TY  - THES
A1  - Bakari Soale, Majeed
T1  - Regulation of the Variant Surface Glycoprotein (VSG) Expression and Characterisation of the Nucleolar DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
T1  - Regulation der Expression des variable Oberflächen- Glykoprotein (VSG) und Charakterisierung des nukleolären DExD/H box Protein Hel66 in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
N2  - The variant surface glycoprotein (VSG) of African trypanosomes plays an essential role in protecting the parasites from host immune factors. These trypanosomes undergo antigenic variation resulting in the expression of a single VSG isoform out of a repertoire of around 2000 genes. The molecular mechanism central to the expression and regulation of the VSG is however not fully understood. 
Gene expression in trypanosomes is unusual due to the absence of typical RNA polymerase II promoters and the polycistronic transcription of genes. The regulation of gene expression is therefore mainly post-transcriptional. Regulatory sequences, mostly present in the 3´ UTRs, often serve as key elements in the modulation of the levels of individual mRNAs. In T. brucei VSG genes, a 100 % conserved 16mer motif within the 3´ UTR has been shown to modulate the stability of VSG transcripts and hence their expression. As a stability-associated sequence element, the absence of nucleotide substitutions in the motif is however unusual. It was therefore hypothesised that the motif is involved in other essential roles/processes besides stability of the VSG transcripts.
In this study, it was demonstrated that the 100 % conservation of the 16mer motif is not essential for cell viability or for the maintenance of functional VSG protein levels. It was further shown that the intact motif in the active VSG 3´ UTR is neither required to promote VSG silencing during switching nor is it needed during differentiation from bloodstream forms to procyclic forms. Crosstalk between the VSG and procyclin genes during differentiation to the insect vector stage is also unaffected in cells with a mutated 16mer motif. Ectopic overexpression of a second VSG however requires the intact motif to trigger silencing and exchange of the active VSG, suggesting a role for the motif in transcriptional VSG switching. The 16mer motif therefore plays a dual role in VSG in situ switching and stability of VSG transcripts. The additional role of the 16mer in the essential process of antigenic variation appears to be the driving force for the 100 % conservation of this RNA motif. 
A screen aimed at identifying candidate RNA-binding proteins interacting with the 16mer motif, led to the identification of a DExD/H box protein, Hel66. Although the protein did not appear to have a direct link to the 16mer regulation of VSG expression, the DExD/H family of proteins are important players in the process of ribosome biogenesis. This process is relatively understudied in trypanosomes and so this candidate was singled out for detailed characterisation, given that the 16mer story had reached a natural end point. Ribosome biogenesis is a major cellular process in eukaryotes involving ribosomal RNA, ribosomal proteins and several non-ribosomal trans-acting protein factors. The DExD/H box proteins are the most important trans-acting protein factors involved in the biosynthesis of ribosomes. Several DExD/H box proteins have been directly implicated in this process in yeast. In trypanosomes, very few of this family of proteins have been characterised and therefore little is known about the specific roles they play in RNA metabolism. Here, it was shown that Hel66 is involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. Hel66 localises to the nucleolus and depleting the protein led to a severe growth defect. Loss of the protein also resulted in a reduced rate of global translation and accumulation of rRNA processing intermediates of both the small and large ribosomal subunits. Hel66 is therefore an essential nucleolar DExD/H protein involved in rRNA processing during ribosome biogenesis. As very few protein factors involved in the processing of rRNAs have been described in trypanosomes, this finding represents an important platform for future investigation of this topic.
N2  - Das variable Oberflächen-Glykoprotein (“varaint surface glycoprotein“, VSG) der Afrikanischen Trypanosomen schützt den Parasiten vor Immunfaktoren des Wirtes. Trypanosomen beherrschen die antigene Variation und expremieren nur eine einzige VSG Isoform aus einem Repertoire von ungefähr 2000 Genen. Der molekulare Mechanismus der die Expression dieser VSG Gene reguliert ist nicht komplett bekannt.
Die Genexpression ist in Trypanosomen sehr ungewöhnlich. Es gibt keine typischen Promotoren für RNA Polymerase II und Gene werden polycistronisch transkribiert. Daher ist die Regulation der Genexpression hauptsächlich posttranskriptional. Die Expression individueller mRNAs wird durch regulatorische Sequenzen reguliert, die sich häufig in den 3´ UTRs befinden. In den VSG Genen von T. brucei moduliert ein zu 100% konserviertes 16mer Motiv in der 3´ UTR die Stabilität der VSG Transkripte und damit deren Expression. Für eine Sequenz, die die Stabilität der mRNA reguliert, ist das Fehlen von Nukleotid Substitutionen sehr ungewöhnlich. Es wurde deshalb spekuliert, dass das 16mer Motiv neben der Stabilisierung des VSG Transkriptes noch an anderen essentiellen Prozessen beteiligt ist.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die 100%ige Konservierung des 16mer Motives weder für das Überleben der Zellen, noch für den Erhalt der Expression des VSG Protein in funktioneller Menge notwendig ist. Außerdem wurde gezeigt dass das intakte Motiv in der 3´UTR des aktiven VSGs weder für das „VSG silencing“ während des VSG Austausches („switching“) noch für die Differenzierung von Blutbahnformen zu prozyklischen Formen benötigt wird. Auch die Interaktionen („crosstalk“), die während der Differenzierung zum Insekten Stadium zwischen den VSG und Prozyklin Genen stattfinden, sind in Zellen mit mutiertem 16mer Motiv noch funktionell. Die ektopische Überexpression eines zweiten VSGs benötigt allerdings das intakte Motiv, um das aktive VSG zu inaktivieren und auszutauschen: dies suggeriert eine Rolle des Motivs im transkriptionalen „VSG switching“. Das 16mer Motif spielt daher eine Doppelrolle bei der Regulation der Stabilität der VSG Transkripte und im VSG in situ
„switching“. Letzteres, die Rolle im essentiellen Prozess der antigenen Variation, ist dabei offensichtlich die treibende Kraft hinter der 100%igen Konservierung des RNA Motives.
Eine Suche nach möglichen RNA bindenden Proteinen, die mit dem 16mer interagieren, führte zur Identifikation des DExD/H box Proteins Hel66. Obwohl das Protein wohl nicht direkt an der Regulation der VSG Expression über das 16mer beteiligt ist, spielen Mitglieder der DexD/H Proteinfamilie eine wichtige Rolle in der Biogenese von Ribosomen. Dieser Prozess ist in Trypanosomen noch nicht komplett verstanden und daher wurde das Protein für eine nähere
 
Analyse ausgewählt, auch weil die 16mer Story ohne weitere Kandidaten zu einem Ende gekommen war. Die Biogenese von Ribosomen ist ein wichtiger zellulärer Prozess in Eukaryoten und benötigt ribosomale RNA, ribosomale Proteine sowie einige nicht-ribosomale, trans-agierende Protein Faktoren. Proteine der DExD/H box Familie sind die wichtigsten trans- agierenden Proteinfaktoren, die an der Biogenese der Ribosomen beteiligt sind. In der Hefe sind mehrere DExD/H box Proteine bekannt, die eine direkte Rolle in diesem Prozess spielen. In Trypanosomen sind erst sehr wenige Proteine aus dieser Familie untersucht worden und es ist daher kaum bekannt, welche spezifische Rollen sie im RNA Metabolismus spielen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Hel66 an der rRNA Prozessierung während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Hel66 ist im Nukleolus lokalisiert und die Reduktion des Proteins durch RNAi führte zu einem schweren Wachstumsphänotyp. Reduktion von Hel66 führte auch zu einer globalen Reduktion der Translation sowie zur Akkumulation von Synthese- Zwischenstadien der rRNAs sowohl der kleinen und als auch der großen ribosomalen Untereinheit. Hel66 ist daher ein essentielles nukleoläres DExD/H Protein dass an der Prozessierung der rRNA während der Biogenese der Ribosomen beteiligt ist. Da bisher erst wenige Proteine bekannt sind, die in Trypanosomen an diesem Prozess beteiligt sind, sind diese Ergebnisse ein sehr wichtiger Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen in der Zukunft.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Genexpression
KW  - Variant Surface Glycoprotein
KW  - VSG
KW  - DExD/H box protein
KW  - Ribosome biogenesis
KW  - rRNA processing
KW  - Ribosome
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258090
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fetiva Mora, Maria Camila
T1  - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration
T1  - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration
N2  - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. 

