TY - THES A1 - Abdelmohsen, Usama Ramadan T1 - Antimicrobial Activities from Plant Cell Cultures and Marine Sponge-Associated Actinomycetes T1 - Antimikrobielle Aktivitäten aus Pflanzenzellkulturen und marinen Schwamm-assoziierten Actinomyceten N2 - This thesis is divided into three parts with the main goal allocating novel antimicrobial compounds that could be used as future antibiotics. The first part aimed to evaluate the potential of plant suspension cultures for the production of antimicrobial proteins. The extracellular, intracellular and cell wall bound fractions of seven heterotrophic and photomixotrophic plant cell suspension cultures treated with nine different elicitors were tested for the elicitor dependent production of antimicrobial proteins. Bioactivities were tested against a selected panel of human isolates including Gram-positive and Gram-negative bacteria as well as fungi using the disc diffusion assay. The intracellular fractions of elicited cell cultures were more active than extracellular fractions while the cell wall bound fractions showed lowest activities. Among the 21 fractions tested, the intracellular fraction of Lavendula angustifolia elicited with DC3000 was most active against Candida maltosa. The second most active fraction was the intracellular fraction of Arabidopsis thaliana elicited with salicylic acid which was moreover active against all test strains. The antimicrobial activity of elicited Arabidopsis thaliana cell cultures was tested by bioautography to locate the antimicrobial proteins in the crude extract. The intracellular fraction of photomixotrophic Arabidopsis thaliana cells elicited with salicylic acid was selected for further gel filtration chromatography on S-200 column leading to the purification of one 19 kDa antimicrobially active protein, designated, AtAMP. Our findings suggest that elicited plant cell cultures may present a new promising alternative source of antimicrobial proteins. The second part comprises the isolation of actinomycetes associated with marine sponges and testing the bioactivities of new species for further investigations. Actinobacterial communities of eleven taxonomically different sponges that had been collected from offshore Ras Mohamed (Egypt) and from Rovinj (Croatia) were investigated by a culture-based approach using different standard media for isolation of actinomycetes and media enriched with aqueous sponge extract to target rare and new actinomycete species. Phylogenetic characterization of 52 representative isolates out of 90 based on almost complete sequences of genes encoding 16S rRNA supported their assignment to 18 different actinomycete genera. Altogether 14 putatively new species were identified based on sequence similarity values below 98.2% to other strains in the NCBI database. The use of M1 agar amended with aqueous sponge extract yielded a putative new genus related to Rubrobacter which highlighting the need for innovative cultivation protocols. Biological activity testing showed that five isolates were active against Gram-positives only, one isolate was active against Candida albicans only and one isolate showed activity against both groups of pathogens. Moreover, the antiparasistic activity was documented for four isolates. These results showed a high diversity of actinomycetes associated with marine sponges as well as highlighted their potential to produce anti-infective agents. The third part of the thesis focused on the isolation and structure elucidation of new bioactive compounds. Streptomyces strain RV15 recovered from sponge Dysidea tupha, was selected for further chemical analysis by virtue of the fact that it exhibited the greatest antimicrobial potential against Staphylococcus aureus as well as Candida albicans among the all tested strains. Moreover, members of the genus Streptomyces are well known as prolific producers of interesting pharmacologically active metabolites. Chemical analysis of the methanolic crude extract using different chromatographic tools yielded four new compounds. The structures of the new compounds were spectroscopically elucidated to be four new cyclic peptides, namely, cyclodysidins A-D. Their bioactivity was tested against different proteases, bacteria and Candida as well as tumor cell lines. The compounds did not show any significant activities at this