TY  - THES
A1  - Schweinlin, Matthias Oliver
T1  - Development of advanced human intestinal in vitro models
T1  - Entwicklung von erweiterten humanen intestinalen in vitro Modellen
N2  - The main function of the small intestine is the absorption of essential nutrients, water and vitamins. Moreover, it constitutes a barrier protecting us from toxic xenobiotics and pathogens. For a better understanding of these processes, the development of intestinal in vitro models is of great interest to the study of pharmacological and pathological issues such as transport mechanisms and barrier function. Depending on the scientific questions, models of different complexity can be applied.
In vitro Transwell® systems based on a porous PET-membrane enable the standardized study of transport mechanisms across the intestinal barrier as well as the investigation of the influence of target substances on barrier integrity. However, this artificial setup reflects only limited aspects of the physiology of the native small intestine and can pose an additional physical barrier. Hence, the applications of this model for tissue engineering are limited.
Previously, tissue models based on a biological decellularized scaffold derived from porcine gut tissue were demonstrated to be a good alternative to the commonly used Transwell® system. This study showed that preserved biological extracellular matrix components like collagen and elastin provide a natural environment for the epithelial cells, promoting cell adhesion and growth. Intestinal epithelial cells such as Caco-2 cultured on such a scaffold showed a confluent, tight monolayer on the apical surface. Additionally, myofibroblasts were able to migrate into the scaffold supporting intestinal barrier formation.
In this thesis, dendritic cells were additionally introduced to this model mimicking an important component of the immune system. This co-culture model was then successfully proven to be suitable for the screening of particle formulations developed as delivery system for cancer antigens in peroral vaccination studies. In particular, nanoparticles based on PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA and Chitosan were tested. Uptake studies revealed only slight differences in the transcellular transport rate among the different particles. Dendritic cells were shown to phagocytose the particles after they have passed the intestinal barrier. The particles demonstrated to be an effective carrier system to transport peptides across the intestinal barrier and therefore present a useful tool for the development of novel drugs.
Furthermore, to mimic the complex structure and physiology of the gut including the presence of multiple different cell types, the Caco-2 cell line was replaced by primary intestinal cells to set up a de novo tissue model. To that end, intestinal crypts including undifferentiated stem cells and progenitor cells were isolated from human small intestinal tissue samples (jejunum) and expanded in vitro in organoid cultures. Cells were cultured on the decellularized porcine gut matrix in co-culture with intestinal myofibroblasts. These novel tissue models were maintained under either static or dynamic conditions.
Primary intestinal epithelial cells formed a confluent monolayer including the major differentiated cell types positive for mucin (goblet cells), villin (enterocytes), chromogranin A (enteroendocrine cells) and lysozyme (paneth cells). Electron microscopy images depicted essential functional units of an intact epithelium, such as microvilli and tight junctions. FITC-dextran permeability and TEER measurements were used to assess tightness of the cell layer. Models showed characteristic transport activity for several reference substances. Mechanical stimulation of the cells by a dynamic culture system had a great impact on barrier integrity and transporter activity resulting in a tighter barrier and a higher efflux transporter activity.
In Summary, the use of primary human intestinal cells combined with a biological decellularized scaffold offers a new and promising way to setup more physiological intestinal in vitro models. Maintenance of primary intestinal stem cells with their proliferation and differentiation potential together with adjusted culture protocols might help further improve the models. In particular, dynamic culture systems and co culture models proofed to be a first crucial steps towards a more physiological model. Such tissue models might be useful to improve the predictive power of in vitro models and in vitro in vivo correlation (IVIVC) studies. Moreover, these tissue models will be useful tools in preclinical studies to test pharmaceutical substances, probiotic active organisms, human pathogenic germs and could even be used to build up patient-specific tissue model for personalized medicine.
N2  - Die Hauptfunktion des Dünndarms besteht in der Aufnahme von lebenswichtigen Nährstoffen, Wasser und Vitaminen. Zudem stellt er eine Barriere dar, die uns vor toxischen Fremdstoffen und Pathogenen schützt. Um diese Prozesse besser zu verstehen, ist die Entwicklung neuer in vitro Modellen des Darms von großem Interesse um pharmakologische und pathologische Studien durchzuführen. Abhängig von der wissenschaftlichen Fragestellung können Modelle von unterschiedlicher Komplexität zur Anwendung kommen.