The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration.

Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration.
N2  - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen.

Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist.

Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht.
KW  - YAP
KW  - B-MYB
KW  - MMB
KW  - enhancers
KW  - transcription
KW  - chromatin accessibility
KW  - opening of chromatin
KW  - closing of chromatin
KW  - cell migration
KW  - G2/M genes
KW  - Chromatin
KW  - Genexpression
KW  - Zellzyklus
KW  - Zellmigration
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910
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TY  - THES
A1  - Jessen, Christina
T1  - NRF2 links antioxidant and immune-relevant features in melanoma
T1  - NRF2 verknüpft antioxidative und immunrelevante Eigenschaften im Melanom
N2  - The transcription factor NRF2 is considered as the master regulator of cytoprotective and ROS-detoxifying gene expression. Due to their vulnerability to accumulating reactive oxygen species, melanomas are dependent on an efficient oxidative stress response, but to what extent melanomas rely on NRF2 is only scarcely investigated so far. In tumor entities harboring activating mutations of NRF2, such as lung adenocarcinoma, NRF2 activation is closely connected to therapy resistance. In melanoma, activating mutations are rare and triggers and effectors of NRF2 are less well characterized.
This work revealed that NRF2 is activated by oncogenic signaling, cytokines and pro-oxidant triggers, released cell-autonomously or by the tumor microenvironment. Moreover, silencing of NRF2 significantly reduced melanoma cell proliferation and repressed well-known NRF2 target genes, indicating basal transcriptional activity of NRF2 in melanoma. Transcriptomic analysis showed a large set of deregulated gene sets, besides the well-known antioxidant effectors. NRF2 suppressed the activity of MITF, a marker for the melanocyte lineage, and induced expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), thereby stabilizing the dedifferentiated melanoma phenotype and limiting pigmentation markers and melanoma-associated antigens. In general, the dedifferentiated melanoma phenotype is associated with a reduced tumor immunogenicity. Furthermore, stress-inducible cyclooxygenase 2 (COX2) expression, a crucial immune-modulating gene, was regulated by NRF2 in an ATF4-dependent manner. Only in presence of both transcription factors was COX2 robustly induced by H2O2 or TNFα. COX2 catalyzes the first step of the prostaglandin E2 (PGE2) synthesis, which was described to be associated with tumor immune evasion and reduction of the innate immune response.
In accordance with these potentially immune-suppressive features, immunocompetent mice injected with NRF2 knockout melanoma cells had a strikingly longer tumor-free survival compared to NRF2-proficient cells. In line with the in vitro data, NRF2-deficient tumors showed suppression of COX2 and induction of MITF. Furthermore, transcriptomic analyses of available tumors revealed a strong induction of genes belonging to the innate immune response, such as RSAD2 and IFIH1. The expression of these genes strongly correlated with immune evasion parameters in human melanoma datasets and NRF2 activation or PGE2 supplementation limited the innate immune response in vitro.
In summary, the stress dependent NRF2 activation stabilizes the dedifferentiated melanoma phenotype and facilitates the synthesis of PGE2. As a result, NRF2 reduces gene expression of the innate immune response and promotes the generation of an immune-cold tumor microenvironment. Therefore, NRF2 not only elevated the ROS resilience, but also strongly contributed to tumor growth, maintenance, and immune control in cutaneous melanoma.
N2  - Der Transkriptionsfaktor NRF2 gilt als Masterregulator der antioxidativen Zellantwort. Im Melanom ist die Rolle von NRF2 bisher nur wenig untersucht worden, obwohl das Melanom anfällig für oxidativen Stress ist und somit eine besondere Abhängigkeit von antioxidativen Prozessen besteht. In Tumorentitäten mit NRF2 aktivierende Mutationen, wie z.B. dem Lungenadenokarzinom, ist die NRF2 Aktivierung mit einer Therapieresistenz verbunden. Allerdings sind diese aktivierenden Mutationen im Melanom selten und Mechanismen, die zu einer NRF2 Aktivierung führen, sind kaum bekannt.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NRF2 hier vor allem durch onkogene Signalwege, Zytokine und pro-oxidative Trigger aktiviert wird. Zudem verringerte die NRF2 Inhibierung die Zellproliferation und reduzierte die Expression von bekannten NRF2 Zielgenen. Dies weist darauf hin, dass die basale Transkriptionsaktivität von NRF2 im Melanom wichtig ist. Neben den bekannten Zielgenen waren außerdem eine Vielzahl von ROS-unabhängigen Gen-Sets dereguliert. Zum einen reduzierte NRF2 die Aktivität von MITF, dem melanozytären Lineage Marker und induzierte die Expression des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors, EGFR. Dadurch stabilisiert NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp, welcher allgemein mit einer verminderten Expression von Pigmentierungsmarkern und Melanom-assoziierten Antigenen verbunden ist. Zum anderen regulierte NRF2 die Expression von Cyclooxygenase 2 (COX2), in Abhängigkeit von dem Transkriptionsfaktor ATF4. COX2 wurde basal und nach H2O2 oder TNFα Stimulation nur in Anwesenheit beider Transkriptionsfaktoren exprimiert. COX2 katalysiert die Prostaglandin E2 (PGE2) Synthese und es wurde beschrieben, dass hohe Konzentrationen an PGE2, sowohl die Immunevasion von Tumoren erleichtert als auch die angeborenen Immunantwort reduziert.
In Übereinstimmung mit diesen potenziell immun-evasiven Eigenschaften zeigten immunkompetente Mäuse, denen NRF2-knockout Melanomzellen injiziert wurden, im Vergleich zu Kontrollzellen, ein deutlich längeres tumorfreies Überleben. Die NRF2-abhängige COX2 Erhöhung und MITF Hemmung, wurde zudem in den Maustumoren bestätigt. Darüber hinaus zeigten die NRF2-defizienten Tumore eine starke Induktion von Genen des angeborenen Immunsystems, wie z.B. RSAD2 und IFIH1. Die Expression dieser Gene korrelierte mit Immunevasionsparametern in Datensätzen des humanen Melanoms und eine NRF2 Aktivierung oder PGE2 Zugabe unterdrückte die Genexpression der angeborene Immunantwort bereits in vitro.
Somit stabilisiert stress-induziertes NRF2 den undifferenzierten Melanom-Phänotyp und fördert die immunmodulierende PGE2 Produktion. Infolgedessen reduziert NRF2 die angeborene Immunantwort und unterstützt die Entstehung einer immun-suppressiven Tumormikroumgebung, welche das Tumorwachstum erleichtert. Die endogene NRF2 Aktivierung im Melanom fördert somit nicht nur die ROS-Resilienz, sondern auch die Tumoraufrechterhaltung und das Tumorwachstum im immunkompetenten Organismus.