point. N2 - Die hier vorliegende Dissertation ist in drei Kapitel gegliedert und hatte die Bereitstellung neuer antimikrobieller Substanzen, die zukünftig als Antibiotika genutzt werden könnten, zum Hauptziel. Das erste Kapitel befasst sich mit dem Potenzial von Pflanzen zur Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung. Pflanzenzellkulturen wurden mit neun verschiedenen Induktoren stimuliert und anschließend auf die Produktion von Proteinen mit antimikrobieller Wirkung hin untersucht. Dafür wurden die extra-, intrazellulären sowie die membrangebundenen Proteinfraktionen von sieben heterotrophen und photomixotrophen Pflanzenzellkulturen extrahiert. Mittels Diffusionstests wurden die Wirkung der Proteine gegen eine Sammlung menschlicher Pathogene inklusive Gram-positiver und Gram-negativer Bakterien, sowie Pilze getestet. Die intrazellulären Fraktionen zeigten dabei höhere Aktivitäten als die extrazellulären, wohingegen die membrangebundenen Proteine die geringsten Aktivitäten aufwiesen. Von den insgesamt 21 getesteten Proteinfraktionen wies die mit DC3000 induzierte intrazelluläre Fraktion von Lavendula angustifolia die größte Wirkung gegen Candida maltosa auf. Die mit Salicylsäure induzierte intrazelluläre Proteinfraktion von Arabidopsis thaliana zeigte eine Hemmung aller getesteten pathogenen Stämme. Die antimikrobielle Aktivität der induzierten Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde mittels Bioautography weiter untersucht, um das wirksame Protein im Gesamt-(Roh-) extrakt einzugrenzen. Die intrazelluläre Fraktion der photomixotrophen Arabidopsis thaliana-Zellkultur wurde ausgewählt, um ein 19 kDa Protein mit antimikrobieller Wirkung, genannt AtAMP, mittels Gelfitrationschromatography über eine S-200 Säule aufzureinigen. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass induzierte Pflanzenzellkulturen zukünftig als aussichtsreiche alternative Quelle für antimikrobiell wirksame Proteine herangezogen werden können. Der zweite Teil dieser Dissertation beinhaltet die Isolation von mit marinen Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Testung auf Bioaktivität. Aus 11 taxonomisch verschiedenen, an den Küsten von Ras Mohamed (Ägypten) und Rovinj (Kroatien) gesammelten Schwammspezies, wurden Actinobakterien auf verschiedenen Standardmedien kultiviert. Um seltene, neue Stämme zu isolieren, wurden diese Medien mit wässrigen Schwammextrakten angereichert. Die auf der 16S rRNA-Gensequenz basierenden phylogenetischen Charakterisierung von 52 der insgesamt 90 Isolate, zeigte die Zugehörigkeit zu 18 verschiedenen Actinomyceten-Gattungen. Die 16S rRNA-Gene von 14 Isolaten zeigten Homologien von weniger als 98,2% zu denen anderer in Datenbanken abgelegten Bakterien und stellen somit vermutlich neue Arten dar. Die Verwendung von mit Schwammextrakt angereichertem M1-Agar resultierte in der Kultivierung einer mutmaßlich neuen, mit Rubrobacter verwandten Gattung und bestätigt die Notwendigkeit der Entwicklung neuer innovativer Kultivierungsprotokolle. Aktivitätstests von fünf Isolaten zeigten deren hemmende Wirkung nur gegen Gram-positive Bakterien, ein Isolat zeigte Aktivität nur gegen Candida albicans und ein Isolat war wirksam gegen beide genannten Pathogengruppen. Desweiteren konnten antiparasitäre Wirkungen von vier Isolaten dokumentiert werden. Die hier beschriebenen Ergebnisse zeigen die große Diversität von mit Schwämmen assoziierten Actinomyceten und deren Potential Antiinfektiva zu produzieren. Der dritte Teil dieser Arbeit fokussierte sich auf die Isolation und Strukturaufklärung neuer bioaktiver Substanzen. Streptomyceten sind bekannt für die Produktion von interessanten, pharmakologisch aktiven Metaboliten. Der aus dem Schwamm Dysidea tupha isolierte Stamm Streptomyces RV 15 zeigte eine hohe Aktivität gegen Staphylococcus aureus und C. albicans und wurde deshalb für nähere Untersuchungen ausgewählt. Die chemische Analyse des Methanol-Rohextrakts unter der Verwendung verschiedener Chromatographie-Verfahren resultierte in der Isolation von vier Substanzen. Die spektroskopische Analyse zeigte, dass diese neuen Substanzen zyklische Peptidstrukturen aufweisen und wurden daraufhin als Cyclodysidin A-D benannt. Die Bioaktivitäten dieser Substanzen wurden gegen verschiedene Proteasen, Bakterien und Candida sowie gegen verschiedene Tumorzelllinien getestet. Bis