TY  - THES
A1  - Popp, Christian
T1  - Identifizierung von Aminosäuren als Teile der Substratbindungstasche des Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1) und Interaktion des rOCT2 mit der schwachen Base Chinin
T1  - Aminoacids critical for substrate transport of rat organic cation transporter 1 and interaction of rOCT2 with the weak base quinine
N2  - Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gründemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminosäure in der 11. Transmembrandomäne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminosäuren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels“ aller 12 hypothetischen Transmembrandomänen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminosäuren in der vierten Transmembrandomäne auf einer Seite. Bei diesen Aminosäuren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingeführt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminosäuren bei den flankieren Aminosäuren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport führte. Weiterhin schien an Position 218 für den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminosäure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls Änderungen bei den Transportraten und Affinitäten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinität der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegenüber dem Wildtyp erhöht. Weiterführende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinitäten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls Änderungen in Affinität und Selektivität. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum verändert war, hingegen wurden sehr starke Änderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminosäurepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies könnte der Grund für die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch bestätigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte.
N2  - The first organic cation transporter was cloned from rat (rOCT1) in 1994 by using the expression cloning technique (Gründemann et al., 1994). In 1999 it was found that one of the aminoacids in the 11th transmembranedomain of rOCT1, is part of it’s substrate binding pocket (Gorboulev et al., 1999). It was the aim of this thesis to identify more aminoacids of functional relevance for this transport protein. A comparison of all 12 helical wheels of the transporter showed, that there is an accumulation of 5 OCT and OCTN specific aminoacids at one side of the a-helix. These aminoacids were K215, W218, Y222, T226 and V229. Different single point mutations have been generated at these positions. Using radiolabeled substrates for rOCT1, the experiments showed, that even a substitution by a structural related aminoacid at the flanking aminoacids resulted in a failure of substrate transport. For TEA transport it has been suggested that the aminoacid at position 218 should have aromatic properties. We therefor suggest a cation-p interaction between the aromatic ringsystem of W218 and the positive charge of TEA. Experiments with mutations in position Y222 also showed differences in transport rates and affinities referring to the wildtype using different substrates. A cation-p interaction could be excluded, but it was shown, that there was a 20fold increased affinity of TPeA for the mutant Y222F. Further experiments utilizing the two electrode voltage clamp technique showed different affinities for wildtype rOCT1 in comparison to the mutated protein in its outward and inward conformation. The wildtype showed a competitive type of inhibition for TPeA inhibited TEA current, the mutant showed a non-competitive type of inhibition. The mutant T226A also showed changes in affinity and selectivity. In all transporting mutants we found no or lowest changes in the transport characteristics of MPP, but very big changes in the transport characteristics of TEA, an indication for different binding sites for these substrates. The experiment clearly showed, that these five aminoacids are of functional relevance for rOCT1 transport. In experiments using quinine as inhibitor of rOCT2 mediated transport quinine in it’s uncharged form passed the oocyte membrane by diffusion and inhibited rOCT2 from the inside. This might be the reason for the non-competitive type of inhibition, using quinine as the inhibitor for TEA uptake. This hypothesis was confirmed when we showed that the type of inhibition changed into the competitive type, when we used the protonated form of quinine.
