektivität durch zwei geno- und phänotypisch identische Spezies von Pseudomonas frederiksbergensis rechtfertigt eine weitere, intensive Suche nach derartigen, natürlichen Mikroorganismen. N2 - The goal of this study was to employ intact microorganisms for the asymmetric synthesis of optically active sulfoxides from organic sulfides. Especially the efficient and convenient conditions of the so-called `whole-cell´ transformations, compared to the elaborate and costly reactions with isolated enzymes, provided the incentives and impetus for the present efforts in the steadily growing and future-oriented field of bioorganic chemistry. The highlights of these studies are enumerated briefly below: 1. The microorganisms were isolated, singularized and cultivated. A soil sample served as source for the manifold bacteria, yeasts and fungi, which were tested for their efficacy of enantioselectively sulfoxidizing phenyl methyl sulfide as the standard model substrate. 2. A total of six microorganisms were genotypically characterized by standard methods and assigned to the corresponding species. The two bacterial strains with the highest enantiomeric excess (ee value) in the sulfoxidation, namely Arthrobacter aurescens (which forms the S enantiomer) and Pseudomonas frederiksbergensis (which forms the R enantiomer), were used for the prospective biosynthetic experiments. Pseudomonas frederiksbergensis was the only strain which produced preferentially the R enantiomer. 3. Direct comparison of the biosynthetic performance of the isolated bacteria with commercially available reference strains revealed that Pseudomonas frederiksbergensis (the isolated soil strain) displayed an opposing sense in the enantioselectivity than the reference strain. Further characterization tests (color and assimilation reactions, surface fatty acid spectra, siderophore typing and direct rRNA comparison) secured that both bacterial strains belong to the Pseudomonas frederiksbergensis species, since no differences whatsoever were found between both strains. Thus, for the first time two natural, genetically not manipulated strains of Pseudomonas frederiksbergensis are reported, which possess an opposing sense in the enantioselectivity for the microbial `whole-cell´ asymmetric sulfoxidation. 4. In an extensive substrate screening, a variety of organic sulfide structures was submitted to the bacterial asymmetric sulfoxidation. On the basis of the ee values, the influence of the sulfide structure on the course of the reaction was assessed. Generally speaking, the aryl alkyl sulfides proved to be optimal substrates for the bacterial sulfoxidation by the isolated and commercially available strains of Arthrobacter aurescens and Pseudomonas frederiksber-gensis; aliphatic sulfides were not accepted in biocatalytic enantioselective conversions. Specifically, the following trends obtain: 4a. Electron-rich para substituents on the aryl system afforded enantiomerically pure sulfoxides. 4b. An increasing number of nitrogen atoms in the aryl ring (N-heterocyclic structure) led to a dramatic decrease of the ee values. 4c. Sulfur-containing furfurals and thiophenes were not accepted in the present enantioselective sulfoxidation. 4d. The use of sulfur-containing pesticides as substrates in the biocatalysis failed, but the phosphor-containing organic pesticides Fenamiphos® and Fenthion® were converted to the respective enantiomerically enriched sulfoxides by chloroperoxidase (CPO), an enzyme known to catalyze asymmetric sulfoxidation. 4e. The application of the biotechnologically important asymmetric sulfoxidation in drug synthesis -in particular the pharmaceutical agents Omeprazol® and Modafinil®- failed. 5. The use of a fermenter established the basis for future asymmetric sulfoxidations on a preparative scale. A cell-count study with Pseudomonas frederiksbergensis was conducted and the fermentation parameters were optimized with simple organic sulfides by employing blanks and inhibition tests. The toxicity of the sulfide substrate and the sulfoxide product on the bacterial `whole-cell´ systems demands particular attention in future work. The new phenomenon of asymmetric sulfoxidation by the two genotypically and phenotypically identical species of Pseudomonas frederiksbergensis displays an opposing sense in the enantioselectivity, which encourages to search intensively for other such natural microorganisms. KW - Organische Sulfide KW - Sulfoxidation KW - Biokatalyse KW - Enantioselektivität KW - Sulfoxidation KW - Pseudomonas frederiksbergensis KW - Biokatalyse KW - Enantiodifferenzierung KW - sulfoxidation KW - Pseudomonas frederiksbergensis KW - biocatalysis KW - enantiodifferentiation Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12415 ER - TY - THES A1 - Heinze, Andreas T1 - Bestimmung des Ausmaßes der Proteinbindung von Arzneistoffen mittels automatisierter kontinuierlicher Ultrafiltration T1 - Determination of the extent of the protein binding of drugs by means of automated continuous ultrafiltration N2 - Das Ausmaß der Proteinbindung eines Arzneistoffs hat Auswirkungen auf eine Vielzahl pharmakokinetischer Parameter wie z.B. das Verteilungsvolumen, die Metabolisierung oder Ausscheidung. Da nur der freie, ungebundene Anteil eines Arzneistoffs durch bio-logische Membranen diffundieren kann, ist dieser direkt für die pharmakologische Wirkung verantwortlich. Lediglich diese ungebundenen und damit frei beweglichen Arzneistoffmoleküle sind also in der Lage, an Rezeptoren zu binden und damit einen Effekt auszulösen. Je größer der ungebundene Anteil eines Arzneistoffs ist, desto größer kann auch der Effekt sein, den er zu bewirken vermag. Wird nun diese freie Konzentration verändert, so kann sich demzufolge die Wirkintensität des Arzneistoffs verändern. Daraus folgt, dass die Kenntnis über die Proteinbindung speziell für die Dosisfindung eines Arzneistoffs unerlässlich ist. Diese Zusammenhänge veranschaulichen, welche Bedeutung das Ausmaß der Proteinbindung eines Arzneistoffs hat. Für die Bestimmung der Proteinbindung existiert eine Vielzahl von Methoden. Neben der klassischen Gleichgewichtsdialyse werden vor allem Ultrafiltrationstechniken angewendet. Neuere Verfahren stellen verschiedenste kapillarelektrophoretische Methoden dar. Allen Verfahren ist gemein, dass es sich um In-vitro-Methoden handelt. Als einzige In-vivo-Methode hat sich die Mikrodialyse etabliert. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Bestimmungsmethode für das Ausmaß der Proteinbindungen stellt eine kontinuierliche Variante der Ultrafiltration dar. Mit Hilfe des in dieser Arbeit beschriebenen Verfahrens ist es im möglich, mit einem einzigen Experiment Proteinbindungen über einen großen Bereich verschiedener Arzneistoff-Protein-Verhältnisse zu berechnen. Dadurch wird die Bestimmung schneller und auch kostengünstiger. Zusätzlich wurde dieses Verfahren teilweise automatisiert, d.h. die Versuche werden programmgesteuert durchgeführt und ein manuelles Eingreifen ist nur noch an wenigen Stellen eines Versuches notwendig. Die Messanlage zur kontinuierlichen Ultrafiltration wurde nach dem Vorbild der Anlage von Oehlmann aufgebaut und im Zuge dessen fortentwickelt. Herzstück ist die Messzelle aus Plexiglas. Sie besteht aus einem Ober- und einem Unterteil. In diesem befindet sich eine Vertiefung für die Rührscheibe. Beim Zusammenbau werden zwischen die beiden Teile die Filterunterstützung und eine Ultrafiltrationsmembran gelegt. Die Ultrafiltrationsmembran hält hierbei aufgrund ihrer Trenngrenze die Proteinmoleküle in der Messzelle zurück und lässt nur freie Arzneistoffmoleküle durch. Ein Dichtungsring sorgt dafür, dass die Zelle, nachdem sie in einem Gestell fixiert wurde, nach außen hin dicht abschließt. Während eines Versuches werden abwechselnd Arzneistofflösung und reine Pufferlösung durch die Messzelle gepumpt. Am Auslass der Ultrafiltrationszelle wird die Absorption gemessen, die zu Absorptions-Zeit-Diagrammen führen. Wird nun der gleiche Versuch durchgeführt, nachdem eine Proteinlösung in die Messzelle injiziert wurde, verschiebt sich diese Kurve aufgrund der Wechselwirkung zwischen Arzneistoff und Proteinlösung nach rechts. Die Fläche zwischen diesen beiden Kurven kann als Maß für die Proteinbindung herangezogen werden. Für die Auswertung der Versuche wird aus den Messdaten errechnet, wie viel Arzneistoff sich zu jedem Zeitpunkt des Versuchs in der Messzelle befunden hat und wie viel ungebunden vorlag und damit am Detektor messbar ist. Da die Konzentration an Arzneistoff in der Messzelle im Laufe eines Versuches kontinuierlich gesteigert wird, erhält man Bindungsdaten über einen weiten Bereich von Arzneistoff-Protein-Verhältnissen. In dieser Arbeit wurden sowohl Versuche mit Rinderserumalbumin (BSA) als auch mit humanem Serumalbumin (HSA) durchgeführt. Die Standardabweichungen der bestimmten Proteinbindungswerte steigen mit fallender Proteinbindung. Damit sind sie nach außen hin neutral und ihre Löslichkeit sinkt. Wie die Ergebnisse zeigen, konnte dennoch das Ausmaß der Proteinbindung für eine Reihe von Fluorochinolonen bestimmt werden. Zusätzlich wurden mit dem Oxazolidinon Linezolid und dem Ketolid Telithromycin weitere Antibiotika vermessen. Die Proteinbindungen aller untersuchten Arzneistoffe gegenüber HSA stimmen mit Daten aus der Literatur überein. Wie bereits erwähnt lassen sich hierbei kleine Abweichungen sowohl mit unterschiedlichen Bestimmungsmethoden als auch mit verschiedenen eingesetzten Proteinen erklären. Die Literaturdaten geben meist die Plasmaproteinbindung eines Arzneistoffes wider und die Messungen in der vorliegenden Arbeit wurden allesamt mit Albumin, sei es vom Mensch oder Rind, durchgeführt. Da jedoch neben dem Albumin auch noch weitere Bestandteile des Plasmas mit den Arzneistoffmolekülen wechselwirken können, sind unterschiedliche Proteinbindungen zu erwarten. N2 - The extent of the protein binding of drugs influences many pharmacokinetic parameters such as the volume of distribution, the metabolism or excretion of a drug. Only the free and unbound fraction of a drug is capable to penetrate biological membranes and as a result, only this fraction is responsible for the pharmacological effect. Just these unbound and therefore mobile drug molecules are able to bind to receptors and cause a certain effect. The larger the free fraction of a drug, the stronger the effect which can be expected. Changes of the concentration of the free drug likely affect the intensity of the pharmacological response. Therefore, the knowledge about the extent of the protein binding is especially important for the finding of the dosage of a drug. All these points demonstrate the importance of the extent of the protein binding for a drug. There are many methods available for the determination of the extent of the protein binding. Besides the classical method of equilibrium dialysis, mainly ultrafiltration techniques are used. Among the new methods are various capillary electrophoretic methods. All methods have in common that they represent in-vitro methods. Only microdialysis has been established as an in-vivo method. Comparing binding data achieved by different methods is difficult because these data often vary a lot. The aim is to develop a method which measures under almost physiological conditions and which allows a fast and easy determination of the protein binding of a drug so that many experiments being carried out with a similar method can be compared. The method for the determination of the extent of the protein binding of drugs developed in this work utilizes continuous ultrafiltration. Using the method described in this work, with one single experiment protein binding data can be calculated over a wide range of drug-protein ratios. Therefore, the determination is faster and even cheaper. Additionally, this method was automated which means that experiments are mostly done by computer and a manual intervention is only necessary at a few points. The measuring system for continuous ultrafiltration is build up according to Oehlmann and was further developed. The heart of the system is the ultrafiltration cell made of acrylic glass. It consists of two parts, a bottom and a top part. The bottom part has a dent for the stirrer. In assembled state, a filter support and an ultrafiltration membrane is put between the two parts. The ultrafiltration membrane keeps the protein molecules inside the ultrafiltration cell due to its molecular weight cut-off. Only unbound drug molecules can pass the membrane. A gasket seals the cell when it is fixed tightly in a frame. During the steps of an experiment, a drug-buffer solution and a pure buffer solution are pumped alternatively through the cell. The absorbance is measured at the outlet side and absorbance-time curves are obtained. Repeating this experiment after injection of protein solution into the cell, gives a curve which is moved to the right due to the interaction between drug and protein. The area between both curves represents the degree of the extent of the protein binding. For evaluation of the data, the amount of drug in the cell and the amount of the detected unbound drug at every single time point is calculated. Since the concentration of the drug in the ultrafiltration cell is continuously increased throughout the experiment, binding data over a wide range of drug/protein ratios are calculated. During this work, measurements using bovine and human serum albumin were performed. Zlotos et al.42 and Oehlmann95 already showed that the determination of drugs with a high extent of the protein binding was easier than the determination of drugs with lower extents of protein binding. The standard deviations of the data increase with decreasing protein binding. Furthermore, the solubility of the drugs should be high enough. The difficulties in the experiments with some fluoroquinolones occur because they are zwitterionic under physiological conditions, thus they are neutral and their solubility is low. However, as the data shows, the extent of the protein binding of some fluoroquinolones could be determined. Additionally, more antibiotics including the new oxazolidinone linezolid and