TY  - THES
A1  - Doll, Julia
T1  - Identifizierung und Charakterisierung neuer, mit Hörstörungen assoziierter Gene und Varianten mittels Exom-Sequenzierung
T1  - Identification and characterization of novel hearing loss associated genes and variants by Exome Sequencing
N2  - Laut des aktuellen Reports der Weltgesundheitsorganisation sind ca. 466 Millionen Menschen weltweit von einer Hörstörung (HS) betroffen. Durch die enorme Heterogenität und die klinische Variabilität, die diese Erkrankung ausmacht, und viele bisher nicht mit HS assoziierte Gene, bleibt ein großer Teil der erblich bedingten HS in vielen Familien unaufgeklärt. Die Entwicklung moderner Techniken, wie die Next-Generation Sequenzierung (NGS) und der Fortschritt bei der Untersuchung von Modellorganismen trugen jedoch in den letzten Jahren immens dazu bei, neue Gene zu identifizieren, die innerhalb des auditorischen Signalwegs oder damit assoziierten Strukturen beteiligt sind. Die vorliegende Arbeit umfasst Ergebnisse dreier Veröffentlichungen, in denen iranische und pakistanische Familien und eine deutsche Familie mit erblich bedingter HS untersucht und neue, krankheitsverursachende Varianten identifiziert und funktionell charakterisiert wurden. Im ersten Abschnitt konnten zwei neue rezessive Varianten im CDC14A-Gen als krankheitsverursachend identifiziert werden, die zu einem potentiellen Funktionsverlust des kodierten Proteins in einer iranischen und einer pakistanischen Familie führen. Mit Hilfe einer funktionellen Charakterisierung auf RNA-Ebene (Spleiß-Assay und RT-qPCR) konnte der Funktionsverlust beider Varianten bestätigt werden. Der zweite Abschnitt umfasst eine deutsche Familie mit sieben von einer HS betroffenen Familienmitgliedern, in der eine heterozygote missense Variante in MYO3A identifiziert wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte somit die erste autosomal dominante Variante in einer europäischen Familie mit einer bilingualen, sensorineuralen Hochtonschwerhörigkeit beschrieben werden und der dominante Charakter von MYO3A bestätigt werden. Im dritten Abschnitt konnten die krankheitsverursachenden Varianten in 13 Familien aus einer Kohorte mit 21 pakistanischen Familien mit einer syndromalen und nicht-syndromalen HS ausfindig gemacht werden. Hierbei wurden sowohl bekannte, als auch bisher nicht beschriebene Varianten detektiert. Die Aufklärungsrate innerhalb dieser Kohorte betrug 61,9% und es konnte somit das Spektrum syndromaler und nicht-syndromaler HS erweitert werden. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschreibt eine iranische Familie mit einer milden HS und milden Intelligenzminderung, in der eine homozygote missense Variante im Kandidatengen DBN1 ausfindig gemacht wurde. Um die Funktion und die Auswirkungen eines potentiellen Verlusts des codierten Proteins Drebrin zu untersuchen, wurden immunhistochemische Färbungen und auditorische Messungen an Dbn1 Knockout (KO)-Mäusen durchgeführt. Hierbei konnte eine Expression innerhalb der Nervenfasern, die innere Haarzellen innervieren, nachgewiesen werden. Eine leicht verlängerte Latenz für die ABR-Welle IV in KO-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp ergab den Hinweis auf einen Defekt innerhalb des zentralen auditorischen Signalwegs, der möglicherweise mit einer Sprachverarbeitungsstörung im Menschen korreliert.
N2  - According to the latest World Health Organization report, approximately 466 million people are affected by hearing loss (HL) worldwide. Due to the enormous heterogeneity and clinical variability that comes with this disorder and the previously unassociated HL genes, a large proportion of hereditary HL remains unexplained in many families. However, the development of modern techniques such as next-generation sequencing (NGS) and constant progress in the study of model organisms contributed immensely to the identification of new genes involved within the auditory pathway or associated structures. This thesis includes results of three publications in which Iranian and Pakistani families and a German family with HL were studied and novel disease-causing variants were identified and characterized. In the first section, two novel recessive variants in the CDC14A gene were identified as disease-causing, leading to a loss-of-function of the encoded protein in an Iranian and a Pakistani family. Functional characterization on RNA level (splice assay and RT-qPCR) confirmed the loss of function of both variants. The second section includes a German family with seven family members affected by HL, in which a heterozygous missense variant in MYO3A was identified. Thus, the first autosomal dominant variant in a European family with a bilingual sensorineural high-frequency hearing loss could be described in the current work. In the third section, the disease-causing variants were established in 13 families from a cohort of 21 Pakistani families with syndromic and non-syndromic HL. Both known and previously undescribed variants were detected. The detection rate within this cohort was 61.9% and thus the spectrum of syndromic and non-syndromic HL could be expanded. The final section of this work describes an Iranian family with mild HL and mild intellectual disability in which a homozygous missense variant in the candidate gene DBN1 was detected. To investigate the function and effects of a potential loss of the encoded protein Drebrin, immunohistochemical staining and auditory measurements were performed in Dbn1 knockout mice. Here, expression within nerve fibers innervating inner hair cells was detected. A slightly prolonged latency for ABR wave IV in the auditory pathway in KO mice compared to wild type mice provided evidence for a defect within the central auditory pathway that might correlate with a speech processing disorder in humans.
KW  - Hörstörung
KW  - Exomsequenzierung
KW  - Konsanguinität
KW  - Hörstörungen
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-261097
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schulz, Ellina
T1  - Lokale Ultraschall-vermittelte Zytostatika-Applikation  zur Behandlung von Hirntumoren
T1  - Local ultrasound mediated cytostatic drug application for the treatment of brain tumors
N2  - Glioblastoma (GBM) sind bösartige hirneigene Tumore, deren schlechte Prognose einer innovativen Therapie bedarf. Aus diesem Grund wurde ein neuer Therapieansatz entwickelt, der auf einer lokalen Ultraschall-vermittelten Zytostatika Applikation beruht. Hierfür wurden stabile Microbubbles (MB) bestehend aus Phospholipiden synthetisiert. Es konnte gezeigt werden, dass MB als auch fokussierter Ultraschall niedriger Intensität (LIFU) keinen negativen Einfluss auf GBM-Zellen hat. MB hingegen konnten mittels LIFU destruiert werden, wodurch das in den MB eingeschlossene Chemotherapeutikum freigesetzt werden kann. Es wurden verschiedene Platin(II)- und Palladium(II)-Komplexe auf GBM Zellen getestet. Zur Beladung der MB wurde Doxorubicin (Dox) verwendet. Es konnte eine Beladungseffizienz der MB mit Dox von 52 % erreicht werden, auch eine Aufreinigung dieser mittel Ionenaustausch-Chromatographie und Dialyse war erfolgreich. Die Austestung der mit Dox beladenen MB (MBDox) erfolgte auf GBM-Zellen in 2D- und 3D-Zelkulturmodellen. Dabei zeigte sich, dass die Behandlung mit MBDox und LIFU für 48 h eine zytotoxische Wirkung hatte, die sich signifikant von der Behandlung mit MBDox ohne LIFU unterschied. Zur Austestung der MBDox in 3D-Zellkulturmodellen wurden zwei Scaffold-Systeme eingesetzt. Es zeigte sich in den Versuchen, dass MBDox mit LIFU im Vergleich zu MBDox ohne LIFU Applikation einen zytotoxischen Effekt auf GBM-Zellen haben. Somit konnte die Wirksamkeit der Zytostatika Applikation mittels MB und LIFU in 2D- und 3D-Zellkulturmodellen erfolgreich etabliert werden. Als weiterer Schritt wurden zwei 3D in vitro Modelle erarbeitet. Dabei wurden zunächst organotypische hippocampale Slice Kulturen (organotypic hippocampal brain slice cultures, OHSC) aus der Maus hergestellt und anschließend mit fluoreszent-markierten Mikrotumoren aus GBM-Zelllinien, Primärzellen (PZ) und aus Patienten generierten GBM-Organoiden hergestellt. Diese GBM-Modelle wurden mit Tumor Treating Fields (TTFields) behandelt. Dabei war eine Abnahme der Tumorgröße von Mikrotumoren aus GBM-Zellen und PZ unter TTFields-Behandlung für 72 h messbar. Als weiteres in vitro Modell wurden humane Tumorschnitte aus intraoperativ entferntem GBM-Patientenmaterial hergestellt. Die Schnitte wiesen ein heterogenes Ansprechen nach 72 h TTFields-Applikation auf. Dies spiegelt die Heterogenität des GBM sehr gut wider und bestärkt die Eignung des Modelles zur Untersuchung von neuen Therapieansätzen zur Behandlung von GBM.
