TY  - THES
A1  - Verhoeven, Michael
T1  - Stachys officinalis – Eine große Arzneipflanze der traditionellen europäischen Medizin. Ihr historischer Stellenwert und ihre aktuelle Bewertung
T1  - Stachys officinalis – An important medicinal plant of the traditional European medicine. Her historical value and actual appraisement
N2  - Stachys officinalis galt von der Antike bis zur frühen Neuzeit als wichtiges Phy-topharmakon. Zu den bedeutendsten Indikationen zählen die Anwendung bei Er-krankungen der Atemwege, des Gastrointestinaltrakts, der Harnwege und der Ein-satz als Analgetikum bei Schmerzen verschiedenster Art. Über den Zeitraum von fast 1800 Jahren zählte die Pflanze fest zum Arzneischatz. Erst Ende des 18. Jahrhunderts nahm ihre Bedeutung als Arzneimittel ab. Mit dem Beginn des 20. Jahrhundert verschwand sie fast vollständig aus der Phytotherapie. Heute wird sie nur noch selten im Bereich der homöopathischen Medizin oder volksheilkundlich eingesetzt. In der vorliegenden Arbeit wird Stachys officinalis durch ihre 2000 jährige Ge-schichte als Arzneipflanze begleitet. Dabei werden die Indikationen verschiedener Quellen mit aktuellem pharmazeutischem Wissen verglichen und beurteilt. Durch diese Auswertung wird geklärt, ob die jeweiligen Indikationsnennungen pharma-zeutisch nachvollziehbar sind oder nicht. Als Vergleichsweke dienen Hagers En-zyklopädie der Arzneistoffe und Drogen´ und Dr. Duke´s Phytochemical and Ethnobotanical Databases´. , Die inhaltsstoffbezogenen Angaben dieser Wer-ke werden durch weitere aktuelle pharmazeutische Erkenntnisse über die phar-makologischen Eigenschaften der Pflanzeninhaltsstoffe von Stachys officinalis ergänzt. Auf Grundlage der zugeordneten Pflanzeninhaltsstoffe und ihrer individu-ellen Wirkungen wird die Plausibilität der Indikationsangaben der Quellen unter-sucht. Im Rahmen dieser Arbeit werden die Indikationsnennungen von 34 Kräuterbü-chern, Lexika und anderer Quellen betrachtet. Dabei werden die vielfältigen Indi-kationsnennungen zu 142 normierten Indikationen zusammengefasst und ausge-wertet. Unter Berücksichtigung der Angaben beider oben genannter Vergleichs-werke erscheinen 59% der 142 normierten Indikationen für Stachys officinalis plausibel und sind mit der Anwesenheit definierter Pflanzeninhaltsstoffe zu erklä-ren. Es wird deutlich, dass viele Nennungen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes, der Atemwege und der Leber betreffen. Die analgetischen Indikationsangaben sind wenig einheitlich, betreffen aber häufig Schmerzen des Kopfes und des Be-wegungsapparats. Zusammengefasst haben die verschiedenen analgetischen Indikationsangaben allerdings einen bemerkenswert hohen Anteil von 11% an den insgesamt 801 Indikationsnennungen. Die vorliegende Arbeit gibt 13 Hauptindikationen für Stachys officinalis an. Diese sind mit Ausnahme der Indikationen Bei Milzerkrankungen´ und Bei Epilepsie´ durch die Wirkungen benannter Pflanzeninhaltsstoffe nachzuvollziehen und phar-mazeutisch plausibel. Es gelingt, aus der Fülle der Indikationsnennungen der his-torischen Quellen die meistgenannten belegbaren Anwendungen hervorzuheben. Die Untersuchung der Überlieferungsgeschichte macht deutlich, dass die antiken Autoren, wie zum Beispiel Dioskurides und Plinius, einen großen Einfluss auf die Indikationsangaben von Stachys officinalis haben. Viele spätere Werke orientieren sich an diesen antiken Quellen und nehmen deren Indikationsangaben auf. Ab dem 18. Jahrhundert nimmt der Umfang der Beschreibungen von Stachys officina-lis und ihre Bedeutung als Phytopharmakon deutlich ab. Auf Grund der hohen Plausibilität der 13 Hauptindikationen sowie der analgeti-schen Anwendungen scheint es nicht gerechtfertigt, dass Stachys officinalis voll-ständig aus dem Arzneischatz verschwunden ist.
N2  - Stachys officinalis was from antiquity to the early modern period an important phy-topharmacon. The most important indications for its use are respiratory diseases, diseases of the gastrointestinal and the urinary tract and its use as an analgesic for pain of various kinds. Over a period of almost 1800 years the plant belonged to the medicinal treasure trove. At the end of the 18th Century its importance as a drug started to decrease. With the beginning of the 20th Century it disappeared almost completely from the phytotherapie. Today it is only rarely used in the field of homeopathic medicine or as traditional medicin. In the present work Stachys officinalis is accompanied through its 2000 years of history as a medicinal plant. The indications from various sources of ancient litera-ture are compared and evaluated with current pharmaceutical knowledge. Based on this evaluation the relevanz of pharmaceutical indications is analyzed. As benchmark for comparison purposes serve Hagers Enzyklopädie der Drogen und Arzneistoffe´ and Dr. Duke's Phytochemical and Ethnobotanical Databases´. , The ingredients related informations of these works are further complemented by current pharmaceutical knowledge about the pharmacological properties of the plant or substances from Stachys officinalis. On the basis of the associated plant substances and their individual effects, the plausibility of the indications of the source data is analysed. In this study, the indications of 34 herbal books, encyclopedias and other sources are considered. As a result the diverse information are clustered into 142 indica-tions. The standardized indications are analyzed and evaluated. Considering the informations of the two benchmark woks, 59% of the 142 standardized indications for Stachys officinalis appear plausible and can be explained by the presence of plant compounds. A result is, that many entries concern the gastrointestinal illnesses, the respiratory tract and the liver. The analgesic indications show little uniformity but often apply to the head pain and musculoskeletal disorders. In summary the analgesic indica-tions have a remarkably high percentage of 11% of the total of 801 responses. The present work names 13 main indications for Stachys officinalis. These are, except for spleen diseases´ and Epilepsy´, to a certain extend backed up by the effects of plant compounds and pharmaceutically plausible. It is possible to sepa-rate verifiable results from the plethora of historical sources. The study of the historical tradition makes clear, that the ancient authors, such as Dioscorides and Pliny, have a major influence on the indication information from Stachys officinalis. Many later works are based on these ancient sources referring to indication information. From the 18th Century Stachys officinalis becomes less important as plant and phytopharmacon. Due to the high plausibility of the 13 main indications as well as its use as analge-sic, it does not seem justified that Stachys officinalis has disappeared completely from the pharmacopoeia.