the macrolide telithromycin were determined. The protein binding of all examined drugs measured with HSA was in accordance to literature data. As described earlier, slight differences in the results may result from different methods or different proteins. In literature, mostly the binding towards human plasma is given and the experiments in this work were performed with human or bovine albumin. Apart from albumin, also other molecules of the plasma can interact with drug molecules and can therefore contribute to the whole binding constant. Therefore, different data could be easily expected. KW - Proteinbindung KW - Ultrafiltration KW - Chinolone KW - Antibiotika KW - protein binding KW - ultrafiltration KW - quinolones KW - antibiotics Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11277 ER - TY - THES A1 - Käppler, Ulrich T1 - Synthese und Testung nichtpeptidischer Cystein-Protease-Inhibitoren - Etacrynsäure als Leitstruktur T1 - Synthesis and evaluation of non-peptidic cysteine protease inhibitors - etacrynic acid as lead compound N2 - Cystein-Proteasen sind in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischen Prozesse involviert. Auch bei humanpathogenen Parasiten sind sie weit verbreitet und für das Überleben der Erreger essentiell. Substanzen, die diese Proteasen hemmen, könnten daher bei vielen Indikationen als neue Arzneistoffe eingesetzt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden nichtpeptidische Cystein-Proteaseinhibitoren synthetisiert, die als elektrophile Gruppe ein a,b-ungesättigtes Keton enthalten, und den Cysteinrest im aktiven Zentrum der Proteasen in einer Michael-Reaktion addieren. Als Leitstruktur diente das Diuretikum Etacrynsäure, dessen Struktur an verschiedenen Positionen modifiziert wurde. Der Hauptsyntheseweg kann wie folgt beschrieben werden: Die Acylseitenkette gewünschter Kettenlänge wurde durch Friedel-Crafts-Acylierung in entsprechend substituierte Anisole eingeführt. Diese wurden in einer unmittelbar anschließenden Reaktion zu acylierten Phenolen gespalten, die in einem Folgeschritt mit Bromessigsäureethylester zu acylierten Phenoxyessigsäureethylestern verethert wurden. In diese wurde in a-Position zum Keton eine Doppelbindung eingeführt. Über eine Mannich-Reaktion mit N,N,N’,N’-Tetramethyldiaminomethan/Acetanhydrid oder Urotropin/Acetanhydrid erhält man so die acylierten Phenoxyessigsäureethylester mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Zur Darstellung der entsprechenden ungesättigten Säuren aus den acylierten Phenoxyessigsäureethylestern bedient man sich einer basenkatalysierten Aldokondensation mit Formaldehyd, unter deren Bedingungen der Ethylester zur Säure gespalten wird. Kupplung von Etacrynsäure mit Aminen unter Aktivierung mit DCC/N-Hydroxysuccinimid führte zu den Etacrynsäureamiden. Methylierung der acylierten Phenole und anschließende Mannich-Reaktion dient der Darstellung der acylierten Anisole mit a,b-ungesättigter Ketonstruktur. Auf diesem Syntheseweg wurden 28 Derivate mit Michael-System synthetisiert. Diese wurden an den Cystein-Proteasen Papain, Cathepsin B (CB), Falcipain (FP) und Rhodesain (RD) getestet. Gegen Serin-Proteasen wurde keine Hemmung festgestellt. Die meisten Inhibitoren zeigten bei CB, FP und RD eine nicht-zeitabhängige Kinetik der Enzyminaktivierung. Nur bei Papain wurde eine zeitabhängige Kinetik beobachtet. Die Substanzen wurden zwar als irreversible Inhibitoren konzipiert, Dialyseversuche beweisen jedoch eine reversible Hemmung. Da eine Vergleichssubstanz ohne aktivierte Doppelbindung unwirksam ist, kann von einer kovalenten Reaktion mit den Cystein-Proteasen ausgegangen werden. Bestimmt wurden die Dissoziationskonstanten Ki der Enzym-Inhibitor-Komplexe EI als Maß für die Affinitäten der Inhibitoren zum Enzym und, soforn möglich, auch die Alkylierungsgeschwindigkeitskonstanten ki der Reaktion zu modifiziertem Enzym E-I. Eine allgemeine Selektivität für einzelne Enzyme konnte nicht gefunden werden. Die besten Inhibitoren (Ki = 3.2 - 57.5 µM) waren die Etacrynsäureamide. Die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen ergab, dass wie erwartet das a,b-ungesättigte System essentiell für die Wirksamkeit an Cystein-Proteasen ist, ebenso ein aromatischer Ring. Eine längere Seitenkette an der Doppelbindung, die mindestens einen Ethylrest trägt, sowie zwei benachbarte Halogenatome am aromatischen Ring erwiesen sich als wirkungssteigernd. Ester und Amide zeigten generell bessere Hemmeigenschaften als die freien Säuren. Methoxy-Gruppen am Aromaten hatten keinen Wirkungsverlust zur Folge, senken aber die Löslichkeit in wässrigem Medium. Viel versprechend ist auch der [5-Chlor-2-(2-methylenbutyryl)-phenoxy]-essigsäureethylester, der das a,b-ungesättigte Doppelbindungs-System in ortho-Position zum phenolischen Sauerstoffatom trägt. Innerhalb der Amide sind kurze, voluminöse Reste wie der tertButylrest von Vorteil, eine gewisse Selektivität wird mit langkettigen Amiden wie dem n-Hexylamid für FP gegenüber CB und RD erreicht. Die Verbindungen wurden auf die Wachstumshemmung von grampositiven und gramnegativen Problemkeimen, sowie auf die Hemmung der Biofilmbildung grampositiver Erreger getestet. Bei gramnegativen Keimen wurde das Wachstum nicht gehemmt. Bei den grampositiven Keimen Staphylococcus aureus und S. epidermidis wirkten ebenfalls der Etacrynsäureethylester und das Hexylamid, Benzylamid, Anilid der Etacrynsäure am besten (MHK = 5 - 20 µM). Die genannten Verbindungen zeigten auch die stärkste Hemmwirkung auf die Biofilmbildung (100 % bei 20 - 40 µM bis zu 95 % bei 2.5 - 5 µM an S. aureus). Aufgrund positiver Screeningergebnisse in einem enzymatischen HPLC-Assays an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) wurden Docking-Experimente mit Etacrynsäure-tertbutylamid an der humanen SARS-Coronavirus Hauptprotease (SARS-CoV Mpro) durchgeführt. Die Ergebnisse führten zur Synthese einer modifizierten Verbindung, die eine geringe Verbesserung der Enzyminhibition im fluorimetrischen Assay zeigte. N2 - Cysteine proteases are involved in a variety of physiological and pathophysiological processes. They are wide-spread in pathogenic parasites as well and are essential for the survival of the pathogens. Compounds which inhibit these proteases could serve as new pharmaceuticals for many therapeutic indications. In the present work non-peptidic cysteine protease inhibitors, which contain an a,b-unsaturated ketone as electrophilic group and which are able to add the cysteine residue of the proteases’ active site in a Michael-type reaction, were synthesized. The diuretic etacrynic acid was used as lead compound, its structure was modified in several positions. The main synthetic pathway is as follows: the acyl side chain of the desired length was introduced in correspondingly substituted anisoles via a Friedel-Crafts acylation. The yielded acylated anisols were cleaved to the acylated phenols in a consecutive reaction. They were transferred to the acylated phenoxy acetic acid esters in a following step with bromo acetic acid ethyl ester. A double bond was introduced into the