N2  - Glioblastoma (GBM) are malignant brain tumor with a poor prognosis requiring innovative therapy. For this reason, a new therapeutic approach based on local ultrasound-mediated cytostatic application is now being established. For this purpose, stable microbubbles (MB) consisting of phospholipids were synthesized. It could be shown that MB as well as focused low intensity ultrasound (LIFU) had no negative effect on GBM cells. MB, on the other hand, could be destroyed by LIFU, allowing the release of the chemotherapeutic agent entrapped in MB. Different platinum(II) and palladium(II) complexes were tested on GBM cells. Doxorubicin (Dox) was used to load the MB. Loading efficiency of MB with Dox of 52% was achieved, and purification of these by ion-exchange chromatography and dialysis was also successful. Dox-loaded MB (MBDox) was tested on GBM cells in 2D and 3D cell culture models. This showed that treatment with MBDox and LIFU for 48 h had a cytotoxic effect that was significantly different from treatment with MBDox without LIFU. Two scaffold systems were used to test MBDox in 3D cell culture models. It was shown in the experiments that MBDox with LIFU had a cytotoxic effect on GBM cells compared with MBDox without LIFU application. Thus, the efficacy of cytostatic drug application using MB and LIFU was successfully established in 2D and 3D cell culture models. As a further step, two 3D in vitro models were developed. Here, organotypic hippocampal brain slice cultures (OHSC) were first prepared from mice and then with fluorescent-labeled microtumors from GBM cell lines, primary cells (PZ), and GBM organoids generated from patients. These GBM models were treated with tumor treating fields (TTFields). Thereby, a decrease in tumor size of microtumors derived from GBM cells and PZ was measurable under TTFields treatment for 72 h. As another in vitro model, human tumor sections were prepared from intraoperatively removed GBM patient material. The sections showed heterogeneous responses after 72 h of TTFields application. This reflects the heterogeneity of GBM very well and reinforces the suitability of the model to investigate new therapeutic approaches for the treatment of GBM.
KW  - Glioblastom
KW  - Hirntumor
KW  - Ultraschall
KW  - Microbubbles
KW  - Glioblastoma
KW  - Slice Culture
KW  - 3D cell culture
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320168
ER  - 
TY  - THES
A1  - Amelingmeier, Florian
T1  - Identifizierung und Untersuchung TOP-mRNA - bindender Faktoren
T1  - Identification and examination of TOP mRNA binding factors
N2  - Im Zellkern eukaryotischer Zellen werden Gene in mRNAs transkribiert, welche umfangreich prozessiert und aus dem Zellkern exportiert werden. Im Zytoplasma erfolgt die Translation der mRNAs in Proteine, ein Prozess, welcher viel Energie benötigt und daher mittels vielfältiger Mechanismen streng reguliert wird. Ein Beispiel hierfür stellt die Klasse der TOP-mRNAs dar, eine RNA-Spezies, welche hauptsächlich Transkripte von Genen umfasst, die selbst in die Translation involviert sind. Die prominentesten Vertreter dieser Klasse sind die Proteine der kleinen und großen ribosomalen Untereinheiten. TOP-mRNAs zeichnen sich durch ein gemeinsames Sequenz-Motiv am Anfang Ihrer 5’-UTR aus, welches aus einem Pyrimidinstrang besteht und unmittelbar nach dem Cap mit einem Cytosin beginnt. Dieses allen TOP-RNAs gemeinsame Motiv ermöglicht die zeitgleiche Translationskontrolle dieser RNA-Klasse. So kann die Translation der TOP-mRNAs unter Stressbedingungen wie z.B. Nährstoffmangel koordiniert inhibiert werden, wodurch Energie eingespart wird.
Bereits lange wird nach einem Regulator gesucht, der an dieses TOP-Motiv bindet und die koordinierte Regulation ermöglicht. Man kann sich hier einen Inhibitor oder auch einen Aktivator vorstellen. Verschiedene Proteine wurden bereits in Erwägung gezogen. In dieser Arbeit wurde das Protein TIAR mittels Massenspektrometrie als TOP-interagierender Faktor identifiziert und dessen Bindungseigenschaften mit dem TOP-Motiv durch Shift Assays untersucht. Hierbei konnten Minimalkonstrukte verschiedener Organismen sowie RNA-TOP – Sequenzen identifiziert werden, welche sich für Strukturanalysen eignen würden. Als weiterer TOP-interagierender Faktor wurde über verschiedene sequenzielle Reinigungsschritte das Protein 14-3-3ε identifiziert.
Weiterhin wurden die TOP-Motiv-bindenden Proteine LARP1 und LARP7 auf Ihre Bindungseigenschaften mit Ihren Zielsequenzen untersucht. Während gezeigt werden konnte, dass LARP1 einen inhibierenden Einfluss auf TOP-RNAs hat, wurde in weiteren Shift-Assays die Bindungseigenschaften von LARP7 mit 7SK untersucht, wobei ebenfalls ein minimales LARP7–Konstrukt sowie 7SK-Konstrukte für Strukturanalysen identifiziert werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass verschiedene Substanzen wie tRNA und Arginin einen starken Einfluss auf die LARP7-7SK – Interaktion ausüben, welcher in weiteren Studien berücksichtigt werden sollte.
N2  - In the nucleus of eucaryotic cells, genes are transcribed into mRNA which are heavily
processed and exported into the cytoplasm. There they are translated into proteins, a process
requiring large amounts of energy so this process is strongly regulated. One example is the
class of TOP RNAs consisting mainly of transcripts encoding for proteins involved in
translation. Some well-known examples include the proteins of the large and small ribosomal
subunits. TOP RNAs share a common motif at the start of their 5’ UTR comprising a sequence
entirely made of Pyrimidines immediately following the cap. This motif common to all TOP
RNAs enables translational control of this class of RNAs in a timely coordinated manner. In this
way, during conditions of stress like nutrient starvation, translation of TOP RNAs can be
inhibited to save energy.
The search for a regulator which binds to the TOP motif and enables coordinated regulation
started long ago. In principle the regulator could activate or inhibit translation. Different
proteins have been considered to be the regulator so far.
In this thesis the protein TIAR was identified as TOP interacting factor using mass
spectrometry. Its binding properties regarding the TOP motif have been evaluated using
EMSA. RNA and proteins of different organisms were evaluated to identify minimal binding
partner constructs for further structural analysis. Using different sequential purification
approaches, the 14-3-3ε protein was also identified as TOP binding factor.
Furthermore, the TOP binding proteins LARP1 and LARP7 and their target RNA sequences have
been evaluated in regard to their binding properties. It could be shown that LARP1 has an
inhibiting effect on translation of TOP RNAs. Using EMSA, minimal binding constructs of LARP7
and 7SK could be established which can be considered for further structural analysis. Also, it
could be shown that certain substances like tRNA and Arginine influence the interaction of
LARP7 and 7SK, an observation which should be considered in further experiments.
KW  - Proteinbiosynthese
KW  - Messenger-RNS
KW  - Genexpression
KW  - Translationskontrolle
KW  - Terminal Oligopyrimidine Tract
KW  - Translationsinitiation
KW  - TIAR
KW  - TOP mRNA
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289231
ER  - 
TY  - THES
A1  - Christmann, Gabriel
T1  - USP 10 als Deubiquitinase für β-Catenin
T1  - USP 10 as a Deubiquitinase for β-Catenin
N2  - Der WNT-Signalweg ist ein hochkonservierter Signalweg, dessen zentraler 
intrazellulärer Regulationsschritt die Proteinstabilität des Proteins β-Catenin ist. 
Deregulierende Mutationen in diesem sind frühe Ereignisse bei der Entstehung von 
Darmtumoren. Ist der Abbau von β-Catenin gestört, so ist unabhängig von äußerer 
Kontrolle der Signalweg konstitutiv aktiviert und liefert ein Wachstumssignal. 