KW  - Melanom
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Genexpression
KW  - Krebsforschung
KW  - NRF2
KW  - Antioxidantien
KW  - melanoma dedifferentiation
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-233495
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TY  - THES
A1  - Zimmermann, Henriette
T1  - Antigenic variation and stumpy development in \(Trypanosoma\)  \(brucei\)
T1  - Antigene Variation und Stumpy Entwicklung in \(Trypanosoma\)  \(brucei\)
N2  - The eukaryotic parasite Trypanosoma brucei has evolved sophisticated strategies to persist within its mammalian host. Trypanosomes evade the hosts' immune system by antigenic variation of their surface coat, consisting of variant surface glycoproteins (VSGs). Out of a repertoire of thousands of VSG genes, only one is expressed at any given time from one of the 15 telomeric expression sites (ES). The VSG is stochastically exchanged either by a transcriptional switch of the active ES (in situ switch) or by a recombinational exchange of the VSG within the active ES. However, for infections to persist, the parasite burden has to be limited. The slender (sl) bloodstream form secretes the stumpy induction factor (SIF), which accumulates with rising parasitemia. SIF induces the irreversible developmental transition from the proliferative sl to the cell cycle-arrested but fly-infective stumpy (st) stage once a concentration threshold is reached. Thus, antigenic variation and st development ensure persistent infections and transmissibility. A previous study in monomorphic cells indicated that the attenuation of the active ES could be relevant for the development of trypanosomes. The present thesis investigated this hypothesis using the inducible overexpression of an ectopic VSG in pleomorphic trypanosomes, which possess full developmental competence. These studies revealed a surprising phenotypic plasticity: while the endogenous VSG was always down-regulated upon induction, the ESactivity determined whether the VSG overexpressors arrested in growth or kept proliferating. Full ES-attenuation induced the differentiation of bona fide st parasites independent of the cell density and thus represents the sole natural SIF-independent differentiation trigger to date. A milder decrease of the ES-activity did not induce phenotypic changes, but appeared to prime the parasites for SIF-induced differentiation. These results demonstrate that antigenic variation and development are linked and indicated that the ES and the VSG are independently regulated. Therefore, I investigated in the second part of my thesis how ES-attenuation and VSG-silencing can be mediated. Integration of reporters with a functional or defective VSG 3'UTR into different genomic loci showed that the maintenance of the active state of the ES depends on a conserved motif within the VSG 3'UTR. In situ switching was only triggered when the telomere-proximal motif was partially deleted, suggesting that it serves as a DNA-binding motif for a telomere-associated protein. The VSG levels seem to be additionally regulated in trans based on the VSG 3'UTR independent of the genomic context, which was reinforced by the regulation of a constitutively expressed reporter with VSG 3' UTR upon ectopic VSG overexpression.
N2  - Der eukaryotische Parasit Trypanosoma brucei hat komplexe Strategien entwickelt, um in seinem Säugetierwirt zu überleben. Die Grundlage der Immunevasion ist die antigene Variation des Oberflächenmantels, der aus dem variablen Oberflächenglykoprotein (VSG) besteht. Von mehreren tausend VSG-Genen wird zu jedem Zeitpunkt nur ein einziges aus einer der 15 telomerischen Expressionsstellen (ES) exprimiert. Das VSG kann entweder durch einen transkriptionellen Wechsel der aktiven ES (in situ Wechsel) oder durch einen rekombinatorischen Wechsel des VSG-Gens innerhalb der aktiven ES stochastisch ausgetauscht werden. Damit jedoch eine langanhaltende Infektion des Wirts möglich wird, muss gleichzeitig der Parasitenbefall begrenzt werden. Mit ansteigender Parasitämie akkumuliert der 'stumpy induction factor' (SIF), welcher von der 'slender' (sl) Blutstromform sekretiert wird. Sobald ein Schwellenwert in der SIF-Konzentration erreicht ist, wird die irreversible Differenzierung der proliferativen sl in die zellzyklusarretierte 'stumpy'(st) Form eingeleitet, welche infektiös für den Fliegenvektor ist. Somit stellen antigene Variation und st- Differenzierung das Persistieren der Infektion und die Übertragung des Parasiten sicher. Eine frühere Arbeit mit monomorphen Zellen deutete darauf hin, dass die Attenuierung der aktiven ES eine Rolle für die Differenzierung der Trypanosomen spielen könnte. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht, indem in pleomorphen Zellen mit vollständiger Entwicklungskompetenz ein ektopisches VSG induzierbar überexprimiert wurde. Diese Studien offenbarten eine erstaunliche phänotypische Plastizität: während das endogene VSG nach Induktion runter reguliert wurde, arretierten die VSG-Überexpressoren in Abhängigkeit von der ES-Aktivität entweder im Wachstum oder teilten sich weiter. Die vollständige ES-Attenuierung löste die Differenzierung zu echten st Zellen unabhängig von der Zelldichte aus und ist somit der bisher einzige natürliche SIF-unabhängige Differenzierungsauslöser. Eine mildere Abnahme der ES-Aktivität verursachte keinen Phänotyp, scheint aber die Zellen auf die SIF-induzierte Differenzierung vorzubereiten. Diese Ergebnisse zeigen, dass antigene Variation und Differenzierung verbunden sind und deuteten an, dass die ES und das VSG unabhängig voneinander reguliert werden. Daher habe ich im zweiten Teil meiner Dissertation untersucht, wie ES-Attenuierung und VSG-Stilllegung vermittelt werden können. Die Integration eines Reporters mit funktioneller oder defekter VSG 3'UTR an verschiedenen Orten im Genom zeigte, dass die Aufrechterhaltung der ES-Aktivität von einem konservierten Motiv in der VSG 3'UTR abhängig ist. Ein in situ Wechsel wurde nur ausgelöst, wenn Teile des Telomer-proximalen Motiv deletiert wurden, was nahelegt, dass das Motiv auf DNA-Ebene von einem Telomerbindeprotein erkannt wird. Die VSG-Level scheinen unabhängig vom genomischen Kontext zusätzlich in trans basierend auf der VSG 3'UTR reguliert zu werden, was durch die Regulation eines konstitutiv exprimierten Reporters mit VSG 3'UTR nach VSG-Überexpression bekräftigt wurde.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Genexpression
KW  - Entwicklung
KW  - Parasit
KW  - VSG
KW  - antigenic variation
KW  - monoallelic expression
KW  - stumpy development
KW  - differentiation
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146902
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TY  - THES
A1  - Weinstock [geb. Pattschull], Grit
T1  - Crosstalk between the MMB complex and YAP in transcriptional regulation of cell cycle genes
T1  - Interaktion zwischen dem MMB-Komplex und YAP bei der transkriptionellen Regulation von Zellzyklusgenen
N2  - The Myb-MuvB (MMB) multiprotein complex is a master regulator of cell cycle-dependent gene expression. Target genes of MMB are expressed at elevated levels in several different cancer types and are included in the chromosomal instability (CIN) signature of lung, brain, and breast tumors. 
This doctoral thesis showed that the complete loss of the MMB core subunit LIN9 leads to strong proliferation defects and nuclear abnormalities in primary lung adenocarcinoma cells. Transcriptome profiling and genome-wide DNA-binding analyses of MMB in lung adenocarcinoma cells revealed that MMB drives the expression of genes linked to cell cycle progression, mitosis, and chromosome segregation by direct binding to promoters of these genes. Unexpectedly, a previously unknown overlap between MMB-dependent genes and several signatures of YAP-regulated genes was identified. YAP is a transcriptional co-activator acting downstream of the Hippo signaling pathway, which is deregulated in many tumor types.  Here, MMB and YAP were found to physically interact and co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes, which are important in cancer. Furthermore, the activation of mitotic genes and the induction of entry into mitosis by YAP were strongly dependent on MMB. By ChIP-seq and 4C-seq, the genome-wide binding of MMB upon YAP overexpression was analyzed and long-range chromatin interaction sites of selected MMB target gene promoters were identified. Strikingly, YAP strongly promoted chromatin-association of B-MYB through binding to distal enhancer elements that interact with MMB-regulated promoters through chromatin looping. 