acylated phenoxy acetic acid esters in a-position of the ketone. The acylated phenoxy acetic acid ethyl esters with an a,b-unsaturated ketone moiety are yielded via a Mannich reaction with N,N,N’,N’-tetramethyl-diaminomethane/acetic acid anhydride or urotropine/acetic acid anhydride. To synthesize the corresponding unsaturated acids out of the acylated phenoxy acetic acid esters a base-catalyzed aldol condensation with formaldehyde in aqueous ethanol is used. Under these conditions the ethyl ester is cleaved to give the free acid. Coupling of etacrynic acid with amines by activation with DCC/N-hydroxy succinic imide led to the etacrynic acid amides. Methylation of the acylated phenols and consecutive Mannich reaction, as described above, leads to the acylated anisols with a,b-unsaturated ketone moiety. Following this synthetic pathway 28 derivatives with a Michael system were synthesized. These compounds were tested in the cysteine proteases papain, cathepsin B (CB), falcipain (FP) and rhodesain (RD). No inhibition of serine proteases was detected. Most of the inhibitors showed non-time-dependent kinetics for enzyme inactivation of CB, FP and RD. Only with papain time-dependent kinetics are observed. Although the compounds were planned as irreversible inhibitors, dialysis assays proved a reversible inhibiton. Since a comparative compound without a double bond is inactive, a covalent reaction with the cystein proteases can be assumed. Dissociation constants Ki of the enzyme-inhibitor-complexes EI were determined as a measurement of the affinities of the inhibitors towards the enzymes, as well as the alkylation velocity constants ki of the reaction yielding the modified enzyme E-I. The latter could be determined only in cases of a time-dependent inhibition. A general selectivity for single enzymes could not be found. The etacrynic acid amides were the best inhibitors (Ki = 3.2 - 57.5 µM). The analysis of the structure-activity relationship showed, as expected, the a,b-unsaturated system being essential for activity in cysteine proteases. The same fact is true for the aromatic ring. A longer side chain next to the double bond, which contains at least an ethyl moiety, as well as two vicinal halogen atoms at the aromatic ring proved to enhance the activtity of the inhibitors. Generally, esters and amides showed better inhibition properties than the free acids. Methoxy groups at the aromatic ring did not result in a loss of inhibition but in a reduced solubility in aqueous media. Compound [5-Chloro-2-(2-methylenebutyryl)-phenoxy]-acetic acid ethyl ester, which carries the a,b-unsaturated double bond system in ortho position to the phenolic oxygen atom, is also promising. Within the amides short voluminous moieties such as the tertbutyl moiety are advantageous. A distinct selectivity for FP against CB and RD can be achieved with long-chain amides such as the n-hexyl amide. The compounds were examined for growth inhibition of gram-positive and gram-negative pathogens as well as for inhibition of biofilm formation of gram-positive pathogens. The growth of gram-negative germs was not inhibited. The gram-positive germs Staphylococcus aureus and S. epidermidis were inactivated best by etacrynic acid ethyl ester and by the n-hexyl amide, the benzyl amide and the anilide of etacrynic acid (MHK = 5 - 20 µM). The mentioned compounds also showed the highest inhibition rate for biofilm formation (100 % at 20 - 40 µM to 95 % at 2.5 - 5 µM in S. aureus). Due to positive screening results in a enzymatic HPLC-assay of human SARS coronavirus main protease (SARS-CoV Mpro) docking experiments were conducted on etacrynic acid tertbutyl amide. The results led to the synthesis of a modified compound which showed weak improvement of enzyme inhibition in a fluorimetric assay. KW - Cysteinproteasen KW - Proteaseinhibitor KW - Etacrynsäure KW - Etacrynsäure KW - nichtpeptidische Inhibitoren KW - Cystein-Protease KW - etacrynic acid KW - non-peptidic inhibitors KW - cysteine protease Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12122 ER - TY - THES A1 - Marquardt, Karin T1 - Untersuchungen zum Zerkleinerungsverhalten kristalliner Stoffe in einer Spriralstrahlmühle T1 - Investigations of the breakage behaviour of cristal materials in a spiral jet mill N2 - Die Feinheit von Mahlprodukten, die durch Beanspruchung in einer Luftstrahlmühle erreicht wird, ist immer das Resultat von Zerkleinerungs- und Sichtungsprozessen in der Mahlkammer. Bei hohem Eintrag von Mahlenergie und unter dem Einfluss von großen Zentrifugalkräften in der Mahlkammer können feinste Mahlprodukte mit enger Korngrößenverteilung erzielt werden. Es ist jedoch nicht nur entscheidend, dass sehr feine, eng verteilte Mahlprodukte durch Luftstrahlmahlung geschaffen werden können. Mindestens genauso wichtig ist es, dass die Korngrößenverteilungen der Mahlprodukte reproduzierbar sind. Reproduzierbar sind die Mahlergebnisse allerdings nur dann, wenn die Abläufe in der Mahlkammer konstant gehalten werden können. Bevor Aussagen über den Mahlvorgang in der Luftstrahlmühle getroffen werden, muss eine Prozessvalidierung vorgenommen werden. Ansonsten sind keine Modellberechnungen, die einen Zusammenhang zwischen Mahleinstellungen und Korngrößenverteilungen von Mahlprodukten herstellen, möglich. Alle Untersuchungen zum Bruchverhalten von Mahlgütern wurden durchgeführt an einer Luftstrahlmühle vom Typ Fryma JMRS 80, die bereits von Rief [40] optimiert worden war. Es konnte gezeigt werden, dass hohe Mahl- und Injektordrücke auch zu hohen Kammerdrücken im stationären Betriebszustand führen. Große Gutaufgaben pro Zeiteinheit und ein breiter Mahlspalt sind dagegen mit niedrigeren Kammerdrücken verbunden. Diese Ergebnisse stimmen gut mit bereits von Muschelknautz [38, 39] und Bauer [34] gewonnenen Erkenntnissen überein. Bei hohen Mahl- und Injektordrücken sind die Strömungsgeschwindigkeiten in der Mahlkammer und damit auch der Mahlkammerdruck relativ groß. Wird dabei jedoch viel Mahlgut pro Zeiteinheit zugeführt, kommt es zu einer starken Abbremsung der Strömung, da das zirkulierende Gas durch Übertragung von Energie auf die Partikel in der Mahlkammer selbst an kinetischer Energie verliert; der Druck in der Mahlkammer sinkt. Die Größe des Mahlspalts hat Einfluss auf den Kammerdruck, da sie bestimmt, wie groß der Unterdruck und damit der Sogeffekt über dem Tauchrohr ist. Ist der Mahlspalt breit, nimmt der Sog aus der Mahlkammer ab. In der Folge verweilt das Mahlgut länger in der Kammer; die Feststoffmenge in der Mahlkammer nimmt zu. Dadurch wird die Strömung in der Mahlkammer stark abgebremst, der Druck in der Kammer sinkt. Harte Stoffe von hoher Dichte und mit elastischem Materialverhalten führen zu niedrigeren Kammerdrücken im konstanten Betriebszustand als weiche Stoffe von niedriger Dichte und mit inelastischem Materialverhalten. Mit Hilfe von Korngrößenanalysen konnte gezeigt werden, welchen Einfluss einzelne operative Parameter auf die Feinheit der Mahlprodukte haben. Am Beispiel von Ascorbinsäure, Natriumascorbat, Lactose und Natriumchlorid wurde untersucht, wie