Untersuchungen haben aber gezeigt, dass beim Vorliegen solcher Mutationen immer 
noch eine – unzureichende – Ubiquitinylierung und ein Abbau von β-Catenin stattfindet.
Ziel dieser Studie war Deubiquitinasen (DUBs) zu finden, die durch ihre 
Aktivität den Abbau von β-Catenin verhindern. Mithilfe eines siRNA Screens in der 
Vorarbeit konnten DUBs als Kandidaten für einen CRISPR Ansatz ausgewählt werden. 
APC Wildtyp HEK293T Zellen und Darmkrebszellen wurden mit lentiviralen 
CRISPR/Cas9 Vektoren infiziert, in welche sgRNAs gegen exonische Sequenzen von 
DUBs geklont waren. Einzelne Zellklone von USP10 CRISPR Zellen wurden weiter 
untersucht. In Western Blots und Immunofluoreszenz zeigte sich bei den USP10 CRISPR 
Zellen eine verminderte Expression von USP10 und damit einhergehend β-Catenin. 
Proteinstabilitätsversuche mit MG132 und Cycloheximid zeigten einen erhöhten Abbau 
von β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR Zellen, vor allem nach Stimulierung des 
WNT-Signalwegs durch LiCl. In Aktivierungsassays (Luciferase und TOP-GFP FACS) 
des WNT-Signalwegs zeigte sich in HEK293T Zellen nach Behandlung mit LiCl eine 
geringere Aktivierung in den USP10 CRISPR Zellen. In einem Wachstumsassay zeigten 
HT29 USP10 CRISPR ein geringeres Wachstum als Kontrollzellen. Während in einer 
histologischen Färbung von Mausgewebe eine erhöhte Expression von USP10 
nachweisbar war, zeigten sich in einer TMA Färbung kein eindeutiger Unterschied 
zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe. 
Die Studie identifiziert USP10 als eine mögliche DUB für β-Catenin und potenzielles
Ziel für eine Beeinflussung des mutierten WNT-Signalwegs in Darmkrebszellen.
N2  - The WNT- signaling pathway is a highly preserved pathway. Its central intracellular regulation
measure is the protein stability of the protein β-Catenin. Mutations that cause a deregulation in said
pathway occur early within the development of intestinal tumors. If the breakdown of β-Catenin is
impaired, the WNT- signaling pathway will get activated constitutively, providing growth signals,
regardless of outer controls. Investigations have shown, that if such mutations exist there will still be
a (insufficient) ubiquitinylation and a breakdown of β-Catenin. It was the aim of this research to
identify deubiquitinases (DUBs) whose activity prevent the breakdown of β-Catenin. It was possible
to select DUBs as potential candidates for a CRISPR approach by using sIRNA Screens. APC Wildtype
HEK293T cells and intestinal tumor cells where infected by lentiviral
CRISPR/Cas9 vectors which contained sgRNAs clones that worked against exonic sequences of DUBs.
Individual cell clones of USP10 CRISPR cells where further investigated. Within western blots and
immunofluorescence USP10 CRISPR cells showed a reduced expression of USP10 and thus, β-
Catenin. Protein stability trials using MG132 and cycloheximide showed an increased breakdown of
β-Catenin in HEK293T USP10 CRISPR cells, especially in response to stimulation of the WNT- signaling
pathway using LiCl. Within activation assays (Luciferase and TOP-GFP FACS) of the WNT- signaling
pathway, a reduced activation in USP10 CRISPR cells after treatment with LiCl was shown within
HEK293T cells. Within a growth assay HT29 USP10 CRISPR showed a reduced growth when
compared to control cells. While there was evidence of an increased expression of USP10 within the
histological coloration of mouse tissue, the TMA coloration did not show a significant difference
between healthy tissue and tumor tissue. This study identified USP10 as a possible DUB for β-
Catenin and as a possible target for the manipulation of the mutations that cause a deregulation
within the WNT- signaling pathway in intestinal tumor cells.
KW  - Darmkrebs
KW  - Ubiquitin
KW  - USP10
KW  - Catenin
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-272998
ER  - 
TY  - THES
A1  - Strack, Stefanie
T1  - Rolle der Polycomb Faktoren PCGF6 und E2F6 in undifferenzierten und differenzierenden embryonalen Stammzellen der Maus
T1  - Role of Polycomb Factors PCGF6 and E2F6 in undifferentiated and differentiating embryonic stem cells of mice
N2  - To investigate the role of PCGF6 and E2F6 in murine embryonic stem cells (mESCs) and at the beginning of differentiation, knockout cell lines of both proteins and in combination were generated by the CRISPR/Cas9n system. Characterization of these knockout cell lines (KO) was performed by growth analysis in mESCs and differentiating murine stem cells (EBs). It was found that Pcgf6 KO cells formed smaller EBs that also could not be maintained in culture for an extended period. To resolve this specific phenotype, further molecular analyses were performed by flow cytometry (FACS). Cells of the Pcgf6 KO exhibited an increased proportion of cells in G1 phase during differentiation as well as an increased apoptotic frequency. Supporting the assumption of a cell cycle defect, RNASeq data were analysed. It could be shown that cells of the Pcgf6 KO differentiated in a temporally uncontrolled manner. Evaluation of differentially expressed genes revealed that expression of E2f6, a regulator of the cell cycle and another component of the non-canonical PRC1.6, was downregulated in mESC and EB cultures, whereas cell cycle-specific targets of E2F6-dependent gene regulation were upregulated at day 2 of differentiation. These results indicated that deletion of Pcgf6 at the beginning of differentiation must have effects on E2F6-dependent cell cycle regulation. Due to mycoplasma contamination in the cell culture at this time point, the Pcgf6 KO cell line had to be re-established. In addition, KO cell lines of E2f6 in Wt and in Pcgf6 KO mESCs were established. The replication of cellular characterization of the phenotype revealed that EB cultures of the Pcgf6 KO and the double knockout of Pcgf6 and E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) exhibited reduced cell numbers during differentiation. Molecular characterizations of the phenotype revealed that the increased proportion of cells in the G1 phase of the Pcgf6 KO, which was detected before mycoplasma contamination, could not be reproduced. However, an increased frequency of cells in the G2 phase of dKOPcgf6/E2f6 was detected in mESC and EB culture. Analysis of apoptotic frequency in all KO cell lines indicated an increase during differentiation. RNASeq data from two publications of PCGF6 and E2F6 were used to support the analyses performed to this point (Qui et al, 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichment analyses of these data revealed that germline genes were independently upregulated in both KO cell lines in mESCs. However, both KO cell lines also showed an overlap of commonly upregulated germline genes. Following these publications, gene expression analysis of individual germline genes revealed that loss of E2f6 leads to de-repression of genes that have a binding site for E2F6. In contrast, loss of Pcgf6 had no effect on expression of these targets.
These results, as well as previously published data, support the assumption that there are distinct subcomplexes that regulate the expression of germline genes in mESC and EB cultures.
