TY - THES A1 - Niehus, Eike T1 - Untersuchungen zur Regulation Motilitäts-assoziierter Gene in Helicobacter pylori T1 - Regulation of Motility-Associated Genes in Helicobacter pylori N2 - Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten. N2 - The gastric human pathogen Helicobacter pylori is a fastidious bacterium, chronically colonizing the stomach of more than half of the world population, leading to severe diseases in some individuals such as ulcers or gastric cancer. H. pylori flagella-driven motility has been shown to be essential for the initial colonization of the human gastric mucosa and for the long-term persistence of the infection. The 2-8 flagella are arranged at one pole of the bacterium and covered by a membranous sheath. The flagella and chemotaxis system comprises more than forty genes. In contrast to the highly ordered gene organization in other organisms, they are scattered along the genome. The aim of this study was to comprehensively characterize the network of transcriptional regulation of flagellar biogenesis with possible links to other cell functions in H. pylori. H. pylori possesses two different flagellin genes, flaA and flaB, the transcription of the corresponding genes is controlled by sigma28 and sigma54 promoters respectively. To characterize the specific transcriptional regulation of these flagellar genes, which belong to two different regulons, transcript levels were monitored throughout the growth curve of H. pylori. A bioluminescence-based reporter gene system was successfully established in H. pylori for the first time. It was utilized to measure the activity of the newly constructed flaA- and flaB-promoter fusions. Furthermore growth-phase dependent transcript levels of the two flagellin genes were confirmed by Northern blot hybridizations and RT-PCR analysis. The results revealed a growthphase dependent differential transcriptional control of flaA and flaB in H. pylori. In agreement with the structural succession of FlaB and FlaA in the filament, as well as the affiliation of the genes to different flagellar regulons, flaA to flaB expression ratio was strongly increasing with the progression of the growth curve. An H. pylori microarray working platform was established to be able to perform genome-wide analyses on this organism. A custom made PCR-product microarray with 1590 H. pylori specific probes was constructed in cooperation with the Max-Planck-Institute for Infection Biology in Berlin. In addition, a commercially available H. pylori-specific oligonucleotide based microarray system was utilized for the first time and validated. By using the microarray technology, a set of different key regulators of the H. pylori flagellar system was analysed on a genome-wide scale for the first time. They are comprising the alternative sigma factors FliA and RpoN, the anti-sigma-factor FlgM, the RpoN specific two component system FlgS/R and the components of the flagellar basal body, FlhA and FlhF. While the fliA mutant revealed a phenotype with truncated flagella, the flgM mutant had a slightly enhanced number of flagella, correlating with their antagonistic function. Mutations in all other regulators lead to loss of flagella and motility. Based on the microarray analyses of the FliA and RpoN regulons, the flagellar regulatory classes 2 and 3 could be newly defined and enlarged by ten additional genes. The microarray studies on early flagellar components revealed a role for FlhA and FlhF as functional equivalents to master regulators. They are governing the transcription of flagellar regulatory classes 2 and 3 and a newly defined intermediate regulon. The latter comprised 24 flagellar and non-flagellar genes controlled by more than one promoter. Furthermore, studies on double mutants of the early regulators with the flagellar antisigma factor FlgM provided evidence for the complex regulatory interconnection of this factor with the determined flagellar feedback regulation of FlhA and FlhF. Based on the results of this study, a revised model of regulation pathways of flagellar biogenesis in H. pylori could be constructed. It is composed of three regulatory classes of flagellar genes and one intermediate class, governed by the three