In vitro Transwell® Systeme basierend auf einer porösen PET-Membran ermöglichen die Untersuchung von Transportmechanismen über die intestinal Barriere und den Einfluss von Wirkstoffen auf deren Integrität. Dieser künstliche Aufbau ähnelt jedoch nur eingeschränkt der Physiologie des Dünndarms und kann eine zusätzliche physikalische Barriere darstellen. Die Anwendungsmöglichkeiten dieses Modells im Tissue Engineering sind daher begrenzt.
Gewebemodelle basierend auf einer dezellularisierten biologischen Matrix hergestellt aus Schweinedarmgewebe haben sich als gute Alternative zum herkömmlichen Transwell® System herausgestellt. Diese Studie zeigt, dass die erhaltenen Komponenten der biologischen Extrazellulärmatrix wie Kollagen und Elastin eine natürliche Umgebung für die Epithelzellen bieten und Zelladhäsion und Wachstum der Zellen fördern. Darmepithelzellen wie Caco-2 Zellen, welche auf einer solchen Matrix kultiviert wurden, bildeten einen konfluenten, dichten Monolayer auf der apikalen Oberfläche aus. Zusätzlich ermöglichte dieser Aufbau die Migration von Myofibroblasten in die Matrix, was die Bildung der intestinalen Barriere unterstützt.
In dieser Doktorarbeit wurden zusätzlich dendritische Zellen als wichtige Komponente des adaptiven Immunsystems in das Modell integriert. Dieses Ko-Kultur Modell erwies sich als geeignet um partikuläre Formulierungen zu testen, welche als Transportsysteme für Tumorantigene entwickelt wurden. Es wurden Partikel basierend auf PLGA, PEG-PAGE-PLGA, Mannose-PEG-PAGE-PLGA und Chitosan untersucht. Aufnahmestudien ergaben nur geringfügige Unterschiede in den Transportraten zwischen den verschiedenen Partikeln. Es konnte ausserdem gezeigt werden, dass dendritische Zellen die Partikel phagozytieren, nachdem sie die intestinale Barriere überwunden haben. Die Partikel erwiesen sich als effektives Transportsystem um Peptide über die intestinale Barriere zu schleusen und stellen daher ein nützliches Werkzeug für die Entwicklung neuartiger Medikamente dar.
Um die komplexe Struktur und Physiologie des Darms noch besser nachzustellen, wurde für den Aufbau des Modells die Caco-2 Zelllinie durch primäre Darmzellen ersetzt. Die Darmkrypten, welche undifferenzierte Stammzellen und Vorläuferzellen enthalten, wurden aus humanen Dünndarmgewebe, dem Jejunum, isoliert und in vitro expandiert. Die Zellen wurden zusammen mit Myofibroblasten auf der dezellularisierten Schweinedarmmatrix, unter statischen und dynamischen Bedingungen, kultiviert.
Die primären Darmepithelzellen bildeten einen konfluenten Monolayer, welcher alle differenzierten intestinalen Zelltypen aufwies, gezeigt durch Zellen positiv für Mucin (Becherzellen), Villin (Enterozyten), Chromogranin A (enteroendokrine Zellen) und Lysozym (Paneth-Zellen). Mit Hilfe von Elektronenmikroskopie ließen sich essentielle funktionelle Einheiten eines intakten Epithels darstellen, wie die Mikrovilli und Tight Junctions. Um die Dichtigkeit des Epithels zu überprüfen wurde mit FITC-Dextran die Permeabilität bestimmt und TEER-Messungen durchgeführt. Die Modelle zeigten einen charakteristischen Transport für mehrere Referenzsubstanzen. Mechanische Stimulation durch ein dynamisches Kultivierungssystem hatte einen starken Einfluss auf die Barriereintegrität und Transporteraktivität der Modelle, was sich in einer dichteren Barriere und erhöhten Efflux-Transporteraktivität widerspiegelte.