N2  - Im Rahmen dieser Arbeit wurde zur Untersuchung der Rolle von PCGF6 und E2F6 in murinen embryonalen Stammzellen (mESCs) und zu Beginn der Differenzierung Knockout-Zelllinien beider Proteine und in Kombination durch das CRISPR/Cas9n Systems erstellt. Die Charakterisierung dieser Knockout-Zelllinien erfolgte durch Wachstumsanalysen in mESCs und differenzierenden murinen Stammzellen (EBs). Es konnte festgestellt werden, dass Zellen des Pcgf6 Knockout (KO) kleinere Ebs bildeten, die zudem nicht über einen längeren Zeitraum in Kultur gehalten werden konnten. Zur Klärung dieses spezifischen Phänotyps wurden weitere molekulare Analysen mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Zellen des Pcgf6 KO wiesen während der Differenzierung einen erhöhten Anteil an Zellen in der G1-Phase sowie eine erhöhte apoptotische Frequenz auf. Unterstützend zur Annahme eines Zellzyklusdefekts wurden RNASeq-Daten analysiert. Die Auswertung ergab, dass Zellen des Pcgf6 KO zeitlich unkontrolliert differenzierten. Die Auswertung differenziell exprimierter Gene ergab zudem, dass die Expression von E2f6, ein Regulator des Zellzyklus und weitere Untereinheit des nicht-kanonischen PRC1.6, in mESC und EB-Kulturen herunter reguliert war, während Zellzyklus-spezifische Targets der E2F6-abhängigen Genregulation an Tag 2 der Differenzierung hochreguliert waren. Diese Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine Deletion von Pcgf6 zu Beginn der Differenzierung Auswirkungen auf eine E2F6-abhängige Zellzyklusregulation haben muss. Auf Grund einer zu diesem Zeitpunkt aufgetretenen Mykoplasmenkontamination in der Zellkultur musste die Pcgf6 KO-Zelllinie neu erstellt werden. Zusätzlich wurden KO-Zelllinien von E2f6 in Wt und in Pcgf6 KO mESCs erstellt. Die anschließende Wiederholung der zellulären Charakterisierung des Phänotyps ergab, dass EB-Kulturen des Pcgf6 KO und des Doppelknockout von Pcgf6 und E2f6 (dKOPcgf6/E2f6) während der Differenzierung eine verringerte Zellzahl aufwiesen. Die molekularen Charakterisierungen des Phänotyps ergaben, dass der erhöhte Anteil an Zellen in der G1-Phase des Pcgf6 KO, welche vor der Mykoplasmenkontamination detektiert wurde, nicht reproduziert werden konnte. Es wurde jedoch eine erhöhte Frequenz an Zellen in der G2-Phase des dKOPcgf6/E2f6 in der mESC-und EB-Kultur ermittelt. Die Analyse der apoptotischen Frequenz in allen KO-Zelllinien zeigte einen Anstieg während der Differenzierung. Zur Unterstützung der bis dahin durchgeführte Analysen wurden RNASeq-Daten zweier Publikationen zu PCGF6 und E2F6 herangezogen (Qui et al., 2021; Dahlet et al, 2021). Gene Ontology Enrichtment Analysen dieser Daten ergaben, dass in beiden KO-Zelllinien in mESCs unabhängig voneinander Keimbahngene hochreguliert waren. Beide KO-Zelllinien zeigten aber auch eine Schnittmenge gemeinsam hochregulierter Keimbahngene. In Anlehnung an diese Veröffentlichungen, ergaben Genexpressionsanalysen einzelner Keimbahngene, dass ein Verlust von E2f6 zu einer De-Repression von Genen führt, die eine Bindestelle für E2F6 besitzen. Der Verlust von Pcgf6 hingegen hatte keine Auswirkung auf Expression dieser Targets. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass es unterschiedliche Subkomplexe gibt, die die Expression von Keimbahngenen in mESC- und EB-Kulturen regulieren.
KW  - Murine embryonale Stammzellen
KW  - Pcgf6
KW  - PRC1.6
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-255600
ER  - 
TY  - THES
A1  - Blümel, Rabea
T1  - Der Zebrabärbling (Danio rerio) als in vivo Modell zur Untersuchung der Entstehung von Kraniosynostosen
T1  - The zebrafish (Danio rerio) as an in vivo model to study the emergence of craniosynostosis
N2  - Die Entwicklung des Schädeldachs beginnt beim Menschen bereits in der frühen Embryogenese und ist erst im Erwachsenenalter abgeschlossen. Das Wachstum der Schädelknochen muss sich während der Entwicklung fortwährend dem Gehirnwachstum anpassen. An den Stellen, wo zwei Schädelknochen aufeinandertreffen, formen sich Schädelnähte, die aus mesenchymalem Bindegewebe bestehen und als Wachstumsfugen des Schädels dienen. Tritt eine frühzeitige Verknöcherung innerhalb einer oder mehrerer Schädelnähte auf, spricht man von einer Kraniosynostose. Als Konsequenz wird ein weiteres Knochenwachstum verhindert, sodass sich das Neurokranium in dieser Region nicht dem expansiven Wachstum des Gehirns anpassen kann. Dies geht in der Regel mit einem kompensatorischen Wachstum des Schädels und infolgedessen mit kraniofazialen Dysmorphien und einem erhöhten intrakraniellen Druck einher. Klinische Studien und Forschungen an Modellorganismen konnten bereits eine Vielzahl an Genen mit der Entstehung von Kraniosynostosen assoziieren, darunter die Transkriptionsfaktoren TCF12 und TWIST1. Beim Menschen sind heterozygote Mutationen in TCF12 und TWIST1 mit Kraniosynostosen der Koronarnaht assoziiert. Bei Mäusen hingegen führt eine heterozygote Tcf12 Mutation nur in Kombination mit einer heterozygoten Twist1 Mutation zu Fusionen der Koronarnaht.
Der Zebrabärbling (Danio rerio, überwiegend auch Zebrafisch genannt) weist eine bemerkenswerte Ähnlichkeit bezüglich der Anatomie und Morphologie des Schädeldachs zum Menschen auf. Um die genaue Funktion von TCF12 bei der Ausbildung der Schädelnähte zu untersuchen, wurde im Rahmen dieser Arbeit der Zebrafisch als in vivo Modell für die Entstehung tcf12-induzierter Kraniosynostosen etabliert. Zu Beginn der Arbeit wurde das Expressionsmuster von tcf12 über die Entwicklung hinweg analysiert. Ein besonderer Fokus lag dabei auf einem Expressionsnachweis während der Entwicklung der Schädelplatten und der Schädelnähte. Ein erster Expressionsnachweis von tcf12 mittels PCR-Analysen und Whole-mount RNA in-situ Hybridisierungen zeigte eine breite Expression von tcf12 ab dem 1-3 Somiten Stadium an. Für tiefergehende in vivo Analysen wurden im Zuge dieser Arbeit tcf12:EGFP Reportergenlinien generiert. Mit diesen gelang ein Nachweis der tcf12 Expression entlang der Wachstumsfronten der Schädelplatten, innerhalb der Schädelnähte sowie im Periost und der Dura mater.  
Mit den tcf12:EGFP Fischen als Referenz wurde in weiterführenden Experimenten die Aktivität drei hochkonservierter CNEs (engl. conserved non-coding elements) in vivo im Zebrafisch untersucht. Zwei der CNEs konnten als tcf12 Enhancer verifiziert werden, die eine Genexpression während der Neurogenese des zentralen Nervensystems (ZNS) steuern. Die beiden Enhancer-Elemente zeichnen sich durch eine hohe Konservierung vom Menschen bis hin zum Zebrafisch aus. 
Aufgrund der unterschiedlichen Sensitivität gegenüber einem Funktionsverlust von TCF12 und TWIST1 in Mensch und Maus sollte die Auswirkung eines Knockouts der orthologen Gene auf die Entwicklung der Schädelnähte des Zebrafisches untersucht werden. Mittels CRISPR/Cas9 wurden verschiedene Knockout-Linien für die Gene tcf12, twist1a und twist1b generiert. Analysen der Knockoutmutanten zeigten, dass ein heterozygoter Verlust von tcf12 und twist1b in seltenen Fällen zu partiellen Fusionen der Koronarnähte im Zebrafisch führt. Des Weiteren konnte bei tcf12 und twist1b Einzel- und Doppelmutanten ein abnormes Wachstum der Schädelplatten im Bereich der Suturen beobachtet werden. Die Expressionsstudien und die Analysen der Knockoutmutanten deuten auf eine Regulation von TCF12 bei der Differenzierung der Stammzellen sowie der Proliferation der Osteoblasten innerhalb der Schädelnähte hin. 
Um die Auswirkung von TCF12 Mutationen auf funktioneller Ebene zu untersuchen wurden im Verlauf dieser Arbeit Luciferase-Reporter Assays durchgeführt. Anhand dieser konnte nachgewiesen werden, dass Mutationen, die die basic helix-loop-helix (bHLH)-Domäne beeinträchtigen, die Transaktivierungsfähigkeit von TCF12 aufheben. Co-Transfektions-Experimente mit TWIST1 offenbarten eine Regulation der Transaktivierung von TCF12 durch TWIST1, sowohl im Menschen, als auch im Zebrafisch. Im Rahmen dieser Arbeit konnten die genauen Expressionsorte von TCF12 während der Morphogenese des Schädeldachs nachgwiesen und die Funktion von TCF12 und seinem Interaktionspartner TWIST1 bei der Entstehung von Kraniosynostosen weiter aufgeklärt werden.