Together, the findings of this thesis provide a so far unknown molecular mechanism by which YAP and MMB cooperate to regulate mitotic gene expression and suggest a link between two cancer-relevant signaling pathways.
N2  - Der Myb-MuvB (MMB) Multiproteinkomplex spielt eine wichtige Rolle in der Expression Zellzyklus abhängiger Gene, welche erhöhte Expressionsraten in verschiedenen Krebsarten aufweisen und Teil der sogenannten chromosomalen Instabilitätssignatur (CIN) von Lungen-, Gehirn- und Brusttumoren sind.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion von LIN9, einer zentralen Untereinheit des MMB-Komplexes, in primären Lungenkarzinomzellen der Maus zu starken Proliferationsdefekten und Anomalitäten des Zellkerns führt. Analysen des gesamten Transkriptoms mit Hilfe von RNA-Seq ergaben, dass der MMB-Komplex die Expression einer Gruppe von Genen reguliert, die mit dem Voranschreiten des Zellzyklus, der Mitose und der Trennung der Chromosomen in Verbindung stehen. Die Regulation dieser Gene erfolgt durch direkte Bindung des MMB-Komplexes an die dazugehörigen Promotoren, wie die Analyse der genomweiten DNA-Bindung des MMB-Komplexes durch ChIP-Seq erkennbar werden ließ. Weiterhin wurde in dieser Arbeit eine neuartige Interaktion zwischen MMB und YAP, einem transkriptionellen Co-Aktivator und Effektorprotein des Hippo-Signalweges, gefunden. Die Dysregulation von Hippo/YAP ist an der Entstehung verschiedener Tumorentitäten beteiligt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass YAP mit Untereinheiten von MMB interagiert und dass beide Signalwege ein überlappendes Set von Zielgenen, die für die Entstehung von Tumoren relevant sind, regulieren. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass YAP den MMB-Komplex benötigt, um die Expression mitotischer Gene zu aktivieren und dass der durch YAP induzierte Eintritt in die Mitose vom MMB-Komplex abhängig ist. 
In einem weiteren Teil der Arbeit wurden mittels ChIP-Seq und 4C-Seq Chromatin-Interaktionen von Promotoren der MMB-Zielgene mit weiter entfernt liegenden Bereichen des Genoms identifiziert. Hierbei konnte festgestellt werden, dass YAP die Bindung der MMB-Untereinheit B-MYB an die Promotoren der MMB-Zielgene verstärkt, indem es an weiter entfernte Enhancer bindet. Diese von YAP gebundenen Enhancer interagieren über Schleifenbildung des Chromatins mit den Promotoren MMB-regulierter Gene. Zusammengefasst konnten die Ergebnisse dieser Arbeit einen bisher unbekannten molekularen Mechanismus für die gemeinsame Regulation von Genen durch den MMB Komplex und YAP enthüllen und somit einen Zusammenhang zwischen zwei krebsrelevanten Signalwegen aufdecken.
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Zellteilung
KW  - Genexpression
KW  - MMB complex
KW  - Hippo pathway
KW  - mitosis
KW  - cytokinesis
KW  - mitotic gene expression
KW  - Lungenkrebs
KW  - Mitose
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170866
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TY  - THES
A1  - Sauer, Markus
T1  - DHX36 function in RNA G-quadruplex-mediated posttranscriptional gene regulation
T1  - Funktion von DHX36 in RNA G-Quadruplex-vermittelter posttranskriptioneller Genregulierung
N2  - The expression of genetic information into proteins is a key aspect of life. The efficient and exact regulation of this process is essential for the cell to produce the correct amounts of these effector molecules to a given situation. For this purpose, eukaryotic cells have developed many different levels of transcriptional and posttranscriptional gene regulation. These mechanisms themselves heavily rely on interactions of proteins with associated nucleic acids. In the case of posttranscriptional gene regulation an orchestrated interplay between RNA-binding proteins, messenger RNAs (mRNA), and non-coding RNAs is compulsory to achieve this important function.
A pivotal factor hereby are RNA secondary structures. One of the most stable and diverse representatives is the G-quadruplex structure (G4) implicated in many cellular mechanisms, such as mRNA processing and translation. In protein biosynthesis, G4s often act as obstacles but can also assist in this process. However, their presence has to be tightly regulated, a task which is often fulfilled by helicases.
One of the best characterized G4-resolving factors is the DEAH-box protein DHX36. The in vitro function of this helicase is extensively described and individual reports aimed to address diverse cellular functions as well. Nevertheless, a comprehensive and systems-wide study on the function of this specific helicase was missing, so far.
The here-presented doctoral thesis provides a detailed view on the global cellular function of DHX36. The binding sites of this helicase were defined in a transcriptome-wide manner, a consensus binding motif was deviated, and RNA targets as well as the effect this helicase exerts on them were examined. In human embryonic kidney cells, DHX36 is a mainly cytoplasmic protein preferentially binding to G-rich and G4-forming sequence motifs on more than 4,500 mRNAs. Loss of DHX36 leads to increased target mRNA levels whereas ribosome occupancy on and protein output of these transcripts are reduced. Furthermore, DHX36 knockout leads to higher RNA G4 levels and concomitant stress reactions in the cell. I hypothesize that, upon loss of this helicase, translationally-incompetent structured DHX36 target mRNAs, prone to localize in stress granules, accumulate in the cell. The cell reacts with basal stress to avoid cytotoxic effects produced by these mis-regulated and structured transcripts.
N2  - Die Umsetzung genetischer Information in Proteine stellt einen Schlüsselaspekt des Lebens dar. Dabei ist die effiziente und exakte Regulierung dieses Prozesses für die Zelle essentiell, um die korrekte Menge dieser Effektormoleküle in einer gegebenen Situation zu produzieren. Zu diesem Zweck haben eukaryotische Zellen viele verschiedene Ebenen der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation entwickelt. Diese Mechanismen wiederum beruhen insbesondere auf den Interaktionen von Proteinen mit assoziierten Nukleinsäuren. Im Fall der posttranskriptionellen Genregulation ist ein abgestimmtes Wechselspiel zwischen RNA-bindenden Proteinen, Boten-RNAs und nicht-kodierenden RNAs zwingend erforderlich um diese wichtige Funktion zu erfüllen.
Ein zentrales Element hierbei bilden RNA-Sekundärstrukturen. Einer der stabilsten und variantenreichsten Vertreter dieser Strukturen ist die G-Quadruplexstruktur (G4), die in vielen zellulären Mechanismen, wie zum Beispiel Prozessierung und Translation der Boten-RNA, involviert ist. Während der Proteinbiosynthese agieren G4s häufig als Hindernisse, können diesen Prozess allerdings auch unterstützen. In beiden Fällen muss deren Präsenz genau reguliert werden, was häufig durch Helikasen erfolgt.
Einer der bestcharakterisiertesten, G4-entwindenden Faktoren ist das DEAH-Box Protein DHX36. Die in vitro Funktion dieser Helikase wurde bereits ausführlich beschrieben und einzelne Berichte haben darüber hinaus versucht, ihr verschiedene Funktionen in der Zelle zuzuweisen. Nichtsdestotrotz fehlt bislang eine umfassende und systemweite Studie zur Funktion dieser speziellen Helikase.