Alles in allem bietet die Verwendung primärer intestinaler Zellen in Kombination mit einer dezellularisierten biologischen Matrix eine neue, vielversprechende Möglichkeit physiologischere in vitro Modelle des Darms aufzubauen. Der Erhalt intestinaler Stammzellen mit ihrem Proliferations- und Differenzierungspotential zusammen mit angepassten Protokollen könnte dabei helfen die Modelle weiter zu verbessern. Insbesondere die dynamische Kultivierung und die Ko-Kultur-Modelle erwiesen sich als entscheidender Schritt auf dem Weg zu physiologischeren Modellen. Solche Gewebemodelle könnten sich als nützlich erweisen, wenn es darum geht die Vorhersagekraft der in vitro Modelle, sowie die in vitro-in vivo Korrelation zu verbessern. Solche Gewebemodelle können ein nützliches Werkzeuge in der präklinischen Forschung für die Testung von pharmazeutischen Wirkstoffen, probiotisch aktiven Organismen, sowie humaner pathogener Keime sein und sogar zum Aufbau personalisierter Modelle für die regenerative Medizin dienen.
KW  - Tissue Engineering
KW  - in vitro
KW  - Dünndarm
KW  - intestinal in vitro model
KW  - intestine
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142571
ER  - 
TY  - THES
A1  - Rosenbaum, Corinna
T1  - The role of enteric glial cells under inflammatory conditions of the intestine
T1  - Die Rolle von enterischen Gliazellen unter entzündlichen Bedingungen im Darm
N2  - The enteric nervous system (ENS) innervates the gastrointestinal (GI) tract and controls central aspects of GI physiology including contractility of the intestinal musculature, glandular secretion and intestinal blood flow. The ENS is composed of neurons that conduct electrical signals and of enteric glial cells (EGCs). EGCs resemble central nervous system (CNS) astrocytes in their morphology and in the expression of shared markers such as the intermediate filament protein glial fibrillary acidic protein (GFAP). They are strategically located at the interface of ENS neurons and their effector cells to modulate intestinal motility, epithelial barrier stability and inflammatory processes. The specific contributions of EGCs to the maintenance of intestinal homeostasis are subject of current research. 
From a clinical point of view EGC involvement in pathophysiological processes such as intestinal inflammation is highly relevant. Like CNS astrocytes ECGs can acquire a reactive, tissue-protective phenotype in response to intestinal injury. In patients with chronic inflammatory bowel diseases (IBD) such as Crohn's disease and ulcerative colitis, alterations in the EGC network are well known, particularly a differential expression of GFAP, which is a hallmark of reactive gliosis in the CNS. 
With increasing recognition of the role of EGCs in intestinal health and disease comes the need to study the glial population in its complexity. The overall aim of this thesis was to comprehensively study EGCs with focus on the reactive GFAP-expressing subpopulation under inflammatory conditions in vivo and in vitro. In a first step, a novel in vivo rat model of acute systemic inflammation mimicking sepsis was employed to investigate rapidly occuring responses of EGCs to inflammation. This study revealed that within a short time frame of a few hours, EGCs responded to the inflammation with an upregulation of Gfap gene expression. This inflammation-induced upregulation was confined to the myenteric plexus and varied in intensity along the intestinal rostro-caudal axis. This highly responsive myenteric GFAP-expressing EGC population was further characterized in vivo andin vitro using a transgenic mouse model (hGFAP-eGFP mice). Primary purified murine GFAP-EGC cultures in vitro were established and it was assessed how the transcriptomic and proteomic profiles of these cells change upon inflammatory stimulation. Here, myenteric GFAP-EGCs were found to undergo a shift in gene expression profile that predominantly affects expression of genes associated with inflammatory responses. Further, a secretion of inflammatory mediators was validated on protein level. The GFAP+ subpopulation is hence an active participant in inflammatory pathophysiology. In an acute murine IBD model in vivo, GFAP-EGCs were found to express components of the major histocompatibility complex (MHC) class II in inflamed tissue, which also indicates a crosstalk of EGCs with the innate and the adaptive lamina propria immune system in acute inflammation.
Taken together, this work advances our knowledge on EGC (patho-)physiology by identifying and characterizing an EGC subpopulation rapidly responsive to inflammation. This study further provides the transcriptomic profile of this population in vivo and in vitro, which can be used to identify targets for therapeutic intervention. Due to the modulating influence of EGCs on the intestinal microenvironment, the study further underlines the importance of integrating EGCs into in vitro test systems that aim to model intestinal tissues in vitro and presents an outlook on a potential strategy.