H. Pylori specific sigma factors sigma80, sigma54 and sigma28 and the associated regulators FlgS/R and FlgM. The transcriptional feedback regulation on class 3 genes is mediated by the anti-sigma factor FlgM, which is also involved in FlhA-dependent transcriptional control of class 2 flagellar genes. FlhF-dependent transcriptional control on class 2 genes is independent from FlgM. In contrast to other organisms, flagellar class 1 genes in H. pylori include flagellar motor and chemotaxis components and are coregulated with housekeeping genes. This coincides with the specific ecological adaptation of H. pylori to its niche and the necessity for the pathogen to be continuously motile to maintain a persistent infection. KW - Helicobacter pylori KW - Geißel KW - Genregulation KW - Helicobacter pylori KW - Flagellen KW - Genregulation KW - Motilität KW - Microarray KW - Helicobacter pylori KW - regulation KW - flagella KW - motility KW - microarray Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11141 ER - TY - THES A1 - Ye, Fang T1 - The role of DNA supercoiling in the coordinated regulation of gene expression in Helicobacter pylori N2 - Summary Mechanisms of global gene regulation in bacteria are not well characterized yet. Changes in global or local supercoiling of chromosomal DNA are thought to play a role in global gene silencing and gene activation. In Helicobacter pylori, a bacterium with few dedicated transcriptional regulators, the structure of some promoters indicates a dependency on DNA topology. For example, the promoter of the major flagellar subunit gene flaA (ó28-dependent) has a shorter spacing of 13 nucleotides (nt) in comparison to the consensus promoter (15 nt). Supercoiling changes might be a mechanism of gene-specific and global transcriptional regulation in this bacterium. The aim of this study was to elucidate, if changes in global supercoiling have an influence on global gene regulation in H. pylori, and on the temporal regulation of the flagellar biosynthesis pathway in this organism. In the present work, global DNA supercoiling in H. pylori was visualized for the first time, by determining the supercoiling state of plasmids under different growth conditions. Using this method, we showed that cellular supercoiling was clearly growth phase-dependent in H. pylori. Coinciding with increased supercoiling during the growth phases, transcription of the flaA gene was increased, while the transcription of a second ó28-dependent gene with regular promoter spacing (HP0472) was reduced, supporting the hypothesis that growth phase-dependency of promoters might be mediated by changes of DNA topology. Supercoiling in H. pylori could be influenced in a reproducible fashion by inhibition of gyrase using novobiocin, which led to DNA relaxation and to a concomitant decrease of flaA transcript levels. Promoter spacer mutagenesis of the flaA promoter was performed. With flaA promoters of increased or reduced length, transcription of flaA was reduced, less susceptible to supercoiling changes, and, under specific conditions, inverted as compared to the wild type promoter. Transcriptional interdependence between the coupled topA-flaB genes and flaA was found by analysis of the flaA promoter mutants. Chromosomally linked gyrA-flgR, and topA-flaB genes were all dependent on supercoiling and coregulated with each other. Comprehensive transcript profiling (DNA microarrays) of wildtype H. pylori with and without novobiocin treatment identified a number of genes (10% of total genes), including flagellin, virulence and housekeeping genes, which were strongly dependent on and appeared to be synchronized by supercoiling changes (transcriptional up- or downregulation). These findings indicate a tightly coupled temporal regulation of flagellar biogenesis and metabolism in H. pylori, dependent on global supercoiling. A specific group of genes was also regulated in H. pylori by overexpression of Topoisomerase I, as detected by genome-wide analysis (DNA microarray). The DNA-bending protein HU is thought to be responsible for influencing the negative supercoiling of DNA, through its ability to wrap DNA. HU is encoded by the hup single gene in H. pylori, and constitutively