Die hier präsentierte Doktorarbeit liefert einen detaillierten Blick auf die globale Funktion von DHX36 in der Zelle. Bindestellen dieser Helikase im Transkriptom wurden definiert, ein allgemeines Bindemotiv abgeleitet und RNA-Bindeziele sowie der Effekt, den diese Helikase auf jene ausübt, untersucht. In humanen embryonalen Nierenzellen ist DHX36 ein vorwiegend zytoplasmatisches Protein, das bevorzugt G-reiche und G4-bildende Sequenzmotive auf über 4.500 Boten-RNAs bindet. Verlust von DHX36 führt zu einem erhöhten Level dieser Boten-RNAs in der Zelle, wobei deren Besetzung mit Ribosomen und die damit verbundene Proteinproduktion reduziert ist. Weiterhin führt der Verlust von DHX36 zu einem höheren RNA G4 Level und zu gleichzeitigen Stressreaktionen in der Zelle. Meine Vermutung ist, dass sich bei einem Verlust von DHX36 translationsinkompetente, strukturierte und leicht akkumulierende Ziel-Boten-RNAs in der Zelle anreichern. Die Zelle reagiert darauf mit basalem Stress um zytotoxische Effekte dieser miss-regulierten und strukturierten Transkripte zu vermeiden.
KW  - RNS
KW  - Helicasen
KW  - Genexpression
KW  - RNA secondary structures
KW  - G-quadruplex
KW  - RNA protein interactions
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183954
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kiser, Dominik Pascal
T1  - Gene x Environment Interactions in Cdh13-deficient Mice: CDH13 as a Factor for Adaptation to the Environment
T1  - Gen x Umwelt-Interaktionen in Cdh13-defizienten Mäusen: CDH13 als ein Faktor für Umweltanpassung
N2  - Neurodevelopmental disorders, including attention-deficit/hyperactivity disorder (ADHD) and autism spectrum disorder (ASD) are disorders of mostly unknown etiopathogenesis, for which both genetic and environmental influences are expected to contribute to the phenotype observed in patients. Changes at all levels of brain function, from network connectivity between brain areas, over neuronal survival, synaptic connectivity and axonal growth, down to molecular changes and epigenetic modifications are suspected to play a key roles in these diseases, resulting in life-long behavioural changes.
Genome-wide association as well as copy-number variation studies have linked cadherin-13 (CDH13) as a novel genetic risk factor to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. CDH13 is highly expressed during embryonic brain development, as well as in the adult brain, where it is present in regions including the hippocampus, striatum and thalamus (among others) and is upregulated in response to chronic stress exposure. It is however unclear how CDH13 interacts with environmentally relevant cues, including stressful triggers, in the formation of long-lasting behavioural and molecular changes. It is currently unknown how the environment influences CDH13 and which long term changes in behaviour and gene expression are caused by their interaction. This work therefore investigates the interaction between CDH13 deficiency and neonatal maternal separation (MS) in mice with the aim to elucidate the function of CDH13 and its role in the response to early-life stress (ELS).
For this purpose, mixed litters of wild-type (Cdh13+/+), heterozygous (Cdh13+/-) and homozygous knockout (Cdh13-/-) mice were maternally separated from postnatal day 1 (PN1) to postnatal day 14 (PN14) for 3 hours each day (180MS; PN1-PN14). In a first series of experiments, these mice were subjected to a battery of behavioural tests starting at 8 weeks of age in order to assess motor activity, memory functions as well as measures of anxiety. Subsequently, expression of RNA in various brain regions was measured using quantitativ real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). A second cohort of mice was exposed to the same MS procedure, but was not behaviourally tested, to assess molecular changes in hippocampus using RNA sequencing.
Behavioural analysis revealed that MS had an overall anxiolytic-like effect, with mice after MS spending more time in the open arms of the elevated-plus-maze (EPM) and the light compartment in the light-dark box (LDB). As a notable exception, Cdh13-/- mice did not show an increase of time spent in the light compartment after MS compared to Cdh13+/+ and Cdh13+/- MS mice. During the Barnes-maze learning task, mice of most groups showed a similar ability in learning the location of the escape hole, both in terms of primary latency and primary errors. Cdh13-/- control (CTRL) mice however committed more primary errors than Cdh13-/- MS mice. In the contextual fear conditioning (cFC) test, Cdh13-/- mice showed more freezing responses during the extinction recall, indicating a reduced extinction of fear memory. In the step-down test, an impulsivity task, Cdh13-/- mice had a tendency to wait longer before stepping down from the platform, indicative of more hesitant behaviour. In the same animals, qRT-PCR of several brain areas revealed changes in the GABAergic and glutamatergic systems, while also highlighting changes in the gatekeeper enzyme Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a), both in relation to Cdh13 deficiency and MS. Results from the RNA sequencing study and subsequent gene-set enrichment analysis revealed changes in adhesion and developmental genes due to Cdh13 deficiency, while also highlighting a strong link between CDH13 and endoplasmatic reticulum function. In addition, some results suggest that MS increased pro-survival pathways, while a gene x environment analysis showed alterations in apoptotic pathways and migration, as well as immune factors and membrane metabolism. An analysis of the overlap between gene and environment, as well as their interaction, highlighted an effect on cell adhesion factors, underscoring their importance for adaptation to the environment.
Overall, the stress model resulted in increased stress resilience in Cdh13+/+ and Cdh13+/- mice, a change absent in Cdh13-/- mice, suggesting a role of CDH13 during programming and adaptation to early-life experiences, that can results in long-lasting consequences on brain functions and associated behaviours. These changes were also visible in the RNA sequencing, where key pathways for cell-cell adhesion, neuronal survival and cell-stress adaptation were altered. In conclusion, these findings further highlight the role of CDH13 during brain development, while also shedding light on its function in the adaptation and response during (early life) environmental challenges.
N2  - Neuronale Entwicklungsstörungen (NES), wie Aufmerksamkeitsdefizit-Hyperaktivitätssyndrom (ADHS) oder Autismus Spektrums Störung (ASS), haben eine größtenteils unbekannte Krankheitsentwicklung, deren klinisches Erscheinungsbild bei dem Patienten durch die individuelle Genetik und Umwelt beieinflusst wird. Veränderungen in allen funktionellen Ebenen des Gehirns, von Netzwerkaktivität zwischen unterschiedlichen Gehirnregionen, über synaptischer Verschaltung,  axonalem Wachstum und den Überlebenschancen einzelner Neuronen, bis hin zu molekularen und epigenetischen Modifikationen werden als Schlüsselrollen in NES betrachtet, welche schlussendlich zu langfristigen Verhaltensauffälligkeiten führen.
Genome-weite-Assoziations und genomische Kopiezahlvariations Studien haben Cadherin 13 (CDH13) als neuartiges Risikogen für neuropsychiatrische und neuronale Entwicklungsstörungen identifizieren können. CDH13 wird sowohl während der embryonalen Entwicklung, als auch im adulten Gehirn, stark exprimiert und kann dort in Regionen wie dem Hippocampus, Striatum und Thalamus gefunden werden. Darüber hinaus wird es als Reaktion auf akuten (physiologischen und psychologischen) Stress exprimiert. Gegenwärtig ist jedoch nicht bekannt, wie Umwelteinflüsse mit CDH13 interagieren und langanhaltende Veränderungen im Verhalten und der Gene Expression im Gehirn herbeiführen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die Interaktion zwischen CDH13 und Stress während eines frühen Lebensabschnitts.