KW  - Ziest
KW  - Heilpflanzen
KW  - betony
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70643
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schauer, Stefanie
T1  - Untersuchungen zu Cyclodextrinkomplexen von typischen nichtsteroidalen Antiphlogistika
T1  - Investigations of cyclodextrin complexes of typical nonsteroidal antiphlogistics
N2  - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen natürlichen Cyclodextrinen und den Substanzen Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Flurbiprofen, Felbinac und Fenbufen aus der Gruppe der nichtsteroidalen Antiphlogistika charakterisiert. Ausgehend davon sollte beurteilt werden, ob anhand der Grundstruktur oder der funktionellen Gruppen eines Gastes vorhergesagt werden kann, in welchem Ausmaß solche Wechselwirkungen auftreten und welche Struktur die sich bildenden Komplexe aufweisen. Alle Substanzen weisen die stärksten Wechselwirkungen in wässriger Lösung mit β-Cyclodextrin auf. Lediglich Flurbiprofen bildet auch mit γ-Cyclodextrin in größerem Umfang Komplexe. Für die Mehrzahl der Gastmoleküle werden Isothermen vom Bs-Typ, für Fenbufen und Naproxen hingegen A-Typ-Isothermen erhalten. Durch die gute Löslichkeit der Komplexe kann eine deutliche Löslichkeitssteigerung für diese beiden Gastmoleküle in Wasser erreicht werden. Der Vorgang der Komplexbildung ist für alle Gastsubstanzen ein spontan ablaufender Prozess. Die Assoziationskonstanten K1:1 bei 25°C bewegen sich zwischen 1000 M-1 und 5000 M-1, für Flurbiprofen beträgt sie etwa 14000 M-1 und für Ibuprofen sogar über 40000 M-1. Eine Betrachtung des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten legt nahe, dass die Lipophilie der Gastmoleküle eine entscheidende Größe für das Ausmaß der Komplexbildung darstellen könnte. Eine Untersuchung bei variierenden pH-Werten zeigte, dass steigende pH-Werte und ein damit erhöhter Dissoziationsgrad der Gastmoleküle durchgehend zu abnehmenden Assoziationskonstanten führten. Löslichkeitsstudien bei verschiedenen Temperaturen zeigten entgegen des erwarteten Absinkens der Assoziationskonstanten mit steigender Temperatur keine eindeutige Tendenz. Für Naproxen und Ketoprofen konnten lineare Van’t Hoff Plots erstellt werden. Kalorimetrische Versuche lieferten für Ibuprofen ergänzende Werte für die Assoziationskonstante und die Gibbs’sche Freie Enthalpie, die mit den Ergebnissen der Löslichkeitsstudien vergleichbar waren. Danach ist die Komplexbildung für diese Stoffe enthalpie- und entropiegetrieben. Job’s Plots deuten auf eine Stöchiometrie von 1:1 für Ibuprofen, Flurbiprofen und Felbinac hin. Obwohl es in der Literatur Hinweise darauf gibt, dass für die anderen Moleküle dieselbe Stöchiometrie vorliegt, sind nach den Ergebnissen auch Komplexe höherer Ordnung möglich. Mit Hilfe von Docking-Studien konnten plausible Komplexstrukturen erhalten werden. Sie deuten auf das Auftreten eines Induced-Fit’s des Cyclodextrins und die Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen hin. Verschiedene Techniken wurden angewendet, um feste Komplexzubereitungen herzustellen, um weitere Informationen über die gebildeten Komplexe im festen Zustand zu erhalten. Mittels thermoanalytischer Verfahren wurde versucht, den im Cyclodextrin eingeschlossenen Gastmolekülanteil zu bestimmen. In lyophilisierten Lösungen lag der noch als ungebunden detektierbare Wirkstoffanteil meistens am niedrigsten. FT-IR-Spektren der Komplexzubereitungen und ihrer physikalischen Mischungen zeigten, dass auch im festen Zustand meist Einschlusskomplexe gebildet werden, bei denen der aromatische Teil des Gastes und die Carbonylgruppe in der Cyclodextrinkavität lokalisiert sind. Lediglich Felbinac weist ein davon abweichendes Verhalten auf. Diese Erkenntnisse werden meist durch die Ergebnisse der zweidimensionalen 1H-NMR-Studien bestätigt, die Einblick in die Komplexstruktur im wässrigen Medium gewährten. Hier nehmen die Modellsubstanzen verschiedene Orientierungen in der Cyclodextrinkavität ein. Möglicherweise liefern diese einen Erklärungsansatz für das besondere Verhalten der Gastmoleküle Naproxen und Fenbufen in den Löslichkeitsstudien. Die Carboxylgruppe nimmt eine Position ein, in der eine Störung der intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen des Cyclodextrins möglich wird, was für die erhöhte Löslichkeit des Wirtes verantwortlich sein könnte. Insgesamt hat sich gezeigt, dass die Grundstruktur und die funktionellen Gruppen des Gastmoleküls erheblichen Einfluss auf die Struktur und die Eigenschaften ihrer Cyclodextrinkomplexe und auf die Stärke der Wechselwirkung zwischen Wirt und Gast haben. Die Lipophilie der Gastmoleküle scheint zudem eine tragende Rolle zu spielen. Da die Ausprägung der Komplexbildung somit eine Summe aus vielen Einzelfaktoren ist, können Vorhersagen für ein vorliegendes System nur unter erheblichen Einschränkungen getroffen werden und es gilt, immer den Einzelfall zu betrachten.
N2  - In this thesis various analytical methods were applied to characterise the interactions between natural cyclodextrins and the nonsteroidal anti-inflammatory drugs ibuprofen, ketoprofen, naproxen, flurbiprofen, felbinac, and fenbufen. The results were analyzed in order to find out, if predictions for the extent of the association and structure of the formed complexes can be deduced from the basic structure or the functional groups of the guest. Solubility determination showed that all model substances – particularly the biphenyl derivatives – are of extreme low solubility in water. First of all, complex formation of the three natural cyclodextrins and the model substances in aqueous solution was investigated. All guests preferably form complexes with β-cyclodextrin. Only flurbiprofen gains a notable solubility enhancement by addition of γ-cyclodextrin. For the majority of the model substances a BS-isotherm is obtained while fenbufen and naproxen exhibit A-type isotherms. From this, a distinct solubility enhancement can be achieved for the latter guests in solution. For the whole group complex formation is a spontaneous process. Their association constants at 25°C range from 1000 to 5000 M-1, for flurbiprofen up to 14000 M-1 and for ibuprofen even over 40000 M-1. A correlation of drug partition coefficient and association constants seems to imply that guest polarity could be an important factor for the extent of the inclusion process. Complex formation was investigated at several pH values. Increasing pH values and thus a higher degree of acid dissociation consequently led to decreasing complexation constants. Phase-solubility analysis at different temperatures showed unexpectedly no uniform tendency in the association constants. For naproxen and ketoprofen linear Van’t Hoff plots could be obtained. In addition, calorimetric studies provided thermodynamic data comparable to phase-solubility analysis for ibuprofen. From there complex formation with these guests is driven both by enthalpy and entropy. Job’s plots by NMR spectroscopy indicate a 1:1 complex stoichiometry for ibuprofen, flurbiprofen and felbinac. Although the same composition can be found for the other molecules in literature the formation of higher order complexes seems to be possible. Docking studies were applied to develop a molecular modeling procedure for the prediction of complex formation. Plausible molecular arrangements were derived indicating an induced fit of the cyclodextrin and possibly intermolecular hydrogen bonding. Several techniques were applied to obtain solid complex preparations in order to gather additional information about the formed complexes in the solid state. Thermal analysis was used for the determination of the inclusion yield. The lowest fraction of free guest was observed in freeze dried solutions. For fenbufen and naproxen the determination was not successful probably caused by changes in cristallinity. FT-IR spectra of the solid complex preparations and physical mixtures indicated the inclusion of the guest’s aromatic part and carbonyl group into the cavity except for felbinac. In most cases these findings are supported by twodimensional NMR-spectra. Here the guest molecules occupy variable orientations inside the cyclodextrin cavity. From the results one can deduce possible explanations for the unusual form of the phase solubility isotherms of naproxen and fenbufen. The carboxylic acid group is positioned possibly allowing a disturbance of the cyclodextrins intramolecular hydrogen binding system and thus causing an increased solubility of the host. To summarize, the basic structure and functional groups of the guest molecule are of particular importance for the structure and the properties of the complexes formed with cyclodextrins and for the extent of the host guest interactions. Possibly the lipophilicity of the guest molecules can be applied for a vague estimation of attraction. As complex formation is driven by a diversity of different factors predictions for a system are only possible under certain limitations. Complex formation should always be regarded as a single case. A general decision for or against the application of cyclodextrins is not feasible.