zum jetzigen Zeitpunkt zeigte keine der getesteten Peptide eine aussagekräftige Wirkung. KW - Antimikrobieller Wirkstoff KW - Pflanzenzelle KW - Zellkultur KW - Antimikrobielle Aktivitäten KW - Pflanzenzellkulturen KW - Proteinen mit antimikrobieller Wirkung KW - Actinomyceten KW - zyklische Peptide KW - Antimicrobial activities KW - Plant cell cultures KW - Antimicrobial proteins KW - Actinomycetes KW - Cyclic peptides Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51483 ER - TY - THES A1 - Börner, Juliane T1 - Charakterisierung der Phosphorylierungsstellen der Guanylyl Cyklase A, dem Rezeptor für das atriale natriuretische Peptid, mittels Massenspektrometrie T1 - Characterization of the phosphorylation sites of Guanylyl cyclase A, the receptor for atrial natriuretic peptide, by mass spectrometry application N2 - Das ANP/GC-A-System spielt durch die Produktion des sekundären Botenstoffs cGMP eine wichtige Rolle bei der Regulation des Blutdruckes und des Blutvolumens. Bei Patienten mit Herzhypertrophie oder Herzinsuffizienz sind die ANP-Plasmakonzentrationen erhöht, aber die GC-A-vermittelten Effekte stark reduziert, was auf einen Defekt des Signalsystems hinweist. Studien an metabolisch markierten GC-A-überexprimierenden HEK 293-Zellen zeigten, dass der GC-A-Rezeptor im basalen Zustand stark phosphoryliert und die homologe bzw. heterologe Desensitisierung wahrscheinlich mit einer Dephosphorylierung verbunden ist. Die Desensitisierung stellt einen Mechanismus dar, der in vivo zu einem Funktionsverlust des Rezeptors beitragen könnte. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mittels Massenspektrometrie sieben Phosphorylierungsstellen in der Kinasehomologen Domäne aus FLAG-GC-A exprimierenden HEK 293-Zellen detektiert werden: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513. Die massenspektrometrische relative Quantifizierung basierend auf der Multiple-Reaction-Monitoring (MRM)-Methode zeigte bei ANP-induzierter, homologer Desensitisierung eine Dephosphorylierung der Phosphorylierungsstellen Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 und Thr513, was mit bereits publizierten Daten übereinstimmt, und einen starken Anstieg der Phosphorylierung an Ser487. Nach Inkubation mit Angiotensin II, welches eine heterologe Desensitisierung hervorruft, wurde eine Reduzierung aller Phosphorylierungen verzeichnet, die zudem stärker ausgeprägt war als bei der ANP-abhängigen Desensitisierung. Die Funktion der neu identifizierten Phosphorylierung an Ser487 wurde mittels Mutagenese analysiert. Die Substitution des Serins durch Alanin, welche den unphosphorylierten Zustand nachstellt, resultierte in einer Rezeptoraktivität und desensitisierung vergleichbar zum GC-A Wildtyp-Rezeptor. Wurde hingegen Serin gegen Glutamat getauscht, um den phosphorylierten Zustand zu imitieren, konnte der Rezeptor weder aktiviert noch desensitisiert werden. Diese Ergebnisse bestätigen vorherige Studien, dass die GC-A-Rezeptorantwort auf ANP durch die Phosphorylierungen reguliert wird. Allerdings scheint bei der homologen Desensitisierung die Phosphorylierung an der Position Ser487 eine Rolle zu spielen, da sie die Aktivität des Rezeptors inhibiert. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser Phosphorylierungsstelle trägt zum Verständnis des Mechanismus der homologen Desensitierung bei. Zusätzlich konnten einige der beschriebenen Phosphorylierungen in Zellsystemen detektiert werden, die die GC-A endogen exprimieren. Dadurch sind unter physiologischen Bedingungen Analysen der Mechanismen möglich, die bei der Aktivierung und Deaktivierung der GC-A involviert sind und somit wichtige pathophysiologische Konsequenzen haben können. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP), via its guanylyl cyclase A (GC-A) receptor and intracellular guanosine 3’,5’-cyclic monophosphate production, is critically involved in the regulation of blood pressure. In patients with chronic heart failure, the plasma levels of ANP are increased, but the cardiovascular actions are severely blunted, indicating a receptor or postreceptor defect. Studies on metabolically labelled GC-A-overexpressing cells have indicated that GC-A is extensively phosphorylated, and that ANP induced homologous desensitisation of GC-A correlates with receptor dephosphorylation, a mechanism which might contribute to a loss