expressed during the whole growth curve. An H. pylori hup mutant was constructed. H. pylori cells lacking HU protein were viable, but exhibited a severe growth defect. Our data indicate that the lack of HU dramatically changes global DNA supercoiling, indicating an important function of HU in chromosome structuring in H. pylori. Transcriptome analyses were performed and demonstrated that a total of 66 genes were differentially transcribed upon hup deletion, which include virulence genes and many other cell functions. The data indicate that HU might act as further important global regulator in H. pylori. Increased gene expression of heat shock proteins and a decreased transcription of the urease gene cluster may indicate a co-ordinated response of H. pylori to changes of environmental conditions in its specific ecological niche, mediated by HU. After the whole genomic sequences of H. pylori strains 26695 and J99 were published, two ORFs (HP0116 and HP0440) were presumptively annotated as topoisomerase I orthologs. HP0116 is the functional H. pylori topoisomerase I (TopA). HP0440 (topA2) was found in only few (5 of 43) strains. Western blot analysis indicated that TopA2 is antigenically different from TopA. TopA2 is transcribed in H. pylori, but the protein must be functionally different from TopA, since it is lacking one functionally essential zinc finger motif, and was not able to functionally complement a TopA-deficient E. coli. Like topA, topA2 was also transcribed in a growth phase-dependent manner. We did not find a function of TopA2 in DNA structuring or topology, but, in the present study, we were able for the first time to establish a unique function for TopA2 in global gene regulation, by comprehensive transcriptome analysis (DNA microarray). Transcriptome analysis showed that a total of 46 genes were differentially regulated upon topA2 deletion, which included flagellar genes and urease genes. These results suggest that TopA2 might act as a novel important regulator of both flagellar biosynthesis and urease in H. pylori. N2 - Zusammenfassung Die Mechanismen der globalen Kontrolle der Genregulation bei Bakterien sind bisher noch wenig charakterisiert. Unterschiede in der globalen oder lokalen Topologie der chromosomalen DNA spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der globalen Kontrolle der Genexpression. Bei Helicobacter pylori, einem Bakterium mit wenigen funktionell definierten Transkriptionsregulatoren, spricht die Struktur einiger Promotoren dafür, daß sie durch die DNA-Topologie kontrolliert werden. Der Promotor des Hauptflagellingens flaA, ein Sigma-28 abhängiger Promotor, hat ein gegenüber dem Konsensuspromotor (15 Nukleotide) verkürztes Spacing von 13 Nukleotiden. Veränderungen der DNA-Superhelizität könnten ein Mechanismus der genspezifischen und globalen transkriptionellen Kontrolle in diesem Bakterium sein. Ziel dieser Untersuchungen war es zu zeigen, ob Veränderungen des globalen Supercoiling-Niveaus einen Einfluß auf die globale Genregulation von H. pylori haben und ob sie sich auf die zeitlich gesteuerte Regulation der Geißelbiosynthese (Beweglichkeitsorganell; essenzieller Virulenz- und Persistenzfaktor von H. pylori) in diesem Organismus auswirkt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Niveau der DNA-Superspiralisierung bei H. pylori erstmals durch Visualisierung des Supercoilingzustands von Plasmiden unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen dargestellt. Wir konnten mit dieser Methode zeigen, daß das zelluläre Supercoiling-Niveau bei H. pylori in Abhängigkeit von der Wachstumsphase stark variiert. In Wachstumsphasen mit erhöhtem Supercoiling war auch die Transkription des flaA-Gens erhöht, während die Transkription eines zweiten Sigma-28-abhängigen Gens mit normalem Promotorabstand (HP0472) reduziert war. Dieser Befund stützte die Hypothese, daß die wachstumsphasenabhängige Aktivität dieser Promotoren durch Veränderungen der DNA-Topologie bewirkt wird. Das Supercoiling-Niveau konnte reproduzierbar durch Hemmung der Gyrase mit Novobiocin beeinflusst werden. Die Gegenwart von Novobiocin führte zur DNA-Relaxation und zu einem gleichzeitigen Absinken der Transkription von flaA. Es wurde eine gerichtete