KW  - Cyclodextrine
KW  - Nichtsteroidales Antiphlogistikum
KW  - Löslichkeit
KW  - Protonen-NMR-Spektroskopie
KW  - Molekulardesign
KW  - phase-solubility
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69701
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schneider, Thomas
T1  - Synthese von reversiblen und kovalent-reversiblen Cysteinprotease-Inhibitoren
T1  - Synthesis of reversible and covalent-reversible inhibitors of cysteine-proteases
N2  - Als Vorlage für diese Inhibitoren diente der kovalent gebundene Inhibitor 9IN aus der Kristallstruktur 2AMD. Die Entwicklung der neuen Leitstruktur (Abbildung 7-1) erfolgte dabei durch Fragmentierung mit dem Programm FRED im Arbeitskreis Prof. Knut Baumann (Univ. Braunschweig). Die dargestellten Verbindungen wurden als nicht-kovalent gebundene Inhibitoren entwickelt und sowohl an SARS-CoV-Mpro als auch an SARSCoV-PLpro getestet. Da die Basisverbindung 34j (R = H) in durchgeführten Dockingstudien die Enzym-Bindetaschen S1, S2 und S4 bereits ausreichend besetzt hatte, war das Ziel v.a. die noch freie Bindetasche S1‘ mit eingefügten Resten R zu besetzen. Dazu wurden in der Reihe 34a-t verschiedene Alkylreste eingefügt. Die Verbindungen 37a-cc bzw. 38a-p besitzen hingegen die Reste C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR und CH2CO2R. Im Verlauf der Synthese wurde der teure Baustein 4-Methylcyclohexancarbonsäure durch die günstigere Verbindung Cyclohexancarbonsäure ersetzt. Keine der dargestellten Verbindungen wies eine besondere Hemmung auf. Trotz geringer Hemmung konnte Verbindung 34e mit dem Enzym SARS-CoV-Mpro co-kristallisiert werden. Die genaue Lage des Inhibitors in der Bindetasche ist bislang noch nicht eindeutig geklärt. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von kovalent-reversiblen Inhibitoren von Cysteinproteasen auf Grundlage von Vinylsulfonen. Bisherige bekannte Vinylsulfone reagieren wie ein Michaelsystem in einer irreversiblen Addition. Es wurden durch QM-Rechnungen in der Arbeitsgruppe Prof. Bernd Engels substituierte Vinylsulfone vorgeschlagen, die fähig sein sollten, mit Cysteinproteasen eine kovalent-reversible Bindung eingehen zu können. Durch die Wahl sowohl eines geeigneten Substituenten als auch einer geeigneten Abgangsgruppe sollte die Reaktion reversibel sein, wenn sie thermoneutral bis schwach endergon verläuft. Um diese Berechnungen zu bestätigen, wurden die dargestellten Verbindungen mit einem Überschuss 2-Phenylethanthiol umgesetzt und der Reaktionsverlauf durch NMR-Spektroskopie verfolgt. Dabei konnte die Einstellung eines Gleichgewichts und damit auch die Reversibilität der Reaktion beobachtet werden. Aus den berechneten Gleichgewichtskonstanten konnten die freien Reaktionsenergien ΔG berechnet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Reaktionen nahezu thermoneutral verlaufen und bestätigen damit die QM-Berechnungen.
N2  - The covalently bound inhibitor 9IN (pdb-code: 2AMD) was the basis of these new synthesized inhibitors (figure 8-1). The development of this new lead structure was achieved in the group of Knut Baumann (Univ. Braunschweig) by fragmentation using the program FRED. The compounds were developed as non-covalent inhibitors and were tested against both SARS-CoV-Mpro and SARS-CoV-PLpro. In the docking studies compound 34j (R=H) occupied the binding pockets S1, S2 and S4 of the enzyme sufficiently. So the aim was to fill the remaining binding pocket S1’ with a side-chain (R). Different alkyl sidechains were attached yielding compounds 34a-t. The compounds 37a-cc and 38a-p are carrying the side-chains C(O)NHR, CO2R, CH2C(O)NHR and CH2CO2R. Furthermore, the expensive building block 4-methylcyclohexanecarboxylic acid was replaced by the cheaper cyclohexanecarboxylic acid. None of the synthesized compounds showed good inhibition. But despite the low inhibition potency compound 34e was successfully co-crystallized with SARS-CoV-Mpro. Up to now the binding mode of the inhibitor in the binding pocket is not clear. Ongoing studies will clarify the exact binding mode of the inhibitor. The second part of this work consists of the development of covalent-reversible inhibitors of cysteineproteases based on vinylsulfones. Known inhibitors with a vinylsulfone-system react via an irreversible addition with the active center similar to a Michael-system. Substituted vinylsulfones were developed by QM-calculations in the group of Prof. Bernd Engels (Univ. Wuerzburg). These systems were postulated to be able to form a covalent-reversible bond with the cysteine sulfur in the active site. The reversible reaction should be possible by choosing a suitable substituent and a suitable leaving group. The reaction energy must be thermoneutral or weakly endergonic. To confirm these calculations the synthesized compounds were reacted with 2-phenylethanethiol and the reaction paths and progress were observed by NMR-spectroscopy. The reaction was found to be reversible. The reaction energies ΔG were calculated from the measured equilibrium constants. The results show that the measured vinylsulfones are reacting nearly thermoneutral. Thus they verify the QM-calculations.