N2  - The morphogenesis of the calvaria is initiated during early embryogenesis and completed during adulthood. The growth of the skull must continuously adapt to the growth of the developing brain. Where two cranial bones meet, fibrous sutures form. The cranial sutures consist of connective tissue and serve as growth sites of the skull. A premature closure (fusion) of one or several of the cranial sutures is a condition called craniosynostosis. Further bone growth in this area is prevented and the neurocranium cannot adapt to the expansive growth of the brain. The result is a compensatory growth of the skull leading to craniofacial dysmorphisms and also, in more severe cases, to an increased intracranial pressure. Clinical studies and research on model organisms have been able to identify a large number of genes involved in suture development and craniosynostosis, including the transcription factors TCF12 and TWIST1. In humans, heterozygous mutations in both, TCF12 and TWIST1, are associated with craniosynostosis. In mice, haploinsufficiency of Tcf12 alone does not lead to coronal suture fusion. Only loss of Twist1 along with loss of Tcf12 results in craniosynostosis of the coronal suture. 
Zebrafish (Danio rerio) show a remarkable similarity regarding the anatomy and morphology of the skull vault to that of humans. To unravel the function of tcf12 in cranial suture development, this study aimed to establish a zebrafish in vivo model for tcf12 induced craniosynostosis. First, the expression pattern of tcf12 was analyzed throughout zebrafish development. Special focus was placed on examining the expression of tcf12 during development of the skull plates and the cranial sutures. 
PCR-analysis and whole-mount RNA in-situ hybridization revealed a broad tcf12 expression in different tissues beginning from the 1-3-somites stage. For more in-depth in vivo analyses, transgenic tcf12:EGFP reporter lines were generated. During cranial vault development, the transgenic fish showed a high amount of tcf12 expressing cells along the growth fronts of the skull plates, within the cranial sutures as well as in the periosteum and the Dura mater. 
In addition, with the tcf12:EGFP fish as a reference, we tested the transcriptional activity of three highly conserved non-coding elements (CNEs) in zebrafish in vivo. We could validate two of the CNEs as tcf12 enhancer elements driving gene expression in the central nervous system during neurogenesis. The two CNEs show a high conservation between humans and zebrafish. 
Due to the different sensitivities to loss of TCF12 and TWIST1 in humans and mice, the effect of a gene knockout of the orthologous genes on the development of the sutures should be examined in zebrafish. Therefore, various knockout lines for the genes tcf12, twist1a and twist1b were generated using CRISPR/Cas9. Analyses of the knockout mutants showed that, in a few cases, a heterozygous loss of tcf12 or twist1b led to partial fusions of the coronal sutures in zebrafish. Furthermore, abnormal growth of the skull plates in the area of the sutures could be observed in tcf12 and twist1b single and double knockout mutants. The expression studies and the analyses of the knockout mutants indicate a regulation of TCF12 in the differentiation of stem cells and in the proliferation of osteoblasts within the cranial sutures. 
In order to investigate the effects of TCF12 mutations on a functional level, luciferase reporter assays were performed. Based on the reporter assays it was demonstrated that mutations impairing the basic helix-loop-helix (bHLH) domain compromise the transactivation ability of TCF12 remarkably. Co-transfection experiments with TWIST1 revealed regulation of the transactivation of TCF12 by TWIST1, both in humans and in zebrafish.
Within the scope of this work, the exact expression patterns of TCF12 could be demonstrated during the morphogenesis of the cranial vault. Moreover, the function of TCF12 and its interaction partner TWIST1 could be further clarified in the development of craniosynostosis. 
 
KW  - Kraniosynostose
KW  - Danio rerio
KW  - Modellsystem
KW  - Genetik
KW  - Modellorganismus
KW  - Craniosynostosis
KW  - Model Organism
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207436
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lekszas, Caroline
T1  - Erweiterung des genetischen Mutationsspektrums verschiedener Krankheitsbilder und Identifizierung neuer krankheitsrelevanter Gene im Menschen mittels Whole Exome Sequenzierung
T1  - Expansion of the genetic mutation spectrum of different pathologies and identification of new disease-relevant genes in humans by means of Whole Exome Sequencing
N2  - Trotz der rasanten Entwicklung molekulargenetischer Analysemethoden sind die Auslöser vieler Erbrankheiten bislang ungeklärt. Eine Identifikation der genetischen Ursache einer Erkrankung ist jedoch essenziell, um zusätzliche invasive Tests vermeiden, adäquate Therapiemaßnahmen in die Wege leiten, akkurate Prognosen stellen und eine entsprechende genetische Beratung anbieten zu können. Next Generation Sequencing (NGS)-basierte Techniken wie die Whole Exome Sequenzierung (WES) haben die humangenetische Forschung und Diagnostik in den letzten Jahren revolutioniert. Die WES ermöglicht die Sequenzierung der Exons aller proteincodierenden Gene von mehreren Individuen gleichzeitig und stellt ein hilfreiches Werkzeug bei der Suche nach neuen kranheitsrelevanten Genen im Menschen dar.
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung genetischer Ursachen verschiedenster Erkrankungen in konsanguinen Familien aus dem nahen und mittleren Osten mittels WES. Insgesamt wurden 43 Patienten mit unterschiedlichen Krankheitsbildern untersucht, darunter viele mit Skelettdysplasien oder Neuropathien. In 22 Fällen (51%) konnte die entsprechende krankheitsverursachende Mutation ausfindig gemacht werden. In 21% der aufgeklärten Fälle wurden Sequenzvarianten detektiert, die in der Literatur bereits als pathogen beschrieben wurden, während 63% bisher noch unbekannte Mutationen in bereits als krankheitsrelevant beschriebenen Genen darstellten. Zudem konnten im Rahmen dieser Arbeit drei neue, für den Menschen krankheitsrelevante Gene identifiziert werden, solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) und MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 codiert für einen Transporter aus der Familie der solute carrier, der in der Plasmamembran verankert ist. In dieser Arbeit geleistete Analyseergebnisse konnten zu der Erstbeschreibung von homozygoten pathogenen SLC10A7-Mutationen als Ursache für eine Skelettdysplasie mit Amelogenesis imperfecta beitragen. Bei TBX4 handelt es sich um einen hochkonservierten Transkriptionsfaktor, der während der embryonalen Entwicklung an der Ausbildung der unteren Extremitäten beteiligt ist. Homozygote pathogene TBX4-Mutationen wurden im Kontext dieser Arbeit erstmalig mit einer posterioren Amelie mit Becken- und Lungenhypoplasie in Verbindung gebracht. MIA3 ist ein Transmembranprotein des endoplasmatischen Retikulums, das eine essenzielle Rolle bei der Proteinsekretion spielt. Die hier vorgestellten Patienten mit homozygoten pathogenen MIA3-Mutationen zeigen eine komplexe syndromale Erkrankung, die sich hauptsächlich in einer Kollagenopathie, Diabetes mellitus und milder mentaler Retardierung manifestiert und ein neues Krankheitsbild darstellt.
	Die im Rahmen dieser Arbeit erzielten Ergebnisse erweitern somit zum einen das Mutationsspektrum verschiedener bekannter Krankheitsbilder und offenbaren zum anderen neue krankheitsrelevante Gene im Menschen.
N2  - Despite the rapid development of molecular genetic analysis methods, the causes of many hereditary diseases are still unknown. However, it is essential to identify the genetic cause of a disease in order to avoid additional invasive tests, to initiate adequate therapeutic measures, to be able to provdide accurate prognoses, and to offer appropriate genetic counselling. Over the past years, Next Generation Sequencing (NGS)-based technologies such as Whole Exome Sequencing (WES) have revolutionized research and diagnostics in human genetics. WES enables sequencing of the exons of all protein-coding genes from several individuals simultaneously and is a powerful tool in identifying new disease-relevant genes in humans.