of function in vivo. In this study, tandem MS analysis of the GC-A receptor, expressed in the human embryonic kidney cell line HEK 293, revealed that the intracellular domain of the receptor is phosphorylated at multiple residues: Ser487, Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510 and Thr513. MS quantification based on multiple reaction monitoring demonstrated that ANP-provoked homologous desensitisation was accompanied by a complex pattern of receptor phosphorylation and dephosphorylation. The population of completely phosphorylated GC-A was diminished which is in agreement with published data. However, the phosphorylation of GC-A at Ser487 was selectively enhanced after exposure to ANP. In contrast, the Angiotensin II-provoked heterologous desensitisation resulted in a complete reduction of phosphorylation, which was even more intensive than after ANP-dependend desensitisation. The functional relevance of the newly identified phosphorylation site at serin 487 was analysed by site-directed mutagenesis. The substitution of Ser487 by alanine which mimics dephosphorylation resulted in a receptor which could be activated and desensitised like the GC-A wild-type receptor. However, the substitution by glutamate (which mimics phosphorylation) blunted the activation of the GC-A receptor by ANP, but prevented further desensitisation. These data corroborate previous studies suggesting that the responsiveness of GC-A to ANP is regulated by phosphorylation. However, in addition to the dephosphorylation of the previously postulated sites (Ser497, Thr500, Ser502, Ser506, Ser510), homologous desensitisation seems to involve the phosphorylation of GC-A at Ser487. Identification and characterisation of this phosphorylation site therefore contribute to the understanding of homologous desensitisation. Additionally, some of the detected phosphorylated residues were detected in cells endogenously expressing the GC-A receptor. Therefore future analyses of the mechanisms which are involved in the activation and desensitisation under pathophysiological conditions might be possible. KW - Guanylatcyclase KW - Phosphorylierung KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Massenspektrometrie KW - Guanylyl cyclase A KW - phosphorylation sites KW - atrial natriuretic peptide KW - mass spectrometry Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51914 ER - TY - THES A1 - Matuschek, Anja T1 - Characterization of tolerogenic rat bone marrow-derived dendritic cells and regulatory T cells T1 - Charakterisierung tolerogener dendritischer Knochenmarkszellen und regulatorischer T-Lymphozyten aus der Ratte N2 - Tolerogene Dendritische Zellen (DZ) und regulatorische T-Lymphozyten (Treg) verfügen über die Fähigkeit, destruktive Immunantworten zu verhindern. Die Hoffnung besteht, solche Zellen in naher Zukunft für therapeutische Zwecke einzusetzen, um z. B. Immunantworten nach Transplantation, aber auch bei Autoimmunität und Allergie antigenspezifisch zu supprimieren. Zum jetzigen Zeitpunkt ist die Generierung solcher Zellen aufwendig und noch nicht für die klinische Routine geeignet. Zudem sind die Mechanismen noch wenig verstanden, wie diese Zellen eine gewünschte Immunhemmung in vivo auszulösen und wie der möglichen Gefahr einer zu starken Immunhemmung zu begegnen ist. Das Kleinnagermodell Ratte ist für die biomedizinische Forschung noch immer von großer Bedeutung, umso überraschender ist es, dass insbesondere tolerogene DZ und Treg in diesem Modell bisher nur unzureichend untersucht wurden. Das Ziel der Arbeit war deshalb, diese Immunzellen umfassend zu charakterisieren und ihre Funktion auf das Immunsystem zu untersuchen. Tolerogene DZ wurden mit GM-CSF und IL-4 aus Knochenmarkvorläuferzellen generiert (= IL-4 DC). Der Anteil an natürlich vorkommenden Treg mit einem Phänotyp CD4posCD25posFoxp3pos umfasst ca. 5-8% der peripheren naiven CD4pos TLymphozyten. Die Charakterisierung der IL-4 DC zeigte im Vergleich zu reifen DZ der Milz eine bis zu 26-fach geringere Expression von Oberflächenmolekülen wie MHC-Klasse II Molekül, CD80, CD86, ICAM-1 und CD25. Diese geringe Expression änderte sich auch nicht, wenn die Zellen verschiedensten Reifungssignalen wie das Replattieren,LPS, TNF-α und CD40L ausgesetzt wurden. IL-4 DC verfügen somit über einen robusten und gegenüber Reifungssignalen überaus resistenten