KW  - Coronaviren
KW  - SARS
KW  - Proteaseinhibitor
KW  - Cysteinproteasen
KW  - Organische Synthese
KW  - coronavirus
KW  - organic synthesis
KW  - SARS
KW  - protease inhibitors
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67491
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heydt, Silke
T1  - Synthese von Nanopartikeln und der Einfluss ihrer Primärpartikelgröße auf die Fließregulierung von idealen und nicht-idealen Schüttgütern
T1  - Synthesis of nanoparticles and the influence of their primary particle size on the flow regulation of ideal and non-ideal bulk materials
N2  - Die Fließfähigkeit eines pharmazeutischen Schüttguts spielt insbesondere bei der Herstellung von volumendosierten Arzneiformen, wie beispielsweise Tabletten, eine große Rolle. Häufig kommen deshalb sogenannte Fließregulierungsmittel zum Einsatz, um eine ausreichende Fließfähigkeit zu gewährleisten. Der Prozess der Fließregulierung kann mit einer Abnahme der van der Waals Kräfte zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln beschrieben werden. Diese Reduktion der Haftkraft beruht auf der Anlagerung von Adsorbaten des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Trägerpartikel. Im Rahmen der Arbeit sollten sowohl die Einflussfaktoren des Schüttguts als auch die des Fließregulierungsmittels auf den Prozess der Fließregulierung geprüft werden. Es wurde gezeigt, dass die Morphologie eines Schüttguts großen Einfluss auf den Prozess der Fließregulierung besitzt. Je glatter die Oberfläche eines Schüttguts ist, desto weniger Fließregulierungsmittel wird ungenutzt eingelagert. Es steht demzufolge mehr Fließregulierungsmittel als Abstandshalter zwischen den einzelnen Schüttgutpartikeln zur Verfügung, was wiederum zu einer Reduktion der van der Waals Kräfte und somit zur Fließverbesserung führt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Beurteilung des Einflusses der Primärpartikelgröße eines Fließregulierungsmittels auf seine fließregulierende Potenz. Hierzu wurden Kieselsäurenanopartikel synthetisiert, die sich lediglich in ihren Primärpartikelgrößen unterscheiden. Mit Hilfe des Sol-Gel-Prozesses innerhalb einer Mikroemulsion wurden prozesssicher diskrete, sphärische und einheitliche Kieselsäurenanopartikel in einem Größenbereich von 8 nm bis 100 nm erhalten. Um den Einfluss der Primärpartikelgröße zu prüfen, wurden die Schüttgüter Maisstärke und Lactose mit den synthetisierten Kieselsäuren versetzt und in einem Turbula-Mischer gemischt. Die Beurteilung der Potenz der Fließregulierungsmittel in Kombination mit dem jeweiligen Schüttgut erfolgte mittels Messungen am Zugspannungstester. Für beide Schüttgüter wurde eine eindeutige Korrelation zwischen der Primärpartikelgröße und der Potenz des Fließregulierungsmittels festgestellt, wobei je nach Schüttgutmorphologie unterschiedliche Ergebnisse für die optimale Primärpartikelgröße des Fließregulierungsmittels erhalten wurden. Die Auswahl eines Fließregulierungsmittels sollte demnach unter Beachtung seiner Primärpartikelgröße in Anpassung an die Schüttgutbeschaffenheit erfolgen. Somit kann der Fließregulierungsprozess zukünftig systematischer gestaltet werden.
N2  - The flowability of a pharmaceutical powder plays a major role, especially in the production of volume-dosed dosage forms like tablets. Therefore, often so called flow regulators are used to ensure sufficient fluidity. The process of flow regulation can be described by a decrease of van der Waals forces between individual bulk particles. This reduction of adhesion strength is due to the addition of adsorbates of the flow control agent to the surface of the carrier particles. In the context of this work the influence factors of the bulk material as well as the flow control agent on the process of flow regulation should be examined. It was shown that the morphology of a bulk material has great influence on the process of flow regulation. The smoother the surface of a bulk material, the less flow-regulator is stored unused. Therefore, more flow control agent is available that acts as a spacer between the bulk particles leading to a reduction of the van der Waals forces and an improvement of the flowability. Another focus was on assessing the influence of the primary particle size of a flow control agent on its flow regulating potency. For this purpose, silica nanoparticles were synthesized, which differ only in their primary particle sizes. Using the sol-gel process within a micro-emulsion it was possible to produce reliably discrete, spherical and uniform silica nanoparticles in a size range of 8 to 100 nm. To examine the influence of the primary particle size, the synthesized silicas were added to corn starch and lactose and then mixed in a turbula mixer. The evaluation of the potency of the flow-regulating agents in combination with the respective bulk material was performed by measurements with a tensile strength tester. For both bulk materials a clear correlation between the primary particle size and the potency of a flow regulating agent was found. Different results for an optimal primary particle size of the flow control agent were obtained depending on the bulk morphology. Therefore, the selection of a flow control agent should be made in accordance with its primary particle size depending on the bulk composition. Thus, the flow-regulating process should be more systematically in the future.
KW  - Nanopartikel
KW  - Fließverhalten
KW  - Pulver
KW  - Schüttgut
KW  - Mikroemulsion
KW  - Zugspannung
KW  - Fließregulierung
KW  - Nanopartikelsynthese
KW  - flow regulation
KW  - microemulsion
KW  - nanoparticle synthesis
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67489
ER  - 
TY  - THES
A1  - Herb, Monika
T1  - Synthese von Pyridin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivaten als potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-M<sup>pro</sup>
T1  - Synthesis of pyridine-, pyridyl acetic acid- and thiazole-derivates as potential inhibitors of SARS-CoV-M<sup>pro</sup>
N2  - Einen möglichen Ansatzpunkt für eine antivirale Therapie gegen SARS-Coronaviren bildet die Hemmung der Cysteinproteasen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro. Diese übernehmen die Polyprotein-Spaltung während der Virusreplikation und sind damit essentiell für das Überleben und die Verbreitung des Virus. Im Rahmen dieser Arbeit wurden potentielle Inhibitoren der SARS-CoV-Mpro synthetisiert, die Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin-, Pyridylessigsäure- und Thiazol-Derivate als Grundbausteine enthalten. Durch Strukturmodifikationen wurde eine Serie neuer Verbindungen erhalten, deren inhibitorische Aktivitäten in fluorimetrischen Assays (FRET-Assays) an den Enzymen SARS-CoV-Mpro und SARS-CoV-PLpro untersucht wurden. Weiterhin wurden Testungen an Coronaviren, den Protozoen Leishmania major und Typanosoma brucei brucei und an Makrophagen durchgeführt. Die synthetisierten Verbindungen wurden in sechs Strukturklassen eingeteilt. Strukturklasse 1 enthält Pyridin-, Piperidin-, Pyrrolidin- und Pyridylessigsäure-Derivate ohne Seitenkette in α-Position. Diese bestehen aus einem peptidischen Carbonsäure-Fragment mit N-Heterozyklus. Die Strukturklasse 2 bilden Pyridylessigsäure-Derivate mit einer zusätzlichen aliphatischen Seitenkette in α-Position zur Carboxylfunktion. Die Seitenkette sollte durch Adressierung der S1‘- bzw. S2‘-Bindetasche der SARS-CoV-Mpro die Affinität zum Enzym erhöhen. In den Strukturklassen 3 bis 6 bilden Thiazolamide das bestimmende Strukturelement. In der Strukturklasse 3 kamen dabei unterschiedlich substituierte aromatische Carbonsäuren zum Einsatz, die mit einer Reihe 4,5-substituierter Thiazolamine verknüpft wurden. In den übrigen Stoffklassen, in denen ausschließlich 5-Acetyl-4-methylthiazolamin als Amin-Fragment diente, wurde der Einfluss von Säure-Bausteinen ohne Michael-System (Strukturklasse 4) bzw. mit Michael-System (Strukturklasse 5), sowie die Einführung einer Seitenkette am Benzolring oder am Michael-System (Strukturklasse 6) untersucht. Bei den durchgeführten Enzymassays an der SARS-CoV-Mpro zeigten die synthetisierten Verbindungen insgesamt nur eine geringe Hemmung der Protease (<30 %, 20 µM). Daher lassen sich aus den erhaltenen Ergebnissen keine Struktur-Wirkungsbeziehungen ableiten. Dennoch sind in den Ergebnissen Trends erkennbar. Alle aktiven Verbindungen (Hemmung >10 % bei 20 μM) der Pyridin-, Pyrrolidin-, Piperidin- und Pyridylessigsäure-Derivate enthielten als Strukturmerkmal größere Seitenketten wie n-Pentyl, Cyclopropylmethyl und Crotyl (Strukturklasse 2). Bei den Thiazolamiden der Strukturklassen 3-6 führte die Einführung eines Michael-Systems in der Strukturklasse 5 zu etwas aktiveren Verbindungen. Den größten Einfluss auf die Aktivität zeigte jedoch die Einführung einer Seitenkette in α-Postion zur Carboxylgruppe (Strukturklasse 6). In den Strukturklassen 3 und 4 erwiesen sich nur sehr wenige Verbindungen als aktiv.