KW  - Ratte
KW  - Kation
KW  - Carrier-Proteine
KW  - Chinin
KW  - Substratspezifität
KW  - rOCT
KW  - organischer
KW  - Kationentransporter
KW  - Chinin
KW  - Mutationsanalyse
KW  - rOCT
KW  - organic
KW  - Cationentransporter
KW  - Quinine
KW  - Mutationanalysis
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12349
ER  - 
TY  - THES
A1  - Voss, Jan
T1  - Substratspezifität und Signaltransduktion zellulärer und onkogener Abl-Tyrosinkinasen
T1  - Substrate specificities and signalling pathways of physiological and oncogenic Abl tyrosin kinases
N2  - Deregulierte Überaktivierung von Tyrosinkinasen der Abl-Familie spielen eine wesentliche Rolle in verschiedenen Leukämieformen beim Menschen. Neben der schon seit vielen Jahren für die CML als ursächlich anerkannten Fusionskinase p210Bcr-Abl sind weitere Fusionskinasen unter Beteiligung der Abl-Kinase in Formen der sowohl CML als auch der ALL und CMML beschrieben worden. Diese seltener auftretenden Abl-Fusionskinasen umfassen sowohl Bcr-Abl Proteine anderer Größe (p165Bcr-Abl, p190Bcr-Abl und p230Bcr-Abl) als auch die Tel-Abl Fusionskinasen, die anstelle von Teilen des Bcr-Proteins Teile des Tel-Proteins beinhalten. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Kinasespezifität der onkongenen Fusionstyrosinkinasen Bcr-Abl und Tel-Abl mit der der physiologischen Kinasen c-Abl und Arg verglichen. Mittels kurzer Peptide, deren Aminosäuresequenzen Phosphorylierungsepitopen in Substratproteinen der Kinasen der Abl-Famile entsprechen, konnte eine verminderte katalytische Spezifität der onkogenen Kinasen Bcr-Abl und Tel-Abl gezeigt werden. Der zweiten Teil der hier dargestellten Ergebnisse fokussiert auf Signaltransduktionsereignisse, die in Tel-Abl exprimierenden Zellen auftreten, und vergleicht diese mit der für Bcr-Abl bekannten Signaltransduktion. Ähnlich wie Bcr-Abl konnte auch Tel-Abl in Proteinkomplexen mit dem Adapterprotein CRKL, ein Protein, das in Bcr-Abl-transformierten Zellen konstitutiv Tyrosin-phosphoryliert ist, nachgewiesen werden. Des weiteren wurde gezeigt, daß in den Tel-Abl exprimierenden Zellen die Adapterproteinen c-CrkII und CRKL phosphoryliert sind und mit vielen anderen tyrosinphosphorylierten Proteinen Komplexe bilden. Schließlich wurden einige Signaltransduktionsschritte beschrieben, die sowohl in Zellen, die Tel-Abl exprimieren, als auch in Zellen mit Bcr-Abl-Expression aktiviert sind. Mittels eines Ras×GPT-spezifischen Präzipitationsassys konnte eine konstitutive Anhebung des GTP-belandenen Anteils des GTPase Ras in den Zellen mit Expression der leukämischen Abl-Formen gezeigt werden. Sowohl die mitogene Kinase MAPK/Erk als auch die Kinase Akt/PKB, welche die Apotptose blockiert, werden ebenfalls durch Tel-Abl aktiviert. Die Ergebnisse der hier dargestellten Arbeit zeigen, daß die leukämischen Abl-Fusionsproteine eine katalytische Spezifität aufweisen, die sich von der der physiologischen Abl-Kinasen unterscheidet und daß Tel-Abl zumindest einige der Signaltransduktionswege zu aktivieren vermag, welche auch durch das onkogene Protein Bcr-Abl aktiviert werden.
N2  - Inappropriate activation of Abl family kinases plays a crucial role in different human leukaemias. In addition to the well known oncoproteins p190Bcr-Abl and p210Bcr-Abl, Tel-Abl, a novel fusion protein resulting from a different chromosomal translocation, has recently been described. In this study, the kinase specificities of the Bcr-Abl and Tel-Abl proteins were compared to the physiological Abl family kinases c-Abl and Arg (abl related gene). Using short peptides which correspond to the target epitopes in known substrate proteins of Abl family kinases, we found a higher catalytic promiscuity of Bcr-Abl and Tel-Abl. Similar to Bcr-Abl, Tel-Abl was found in complexes with the adapter protein CRKL. In addition, c-Crk II and CRKL are tyrosine phosphorylated and complexed with numerous other tyrosine phosphorylated proteins in Tel-Abl expressing cells. GTPase analysis with a Ras-GTP-specific precipitation assay showed constitutive elevation of GTP-loaded Ras in cells expressing the leukaemic Abl proteins. The mitogenic MAPK/Erk kinases as well as Akt/PKB, a kinase implicated to negatively regulate apoptosis, were also constitutively activated by both Bcr-Abl and Tel-Abl. The results indicate that the leukaemic Abl-fusion proteins have catalytic specificities different from the normal kinases c-Abl and Arg and that Tel-Abl is capable to activate at least some pathways which are also upregulated by Bcr-Abl.
KW  - Bcr-Abl
KW  - Tel-Abl
KW  - Substratspezifität
KW  - Signaltransduktion
KW  - Bcr-Abl
KW  - Tel-Abl
KW  - substrate specificity
KW  - signal transduction
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12819
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