The present work deals with the elucidation of genetic disease causes in consanguineous families from the Near and Middle East by means of WES. A total of 43 patients with various clinical phenotypes were examined, including many with skeletal dysplasias or neuropathies. In 22 cases (51%), the genetic cause of the disease could be found. In 21% of the solved cases, sequence variants were detected that were already described as pathogenic in the literature, while 63% showed previously unknown mutations in genes already described as disease-relevant in humans. In addition, three new disease-relevant genes could be identified within the scope of this work: solute carrier family 10 member 7 (SLC10A7), T-box 4 (TBX4) and MIA SH3 domain ER export factor 3 (MIA3). SLC10A7 encodes a transporter from the family of solute carriers, which is anchored in the plasma membrane. The analysis results performed in this study could contribute to the first description of homozygous pathogenic SLC10A7 mutations as the cause of a novel skeletal dysplasia with amelogenesis imperfecta. TBX4 is a highly conserved transcription factor that is involved in the formation of the lower extremities during embryonic development. Homozygous pathogenic TBX4 mutations were associated for the first time with posterior amelia with pelvic and pulmonary hypoplasia in the context of this study. MIA3 is a transmembrane protein of the endoplasmic reticulum that plays an essential role in the secretory pathway. The patients presented here with homozygous pathogenic MIA3 mutations show a complex syndromal disease manifesting mainly in a collagenopathy, diabetes mellitus, and mild mental retardation, representing a novel clinical picture.
	The results obtained within the scope of this work expand on the one hand the range of mutations of various known diseases and on the other hand reveal novel disease-relevant genes in humans.
KW  - Verwandtenehe
KW  - Exomsequenzierung
KW  - Konsanguinität
KW  - autosomal rezessiver Erbgang
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208807
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hausmann, Michael
T1  - Analyse der Genexpression verschiedener Kandidatengene und der Methylierung im Xiphophorus Melanom
T1  - Analysing Gene Expression of Candidate Genes and Methylation in Xiphophorus Melanoma
N2  - Das Melanom ist eine der aggressivsten Formen von malignen Tumoren beim Menschen. Bei Fischen der Gattung Xiphophorus kommt es zur spontanen Tumorformation, welche auch durch zwischenartliche Kreuzung herbeiführbar ist. Hybride mit angeborenem Melanom stellen ein nützliches Tiermodell zur Untersuchung der genetischen Grundlage der Tumorentwicklung dar. Ihre Tumorigenese hängt mit der pigmentzellspezifischen Überexpression der durch eine Mutation aktivierten Rezeptortyrosinkinase Xmrk zusammen. In reinrassigen Fischen wird die onkogene Funktion des xmrk durch den Genlocus R, welcher molekular noch nicht identifiziert wurde, unterdrückt. Zusammen mit der Überexpression von xmrk konnten mittels einer RNA-Seq Analyse weitere Gene gefunden werden, welche differenziell in den Proben von malignen und benignen Geweben des Xiphophorus exprimiert werden. Des Weiteren ist bekannt, dass die Methylierung des xmrk Promotors Einfluss auf die Expression des Genes hat.
Um die Daten der durch RNA-Seq gefundenen Kandidatengene zu validieren, wurde deren Expression in malignen und benignen Geweben der Flossen und des Rumpfes mittels qPCR quantifiziert. Zusätzlich dazu wurde die Expression einiger humaner Orthologe dieser Gene in Proben aus humanen Melanomzelllinien gemessen. Mir war es möglich zu zeigen, dass mit Ausnahme von cdkn2ab, mitfb und xirp2b alle Kandidatengene signifikant unterschiedlich in mindestens einem Vergleich von benignem und malignem Gewebe exprimiert waren. Das mit xmrk verglichen gegensätzliche Expressionsmuster von pdcd4a macht es zu einem vielversprechenden Kandidaten als vom R-Locus codierten Tumorsuppressorgen. In den humanen Melanomzelllinien konnte ausschließlich von PDGFRB keine erhöhte Expression in irgendeiner Probe nachgewiesen werden. Während die Expression von PDCD4, C-MYC und MITF in mindestens drei der vier Zelllinien mittelstark erhöht war, ließ sich bei KIT eine enorm gesteigerte Überexpression in Zellen der Linie Hermes3a nachweisen. Da drei der fünf analysierten Gene und ihre Orthologen ähnliche Expressionsmuster in Proben des Xiphophorus und der humanen Melanomzelllinien zeigen, deuten diese Ergebnisse auf die Nützlichkeit des Tiermodells zur Identifizierung entscheidender Gene und Signalwege im malignen Melanom hin. Ein zweites Ziel der Arbeit war das Erlangen tieferer Einblicke in die Methylierung des Xiphophorus Melanoms auf einer globalen und promotor- spezifischen Ebene. Um die Hypothese einer Reduzierung der globalen Methylierung zu testen, führte ich eine kolorimetrische Quantifizierung der 5-mC DNA in Kontroll- und Tumorgeweben aus. Diese Vorgehensweise zeigte zum ersten Mal eine signifikante Verminderung der methylierten globalen DNA in den benignen Läsionen und malignen Melanomen der Flossen verglichen mit dem Kontrollgewebe. Um herauszufinden, on diese Demethylierung direkt mit der Überexpression des xmrk verbunden ist, analysierte ich als nächstes die Methylierung eines CpG Dinukleotids des xmrk Promotors mithilfe von methylierungssensitiven Restriktionsendonukleasen. Obwohl nur in den Proben des exophytischen Tumorwachstums als Krebsgewebe eine verringerte Methylierung des CpG Dinukleotids verglichen mit den Kontrollen nachgewiesen werden konnte, zeigte sich die Stelle in Zellen der Xiphophorus Melanomzelllinie PSM komplett unmethyliert. Diese Ergebnisse deuten stark daraufhin, dass eine differenzierte Methylierung das onkogene Potential dieser Zellen bewirkt. Um die Effekte veränderter globaler und promotor-spezifischer Methylierung auf die Tumorigenese besser zu verstehen, sind weitere Untersuchungen nötig.
N2  - Melanoma is among the most aggressive forms of malignant tumors in humans. In fish of the genus Xiphophorus melanoma tumor formation happens spontaneously in nature and can also be induced by interspecific crossing. Hybrid fish with hereditary melanoma are an established animal model for the study of the genetic origin of tumor development. Their tumorigenesis is linked to the overexpression of the mutationally activated receptor tyrosine kinase Xmrk in pigment cells. In purebred fish the molecularly still unrevealed locus R is suppressing the oncogenic function of xmrk. Along with the overexpression of xmrk a RNA-Seq analysis revealed even more differentially expressed genes in the tissues of malignant melanoma in Xiphophorus compared to benign tissues. Furthermore, there has already been gained evidence that the methylation status of the xmrk promotor has effects on its overexpression. To validate the RNA-Seq data of the candidate genes, gene expression in malignant and benign tissues of the fins and trunk was quantified using qPCR. Additionally, the expression of some human orthologues of these genes was also analyzed in samples of human melanoma cell lines. I was able to demonstrate that with the exception of cdkn2ab, mitfb and xirp2b all candidate genes are significantly differentially expressed in at least one set of tissues varying in dignity. The opposite expression pattern of pdcd4a compared to xmrk makes it a promising candidate as the at the R locus encoded tumor suppressor gene. In the human melanoma cell lines only the expression of PDGFRB wasn't increased in any of the samples. While the expression of PDCD4, C-MYC and MITF was moderately higher in at least three of the four cell lines, KIT was shown to be hugely overexpressed in Hermes3a. As three of the five analyzed genes and its orthologues show a similar expression pattern in samples of the Xiphophorus and the human melanoma cell lines, these findings point out the usefulness of the animal model to find new genes and pathways within the malignant melanoma. A second aim of the thesis was to gain a deeper insight into to methylation regulation in the Xiphophorus melanoma on a global and a promoter-specific level. To test the hypothesis that global methylation is reduced in the melanoma cells, I performed a colorimetric quantification of 5-mC DNA in control and tumor tissues. This approach showed for the first time a significantly decreased amount of global DNA in the benign and malignant samples deriving from the fins compared to control tissues. To find out if this demethylation is directly linked to the overexpression of xmrk, I analyzed the methylation of CpG site in the xmrk promotor using methylation sensitive restriciton endonucleases. Interestingly in the samples of the Xiphophorus melanoma cell line PSM the CpG site wasn't methylated at all. Although only the samples of the exophytic tumor growth as a tumoric tissue were less methylated than the control, the cells of the Xiphophorus melanoma cell line PSM were completely unmethylated. These results imply that differential methylation triggers the oncogenic potential of these cells. To improve the understanding of the effects global and promoter-specific methylation has on tumorigenesis, further studies are necessary.