Phänotyp. IL-4 DC nehmen Antigene durch Endozytose auf und sind unfähig, sowohl naive TLymphozyten zu aktivieren, als auch antigenspezifische T-Lymphozyten zu restimulieren. Zudem sind sie in der Lage, die Aktivierung naiver T-Lymphozyten und die Restimulierung antigenspezifischer T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ zu bzw. zu verzögern. Dabei verringerte sich die Proliferation der TLymphozyten um bis zu 95%. Diese Beeinflussung der Proliferation ist nach Zugabe der IL-4 DC bereits innerhalb von 24 Stunden zu messen. Die verringerte Aktivierung geht zu dem mit einer verringerten Zytokinausschüttung (IL-2 um 49% und IFN-γ um 92%) einher. Die inhibitorischen Eigenschaften der IL-4 DC scheinen aber nicht ausschließlich auf der verringerten Expression kostimulatorischer Moleküle zu beruhen. Der Nachweis der beiden inhibitorischen Oberflächenmoleküle PD-L1 und PD-L2 auf IL-4 DC lässt ebenfalls eine Bedeutung dieser Moleküle bei der Vermittlung inhibierender Signale vermuten. Auch die suppressive Wirkung löslicher Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt. Überstände einer 24-stündigen Kultur mit einer Million IL-4 DC hemmten die Aktivierung naiver T-Lymphozyten durch reife Milz-DZ um etwa 90%. Für diese Immunhemmung scheint das in diesen Überständen nachgewiesene Zytokin TGF-β (bis 300 pg/ml) verantwortlich zu sein. Im Vergleich dazu wiesen Überstände reifer Milz-DZ, die nicht die Aktivierung von T-Lymphozyten hemmten, eine TGF-β Konzentrationen von bis 100 pg/ml auf. Im Gegensatz dazu scheint zelltoxisches Stickstoffmonoxid nur eine geringe Rolle bei der Inhibierung der T-Zellproliferation zu spielen. Die Zugabe des NO Synthase-Inhibitors NMMA verringerte zwar den Anteil an NO um ca. 50%, doch führte dies nicht zu einer Steigerung der Proliferation von T-Lymphozyten. IL-4 DC sind zwar nicht in der Lage, T-Lymphozyten zur Proliferation zu bringen, doch bedeutet dies nicht, dass keinerlei Veränderungen auf molekularer Ebene festzustellen wären. So sind T-Lymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC nicht in der Lage, in Gegenwart von reifen Milz-DZ zu proliferieren. Dieser anergische Zustand wurde nach Zugabe von IL-2 aufgehoben. Zudem können diese TLymphozyten nach ihrer Inkubation mit IL-4 DC die Aktivierung naïver TLymphozyten hemmen. Naïve und aktivierte T-Lymphozyten können dies nicht. Diese Beobachtung, die auf eine Induktion von Treg schließen lässt, wurde genauer untersucht. In der Tat zeigten durchflusszytometrische Analysen eine 1,6-fach verstärkte Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten aus natürlich vorkommenden Treg in Gegenwart von IL-4 DC. Dabei erfolgte die Expansion von CD4posCD25posFoxp3pos T-Lymphozyten unabhängig vom Reifegrad der DZ. So waren auch reife Milz-DZ dazu in der Lage, die Zahl der natürlich vorkommenden Treg zu erhöhen. Doch wiesen diese mit Milz-DZ inkubierten Treg einen verminderten inhibitorischen Effekt auf. Im Gegensatz dazu waren die mit IL-4 DC inkubierten Treg in der Lage die Aktivierung naiver T-Lymphozyten zu hemmen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass sich das regulatorische Potential von DZ nicht ausschließlich vom Phänotyp bzw. ihrem Reifegrad ableiten lässt, sondern dass hierzu auch ihre funktionellen Eigenschaften zu untersuchen sind. Die Induktion von Treg mit suppressiven Eigenschaften durch in vitro generierte tolerogene IL-4 DC könnte ein wichtiger Mechanismus zur Aufrechterhaltung der peripheren Toleranz darstellen. Vor einer klinischen Umsetzung sind aber noch weitergehende Untersuchungen notwendig, um das Zusammenspiel zwischen tolerogenen DZ und Treg zu verstehen, aber auch um die Auswirkungen eines Transfers großer Mengen regulatorischer Zellen auf das Immunsystem des Empfängers zu untersuchen. N2 - Tolerogenic dendritic cells (DC) and regulatory T (Treg) cells are able to prevent destructive immune responses. There is reason to hope that it may soon be possible to use DC and Treg cells to suppress immune responses antigen-specific, not only after transplantation, but also in the case of autoimmunity and allergy. At the moment, the generation of such cell types is very time-consuming and not suitable for clinical routine. In addition, it is not yet fully understood how these cells elicit a desired protective immune response in vivo and how the risks of