sich die Förderrate, der Mahl- und Injektordruck und die Größe des Mahlspalts auf die Produktfeinheit auswirken. Ein Vergleich der verschieden Mahlgüter ermöglichte es, abzuschätzen, inwieweit sich mechanische Eigenschaften auf den Verlauf des Mahlprozesses auswirken. Mit zunehmender Gutaufgabe pro Zeiteinheit werden die Korngrößenverteilungen der Mahlprodukte breiter und hin zu größeren Korngrößen verschoben. Steigender Mahl- und Injektordruck und ein größer werdender Mahlspalt führen dagegen zu feineren und enger verteilten Mahlprodukten. Während Förderrate und Mahl- bzw. Injektordruck die absolut zur Zerkleinerung verfügbare Energie bestimmen, nimmt die Größe des Mahlspalts eher Einfluss auf die Beanspruchungsdauer der Mahlgutpartikel. Da bei breitem Mahlspalt der Unterdruck über dem Tauchrohr und damit der Sog aus der Mahlkammer reduziert wird, nimmt mit wachsendem Mahlspalt die Verweildauer der Mahlgutpartikel in der Mahlkammer zu; das gewonnene Mahlprodukt wird feiner und enger verteilt. Experimente ergaben, dass sich Ascorbinsäure am leichtesten zerkleinern lässt, gefolgt von Natriumascorbat, Natriumchlorid und zuletzt Lactose. Je kleiner das Elastizitätsmodul und je größer die Härte und die Dichte eines Mahlguts, desto energieaufwändiger ist die Zerkleinerung. Mit Erfolg konnten die operativen Parameter Förderrate, Mahldruck und Mahlspalt mit den charakteristischen Größen der Mahlproduktverteilungen korreliert werden. Ebenso gelang es, die Materialeigenschaften Härte, Elatizitätsmodul und Dichte in die Korrelation mit einzubeziehen. Für alle mathematischen Rechenansätze wurden Modelle zweiter Ordnung gewählt, da diese nicht zu kompliziert sind und dennoch den Prozess sehr gut beschreiben. N2 - It was the aim of this study to investigate the breaking behaviour of different materials a spiral jet mill Type Fryma JMRS 80 modified by Rief. It has been shown that high grinding and high particle feed pressures result in high pressures inside the milling chamber in the stationary state. In contrary a high feed rate and a wide slit width lead to a lower pressure. These results agree to those of Muschelknautz [38, 39] and Bauer [34]. High milling and high feed pressures are connected with a high flow velocity. In consequence the pressure inside the milling chamber increases. The flow velocity is reduced, if the material to be ground is transported into the milling chamber by high feed rates. Under these circumstances the concentration of solid material inside the milling chamber is high and the circulating gas is decelerated enormously. The slit width influences the pressure inside the milling chamber because it determines the size of the outlet of the mill. If there is a large slit width, the underpressure at the outlet is low. Therefore only finest particles leave the mill and the concentration of solid material inside the milling chamber is high. In consequence the flow velocity and the static pressure decrease. In order to investigate the influence of material properties, the pressures inside the milling chamber measured at constant slit width, feed rate, milling and feed pressure but at different materials are compared. The following trend was recognized: When soft and inelastic materials of low specific density are ground the pressure inside the milling chamber drops less than when hard and elastic materials of high specific density are ground. The pressure indicates the amount of energy input not spent by the acceleration and at least by the fragmentation of particles. The higher is the pressure inside the mill, the finer is the product. Then there rests a high amount of energy not necessary for the acceleration of the material that can be ground at low mechanical load. With decreasing feed rate and with increasing milling pressure the mean particle sizes of all mill products become smaller. In addition the size distributions become narrower. In contrary high feed rates and low milling pressures lead to coarse product sizes with wide particle size distributions. Feed rate, grinding and feed pressure determine the amount of energy per particle available for breakage processes, whereas the slit width determins, how long particles to be ground are stressed in the milling chamber. The slit width at the vortx finder determines the pressure drop inside the milling chamber as well as the underpressure in the vortex. A wide slit width results in a low underpressure and a low suction effect. In consequence the material can be stressed for a longer time and therefore only fine particles are discharged. These results confirm earlier findings [40]. As materials to be ground differ in their hardness, Young’s modulus and specific gravity it is expected that they differ in their breakage behaviour. Experimentally the following phenomenon could be shown: ascorbic acid can be ground best followed by sodium ascorbat, sodium chloride and lactose. Lactose is a very elastic material compared to the other three substances. Sodium chloride excels as a soft and brittle material, but it is characterised by a high specific gravity. Ascorbic acid and sodium ascorbat take an intermediate position. The material properties of these two substances differ only little. Ascobic acid is a bit more elastic but also a bit softer and of a lower density than sodium ascorbat. That means: To reach a certain particle size distribution hard and elastic materials of high density require enormous grinding energies compared with soft and inelastic materials of low density. Two approaches were made: First of all the operational parameters, namely the feed rate, the grinding pressure and the slit width, were correlated to the characteristic values of the particle size distributions of the mill products. With success even material properties such as hardness, elasticity and specific gravity could be included into the statistical calculations. The bases of all calculations are models of second order. Models of second order were chosen for two reasons: they are not too complicated and describe the grinding process quite exaclty. In order to describe the processes in the spiral jet mill by a smaller number of parameters, a second approach was made. In order to reduce the number of influencing parameters dimensionless characteristics were introduced. It was possible to connect the dimensionless charcteristics to a mathematical model of second order. KW - Spiralstrahlmühle KW - Zerkleinerungsverhalten KW - Modellberechnungen KW - Laserbeugungsanalyse KW - spiral jet mill KW - breakage behaviour KW - modelling of a spiral jet mill KW - laser diffraction analysis Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8308 ER - TY - THES A1 - Muth, Mathias T1 - Synthese und Charakterisierung allosterer Modulatoren muscarinischer M2-Rezeptoren : Strukturvariationen der Bis(ammonium)alkan-Verbindung W84 T1 - Synthesis and characterisation of allosteric modulators of the muscarinic M2-receptor - structural variations of the bis(ammonio)alkane-compound W84 N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung allosterer Modulatoren