KW  - Xiphophorus Melanom
KW  - Genexpression
KW  - Epigenetik
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205258
ER  - 
TY  - THES
A1  - Aue, Annemarie
T1  - Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Lungenfibrose in der Maus
T1  - Localization and importance of NO-sensitive guanylyl cyclase in a murine model of lung fibrosis
N2  - Die im Rahmen dieser Arbeit behandelten Fragestellungen vermitteln neue Kenntnisse über die Pathogenese der Lungenfibrose auf zellulärer Ebene. Bei der Lungenfibrose handelt es sich um eine chronische Erkrankung, die durch eine initiale Inflammation und das Auftreten von Myofibroblasten gekennzeichnet ist. Die Myofibroblasten führen zu einer vermehrten Produktion von EZM, was in einer Zerstörung der Lungenarchitektur, Narbenbildung und folglich einem verminderten Gasaustausch resultiert. Eine modulatorische Rolle von Stickstoffmonoxid (NO) bei der Entwicklung der Lungenfibrose wird vermutet, dennoch sind die Effektorzellen in der Lunge noch nicht bekannt. 
Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit die Lokalisation des NO-Rezeptors, der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), in der Lunge untersucht. Dazu wurden Knockout-Mäuse generiert, bei denen die NO-GC global (GCKO) oder Perizyten-spezifisch (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO) deletiert ist. Zudem wurden tdTomato-Reportermäuse verwendet, die das Fluoreszenzprotein unter Kontrolle eines spezifischen Reporters exprimieren (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). In der Lunge sind Perizyten der NO-GC-exprimierende Zelltyp. Durch Immunhistochemie konnten zudem zwei verschiedene Subpopulationen von NO-GC-exprimierenden Perizyten identifiziert werden: Eine große Population an SMMHC/PDGFRβ-positiven Perizyten und eine kleine Population an NG2/PDGFRβ-positiven Perizyten. 
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion der NO-GC während der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose untersucht. Bleomycin führt zu einer fibrotischen Antwort in allen Genotypen, was durch ein erhöhtes Lungengewicht und einen erhöhten Kollagengehalt deutlich wird. Der Schweregrad der Lungenverletzung ist in NO-GC-defizienten Mäusen größer als in Anwesenheit der NO-GC. Dies deutet auf eine Rolle der NO-GC bei der Bleomycin-induzierten Lungenfibrose hin. 
Während der Entstehung der Lungenfibrose kommt es zur Bildung von Myofibroblasten, die als die Schlüsselzellen der Wundheilung und fibrotischer Prozesse bezeichnet werden. Diese Zellen kommen unter physiologischen Bedingungen kaum vor und ihre Herkunft ist nach wie vor nicht eindeutig geklärt. Da Perizyten als mögliche Vorläuferzellen betrachtet werden, wurde Lineage Tracing von Perizyten durchgeführt. Erstmals wurden zwei verschiedene Myofibroblasten-Subtypen durch die Expression von NO-GC unterschieden: (1) NO-GC-positive Myofibroblasten, die in der Alveolarwand lokalisiert sind und von Perizyten abstammen und (2) NO-GC-negative Myofibroblasten, die sich innerhalb der Alveolen befinden, deren Ursprung jedoch nicht Perizyten sind. Diese Myofibroblasten zeigen jedoch eine de novo-Synthese von PDGFRβ. Durch Lineage Tracing-Versuche sowie immunhistochemische Analysen können Perizyten, Endothelzellen und Fibrozyten als Vorläuferzellen ausgeschlossen werden. Die Ursprungszelle der intra-alveolären Myofibroblasten ist somit bislang nicht identifiziert. 
Im letzten Teil der Arbeit wurde die Rolle der an der Lungenfibrose beteiligten Zelltypen näher untersucht. Dazu wurde die Auflösung der reversiblen Bleomycin-induzierten Lungenschäden betrachtet. Der Verlust der beiden Myofibroblasten-Subtypen weist darauf hin, dass sie zwar die Effektorzellen der Wundheilungsreaktion, jedoch nicht an der Entstehung der chronisch manifesten Fibrose beteiligt sind. Perizyten proliferieren in Folge der Gabe von Bleomycin und sind vermehrt im Lungenparenchym auch nach Auflösung der Bleomycin-induzierten Lungenverletzung vorzufinden. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass es sich hierbei um die Effektorzellen der chronisch manifesten Lungenfibrose handelt, die durch eine Verdickung der Alveolarwand gekennzeichnet ist. Um die zellulären Mechanismen der Lungenfibrose umfassend aufzuklären, müssen weitere Untersuchungen an irreversiblen Fibrosemodellen folgen, die auch die chronischen Charakteristiken der Erkrankung berücksichtigen.
N2  - This project provides new insights into the pathogenesis of pulmonary fibrosis on the cellular level. Pulmonary fibrosis is a chronic disease characterized by signs of inflammation and the appearance of myofibroblasts that are responsible for excessive production of extracellular matrix (ECM). This leads to destroyed lung architecture, scar formation and reduced gas exchange. A modulatory role of nitric oxide (NO) in the development of pulmonary fibrosis has been proposed. However, the effector cells in the lung are remain elusive. 
The first part of the thesis focused on the localization of NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC) in lung. Pericytes are the major NO-GC-expressing cell type in lung. Knock-out mice were generated lacking NO-GC globally (GCKO) as well as pericyte-specific GCKO mice (PDGFRβ-GCKO, SMMHC-GCKO, NG2-GCKO und SMMHC/NG2-GCKO). In addition, reporter mice were used that express tdTomato following cre-mediated recombination (PDGFRβ/tomato, SMMHC/tomato, NG2/tomato, FoxD1/tomato und Tie2/tomato). Immunohistochemical analysis shows the existence of two subpopulations of pericytes expressing NO-GC in lung: SMMHC/PDGFRβ-positive pericytes and a smaller subpopulation of NG2/PDGFRβ-positive pericytes.
In the second part of the thesis, the role of NO-GC during bleomycin-induced lung injury was investigated. Bleomycin led to a fibrotic response in all genotypes as seen by an increase of lung weight and collagen content. Severity of lung injury in NO-GC-deficient mice was greater compared to wild type (WT) mice following instillation of bleomycin. These results indicate a possible role of NO-GC during bleomycin-induced lung injury. 
The development of pulmonary fibrosis is characterized by the formation of myofibroblasts that are known to be key players of wound healing and fibrotic processes. These cells do not occur under physiological conditions and their origin is still under debate. Lineage tracing of pericytes showed that NO-GC-expression allows to differentiate interstitial from intra-alveolar myofibroblasts: (1) NO-GC-positive, pericyte-derived myofibroblasts located in the alveolar wall and (2) NO-GC-negative, intra-alveolar myofibroblasts that are not derived from pericytes but, surprisingly, show de novo-expression of PDGFRβ after injury.
The precursor cell type of intra-alveolar myofibroblasts is not identified yet. Pericytes, endothelial cells and fibrocytes do not transdifferentiate into myofibroblasts. 
Investigation of different cell types during resolution of lung fibrosis showed the disappearance of both types of myofibroblast. NO-GC-expressing pericytes that proliferate following administration of bleomycin are still present in an increased number. These results implicate a major role of myofibroblasts during wound healing responses but pericytes could be the effectors of chronic and manifest pulmonary fibrosis that is characterized by thickening of the alveolar wall. For a further understanding of the cellular mechanisms during pulmonary fibrosis investigations on irreversible models of fibrosis need to be performed.
KW  - Lungenfibrose
KW  - Guanylatcyclase
KW  - Myofibroblast
KW  - Perizyt
KW  - NO-sensitive Guanylyl-Cyclase
KW  - Bleomycin
KW  - Pulmonary fibrosis
KW  - NO-sensitive guanylyl cyclase
KW  - myofibroblast
KW  - pericyte
KW  - bleomycin
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176710
ER  - 
TY  - THES
A1  - Oerter, Sabrina
T1  - Expression von Natrium/Glukose-Cotransportern im menschlichen Gehirn bei Todesfällen durch Schädel-Hirn-Trauma und Todesfällen durch Ersticken
T1  - Expression of sodium/glucose cotransporter in the human brain following death by traumatic brain inury and suffocation
N2  - Glukosetransporter spielen eine wichtige Rolle in der Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und somit für den Erhalt der physiologischen Zellintegrität. Glukose wird über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) mittels spezifischen transmembranen Transportproteinen der SLC-Genfamilie (GLUT, SGLT) befördert. Dabei scheint während physiologischen Bedingungen hauptsächlich der Glukosetransporter GLUT1 (SLC2A1) für die Energieversorgung des Gehirns zuständig zu sein. 