an excessive immune suppression can be managed. The rat is one of the most important animal models in biomedical research. It is therefore surprising that tolerogenic DC and Treg cells in particular have not been more thoroughly investigated in this model. Thus, the aim of the present study was to systematically characterize these immune cells and investigate their impact on the immune system. Tolerogenic DC were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF and IL-4 (= IL-4 DC). The proportion of naturally occurring Treg cells with a CD4posCD25posFoxp3pos phenotype comprises approximately 5-8% of the peripheral CD4pos T cells. The characterization of IL-4 DC revealed an up to 26-fold reduced expression of surface molecules such as MHC class II molecules, CD80, CD86, ICAM-1 and CD25 in comparison to mature splenic DC (S-DC). This low expression did not change when the cells where stimulated with different maturation-inducing signals such as replating, LPS, TNF- α and CD40L. Thus, these cells possess a robust phenotype resistant to maturation-inducing stimuli. IL-4 DC take up antigen via endocytosis and are not able to activate naïve T cells or to restimulate antigen-specific T cells. Furthermore, they are able to inhibit and prolongate mature S-DC induced T cell proliferation as well as mature S-DC induced restimulation of antigen-specific T cells, respectively. Thereby, the T cell proliferation was reduced up to 95%. This strong inhibitory effect was mediated within 24 hours in association with a reduced cytokine production (IL-2 about 49% and IFN-γ about 92%). The inhibitory properties of IL-4 DC don´t seem to be caused exclusively by the reduced expression of co-stimulatory molecules. In this study, the detection of the inhibitory molecules PD-L1 and PD-L2 on IL-4 DC suggests they have an impact on mediating inhibitory signals to the T cells. In addition, a suppressive effect of soluble factors was shown. The supernatant of one million IL-4 DC, collected after a 24 hour culture, suppressed mature S-DC induced proliferation of naïve T cells by about 90%. TGF-β, which was detected in the supernatant (up to 300 pg/ml), appears to be the causing soluble factor for this immune inhibition. By contrast, the supernatants of mature S-DC, which did not inhibit the activation of T cells, showed a TGF-β concentration of only about 100 pg/ml. The cytotoxic nitric oxide does not contribute to the IL-4 DC-mediated inhibition of T cell proliferation. The NO synthase inhibitor NMMA reduced the amount of NO by about 50%, but the decreased NO levels did not influence T cell proliferation. Indeed, IL-4 DC are not able to induce T cell proliferation, but this doesn´t mean that there is no change on the molecular level. For instance, T cells co-cultured with IL-4 DC during a first culture are not able to proliferate in the presence of mature S-DC during a second culture. This anergic-like state, however, could be abolished by adding exogenous IL-2. In addition, T cells co-cultured with IL-4 DC are able to inhibit the activation of naïve T cells. Naïve and activated T cells were not able to inhibit the mature S-DC induced T cell proliferation. This observation suggests the induction of Treg cells and was investigated in more detail. Indeed, flow cytometric analysis showed a 1.6-fold expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells from naturally occurring Treg cells in the presence of IL-4 DC. Thereby, the expansion of CD4posCD25posFoxp3pos T cells occurs independently of the maturation state of DC. Both immature IL-4 DC as well as mature S-DC were able to expand the percentage of naturally occurring Treg cells. However, Treg cells pre-incubated with mature S-DC demonstrated a diminished inhibitory effect compared to Treg cells pre-incubated with IL-4 DC. Treg cells pre-incubated with IL-4 DC were able to inhibit the activation of naïve T cells. In this study it was shown that the regulatory potential of DC cannot be deduced solely by their phenotype or maturation state. Other factors, such as functional properties, need to taken into consideration, too. The induction of Treg cells with suppressive properties induced by in vitro generated tolerogenic IL-4 DC might provide an important mechanism for the maintenance of peripheral tolerance. However, for clinical application further