N2  - Potential targets in antiviral therapy against SARS are the viral cysteine proteases SARS-CoV-Mpro and SARS-CoV-PLpro which are essential enzymes for the viability and the propagation of the virus. These are outstanding targets for the development of new protease inhibitors as antiviral drugs due to the cleavage of the polyprotein encoded by the viral RNA. The main goal of this work was the synthesis of potential inhibitors of SARS-CoV-Mpro which are comprised of pyridine-, piperidine-, pyrrolidine-, pyridyl acetic acid- and thiazole-building blocks. By structural modifications, series of new chemical entities have been synthesized and tested in fluorometric enzyme assays (FRET-assays) for inhibition of SARS-CoV-Mpro and SARS-CoV-PLpro. They were also tested against SARS-coronavirus, the protozoa Leishmania major and Typanosoma brucei brucei and macrophages. These compounds can be subdivided into six structural classes The class 1 contains pyridine-, pyrrolidine-, piperidine- and pyridyl acetic acid-derivatives without a side chain in the α-position. They consist of a carboxylic acid fragment attached to a N-heterocycle. Class 2 compounds are pyridyl acetic acid-derivatives containing an additional aliphatic side chain in α-position to the carboxylic function. Introduction of this side chain was supposed to enhance the affinity of the compound to the enzyme by addressing the S1‘-/S2‘-binding pockets of SARS-CoV-Mpro. In classes 3-6 thiazole amides are the essential structural element. Class 3 comprises thiazole amides with varying aromatic carboxylic acids linked to 4,5-substituted thiazole amines. The classes 4-6 contain 5-acetyl-4-methylthiazolamine as amine fragment with acetic acid building blocks without double bond (class 4), with double bond (class 5) as well as building blocks with an additional side chain attached to the aromatic system or the double bond (class 6). In general, all compounds showed only poor inhibition in enzyme assays with SARS-CoV-Mpro (<30 %, 20 µM). For this reason no clear structure-activity-relationship (SAR) can be deduced, nevertheless the results show some trends. All active compounds (inhibition >10 % at 20 µM) of pyridine-, pyrrolidine-, piperidine- and pyridyl acetic acid-derivatives comprise longer side chains like n-pentyl, cyclopropylmethyl and crotyl (class 2). Examining the thiazole amides of classes 3-6 the introduction of a double bond (class 5) lead to slightly more active compounds. However, the highest influence on protease activity is found with compounds containing a side chain in α-postion to the carboxylic function (class 6). Within classes 3 and 4 only few compounds are active.
KW  - Coronaviren
KW  - SARS
KW  - Proteaseinhibitor
KW  - Organische Synthese
KW  - coronavirus
KW  - organic synthesis
KW  - SARS
KW  - protease inhibitors
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66495
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pabel, Christian Thomas
T1  - Fraktale Charakterisierung pharmazeutischer Schüttgutoberflächen
T1  - Fractal characterization of pharmaceutical bulk solid surfaces
N2  - Schüttgüter in Form von Pulvern oder Granulaten stellen sowohl eigenständige Arzneiformen als auch häufige Zwischenprodukte bei der Arzneimittelherstellung dar. Um die Einheitlichkeit der Dosierung zu gewährleisten, ist die Fließfähigkeit als eines der zentralen Qualitätsmerkmale anzusehen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Veränderung der fraktalen Dimension D der Partikeloberflächen in binären Mischungen von α-Lactose-Monohydrat (GranuLac® 200) und hydrophilem hochdispersem Sili-ciumdioxid (Aerosil® 200) in Abhängigkeit von der Mischzeit untersucht. Hierbei kamen sowohl die Ras-terkraftmikroskopie als auch verschiedene Adsorptionsmethoden zur Anwendung. Ziel war es, die prin-zipielle Durchführbarkeit der beschriebenen Techniken sowie deren Anwendbarkeit auf das vorliegende Modellsystem zu prüfen und die ggf. bestehende Korrelation zwischen D und den Ergebnissen der Zug-spannungstests aufzuzeigen.
N2  - Bulk solids like powders or granulates are dosage forms of their own as well as regular intermediates in pharmaceutical production. Flowability is considered a key prerequisite for uniformity of dosage. In the survey reported here the effect of blending time on particle surface fractal dimension D of binary mixtures of α-lactose monohydrate (GranuLac® 200) and hydrophilic highly dispersible silicon dioxide (Aerosil® 200) was investigated by use of atomic force microscopy as well as several adsorption tech-niques. Aim of the study was to test the described methods for applicability to the current model and to identify the correlation between D and the tensile strength, if any.
KW  - Schüttgut
KW  - Teilchen
KW  - Festkörperoberfläche
KW  - Fraktale Dimension
KW  - bulk solid
KW  - particle
KW  - particle surface
KW  - fractal dimension
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66562
ER  - 
TY  - THES
A1  - Trammer, Beatrice
T1  - Ex-vivo-Modelle zur Charakterisierung der Pharmakokinetik pulmonal applizierter Wirkstoffe: Dialyse- und humanes Lungenperfusionsmodell
T1  - Ex-vivo models enabling the pharmacokinetic characterization of pulmonary applied drugs: dialysis model and isolated human lung perfusion model
N2  - Aus pharmakokinetischer Sicht sind neben Parametern wie der oralen Bioverfügbarkeit und der systemischen Clearance, für die Effektivität und Sicherheit eines inhalativ angewendeten Wirkstoffes unter anderem das Ausmaß der pulmonalen Deposition und seine pulmonale Umverteilungskinetik entscheidend. Wird eine topische Wirkung des Arzneistoffes angestrebt, so trägt eine lange Verweilzeit des Arzneistoffes im Zielgewebe, verbunden mit einer langsamen Umverteilung in den systemischen Kreislauf zu einer Wirkungsoptimierung mit gleichzeitiger Minimierung systemischer Nebenwirkungen bei. In-vitro- und ex-vivo-Modelle eignen sich hervorragend zur isolierten Untersuchung solcher pharmakokinetischer Vorgänge ohne den Einfluss verschiedener in-vivo-Faktoren, wie der Verteilung in andere Gewebe, Metabolisierungs- oder Eliminationsprozessen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, Modelle der humanen Lunge zu etablieren bzw. weiterzuentwickeln, die möglichst realitätsnah die Untersuchung der Pharmakokinetik pulmonal applizierter Wirkstoffe ermöglichen.