muscarinischer Rezeptoren. Allostere Modulatoren binden an einer topographisch anderen Stelle am Rezeptor als klassische orthostere Liganden und sind so in der Lage, die Dissoziation und die Assoziation orthosterer Agonisten und Antagonisten zu beeinflussen. Die fünf Subtypen des Muscarinrezeptors M1-M5 unterscheiden sich vor allem in der Aminosäuresequenz der in den äußeren Bereichen des Rezeptorproteins vorhandenen Loops, während sie im Bereich des Rezeptorkanals, wo die orthostere Bindungsstelle lokalisiert ist, eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. Die gemeinsame Bindungsstelle allosterer Modulatoren des M2-Rezeptors befindet sich im weniger konservierten extrazellulären Bereich. Somit sind allostere Modulatoren in der Lage, spezifisch an einen der Rezeptorsubtypen zu binden. Als Leitstruktur zum Entwurf der im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen diente die Bis(ammonium)alkanverbindung W84. Über Weg A wurden Phthalsäure- bzw. Naphthalsäureanhydridderivate in einer Kondensationsreaktion mit dem entsprechenden N,N-Dimethylpropan-1,3-diaminderivat zum jeweiligen Phthalimidopropylaminderivat umgesetzt. Durch die Reaktion von zwei Äquivalenten des Amins mit einem Äquivalent 1,6-Dibromhexan wurden dann die symmetrischen W84-Derivate erhalten. Um die unsymmetrischen W84-Derivate zu erhalten, musste zunächst das jeweilige Phthalimidopropylamin einseitig durch 1,6-Dibromhexan alkyliert werden. Im letzten Schritt wurden äquimolare Mengen der alkylierten Verbindung und eines Phthalimidopropylamins umgesetzt. Da sich im Laufe der Arbeit die Methylierung an Position 2 der Propylketten als kritische Position zur Beeinflussung der Gleichgewichtsbindung herausstellte, wurden Verbindungen hergestellt, die an den Propylketten Alkylgruppen verschiedener Länge tragen. Aus diesem Grund wurde Syntheseweg B entwickelt. Zunächst wurden in mehreren Stufen, ausgehend von Malonsäurediethylester, einfach und zweifach mit Alkylgruppen substituierte 1,3-Dibrompropanderivate hergestellt. Diese wurden dann mit Kaliumphthalimid zu den jeweiligen 3-Brompropylphthalimidderivaten umgesetzt. Zwei Äquivalente dieser 3-Brompropylphthalimide reagierten mit einem Äquivalent N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,6-hexandiamin zu den entsprechenden symmetrischen W84-Derivaten. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, stark fluoreszierende W84-Derivate herzustellen. Die fluoreszierenden Eigenschaften N-substituierter Naphthalimide könnten zur direkten Charakterisierung allosterer Interaktionen oder zur Verfolgung des „Rezeptor-Traffickings“ mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie genutzt werden. Deshalb wurden in Position 3 und 4 des Naphthalimidringes des potentesten allosteren Modulators Aminogruppen eingeführt. Hexamethonio-Derivate beeinflussen in nennenswertem Maße bisher nur die Bindung von Antagonisten am M2-Rezeptor. Da die allostere und die orthostere Bindungsstelle räumlich nahe zusammenliegen, wurde der Versuch unternommen, einen orthosteren Agonisten und einen allosteren Modulator in einem Molekül miteinander zu verknüpfen. Es wurden zwölf Hybridmoleküle aus einem Teil des hochaffinen allosteren Modulators 3a und Derivaten des Muscarinagonisten Oxotremorin-M, verbunden durch aliphatische Spacer verschiedener Länge, hergestellt. In pharmakologischen Testungen soll aufgeklärt werden, ob es möglich ist, mit einem Agonist/Alloster-Hybridmolekül gleichzeitig die orthostere und die allostere Bindungsstelle zu besetzen. Die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte durch Radioligandbindungsstudien. Der allostere Effekt der Testsubstanzen wurde indirekt über die Verzögerung der Dissoziation des radioaktiv markierten orthosteren Antagonisten [3H]N-Methylscopolamin bestimmt. Alle bisquartären Testverbindungen weisen deutlich höhere Affinitätswerte als die Leitstruktur W84 auf. Die 1,8-Naphthalimid-substituierten Verbindungen mit gleichzeitiger zweifacher Methylierung erwiesen sich als hochaffin und zugleich positiv kooperativ. Die wirksamste Verbindung dieser Serie ist Verbindung 3a (Naphmethonium), deren Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor im einstelligen nanomolaren Bereich liegt (pEC50 = 8.36). Somit stellt Naphmethonium den potentesten in der Literatur bekannten allosteren Modulator des M2 Rezeptors dar. Mittels QSAR-Analysen wurden die ermittelten Affinitäten zum freien und zum NMS-besetzten Rezeptor in Zusammenhang mit verschiedenen physikochemischen Parametern gebracht. Die Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor der Verbindungen der Serie 2 lässt sich mit hoher Güte durch das Volumen eines lateralen N-Methylimids in Kombination mit der benachbarten Dimethylierung der Propylkette beschreiben. Somit wird deutlich, dass zur Erzielung von positiver Kooperativität die Kombination aus einem hochaffinen aromatischen Imid in direkter Nachbarschaft zu einer 2,2-Alkylpropylkette essentiell ist. N2 - The present work deals with the synthesis and characterization of allosteric modulators of muscarinic receptors. Allosteric modulators bind to a topographically different site than classical orthosteric ligands and, thus, are capable of influencing both the dissociation and the association of orthosteric agonists and antagonists. Allosteric modulators are capable of binding selectively to specific subtypes. The bis(ammonio)alkane-type compound W84 served as a lead for the compounds synthesized in this work. Via pathway A, phthalic- and naphthalic anhydride derivatives were converted with N,N-dimethylpropane-1,3-diamines to the phthalimidopropylamine derivatives. The symmetrical W84-derivatives were obtained by the conversion of two equivalents of the amine with one equivalent 1,6 dibromohexane. To obtain the non-symmetrical W84-derivatives the phthalimidopropylamines were unilaterally alkylated by 1,6-dibromohexane. In the last step equimolar amounts of the monoalkylated compound and a phthalimidopropylamine were connected. During our studies the methylation of position 2 of the propylene chains was identified as critical position for the influence on equilibrium binding. Therefore, compounds with varying alkyl substituents were synthesized. First, starting from malonic diethyl ester, 1,3-dibromo-propane derivatives carrying one or two ethyl-, propyl- or iso-butyl groups, respectively, were synthesized first. The latter were converted to the corresponding 3-bromopropylphthalimid derivatives with potassium phthalimide. In the last step two equivalents of the bromopropyl-phthalimides reacted with one equivalent tetramethyl-1,6-hexane-diamine to the symmetrical hexamethonio-derivatives. A further aim of the work was to synthesize highly fluorescent W84-derivatives. The fluorescent properties of N-substituted naphthalimides could be utilized for the direct characterization of allosteric interactions. Therefore, amino groups were introduced in positions 3 and 4 of the naphthalimide moiety. Until now, only the binding of antagonists of the M2 receptor was influenced by hexamethonio derivatives. Because