N2  - Das enterische Nervensystem (ENS) innerviert den gastrointestinalen Trakt und kontrolliert zentrale Aspekte der gastrointetinalen Physiologie, wie die Kontraktilität der intestinalen Muskulatur, Sekretion und den intestinalen Blutfluss. Das ENS setzt sich aus elektrisch leitenden Neuronen und enterischen Gliazellen (EGZ) zusammen. EGZ ähneln Astrozyten des zentralen Nervensystems (ZNS) hinsichtlich ihrer Morphologie und der Expression gemeinsamer Marker wie dem Intermediärfilament Saures Gliafaserprotein (GFAP von engl. glial fibrillary acidic protein). EGZ sind strategisch an der Kontaktstelle zwischen ENS-Neuronen und deren Effektorzellen positioniert, um die intestinale Motilität, die epitheliale Barrierestabilität sowie inflammatorischen Prozesse zu modulieren. Die spezifische Beteiligung der EGZ an der Aufrechterhaltung der Darmhomöostase wird gegenwärtig erforscht.
Aus klinischer Sicht ist die Beteiligung von EGZ an pathophysiologischen Prozessen wie der intestinalen Entzündung besonders relevant. Wie ZNS-Astrozyten können EGZ bei intestinalen Schädigungen einen reaktiven, gewebe-protektiven Phänotyp annehmen. Bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (IBD, von engl. inflammatory bowel disease) wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa sind Veränderungen im EGZ-Netzwerk bekannt, besonders eine veränderte Expression von GFAP, welches ein prominentes Kennzeichen der reaktiven Gliose im ZNS ist.
Nachdem sich die Bedeutung der EGZ im gesunden und kranken Darm zunehmend herausgestellt hat, muss ein stärkerer Fokus auf die Erforschung der glialen Population gelegt werden. Die Zielsetzung dieser Arbeit war die umfassende Untersuchung der EGZ mit Fokus auf die reaktive GFAP-exprimierende Population unter entzündlichen Bedingungen in vivo und in vitro}. In einem ersten Schritt wurde ein neuartiges in vivo-Rattenmodell einer akuten systemischen Entzündung verwendet, um die schnell stattfindenden Veränderungen der EGZ unter entzündlichen Bedingungen zu untersuchen. Diese Studie ergab, dass innerhalb von wenigen Stunden EGZ mit einer Hochregulation der Gfap-Genexpression auf die Entzündung reagieren. Diese entzündungsinduzierte Hochregulation war lokal auf den myenterischen Plexus begrenzt und entlang der rostro-kaudalen Achse des Darms unterschiedlich stark ausgeprägt. Die responsive, GFAP-exprimierende myenterische EGZ-Population wurde daraufhin in vivo und in vitro charakterisiert unter Zuhilfenahme eines transgenen Mausmodells (hGFAP-eGFP-exprimierende Mäuse). Primäre, aufgereinigte GFAP-EGZ-Zellkulturen wurden etabliert und dahingehend untersucht, wie sich das transkriptomische und proteomische Profil der Population unter entzündlichen Bedingungen verändert. Hierbei wurde reproduzierbar eine Verschiebung des transkriptomischen Profils  myenterischer GFAP-exprimierender EGZ gefunden. Die davon betroffenen Gene sind vorwiegend mit Immunantworten assoziiert. Weiterhin wurde die Sekretion solcher Immunmediatoren auf Proteinebene validiert. Die GFAP+ Subpopulation ist somit ein aktiver Modulator entzündlicher pathophysiologischer Prozesse. In einem akuten IBD-Mausmodell konnte weiterhin gezeigt werden, dass GFAP-EGZ verstärkt Komponenten des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II im entzündeten Gewebe exprimieren. Dies weist auf eine direkt Interaktion der EGZ mit dem Immunsystem in der Lamina propria hin. 
Insgesamt konnte mit dieser Arbeit das Wissen über die (Patho-)Physiologie von EGZ erweitert werden, indem eine schnell responsive EGZ-Subpopulation identifizert und charakterisiert wurde. Weiterhin wurde im Rahmen dieser Arbeit das gesamte Transkriptomprofil der GFAP-Subpopulation in vivo und in vitro veröffentlicht, welches für weitere Studien zur Identifikation möglicher therapeutischer Anwendungen genutzt werden kann. Aufgrund des modulierenden Einflusses der EGZ auf die Darmphysiologie betont diese Studie die Notwendigkeit EGZs in in-vitro-Gewebemodelle des Darms zu integrieren und präsentiert einen Ausblick auf eine mögliche Strategie.
KW  - Darmwandnervensystem
KW  - Glia
KW  - in vitro
KW  - Sepsis
KW  - Enterische Glia
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-138946
ER  -