N2  - From a pharmacokinetic point of view, the extent of pulmonary deposition and the pulmonary redistribution are crucial for an inhaled drug’s effectiveness and safety besides parameters such as oral bioavailability and systemic clearance. Aiming at a local effect, a long residence time in the target tissue combined with a slow redistribution into systemic circulation contribute to a drug’s optimal potency while simultaneously minimizing systemic adverse effects. In-vitro and ex-vivo models are particularly suitable for examining single pharmacokinetic aspects without the influences occurring in-vivo such as distribution into other tissues and processes of metabolism or elimination. Therefore, the aim of the present thesis was to establish, respectively enhance models of the human lung, which were able to describe the pharmacokinetics of pulmonary applied drugs close to reality.
KW  - Pharmakokinetik
KW  - Lunge
KW  - Ex vivo
KW  - Wirkstoff
KW  - pharmacokinetic
KW  - lung
KW  - ex vivo
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66119
ER  - 
TY  - THES
A1  - Erxleben, Franziska
T1  - cDNA-Microarray-Analyse von ZNS-Kaliumkanal defizienten Mäusen
T1  - cDNA-Microarry-Analysis of CNS-potassium channel deficient mice
N2  - Ziel der Arbeit war die Erstellung eines „Kaliumkanal-Chips“, die Entwicklung einer geeigneten Messmethode und Auswertungsstrategie, die Durchführung von Testmessungen und die Untersuchung eines Knockout-Mausstammes auf den Genexpressionsstatus und die auftretenden Kompensationsmechanismen. Am Beginn der Arbeit stand vor allem die Auswahl der zu untersuchenden Kaliumkanal-Gene und die Sammlung von Sequenz-Informationen. Ausgehend davon konnte die cDNAMicroarray-Technologie als Methode der Wahl bestimmt werden und die entsprechenden Vorbereitungen für die Umsetzung getroffen werden. Die ersten Messungen im Zuge der Methodenentwicklungen zeigten vor allem, dass jeder Microarray seine individuellen Probleme mit sich bringt, ließen jedoch auch schon erahnen, welche umfangreichen Möglichkeiten diese Technologie bietet. Dann folgten Versuchsmessreihen, wie die Untersuchung der lterspezifischen Expression und der Vergleich von bestimmten Gehirnabschnitten mit dem Gesamtgehirn. Den Abschluss bildete die Messung der TRESK-Knockout-Mauslinie im Vergleich zu ihrem Wildtyp. Hier stand die Frage nach möglichen Kompensationsmechanismen im Vordergrund. Mit kcnk16 haben die Messungen einen interessanten Kandidaten aus der gleichen Genfamilie geliefert, dessen Funktion und Kompensationsvermögen nun in weiteren Tests zu untersuchen ist. Die Arbeit hat gezeigt, dass der Einsatz der Microarray-Technologie zur Untersuchung von Genexpressionsdaten bei Ionenkanalfamilien geeignet ist. Das Fundament der Microarrayanalyse von Kaliumkanälen mit einem individuell entwickelten Microarray ist zum einen das Wissen um Genetik und Funktion der Kaliumkanäle und zum anderen die Technologie, die eine solche Analyse möglich macht. Die Tatsache, dass Säugerorganismen wie Maus und Mensch eine solch hohe Zahl an Kaliumkanälen entwickelt haben und im ständigen Zellstoffwechsel in umfassender Form einsetzen, zeigt die Bedeutung dieser Ionenkanalfamilie und macht die Forschung an diesen Kanälen so interessant und wichtig für die medizinische Grundlagenforschung. Eine Vielzahl von Krankheiten kann schon jetzt direkt oder indirekt auf Gendefekte bei Kaliumkanal-Genen zurückgeführt werden. Mit der Microarray-Analyse steht nun eine Technologie zu Verfügung, die es ermöglicht, die Expression dieser Gene direkt zu untersuchen und mögliche Kompensationsvorgänge aufzudecken. Damit können Zusammenhänge ermittelt werden, die die Grundlage für weitere Forschungen sein können, mit deren Hilfe wir Krankheiten wie Depression eines Tages wirklich verstehen und behandeln können.
N2  - The aims of this dissertation were the creation of a „potassium channel chip“, the development of adequate measurement method and strategy of analysis, the performance of developmental experiments and the analysis of the status of genexpression and the occurring mechanisms of compensation in a knockout mouse stem. In beginning the selection of the potassium channel genes to be considered as interesting part of the microarray and the compilation of the sequence information was the main part of the work. Starting from this the choice of the adequate cDNA-microarray-technology and the preparation of the implementation was possible. The first experiments performed in the course of the method development have given a hint on the problems connected with every microarray. However they also have shown the great possibilities of the microarray technology. In the ollowing series of measurements like the investigation of variation of expression during the juvenile development and the comparison of different parts of the brain with the whole brain were performed. The studies were completed by the investigation of the TRESK-Knockout mouse stem in comparison to its wild type. The centre of these studies was the question for possible mechanisms of compensation. As a result kcnk16 - being part of the same gene family as TRESK - can be named as an interesting candidate to be investigated for its function and capacity of compensation in the future. In my dissertation I was able to show that the microarray technology is an adequate method for the comparison of genexpression between members of ion channel families. The bases of the microarray analysis of potassium channels with a individually designed microarray are on the one side the knowledge of the genetics and function of the potassium channels and on the other side the technology which allows this kind of analysis. The fact that mammalian organism like mouse and human have developed such a great number of potassium channels and are using these in the regular cell metabolism in a comprehensive way shows the importance of this ion channel family and makes the research on these channels so interesting and important for fundamental research. A multiplicity of diseases can be attributed indirectly or directly to gene malfunctions in potassium channels. With microarray a technology is available, which permits to investigate the expression of these genes directly and to discover possible ways of compensation. By this coherences can be identified being the basis for continuative research which one day will make it possible to really understand and treat diseases like depression.