Mutagenese der Promotor-Spacer-Region des flaA-Promotors durchgeführt. Die Verlängerung oder Verkürzung des H.pylori flaA-Promotors führte zu einer verminderten Transkription von flaA, sowie zu reduzierter Empfindlichkeit der Promotoraktivität gegenüber Veränderungen des Supercoiling-Niveaus. Unter spezifischen Bedingungen war die Supercoiling-Abhängigkeit umgekehrt im Vergleich zum Wildtyppromotor. Es konnte weiterhin eine inverse transkriptionelle Abhängigkeit zwischen dem gekoppelten Genpaar topA-flaB und flaA durch Analyse der flaA-Promotormutanten nachgewiesen werden. Auch die chromosomal gekoppelten Gene gyrA und flgR sowie topA und flaB waren abhängig vom Supercoiling-Zustand und miteinander koreguliert. Die Analyse des Transkriptoms von H.pylori-Wildtypbakterien mit DNA-Microarrays mit und ohne Novobiocinbehandlung führte zur Identifizierung von zahlreichen Genen (etwa 10% des Gesamttranskriptoms), deren Expression Supercoiling-abhängig war und durch Veränderungen des Supercoilings synchronisiert verändert werden konnte. Unter diesen waren Flagellin-, andere Virulenz-, sowie Grundstoffwechsel-Gene. Diese Befunde weisen auf eine enge Verbindung zwischen der chronologischen Kontrolle der Flagellen-Biogenese und des Metabolismus bei H. pylori, die gemeinsam durch das Supercoiling-Niveau gesteuert werden. Eine definierte Gruppe von Genen konnte bei H.pylori durch Überexpression von Topoisomerase-1 reguliert werden. Das Protein HU beeinflusst ebenfalls das Supercoiling-Niveau von DNA durch seine Fähigkeit, DNA zu biegen. HU wird bei H. pylori durch das Gen hup kodiert und ist während sämtlicher Wachstumsphasen konstitutiv exprimiert. Eine HU-defiziente Mutante wurde konstruiert. Zellen, die kein HU-Protein exprimierten, waren lebensfähig, zeigten aber einen deutlichen Wachstumsdefekt. Unsere Daten weisen daraufhin, daß der Mangel von HU sich dramatisch auf das globale DNA-Supercoiling-Niveau auswirkt, und sprechen für eine wichtige Funktion von HU bei der Kontrolle der DNA-Struktur von H. pylori. Mittels DNA-Microarray-Hybridisierung wurden die Transkriptome von H. pylori-Wildtyp und HU-Mutante miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß insgesamt 66 Gene in der HU-Mutante differentiell transkribiert werden, darunter Virulenzgene und Gene für viele andere Zellfunktionen. Diese Daten deuten darauf hin, daß auch HU eine wichtige Rolle in der Kontrolle der globalen Genexpression bei H. pylori spielt. Die erhöhte Expression von Hitzestress-Proteinen, verbunden mit einer verminderten Transkription des Ureasegenclusters, könnte auf eine koordinierte Antwort der Bakterien auf Veränderungen der Umweltbedingungen in ihrer spezifischen ökologischen Nische hinweisen. Nach der Publikation der Gesamtgenomsequenzen von H.pylori 26695 und J99 wurden 2 ORFs (HP 0116 und HP 0440) als Topoisomerase-1-Orthologe annotiert. HP 0116 ist das funktionelle H.pylori Topoisomerase-1-Gen. HP 0442 (topA2) wurde nur in wenigen (5 aus 43) Stämmen nachgewiesen. topA2 ist trotz seines seltenen Vorkommens kein Pseudogen und wird in H.pylori transkribiert. Westernblot-Analysen sprechen dafür, daß TopA2 sich antigenetisch von TopA unterscheidet. Das TopA2-Protein unterscheidet sich ebenfalls funktionell von TopA, da ihm ein funktionell essentielles Zinkfingermotiv fehlt. TopA2 konnte außerdem eine TopA-defiziente E.coli-Mutante nicht funktionell komplementieren. Wie bei topA war auch die Transkription von topA2 von der Wachstumsphase abhängig. Eine Funktion von TopA2 bei der Kontrolle der DNA-Topologie konnte bisher nicht nachgewiesen werden, Transkriptomanalysen zeigten aber, dass TopA2 eine klare Regulationsfunktion hat, da die topA2-Mutante gravierende Veränderungen des Transkriptoms gegenüber dem Wildtyp aufwies. Diese Untersuchungen zeigten, daß 46 Gene in der TopA2-Mutante differentiell reguliert wurden, darunter Flagellengene und Ureasegene. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß TopA2 ein weiterer wichtiger Regulator von sowohl Flagellenbiosynthese als auch Ureasebildung bei H.pylori sein könnte. KW - Helicobacter pylori KW - Genexpression KW - Flagelline KW - Supercoiling KW - regulation KW - flagella Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9878 ER -