investigation is necessary, not only to understand the interactions between tolerogenic DC and Treg cells, but also to investigate the impact of the transfer of a larger quantity of regulatory cells on the immune system of the recipient. KW - Dendritische Zelle KW - T-Lymphozyt KW - Immuntoleranz KW - Allogene Zelle KW - Transforming Growth Factor beta KW - tolerogen KW - Dendritische Zelle KW - regulatorische T-Zellen KW - allogen KW - TGF-ß KW - tolerogenic KW - dendritic cell KW - regulatory T cells KW - allogenic KW - TGF-ß Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51708 ER - TY - THES A1 - Leonhardt, Sara Diana T1 - Resin collection and use in stingless bees T1 - Wie stachellose Bienen Pflanzenharze sammeln und nutzen N2 - Harz ist ein klebriges Pflanzenprodukt mit einem oft intensiven aromatischen Geruch. Es wird von Bäumen produziert, um Wunden zu verschließen und schädliche Besucher abzuwehren. Einige Insektenarten haben jedoch die erstaunliche Fähigkeit entwickelt, mit der klebrigen Substanz umzugehen und sie sich gar zu Nutzen zu machen. So verwenden Bienen Harz beispielsweise zum Nestbau und zur Verteidigung ihrer Kolonien. Während allgemein bekannt ist, dass Bienen Pollen und Nektar sammeln, wird der Tatsache, dass sie auch Harz sammlen, allerdings sehr viel weniger Beachtung geschenkt. Ziel meiner Dissertation war es daher, herauszufinden, warum, wie und wo stachellose Bienen in Borneo (sieben untersuchte Bienenarten), Australien (acht Arten) und Costa Rica (27 Arten) Pflanzenharze sammeln und verwerten. Diese Arbeit behandelt somit die enge Beziehung zwischen einer eusozialen Insektengattung und einem chemisch und physiologisch hoch komplexen Pflanzenprodukt, das Bienen nicht nur als Nestmaterial und zur Verteidigung dient, sondern auch eine wesentliche Bedeutung für deren chemische Diversität hat. Stachellose Bienen verhalten sich hochgradig opportunistisch, wenn sie Harz sammeln, d.h. verschiedene Bienenarten sammeln Harz von denselben Baumarten, wobei sie nahezu jede verfügbare Harzquelle nutzen. Dabei finden und erkennen sie Harzquellen anhand einiger charakteristischer Mono- und Sesquiterpene, nutzen jedoch nicht das gesamte Harz-Bouquet. Die Menge an eingetragenem Harz unterscheidet sich zwischen verschiedenen Bienenarten und kolonien und varriert mit verschiedenen Umweltbedingungen. Insbesondere eine Bedrohung durch Fressfeinde (z. B. Ameisen) führt zu einer massiven Steigerung des Harzeintrages; eine manuelle Zerstörung des Nesteinganges hat dagegen relativ wenig Einfluss. Das eingetragene Harz wird zum Nestbau und zur Verteidigung gegen Fressfeinde und Mikroben genutzt. Darüber hinaus dient es als Quelle für Terpene, die von den Bienen in ihre chemischen Oberflächenprofile eingebaut werden (kutikuläre Terpene). Dabei übertragen sie nur einen Bruchteil (8 %) der gewaltigen Menge (>> 1000) an Terpenen, die man im Harz von Bäumen findet, auf ihre Oberfläche. Die übertragenen Terpene bleiben in ihrer Struktur unverändert, allerdings unterscheiden sich die Bienenarten in der Zusammensetzung der Terpenprofile auf ihrer Oberfläche, obwohl alle untersuchten Arten Harz von denselben Bäumen sammeln. Die unterschiedlichen Terpenprofile sowie die Tatsache, dass nur wenige Terpene aus dem Harz aufgenommen werden, deuten auf einen artspezifischen und bisher unbekannten Filterungsmechanismus bei stachellosen Bienen hin. Auch übersteigt durch die Aufnahme von Terpenen die chemische Diversität der Oberflächenprofile von stachellosen Bienen die zahlreicher anderer Hymenopteren. Da Bienen die Terpene aus dem Harz nur „filtern“, sie dabei aber nicht verändern, sind sämtliche Bienenarten aus Borneo, Australien und Costa den charakteristischen Harzprofilen von Bäumen aus ihren Ursprungsgebieten chemisch sehr ähnlich. Da in jeder tropischen Region andere Baumarten vorkommen, varriert die chemische Zusammensetzung der vorkommenden Harze und damit der kutikulären Terpene von dort vorkommenden Bienen. Die meisten Bienenarten mit kutikulären Terpenen findet man in Borneo, wo nahezu 100 % der untersuchten Arten aus Baumharzen gewonnene Terpene in ihre chemischen Profilen einbauen. Im Gegensatz dazu sind es in Costa Rica nur 40 % der untersuchten Arten. Auch sammeln in Borneo gelegentlich 9 von 10 Arbeiterinnen einer Tetragonilla collina Kolonie Harz, wohingegen in Australien maximal 