KW  - Maus
KW  - Knockout <Molekulargenetik>
KW  - Kaliumkanal
KW  - Zentralnervensystem
KW  - Microarray
KW  - DNS-Chip
KW  - Knock-out Maus
KW  - TRESK
KW  - Zentralnervensystem
KW  - Hirnzelle
KW  - Ionenkanal
KW  - Spannungskontrollierter Ionenkanal
KW  - Differentielle Genexpression
KW  - Potassium channel
KW  - Microarray
KW  - CNS
KW  - Genexpression
KW  - Knock out
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65640
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stempka, Martin
T1  - Expression und Reinigung der SARS-Coronavirus-M<sup>pro</sup> und deren Co-Kristallisation mit spezifischen Inhibitoren
T1  - Expression and purification of the SARS coronavirus m<sup>pro</sup> and its co-crystallization with specific inhibitors
N2  - Bei SARS („Schweres akutes respiratorisches Syndrom“) handelt es sich um eine Infektionskrankheit des Menschen, welche im November 2002 erstmalig auftrat. Als Erreger dieser Krankheit wurde das SARS-assoziierte Coronavirus identifiziert. Dessen viruseigene Reproduktionsmaschinerie wird vor allem durch die katalytische Aktivität einer Cysteinprotease, der SARS-Coronavirus-Hauptprotease (SARS-CoV-Mpro), und die damit verbundene Prozessierung von viralen Polyproteinen, aufrechterhalten. Diese Schlüsselfunktion der SARS-CoV-Mpro macht sie zu einem vielversprechenden Zielobjekt bei der Entwicklung von spezifischen Inhibitoren für diese Protease, welche somit eine Vermehrung des Virus verhindern. In dieser Arbeit wurde die SARS-CoV-Mpro mit optimierten Methoden exprimiert und gereinigt. Mit der Methode der ESI-MS-Analyse konnte ein kovalentes, irreversibles Bindungsverhalten verschiedener Inhibitoren gezeigt werden und erstmals auch die Bindung von Fragmenten von Inhibitormolekülen an die Protease. So zeigten die SARS-CoV-Mpro-Inhibitoren MH211A und UK-VI-1g eine kovalente Bindung des kompletten Moleküls pro Enzym-Monomer: überraschenderweise hatten bis zu vier Moleküle MH211A bzw. zwei Moleküle UK-VI-1g an ein Proteasemolekül gebunden. Die Bindung von UK-VI-1g an die Protease wurde an zwei Peptiden im Bereich von den Aminosäuren 62 bis 76 bzw. 280 bis 298 nachgewiesen, wobei beide nicht in der Nähe der active site lokalisiert sind. Im Falle des Inhibitors Lit1 bindet der 2,6-Dinitro-4-trifluoromethyl-phenyl-Rest, bei TS48 das Zimtsäure-Thioester-Fragment kovalent an jedes Monomer im dimeren Enzym. Die SARS-CoV-Mpro wurde erstmals ohne Abtrennung des C-terminalen His-tag mit spezifischen Inhibitoren co-kristallisiert. Drei mögliche Orientierungen des Inhibitors TS174 wurden in der active site der Protease identifiziert. Aufgrund der schwachen Elektronendichte des Inhibitors konnten diese nicht weiter untersucht werden. Das Iod-Isatin-Derivat IISBT wurde ebenfalls mit der SARS-CoV-Mpro zusammen co-kristallisiert und es konnte erstmalig eine kovalente Bindung eines Isatin-Derivats an die SARS-CoV-Mpro anhand einer Röntgenstruktur klar gezeigt werden. Diese Struktur zeigte dann, dass früher veröffentlichte molekulare docking-Studien, die eine nicht-kovalente Bindung von IISBT und anderen Isatin-Derivaten veranschaulichen, nochmal überdacht werden sollten. Basierend auf einer ESI-MS-Analyse und früheren Ergebnissen von MALDI- und Dialyse-Experimenten, kann man sicher annehmen, dass IISBT in einer kombinierten kovalent-reversiblen Art und Weise an die SARS-CoV-Mpro bindet.
N2  - SARS („severe acute respiratory syndrome”), a respiratory disease in humans, appeared in November 2002 for the first time. The causative agent of this disease is the SARS-associated coronavirus. Its replication machinery is maintained by the catalytic activity of a cysteine protease, named SARS coronavirus main protease (SARS-CoV-Mpro) that processes the virus derived polyproteins. Based on this key role the SARS-CoV-Mpro is an attractive target for the development of specific inhibitors against this protease thereby inhibiting the reproduction of the virus. In this work, the SARS-CoV-Mpro was expressed and purified by optimized methods. Through ESI-MS analysis an irreversible covalent interaction of various inhibitors was detected but also for the first time the binding of fragments of the inhibitors to the protease. Accordingly the SARS-CoV-Mpro inhibitors MH211A and UK-VI-1g displayed a covalent binding of the complete molecule to the enzyme monomer: surprisingly up to four molecules of MH211A and two molecules of UK-VI-1g respectively bound to one protease molecule. The interaction of UK-VI-1g with the protease was detected for two peptides ranging from amino acids 62 to 76 and 280 to 298 both of which are not located near the active site. In case of inhibitor Lit1 the 2,5-dinitro-4-trifluormethlphenyl-fragment and in TS48 the cinnamic acid-thioester-fragment binds covalently to each monomer in the dimeric enzyme. For the first time the SARS-CoV-Mpro was co-crystallized with specific inhibitors without cleaving the C-terminal His-tag. Three possible orientations of the inhibitor TS174 were identified in the active site of the protease. They could not be further resolved due to the weak electron density for the inhibitor. The iodoisatin derivative IISBT was co-crystallized with SARS-CoV-Mpro as well and a covalent binding mechanism of an isatin derivative to the SARS-CoV-Mpro was clearly shown for the first time in an X-ray structure. This structure then indicates that the previously published molecular docking studies demonstrating a noncovalent binding mode of IISBT and other isatin derivatives should be reconsidered. Based on an ESI-MS analysis and previous results of MALDI and dialysis experiments it is safe to assume that IISBT binds to the SARS-CoV-Mpro in a combined covalent reversible manner.
KW  - SARS
KW  - Kristallisation
KW  - Proteaseinhibitor
KW  - ESI-MS
KW  - Coronavirus
KW  - SARS
KW  - protease inhibitor
KW  - crystallization
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57083
ER  - 
TY  - THES
A1  - Freitag, Claudia
T1  - Quantifizierung von Aminosäuren in Infusionslösungen mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-(Tandem) - Massenspektrometrie(HPLC-[MS/]MS) Methodenentwicklung und Validierung
T1  - Quantitation of amino acids in infusion solutions by high performance liquid chromatography - (tandem) - mass spectrometry (HPLC-[MS/MS]) - method development and validation
N2  - Das Ziel vorliegender Arbeit war die Entwicklung einer HPLC-MS(/MS)-Methode, die im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle zur direkten Quantifizierung von Aminosäuren (AS) in Infusionslösungen angewendet werden kann. Die Zielset-zung schloss eine Validierung innerhalb der für die Zweckbestimmung vorgesehenen Grenzen ein. Im Rahmen der Methodenentwicklung wurde das ESI-MS/MS-Fragmentierungs-muster von 21 Aminosäuren, von 20 stabil-isotopenmarkierten Aminosäuren, die als interne Standards verwendet wurden, sowie von einigen weiteren Substanzen bestimmt. Nach Kenntnis von Precursor- und Produktionen erstellte man eine SRM-Methode zur spezifischen MS/MS-Analyse. Dabei wurden durch das jeweilige Frag-mentierungsmuster bedingte Interferenzen bei den zu untersuchenden Aminosäuren bestimmt, die bei der zu erarbeitenden HPLC-MS-Methode beachtet werden mussten. Die Methodenentwicklung zur HPLC-MS-Analytik von underivatisierten AS umfasste mit der RP-HPLC unter Verwendung eines Ionenpaarreagenzes (IP) und der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) zwei verschiedene chromatographi-sche Ansätze. Bei der Anwendung der RP-HPLC ergaben sich Probleme. Die Verwendung eines IP, im vorliegenden Fall TDFHA (Tridecafluorheptansäure), führte zu langen Equilibrierungs-, Re-Equilibrierungs- und Spülzeiten und damit bei zwar relativ kurzer HPLC-Laufzeit zu einem aber insgesamt hohen Zeitaufwand. Gleich-zeitig war die LC-MS-Anlage auf diese Anwendung fixiert, da das Ionenpaarreagenz das Gerät stark verschmutzte und dadurch andere Analysen erheblich störte. Zudem waren die Retentionszeiten der Analyten trotz langer Equilibrierungszeiten schlecht