of the spatial proximity of the orthosteric to the allosteric binding site it was tried to combine an agonist and an allosteric modulator in one molecule. Twelve hybride molecules consisting of a part of a highly affin allosteric modulator and of derivatives of the muscarinic agonist oxotremorine-M were synthesized. In the pharmacological evaluation it will be elucidated if it is possible for an agonist/alloster-hybride molecule to bind simultaneously to the orthosteric and the allosteric site. The pharmacological testing of the compounds was accomplished by radioligand binding studies . The allosteric effect of the compounds was determined by measurement of the inhibition of the dissociation of the radioactive marked orthosteric antagonist [3H]N-methylscopolamine. All compounds revealed higher affinitiy values than the lead structure W84. The most potent compound of that series is compound 3a (naphmethonium) that reveals an affinity to the NMS-occupied receptor in the low nanomolar range (pEC50 = 8.36). Taking all results together, the highest affinity values in combination with positive cooperativity were obtained for W84-derivatives carrying at least one naphthalimide moiety directly connected to a 2,2-dimethylpropyl chain. By the introduction of different alkyl groups in the propylene chains it was possible to verify the critical position with respect to the cooperative behaviour of W84-derivatives. QSAR-studies were performed in order to check whether the pharmacologically determined affinities to the free and to the NMS-occupied receptor can be explained by physicochemical properties of the compounds. The affinity to the NMS-occupied receptor of the compounds of series 2 can be described using the volume of one lateral N-methylimide in combination with the dimethylation of the neighbored propylene chain. Summarizing these results it can be concluded that the compounds feature a dominant side with regard to allosteric potency. To achieve positive cooperativity the combination of an affinity generating lateral aromatic imide moiety connected to a 2,2-alkylated propylene chain is essential. KW - Muscarinrezeptor KW - allosterischer Effektor KW - W84 KW - Analoga KW - Chemische Synthese KW - GPCR KW - allostere Modulation KW - Muscarinrezeptor KW - GPCR KW - allosteric modulation KW - muscarinic receptor Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8839 ER - TY - THES A1 - Raab, Thomas T1 - Untersuchungen zur Erdbeerfruchtreifung : Biosynthese von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon und Enzymaktivitäten während des Reifungsprozesses T1 - Investigations on strawberry fruit ripening - Biosynthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone and enzymatic activities within the ripening process N2 - Die Fruchtreifung stellt einen hochkomplexen Prozess dar, der durch eine Reihe von biochemischen und physiologischen Veränderungen gekennzeichnet ist. Dies umfasst bedeutende Veränderungen von Textur, Farbe sowie die Bildung von geschmacks- und geruchsaktiven Verbindungen. Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (Furaneol®, HDMF), einer Schlüssel-Aromakomponente der Erdbeere (Fragaria x ananassa). Daneben lieferten die durchgeführten Versuche den Nachweis einer Reihe enzymatischer Aktivitäten in der Erdbeerfrucht und beleuchteten deren Entwicklung im Verlauf der Erdbeer-Fruchtreifung. Zum ersten Mal wurde ein Protein aus Erdbeerfrüchten isoliert, partiell sequenziert und seine Beteiligung an der enzymatischen Bildung von HDMF während der Fruchtreifung nachgewiesen. N2 - Fruit ripening represents a highly complex process, characterized by a series of biochemi-cal and physiological changes. This comprises significant changes in texture and colour as well as production of odor- and flavour-active compounds. The present work reveals new insight into the biosynthesis of 4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanone (Furaneol®, HDMF), a key flavour compound of strawberry (Fragaria x ananassa). For the first time, a protein active in the enzymatic formation of this compound during strawberry fruit ripening was isolated from the fruit, partially sequenced and characterised. KW - Erdbeere KW - Fruchtreife KW - Furaneol KW - Biosynthese KW - Furaneol KW - Chinon-oxidoreduktase KW - Erdbeere KW - Aroma KW - HDMF KW - Furaneol KW - quinone oxidoreductase KW - strawberry KW - flavor KW - HDMF Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8640 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Ulrich T1 - Cyclodextrine als chirale Selektoren in der kapillarelektrophoretischen Enantiomerentrennung T1 - Cyclodextrins as chiral selectors in capillary electrophoretic separation of enaantiomers N2 - Die vielfältigen isomeren Substanzen, die in dieser Arbeit getrennt wurden, zeigen, dass die cyclodextrin-modifizierte Kapillarelektrophorese eine sehr leistungsfähige Technik für die Trennung von Enantiomeren darstellt. Als kritisch erweist sich jedoch das Auffinden des richtigen Cyclodextrins bzw. dessen optimale Konzentration. Die Vorhersagbarkeit dieser Parameter ist noch zu gering, um hier vor den ersten Versuchen alleine anhand der Struktur des Moleküls sichere Aussagen machen zu können. So sind zur Zeit noch Versuchsreihen mit verschiedenen Cyclodextrinen und Bedingungen nötig, wie sie in dieser Arbeit durchgeführt wurden. Für die Zukunft wäre es wünschenswert, durch das Sammeln von mehr Erfahrungen und Ergebnissen, wie sie hier gezeigt wurden, schon möglichst direkt aus den Strukturen der zu trennenden Zielmoleküle eine Aussage über die Beschaffenheit des Cyclodextrins oder der CE-Methode machen zu können. Von sechs verschiedenen schwach basischen Thiobarbituratracematen konnten fünf erfolgreich in ihr Enantiomeren getrennt werden. Unter den fünf erfolgreich getrennt Barbituraten waren zwei am Stickstoff alkyliert und ein weiteres sowohl am Stickstoff als auch am Schwefel. Die Thiobarbiturate, die am Stickstoffatom keinen Substituenten tragen, konnten mit -CD am besten getrennt werden (RS > 6). Hingegen konnte für die beiden nur am Stickstoff alkylierten Barbituratemit mit -CD und HDMS jeweils Auflösungen über RS = 6 erzielt werden. Für den in der Erdbeere vorhandene Schlüsselaromastoff 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, Furaneol, konnte eine CE-Methode entwickelt werden, die es zum einen ermöglicht, die Enantiomere vollständig zu trennen, und zum anderen so beschaffen ist, dass es bei der Trennung selbst zu keiner Racemisierung kommt, wie es bei der bisher verwendeten Gaschromatographie der Fall war. Die CE-Methode machte es erstmalig möglich, die enantioselektive Biosynthese von Furaneol in Erdbeerproteinextrakten nachzuweisen. Zusätzlich wurde noch die Racemisierungsgeschwindigkeit von einem angereichertem Gemisch bei vier verschiedenen pH-Werte getestet, was für weitere Arbeiten mit Furaneol-Proben von Bedeutung ist. Die Racemisierungsgeschwindigkeit erwies sich für den pH-Bereich von 3.8 bis 5 am langsamsten. Im neutralen Bereich wurde die schnellste Racemisierung beobachtet. Bei den Experimenten mit Atropin