Die Erforschung der SGLT-Expression ist in den letzten Jahren ein wichtiger Ansatzpunkt für neue Behandlungsstrategien vieler Erkrankungen, wie Diabetes Mellitus, maligne Neoplasien oder eines Herzinfarkts, geworden. Jedoch ist über deren Expression und Funktion im menschlichen Gehirn nur wenig bekannt. Besonders die Lokalisation entlang der BHS bleibt fraglich. Ein Großteil bisheriger Forschungsarbeiten beschäftigt sich hauptsächlich mit der Expressionsanalyse des Transporters SGLT1 im tierischen Gehirn in vivo (Poppe et al. 1997; Balen et al. 2008; Yu et al. 2013). Es konnte aufgezeigt werden, dass SGLT1 mRNA exklusiv in Neuronen und nicht an der BHS exprimiert wird. Dies wird durch in vitro Analysen einer humanen Hirnendothelzelllinie bestätigt. Demnach kann kein SGLT1 unter physiologischen Bedingungen nachgewiesen werden (Sajja et al. 2014). Im menschlichen Hirngewebe besitzen SGLTs somit keine zentrale Funktion für den Glukosetransport an der BHS. Im Gegensatz dazu konnte eine Expression von SGLT sowohl in vivo als auch in vitro während hypoglykämischen Bedingungen belegt werden (Vemula et al. 2009; Sajja et al. 2014). Die Expression der SGLT-Transporter während einer ischämischen Hypoglykämie führt zu der Annahme, dass diese Transporter für die Aufrechterhaltung der Energieversorgung des geschädigten Hirngewebes notwendig sind. Um die physiologischen Mechanismen nach einem Glukosemangel zu untersuchen, wurden SHT-Modelle etabliert (Salvador et al. 2013). In einem experimentellen Modell des Schädel-Hirn-Traumas im Rahmen eines DFG-gefördertes Projekts ist ein Expressionsverlauf von Glukosetransportern im Maushirn und in Hirnendothelzellen erarbeitet worden (Wais 2012; Salvador et al. 2015). Somit könnten SGLTs als Ansatzpunkt für den Nachweis der Überlebenszeit nach einem SHT fungieren.
Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf die Expression der Natrium-abhängigen Glukosetransporter SGLT1 und SGLT2 im menschlichen Gehirn. Hierbei liegt das Hauptaugenmerk auf der Lokalisation dieser Transporter an der menschlichen BHS von post mortalem Hirngewebe. Weiterhin wird untersucht ob die Expressionsstärke von SGLT1 und SGLT2 eine Aussage über die Überlebenszeit von Verstorbenen nach einer traumatisch bedingten Hirnveränderung zulässt.
Die Lokalisation von SGLT1 und SGLT2 an der menschlichen BHS konnte durch die Etablierung eines Protokolls zur Isolation von Hirnkapillaren erfolgen. Vorab wurden alle verwendeten Antikörper auf ihre Spezifität mittels siRNA Transfektion und Blockierung der Immunfluoreszenzsignale mittels immunisierten Peptids getestet. Somit ist die Spezifität der detektierten SGLT1- und SGLT2-Expression in menschlichen Hirnkapillaren gewährleistet. Anschließend wird untersucht, in welchen zeitlichem Verlauf nach einer traumatisch bedingten Hirnveränderung die verschiedenen Formen der Glukosetransporter exprimiert werden und ob ggf. der Umfang und die Verteilung von SGLT1, SGLT2 und GLUT1 sowie das Verhältnis zueinander Auskünfte über eine vitale bzw. postmortale Entstehung eines Traumas bzw. dessen Überlebenszeit zulässt. Hierfür wird ein Expressionsschema der Glukosetransporter generiert, abhängig von Todeszeitpunkt und Todesursache. Es konnte festgestellt werden, dass GLUT1 nicht als Target für die Ermittlung der Überlebenszeit nach einem Trauma geeignet ist. Dahingegen zeigen SGLT1 und SGLT2 eine signifikante Änderung der Expressionsstärke im contusionalen Gewebe in Abhängigkeit von der Überlebenszeit. Obwohl diese vorläufigen Daten einen neuen Ansatzpunkt für die forensische Fragestellung aufzeigen, müssen weitere Experimente mit einem erhöhten Umfang der Probenanzahl und kürzere Zeitspannen der Überlebenszeiträume durchgeführt werden.
N2  - The transport of glucose across the endothelial cells of the human blood-brain barrier (hBBB) plays a major role for energy supply of the brain and therefor for neuronal integrity. Glucose enters the brain cells through specific transmembrane transporter proteins of the SLC-gene family (GLUT, SGLT). Under physiological conditions glucose uptake across the BBB seems to be mediated primarily by facilitated diffusion through glucose transporter 1 (GLUT1).
Although SGLTs are a known drug target for diabetes and furthermore play a role in other disease like cancer and cardiac ischemia, active glucose transport by SGLTs is hardly observed and very little is known about their expression or activity in human brain. Especially the function along the BBB remains uncertain. Up to now, expression analysis focused on SGLT1 and has been confirmed in vivo by analyzing brain tissue of animals (Poppe et al. 1997; Balen et al. 2008; Yu et al. 2013). Here detection mainly occurs in neurons, no SGLT1 mRNA in capillaries of the BBB could be found. Similarly in vitro experiments with a human brain microvascular endothelial cell line reveals no expression of SGLT1 under physiological conditions (Sajja et al. 2014). In human brain, SGLT1 is hardly expressed and so far could not be found along the BBB. In contrast to these findings, expression of SGLT1 could be detected in vivo as well as in vitro under hypoglycemic conditions (Vemula et al. 2009; Sajja et al. 2014). The occurrence of these transporters during ischemic hypoglycemia could lead to the conclusion that the secondary active glucose transport by SGLTs is necessary for additional glucose supply in injured brain. To investigate if SGLTs are required for the reconstruction of energy supply after glucose deficiency, traumatic brain injury (TBI) models were established to study secondary physiological mechanisms along the BBB (Salvador et al. 2013). In an experimental CCI (controlled cortical impact) mouse model within a DFG-funded project, an expression pattern of glucose transporters in the mouse brain and in brain endothelial cells has been developed (Wais 2012; Salvador et al. 2015). Thus it could lead as a Target for evidence of the time of survival after TBI.
This study focuses on the sodium-dependent glucose transporters SGLT1 and SGLT2 expression in human brain. The main topic is to localize the sodium-dependent glucose transporters along the human BBB of post mortem brain tissue and to examine whether SGLT expression allow a conclusion to be drawn about the survival time of a patient after TBI. First of all the localization of SGLT1 and SGLT2 at the human BBB could be shown by establishment a capillary isolation protocol of human post mortem brain tissue. Therefore the antibody specificity was tested by a siRNA transfection protocol and blocking the immunofluorescence signal with an immunized peptide. Thus, specific SGLT1 and SGLT2 expression at the endothelial lining of the capillary lumen could be demonstrated. After attaching the value of SGLTs at the human BBB, the relationship of the glucose transporter expression in TBI tissue according to the survival time of the patient is presented. Hereby it should be clarified whether the expression and distribution of the transporters GLUT1, SGLT1 and SGLT2 as well as the relation to each other provide information on a vital or post mortal development of a trauma or its survival time. It could determine that GLUT1 is not suitable as a target for the representation of survival time after TBI. However, SGLT1 and SGLT2 show a significant change in the expression profile of traumatic brain regions. Here an increase according to the survival time after trauma can be shown. Although these preliminary data suggest a novel target for forensic questions, more experiments with an increased scope of survival time frames should be carried out.
KW  - Sodium-Glucose Transporter 2
KW  - Glucosetransportproteine
KW  - Natrium/Glukose Cotransporter
KW  - SGLT
KW  - Schädel-Hirn-Trauma
KW  - sodium-dependend glucose transporter
KW  - traumatic brain injury
KW  - Rechtsmedizin
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164093
ER  -