reproduzierbar, so dass eine solche Methode im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätskontrolle schwer validierbar wäre. Weiterführende Untersuchungen erfolgten daher nicht. In nachfolgenden Studien mit der HILIC wurden verschiedene Einflussparameter (Anteil organischer Phase im Fließmittel, pH-Wert des Fließmittels, Temperatur der Säule, Pufferkonzentration im Fließmittel, Gradientenelution) auf die Trennung der AS an einer ZIC®-HILIC-Säule untersucht. Durch Optimierung der Parameter wurde so eine HILIC-HPLC-Methode entwickelt, bei der 21 AS und 20 ihrer isotopen-markierten Referenz-AS innerhalb von 20 min eluierten. Diejenigen AS, bei denen im Rahmen der Fragmentierungsstudien Interferenzen aufgrund gleicher bzw. ähnlicher Massen der Precursor- bzw. Produktionen aufgetreten waren, wurden chroma-tographisch getrennt. Gleichzeitig hat sich die SIM-Analyse als anwendbar erwiesen. Die Anwendung des spezifischeren SRM-Modus und damit der Tandem-Massenspektrometrie war nicht erforderlich. Im Rahmen der nachfolgenden Studien zur Validierung ergab sich, dass die entwickelte Methode über einen weiten Bereich eine lineare Abhängigkeit zwischen Konzentrations- und Messwerten zeigte. Für drei der 21 AS (NAcCys, NAcTyr, Pro) wurde die quadratische Regression mit dem Anpassungstest nach Mandel als geeig-neteres Regressionsmodell ermittelt. Bei Untersuchungen zur Wiederfindung wurde ein Einfluss der Matrix-Lösung der Infusionslösung festgestellt, der zu Abweichungen hinsichtlich des Quotienten AreaAS / AreaIS führte, so dass eine Quantifizierung innerhalb der geforderten Grenzen bei Kalibrierung über reine Standardlösungen nicht möglich war. Die Validierung wurde daher nachfolgend in der Matrixlösung durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass mit der entwickelten HILIC-HPLC-MS-Methode Aminosäuren in Infusionslösungen mit hoher Präzision und Richtigkeit bestimmt werden können. Neun der 21 untersuchten AS konnten im Bereich von 30% - 350%, zehn weitere im Bereich von 50% - 350% innerhalb der zur Gehaltsbestimmung von pharmazeutischen Formulierungen vorgeschriebenen Grenzen (Wiederfindung Einzelbestimmung: 98% -102.0%, Mittelwert einer Dreifachbestimmung: 98.5% – 101.5%) quantifiziert werden. Für His und Phe gelang allerdings keine Quantifizierung innerhalb der Akzeptanzkriterien, wobei der Grund hierfür in weiteren Studien geklärt werden müsste. Mit der entwickelten Methode ist damit eine gleichzeitige Quantifizierung verschiedener AS-Infusionslösungsformulierungen möglich, die sich bei gleicher Matrix in der Konzentration an AS unterscheiden. Beispielsweise seien hier die Formulierungen „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ genannt, die mit der validierten Methode erfassbar sind. Die Probenvorbereitung beschränkt sich dabei auf den Zusatz der IS-Formulierung zur Infusionslösung und einen Verdünnungsschritt. Die Quanti-fizierung erfolgt über eine 5-Punkt-Kalibriergerade, die aus einer AS- und IS-Standardmischung, nach Zusatz der einfach herzustellenden Elektrolyt-Matrix, erstellt wird. Die Analysenzeit der HPLC-MS-Methode beträgt einschließlich Equilibrie-rungszeit 35 min und ist damit deutlich kürzer als die 120 min, die bei der nach wie vor zur AS-Analytik allgemein gebräuchlichen Ionenaustauschchromatographie mit Ninhydrin-Nachsäulenderivatisierung anzusetzen sind.
N2  - The aim of this study was to develop an HPLC-MS(/MS) method to be used within pharmaceutical quality control for the direct quantitation of amino acids (AS) in infusion solutions. The validation within the limits of the intended purpose was part of the objective. In the course of the method development the ESI-MS/MS fragmentation pattern of 21 amino acids, 20 stable isotope labelled amino acids, which were used as internal standards, and some further substances were determined. By knowing precursor- and product ions a SRM-method for specific MS/MS analysis was created. Interferences due to the respective fragmentation pattern within the analytes were detected, which had to be considered during the following HPLC-MS method development. The HPLC-MS method development for the analysis of underivatized AS comprised two different approaches: the RP-HPLC using an ion-pair reagent (IP) und the hydrophilic interaction chromatography (HILIC). Problems occurred using the RP-HPLC. Due to the IP, in this study TDFHA (tridecafluoroheptanoic acid), long equilibration-, re-equilibration and rinsing-times were necessary so that this method is very time consuming despite short HPLC run times. Because of the contamination with TDFHA the use of the LC-MS system was limited. Furthermore, despite long equilibration times, retention times of the analytes were poorly reproducible. A validation of the method within the requirements of the pharmaceutical quality control would be therefore hardly to perform. Thus, further studies were not carried out. The following studies were focused on HILIC. Different parameters (percentage of organic solvent in the eluent, pH of the eluent, column temperature, buffer concentration in the eluent, gradient elution) were checked concerning their effects on the separation of AS on a ZIC®-HILIC column. By optimizing the parameters, a HILIC-HPLC method was developed, by which 21 AS and 20 of their stable labelled isotopes were eluted within 20 min. All AS, which interfered with other AS due to their fragmentation pattern, were chromatographically separated. Moreover, the SIM mode was found to be suitable for the separation of AS, thus avoiding SRM mode and tandem mass spectrometry. During the validation studies the HILIC-HPLC-MS method showed linear relation between AS-concentration and measured value over a wide range. Linearity was tested with the Mandel test revealing better fit by quadratic regression for three of 21 AS (NAcCys, NAcTyr and Pro). Recovery studies showed an influence of the matrix of the infusion solution, which led to deviations in the quotients areaAS / areaIS. As a result, quantitation by calibration with pure AS standard solutions was not possible within the given limits. Thus, validation was performed with matrix solution. Thereby it was shown that with the developed HPLC-MS method AS could be deter-mined in infusion solutions with high precision and accuracy. Nine of 21 AS were quantified in the range of 30%-350%, ten AS in the range of 50%-350% within the given requirements of pharmaceutical quality control (individual recovery value: 98% -102.0%, mean recovery value (threefold determination): 98.5% – 101.5%). His and Phe could not be quantified within the acceptance criteria; the reason for this would have to be found out in further studies. With the developed method the simultaneous quantitation of different AS infusion solutions, which differ in analytes concentrations with constant matrix concentration, can be realized. For instance, the formulations „Aminoplasmal® E 5% / 10% /15%“ can be mentioned, which could be determined by using the validated method. Sample preparation is fast and simple, consisting in addition of IS-formulation to the infusion solution and a single dilution step. Quantitation is performed by external standard calibration; the 5-point-regression-line is made by analyzing AS- and IS-standard solution after adding the electrolyte matrix solution, which is easily to produce. HPLC-MS analysis time is 35 min (including equilibration time), thus considerably shorter than the approximately 120 min required with the still common AS analytical method (ion exchange chromatography with postcolumn ninhydrin derivatization).
KW  - Aminosäuren
KW  - Qualitätskontrolle
KW  - HPLC-MS
KW  - Aminosäuren
KW  - hydrophile Interaktionschromatographie
KW  -   HILIC
KW  - Validierung
KW  - Methodenentwicklung
KW  - Infusionslösungen
KW  - amino acids
KW  - hydrophilic interaction chromatography
KW  - HILIC
KW  - HPLC-MS
KW  - validation
KW  - method development
KW  - infusion solutions
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65198
ER  -