und dem verwandten Homatropin sollte geprüft werden, ob der Einsatz sulfatierter Cyclodextrine von vier verschiedenen Herstellern zu identischen Ergebnissen führt. Es konnten anhand einer kritischen Trennung gezeigt werden, dass dies nicht der Fall ist. Die Trennleistung der Cyclodextrine in Bezug auf den Vergleich Atropin/Homatropin war hierbei sehr ähnlich. Ein bei diesen Arbeiten zusätzlich entstandener Peak konnte eindeutig einem Zerfallsprodukt des Atropins, der Tropasäure, zugeordnet werden. Mit Hilfe von Experimenten mit den Atropisomeren von 1,1′-Binaphthalin-2,2′-diyl-phosphat sollte erprobt werden, ob eine Charakterisierung von randomisiert substituierter CDs über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) ausreicht, um beim erneuten Einsatz eines vergleichbaren Produktes reproduzierbare Ergebnisse zu bekommen. Die Trennleistung von unterschiedlich randomisiert substituierten acetylierten und methylierten Cyclodextrinen wurde hierzu getestet, und mit der von -CD und Heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)--cyclodextrin, bzw. deren Gemischen in Verhältnis von 1:9 bis 9:1 verglichen. Der Vergleich dieser Messergebnisse führte zu dem Schluss, dass eine einfache Charakterisierung randomisiert substituierter Cyclodextrine über den durchschnittlichen molekularen Substitutionsgrad (MS) nicht ausreicht, um reproduzierbare Ergebnisse beim Einsatz solcher Cyclodextrine zu erreichen. Die Aufnahme von Massenspektren ermöglichte es hingegen, randomisiert substituierte CDs aussagekräftig zu charakterisieren. Will man eine CE-Methode validieren, in der ein randomisiertes Cyclodextrin zu Einsatz kommt, so sollte man dieses mittels Massenspektroskopie charakterisieren und sich dessen bewusst sein, das die Validierung nur für diese eine Charge des Herstellers bzw. für Chargen mit vergleichbaren Massenspektren Gültigkeit besitzt. Für das im Arbeitskreis Bringmann racemisch synthetisierte 2-Hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin sollte eine Trennmethode für die Atropisomere entwickelt werden, da für die Zukunft eine enantioselektive Synthese geplant ist. Unter Einsatz der chiralen Selektoren Heptakis-(6-sulfato)--CD (HS) und Heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)--cyclodextrin (HDAS) konnten zwei Trennmethoden gefunden werden, die bei einer jeweiligen Cyclodextrinkonzentration von 15 mM zu einer guten Trennung der Enantiomeren führte. Dies ermöglicht eine Quantifizierung des Enantiomerenüberschuß (ee) für eine nicht-racemische Syntheseroute. N2 - The manifold of isomeric substances being separated within the frame of this thesis shows the power of cyclodextrin-modified capillary electrophoresis concerning to the separation of enantiomers. The major problem is still to find the appropriate cyclodextrin respectively the optimum concentration. The possibility to predict these parameters only on the basis of the molecule structure is still too small. Thus, it is still necessary, to perform experiments to find the suitable cyclodextrin. It would be desirable for the future, to make this possible by collecting more experiences and information. The enantiomers of five of six weakly basic thiobarbiturates could be successfully separated. Two of these five barbiturates were N-substituted, one N-substituted as well as S-substituted. The three N-substituted thiobarbiturates characterized by phenyl- and ethyl-substituent in five positions being the chiral centre. In the two other molecules the chiral centre is located in the side chain, bound at the five position. Furthermore the dependence of the cyclodextrin concentration on the resolution power of five commercial cyclodextrins could be shown. The concentration leading to the best resolution was varying from the smallest (1 mmol/l) to the highest (18 mmol/l) concentrations which were used. The thiobarbiturates without a substituent at the nitrogen atom could be separated best by using -CD (RS > 6). Whereas the two barbiturates carrying a N-alkyl substituent reach their best resolution with -CD and HDMS (both RS > 6). Beside the absolute maxima local maxima were observed. For the key flavouring substance of the strawberry, 2,5-dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon, furaneol, a CE-method was developed, which makes it possible to separate the enantiomers without racemisation, which happens when using gas chromatography. This makes it possible to verify enantioselective biosynthesis of furaneol in strawberry protein extract for the first time. Additional the rate of racemisation of enantiomeric enriched samples at four different pH-values were tested, which is important for further experiments with furaneol. The studies on atropine and the related homatropine were performed to show, whether four sulphated cyclodextrins of four different manufacturers lead to identical results. By means of a critical separation the differences of the resolution powers could be shown. It varies from no resolution over separation 1/3 of the peak to 2/3. The resolution power to the atropine enantiomeres was comparable to the one of homatropine. An additional peak, which was found in the tests, was assigned to a decomposition product of atropine being tropic acid. By means of a study with the atrop-isomers of 1,1′-binaphthalin-2,2′-diyl-phosphate it was checked, whether the characterisation of randomly substituted cyclodextrins via the average molecular degree of substitution (MS) is sufficient to obtain comparable results in CD-modified CE. The resolution power of different randomly substituted acetylated and methylated cyclodextrins were tested and compared to the one of -CD and heptakis-(2,3,6-tri-O-methyl)--cyclodextrin and their mixtures in a ratio of 1:9 to 9:1. The comparison of these results shows, that a simple classification of randomly substituted cyclodextrins by the average molecular degree of substitution (MS) is not sufficient to reproduce the results of measurements done with such kind of cyclodextrins. To validate a CE-method, in which a randomly substituted cyclodextrin is used, a mass spectrum of this cyclodextrin should be recorded and it should be clear, that the validation is effective only for this batch of the producer or for batches which have comparable mass spectra. For 2-hydroxymethyl-1-(2-hydroxy-4,6-dimethoxyphenyl)naphthalin, which was racemically synthesized in the group of Prof. Bringmann, a separation method for the atop-isomers was developed, because a enantioselective synthesis is planed in the future. Using either heptakis-(6-sulfato)--CD (HS) or heptakis-(2,3-di-O-acetyl-6-sulfato)--cyclodextrin (HDAS) as chiral selectors at a cyclodextrin concentration of 15 mM a good separation was obtained. This makes a quantification of the enantiomeric excess (ee) for enantioselective synthesis routes possible. KW - Enantiomerentrennung KW - Kapillarelektrophorese KW - Cyclodextrine KW - Kapillarelektrophorese KW - Cyclodextrin KW - Enantiomere KW - capillary electrophoresis KW - cyclodextrin KW - enantiomer Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10043 ER -