Hierfür wurden Würfe mit wildtyp (Cdh13+/+), heterozygoten (Cdh13+/-) und homozygoten knockout (Cdh13-/-) Mäusen zwischen dem ersten und vierzehnten Tag nach der Geburt für jeweils 3 Stunden von ihren Müttern getrennt (englisch: maternal separation, MS). In einem ersten Experiment wurden diese Mäuse dann im Alter von 8 Wochen in einer Reihe von Verhaltensversuchen auf ihre motorischen Fähigkeiten und Gedächtnisleistung getestet. Im Anschluss daran wurde mittels der quantitativen Polymerase Kettenreaktion (qPCR) verschiedene Gehirnregionen dieser Tiere auf Expressionsunterschiede in Faktoren für Neurotransmittersysteme, Neurogenese und DNA Methylierungsmechanismen hin analysiert. Das Hippocampus-Gewebe einer zweiten gleich aufgebauten Versuchsgruppe wurde mittels RNA Sequenzierung untersucht.
Die Verhaltensanalyse zeigt das MS einen überwiegend angst-lindernden Einfluss auf die Mäuse hatte. Im Vergleich zu Mäusen ohne MS verbrachten MS-Mäuse mehr Zeit auf dem offenen Arm eines erhöhten Plus-Labyrinths, so wie in der hell-erleuchteten Seite einer Hell-Dunkel Box (HDB). Eine auffallende Ausnahme stellten jedoch die Cdh13-/- Mäuse dar, welche in der HDB keinen Zeitanstieg wie ihre Cdh13+/+ und Cdh13+/- MS Geschwister auf der hell-erleuchteten Seite aufwiesen. In dem Barnes Labyrinth (einem Test für räumliches Lernen) zeigte sich, dass alle Tiere, gemessen an den Fehlern und der Zeit die sie brauchten bis sie den Ausgang fanden, zunächst ähnliche Lernerfolge hatten. Im zweiten Teil des Experiments, in dem der Ausgang auf eine neue Position gelegt wurde, begangen Cdh13-/- Mäuse ohne MS hingegen mehr Fehler als Cdh13-/- MS Mäusee. In der Kontext-Angst-Konditionierung (KAK) zeigten männliche Cdh13-/- Mäuse mehr Angst-Starre während der Extinktions-Wiederholung; ein Befund der eine reduzierte Angst-Auslöschung impliziert. Im Abstiegs-Test, einem Impulsivitätstest, blieben Cdh13-/- Mäuse länger auf einem Podest stehen. Mittels qPCR konnte außerdem gezeigt werden dass sowohl ein Cdh13-/- Defizit, als auch MS, Veränderungen von GABAergen und glutamatergen Faktoren, so wie Änderungen in dem wichtigen Signalmolekühl Glykogensynthase-Kinase 3 (Gsk3a) verursacht haben. Die Ergebnisse der RNA Sequenzierung zeigten eine Anreicherung von Veränderungen in Adhesions-, Entwicklungs- und Endoplasmatischen Reticulumgenen in Cdh13-/- defiziten Tieren im Vergleich zu Cdh13+/+ Mäusen. Im selben Versuch trug MS zu einer erhöhten Aktivierung von Anti-Apoptotischen Signalwegen im Hippocampus bei, während Zell-Adhesionsmoleküle maßgeblich von der Wechselwirkung beider Faktoren betroffen waren.
Zusammenfassend waren Cdh13+/+ und Cdh13+/- Mäuse im Gegensatz zu Cdh13-/- Tieren größtenteils stressresitenter, während die RNA Sequenzierung aufzeigte, dass CDH13 Schlüsselkomponenten von Zell-Zell-Adhesions, Überlebens und Zell-Stress-Signalwegen reguiert. Dies suggeriert, dass CDH13 die Programmierung und Anpassung an Umwelteinflüsse steuert, was wiederum lang anhaltende Auswirkungen auf molekularer Ebene und auf das Verhalten der Mäuse zur Folge hat. Abschließend legen die Befunde eine Rolle von CDH13 in der Umgebungsanpassung während der Entwicklung nahe.
KW  - Cadherine
KW  - Genexpression
KW  - Tiermodell
KW  - Animales Nervensystem
KW  - Verhalten
KW  - Cdh13
KW  - RNA Sequencing
KW  - Gene by Environment
KW  - Neurodevelopmental Disorder
KW  - ADHD
KW  - Hippocampus
KW  - Prefrontal cortex
KW  - Amygdala
KW  - Raphe
KW  - Adaptation
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-179591
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wedel, Carolin
T1  - The impact of DNA sequence and chromatin on transcription in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
T1  - Der Einfluss der DNA-Sequenz und der Chromatinstruktur auf die Transkription in \(Trypanosoma\) \(brucei\)
N2  - For cellular viability, transcription is a fundamental process. Hereby, the DNA plays the most elemental and highly versatile role. It has long been known that promoters contain conserved and often well-defined motifs, which dictate the site of transcription initiation by providing binding sites for regulatory proteins. However, research within the last decade revealed that it is promoters lacking conserved promoter motifs and transcribing constitutively expressed genes that constitute the majority of promoters in eukaryotes. While the process of transcription initiation is well studied, whether defined DNA sequence motifs are required for the transcription of constitutively expressed genes in eukaryotes remains unknown. In the highly divergent protozoan parasite Trypanosoma brucei, most of the proteincoding genes are organized in large polycistronic transcription units. The genes within one polycistronic transcription unit are generally unrelated and transcribed by a common transcription start site for which no RNA polymerase II promoter motifs have been identified so far. Thus, it is assumed that transcription initiation is not regulated but how transcription is initiated in T. brucei is not known. This study aimed to investigate the requirement of DNA sequence motifs and chromatin structures for transcription initiation in an organism lacking transcriptional regulation. To this end, I performed a systematic analysis to investigate the dependence of transcription initiation on the DNA sequence. I was able to identify GT-rich promoter elements required for directional transcription initiation and targeted deposition of the histone variant H2A.Z, a conserved component during transcription initiation. Furthermore, nucleosome positioning data in this work provide evidence that sites of transcription initiation are rather characterized by broad regions of open and more accessible chromatin than narrow nucleosome depleted regions as it is the case in other eukaryotes. These findings highlight the importance of chromatin during transcription initiation. Polycistronic RNA in T. brucei is separated by adding an independently transcribed miniexon during trans-splicing. The data in this work suggest that nucleosome occupancy plays an important role during RNA maturation by slowing down the progressing polymerase and thereby facilitating the choice of the proper splice site during trans-splicing. Overall, this work investigated the role of the DNA sequence during transcription initiation and nucleosome positioning in a highly divergent eukaryote. Furthermore, the findings shed light on the conservation of the requirement of DNA motifs during transcription initiation and the regulatory potential of chromatin during RNA maturation. The findings improve the understanding of gene expression regulation in T. brucei, a eukaryotic parasite lacking transcriptional Regulation.
N2  - Die Transkription ist ein entscheidender Prozess in der Zelle und die DNA-Sequenz nimmt hierbei eine elementare Rolle ein. Promotoren beinhalten spezifische und konservierte DNASequenzen und vermitteln den Start der Transkription durch die Rekrutierung spezifischer Proteine. Jedoch haben Forschungen im vergangenen Jahrzehnt gezeigt, dass die Mehrzahl der Promotoren in eukaryotischen Genomen keine konservierten Promotormotive aufweisen und häufig konstitutiv exprimierte Gene transkribieren. Obgleich der Prozess der Transkriptionsinitiation im Allgemeinen gut erforscht ist, konnte bisher nicht nachgewiesen werden, ob ein definiertes DNA-Motiv während der Transkription von konstitutiv exprimierten Genes erforderlich ist. In dem eukaryotischen und einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei ist die Mehrzahl der proteinkodierenden Gene in lange polycistronische Transkriptionseinheiten arrangiert. Diese werden von einem gemeinsamen Transkriptionsstart durch die RNA Polymerase II transkribiert, allerdings konnten hier bisher keine Promotormotive identifiziert werden. Aus diesem Grund besteht die Annahme, dass Transkription keiner Regulation unterliegt. Allgemein ist der Prozess der Transkriptionsinitiation in T. brucei bisher nur wenig verstanden. Um den Zusammenhang zwischen DNA-Motiven und konstitutiver Genexpression näher zu untersuchen und Schlussfolgerungen über die DNA-Sequenz-Abhängigkeit der Transkriptionsinitiation zu ziehen, habe ich eine systematische Analyse in T. brucei durchgeführt. Ich konnte GT-reiche Promotorelemente innerhalb dieser Regionen identifizieren, die sowohl eine gerichtete Transkriptionsinitiation, als auch den gezielten Einbau der Histonvariante H2A.Z in Nukleosomen nahe der Transkriptionsstartstelle vermittelt haben. Des Weiteren zeigten Nukleosomenpositionierungsdaten, dass in Trypanosomen die Transkripitonsstartstellen nicht die charakteristische, nukleosomendepletierte Region, wie für andere Organismen beschrieben, sondern eine offene Chromatinstruktur enthalten. Zusätzlich konnte ich zeigen, dass die Chromatinstruktur eine wichtige Rolle während der mRNAProzessierung spielt. In T. brucei wird die polycistronische pre-mRNA durch das Anfügen eines Miniexons während des sogenannten trans-Splicens in individuelle mRNAs aufgetrennt. Die Daten dieser Arbeit belegen, dass die Anreicherung von Nukleosomen eine Verlangsamung der transkribierenden Polymerase bewirken und sie somit die richtige Wahl der Splicestelle gewährleisten. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Rolle der DNA Sequenz während der Transkriptionsinitiation und Nukleosomenpositionierung in einem divergenten Eukaryoten untersucht. Die Erkenntnisse bringen mehr Licht in die Konservierung der Notwendigkeit eines DNA-Motivs während der Transkriptionsinitiation und das regulatorische Potential der Chromatinstruktur während der RNA-Reifung. Zudem verbessern sie das Verständnis der Genexpressionsregulation in T. brucei, einem eukaryotischen Parasiten, der ohne transkriptionelle Regulation überlebt.
KW  - Transkription
KW  - Chromatin
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Genexpression
KW  - Epigenetik
KW  - RNA polymerase II
KW  - splicing
KW  - nuclesosome positioning
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173438
ER  - 
TY  - THES
A1  - Sommerlandt, Frank M. J.
T1  - Mechanisms of visual memory formation in bees: About immediate early genes and synaptic plasticity
T1  - Mechanismen der visuellen Gedächtnisbildung bei Bienen: Über unmittelbar früh exprimierte Gene und synaptische Plastizität
N2  - Animals form perceptual associations through processes of learning, and retain that information through mechanisms of memory. Honeybees and bumblebees are classic models for insect perception and learning, and despite their small brains with about one million neurons, they are organized in highly social colonies and possess an astonishing rich behavioral repertoire including navigation, communication and cognition. Honeybees are able to harvest hundreds of morphologically divergent flower types in a quick and efficient manner to gain nutrition and, back in the hive, communicate discovered food sources to nest mates. To accomplish such complex tasks, bees must be equipped with diverse sensory organs receptive to stimuli of different modalities and must be able to associatively learn and memorize the acquired information. Particularly color vision plays a prominent role, e.g. in navigation along landmarks and when bees identify inflorescences by their color signals. Once acquired, bees are known to retain visual information for days or even months. Numerous studies on visual perception and color vision have been conducted in the past decades and largely revealed the information processing pathways in the brain. In contrast, there are no data available on how the brain may change in the course of color learning experience and whether pathways differ for coarse and fine color learning. Although long-term memory (LTM) storage is assumed to generally include reorganization of the neuronal network, to date it is unclear where in the bee brain such changes occur in the course of color learning and whether visual memories are stored in one particular site or decentrally distributed over different brain domains. The present dissertation research aimed to dissect the visual memory trace in bees that is beyond mere stimulus processing and therefore two different approaches were elaborated: first, the application of immediate early genes (IEG) as genetic markers for neuronal activation to localize early processes underlying the formation of a stable LTM. Second, the analysis of late consequences of memory formation, including synaptic reorganization in central brain areas and dependencies of color discrimination complexity. 
Immediate early genes (IEG) are a group of rapidly and transiently expressed genes that are induced by various types of cellular stimulation. A great number of different IEGs are routinely used as markers for the localization of neuronal activation in vertebrate brains. The present dissertation research was dedicated to establish this approach for application in bees, with focus on the candidate genes Amjra and Amegr, which are orthologous to the two common vertebrate IEGs c-jun and egr-1. First the general requirement of gene transcription for visual LTM formation was proved. Bumblebees were trained in associative proboscis extension response (PER) conditioning to monochromatic light and subsequently injected with an inhibitor of gene transcription. Memory retention tests at different intervals revealed that gene transcription is not required for the formation of a mid-term memory, but for stable LTM. Next, the appliance of the candidate genes was validated. Honeybees were exposed to stimulation with either alarm pheromone or a light pulse, followed by qPCR analysis of gene expression. Both genes differed in their expression response to sensory exposure: Amjra was upregulated in all analyzed brain parts (antennal lobes, optic lobes and mushroom bodies, MB), independent from stimulus modality, suggesting the gene as a genetic marker for unspecific general arousal. In contrast, Amegr was not significantly affected by mere sensory exposure. Therefore, the relevance of associative learning on Amegr expression was assessed. Honeybees were trained in visual PER conditioning followed by a qPCR-based analysis of the expression of all three Amegr isoforms at different intervals after conditioning. No learning-dependent alteration of gene expression was observed. However, the presence of AmEgr protein in virtually all cerebral cell nuclei was validated by immunofluorescence staining. The most prominent immune-reactivity was detected in MB calyx neurons.
Analysis of task-dependent neuronal correlates underlying visual long-term memory was conducted in free-flying honeybees confronted with either absolute conditioning to one of two perceptually similar colors or differential conditioning with both colors. Subsequent presentation of the two colors in non-rewarded discrimination tests revealed that only bees trained with differential conditioning preferred the previously learned color. In contrast, bees of the absolute conditioning group chose randomly among color stimuli. To investigate whether the observed difference in memory acquisition is also reflected at the level of synaptic microcircuits, so called microglomeruli (MG), within the visual domains of the MB calyces, MG distribution was quantified by whole-mount immunostaining three days following conditioning. Although learning-dependent differences in neuroarchitecture were absent, a significant correlation between learning performance and MG density was observed.
Taken together, this dissertation research provides fundamental work on the potential use of IEGs as markers for neuronal activation and promotes future research approaches combining behaviorally relevant color learning tests in bees with examination of the neuroarchitecture to pave the way for unraveling the visual memory trace.
N2  - Tiere erlangen Informationen über die Umwelt durch Lernprozesse und speichern diese Informationen durch Mechanismen der Gedächtnisbildung. Honigbienen und Hummeln stellen klassische Modellorganismen zur Untersuchung von sensorischer Perzeption und Lernvorgängen dar. Trotz ihres kleinen, lediglich etwa eine Millionen Nervenzellen umfassenden Gehirns sind diese hoch sozialen Bienen zu erstaunlichen Verhaltensleistungen fähig, welche komplexe Navigation, Kommunikation und Kognition einschließen. Auf der Suche nach Futterquellen navigieren Honigbienen über große Distanzen, ohne dabei die Lage ihres Nestes aus dem Gedächtnis zu verlieren. Außerdem sammeln sie hoch effizient Futter an zahlreichen morphologisch divergenten Blütentypen und kommunizieren neu erschlossene Futterstellen anderen Sammelbienen im Nest. Zur Bewältigung solch komplexer Aufgaben stehen Bienen diverse sensorische Organe zur Verfügung, womit sie Reize unterschiedlicher Modalitäten wahrnehmen und verarbeiten können. Außerdem sind sie zu assoziativem Lernen und dem Speichern und Abrufen von Informationen in der Lage. Insbesondere der Sehsinn spielt für Bienen eine große Rolle, wenn sie sich beispielsweise anhand von Landmarken orientieren oder farbige Blütensignale wahrnehmen. Einmal erlernte visuelle Informationen können mitunter über Tage und Monate hinweg gespeichert werden. Während die Aufnahme und Verarbeitung von Farbinformationen im Bienengehirn bereits gut untersucht wurde, ist über räumliche und zeitliche Abläufe der Speicherung solcher Informationen wenig bekannt. Mit der vorliegenden Arbeit wurde versucht, experimentellen Zugang zur visuellen Gedächtnisspur in Bienen zu bekommen. Die Bildung eines Langzeitgedächtnisses (LZG) geht im Allgemeinen mit Umstrukturierungsprozessen im neuronalen Netzwerk einher. Bislang ist es jedoch unklar, wo im Gehirn diese Veränderungen im Laufe des Farbenlernens stattfinden und ob Informationen in einem zentralen Bereich gespeichert oder dezentral über verschiedene Gehirndomänen verteilt werden. Unterschiedliche Verarbeitungsbahnen werden für das Erlernen grober und feiner Farbunterschiede vermutet. Mit der vorliegenden Arbeit wurden zwei Versuchsansätze gewählt, womit die Lage des visuellen Gedächtnisses untersucht werden sollte: Zum einen wurde die Eignung unmittelbar exprimierter Gene (immediate early genes, IEG) als genetische Marker für neuronale Aktivität untersucht, um damit frühe Prozesse der Bildung eines LZG lokalisieren zu können. Zum anderen wurden Spätfolgen der Bildung eines LZG auf die Organisation synaptischer Netzwerke im zentralen Gehirn untersucht und der Einfluss der Komplexität einer Aufgabenstellung auf diese Organisation betrachtet.
IEGs sind eine Gruppe von Genen, die in Antwort auf zelluläre Stimulierung schnell und vorübergehend exprimiert werden. Zahlreiche IEGs werden bereits routinemäßig als Marker für neuronale Aktivierung im Gehirn von Vertebraten eingesetzt und mit der vorliegenden Arbeit sollten die Möglichkeiten evaluiert werden, diesen Ansatz auch in Bienen nutzbar zu machen. Hierzu wurde zunächst ermittelt, ob die Transkription von Genen überhaupt für die Ausbildung eines visuellen LZG von Nöten ist. Hummeln wurden mit Hilfe der Proboscis-Streckreaktion (PER) trainiert, monochromatisches Licht mit Zuckerbelohnung zu assoziieren. Nach erfolgtem Training wurde die Gentranskription pharmazeutisch gehemmt und die Gedächtnisleistung der Hummeln zu zwei Zeitpunkten ermittelt, die das Mittelzeitgedächtnis (MZG) bzw. LZG repräsentieren. Es zeigte sich, dass Gentranskription nicht für die Ausbildung des MZG, jedoch für die des LZG unabdingbar ist. Als nächstes wurden mögliche Kandidatengene validiert. Honigbienen wurden entweder mit Alarmpheromon oder einem Lichtimpuls stimuliert. Die Bienengehirne wurden anschließend seziert und mittels qPCR die Expression von Amjra und Amegr untersucht, zweier Gene, deren orthologe Vertreter c-jun bzw. egr-1 gebräuchliche IEGs in Vertebraten darstellen. Während durch beide Reize die Expression von Amjra in allen Gehirnbereichen (Antenalloben, optische Loben und Pilzkörper) induziert wurde, konnten keine Veränderungen in der Expression von Amegr festgestellt werden. Daraufhin wurde überprüft, ob die Induktion von Amegr möglicherweise abhängig von assoziativen Lernvorgängen ist. Honigbienen wurden mittels PER visuell konditioniert, bevor die Pilzkörper zu verschiedenen Zeiten nach dem Training isoliert und mittels qPCR auf die Expression von Amegr Isoformen untersucht wurden. Hierbei konnte kein Lerneffekt auf die Amegr-Expression nachgewiesen werden.
Die Analyse Aufgaben-abhängiger neuronaler Korrelate, die der Bildung des visuellen LZG zugrunde liegen, wurde anhand frei-fliegender Honigbienen durchgeführt. Diese wurden entweder absolut konditioniert auf eine von zwei ähnlichen Farben, oder differentiell auf die Diskriminierung beider Farben. Bei der anschließenden unbelohnten Präsentation beider Farben bevorzugte nur die differentiell trainierte Gruppe die zuvor gelernte Farbe, während absolut konditionierte Bienen zufällig wählten. Um zu ermitteln, ob die beobachteten Unterschiede im Verhalten auch auf neuroanatomischer Ebene repräsentiert werden, wurden alle Bienen nach drei Tagen seziert und mittels Immunfärbung synaptische Komplexe, so genannte Microglomeruli, im visuelle Informationen verarbeitenden Bereich der Pilzkörper quantifiziert. Der Vergleich zwischen den Versuchsgruppen legte keine signifikanten Unterschiede in der neuronalen Architektur offen, jedoch wurden mögliche Zusammenhänge zwischen Lernleistung und Microglomeruli-Dichte gefunden.
Die vorliegende Arbeit bietet grundlegende Ergebnisse zum Potential von IEGs als Marker neuronaler Aktivität und unterstreicht die Bedeutung integrativer Versuchsansätze, welche Verhaltensuntersuchungen mit der molekularen und histologischen Analyse des Nervensystems verbinden, um letztlich das visuelle Gedächtnis im Bienengehirn lokalisieren zu können.
KW  - Biene
KW  - Langzeitgedächtnis
KW  - Bestäubung
KW  - Farbensehen
KW  - insect visual learning
KW  - long-term memory formation
KW  - mushroom body calyx microglomeruli
KW  - neuronal activation
KW  - IEG
KW  - Bienen Dressur Lernen
KW  - Pilzkörper
KW  - visuelles Langzeitgedächtnis
KW  - Genexpression
KW  - Bestäubung Pollination Honigbiene Hummel
KW  - Soziale Insekten
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136997
ER  - 
TY  - THES
A1  - Simann, Meike
T1  - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen
T1  - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells
N2  - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach.

This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. 

Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect.

The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature.

Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis.
N2  - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden.
Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte.
Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung.
Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst.
Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind.
KW  - Mesenchymzelle
KW  - Genexpression
KW  - Fibroblastenwachstumsfaktor
KW  - Osteoporose
KW  - Fettzelle
KW  - Bone marrow stromal cell (BMSC)
KW  - Osteogenesis
KW  - Adipogenesis
KW  - Differentiation
KW  - adipocytes
KW  - Mesenchymale Stammzelle
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322
ER  -