10 % und in Costa Rica maximal 40 % der Arbeiterinnen einer Kolonie Harz sammeln. Das Vorherrschen von Harz und aus Harz gewonnenen Terpenen in der chemischen Ökologie von Bienen auf Borneo spiegelt das Vorherrschen einer bestimmten südostasiatischen Baumfamilie wieder: der Dipterocarpaceen, deren Holz ungewöhnlich harzig ist. Ein solch enger Zusammenhang zwischen der Chemie von Bienen und der von Baumharzen verdeutlicht die enge Beziehung zwischen stachellosen Bienen und den Bäumen in ihrem Habitat. Die kutikulären Terpene schützen ihre Träger vor Angreifern (z.B. Ameisen) und Mikrobenbefall. Dabei variiert eine bestimmte Gruppe – Sesquiterpene – am meisten zwischen den Arten. Diese Terpengruppe manipuliert die natürlichweise auftretende zwischen-artliche Aggression, indem sie letztere bei jenen Arten verringert, die selbst keine Sesquiterpene in ihrem Profil haben. Aggressionsminderung durch chemische Komponenten, welche aus der Umwelt aufgenommen werden, stellt somit einen bisher unbekannten Mechanismus dar, um Toleranz zwischen sonst aggressiven Arten zu erreichen. Eine derarte Herabsetzung von aggressiven Verhalten bei stachellosen Bienen kann darüber hinaus ein entscheidender Faktor für das Entstehen sogenannter Nestaggregationen sein. Dabei nisten Kolonien von Bienenarten mit und Bienenarten ohne Sesquiterpene in ihrem chemischen Profil in unmittelbarer Nachbarschaft, ohne gegeneinander aggressiv zu sein. Im Hinblick auf die zahlreichen Funktionen, die Harze und/oder aus dem Harz gewonnene Substanzen für stachellose Bienen haben, stellt Harz zweifelsohne eine bedeutende Ressource in der Welt der Bienen dar – eine Ressource, die einen direkten Einfluss auf deren chemische Ökologie, Verteidigungsmechanismen und zwischen-artliche Kommunikation ausübt. Wie genau die Bienen ihre artspezifischen Terpenprofile erzeugen, insbesondere, wie es ihnen gelingt, dabei ganze Terpengruppen auszuschließen, muss in zukünftigen Studien genauer untersucht werden. Auch stellt sich die Frage, wie wichtig eine hohe Diversität an Harzquellen und damit Baumarten für die Bienen ist! Es ist durchaus möglich, dass neben einer Vielfalt an Blütenpflanzenarten auch der „Harzreichtum“ für das Wohlergehen der Bienen eine entscheidende Rolle spielt. N2 - Resin, a sticky sap emitting terpenoids and other volatiles, is produced by various plant species to seal wounds and protect themselves against herbivores and microbes. Among several other insects, bees have evolved the surprising ability to handle the repellent plant sap and use it to construct and defend their nests. Whereas the collection of pollen and nectar has been intensively studied in bees, resin collection has received only little attention. The aim of this dissertation was to better understand how the physiological and chemical properties of resin and resin-derived compounds (terpenes) affect the ecology of stingless bees. I therefore asked why, where and how stingless bees of Borneo (seven study-species), Australia (eight) and Costa Rica (27) collect and process plant resins, addressing the importance of a largely neglected resource not only for building and defensive properties, but also for the bees’ chemical diversity. Stingless bees are highly opportunistic resin foragers with all species collecting resin from a similar set of tree species. They locate and/or recognize resin sources on the basis of several volatile mono- and sesquiterpenes. I found that different bee species and even colonies significantly varied in the amount of resin collected. Predator attack (e.g., by ants) had the strongest affect on resin intake, whereas manual nest destruction only slightly increased the number of resin foragers. Resin is used to build, maintain and defend nests, but also as source for chemical compounds (terpenes) which stingless bees include in their surface profiles (chemical profiles). They directly transfer resin-derived compounds to their body surfaces (cuticular terpenes), but only include a subset (8 %) of the large number (>> 1000) of terpenes found in tree resins. This phenomenon can only be explained by a hitherto unknown ability to filter environmentally derived compounds which results in species-specific terpene profiles and thus in an increased chemical heterogeneity among species. Moreover, due to the addition of resin-derived substances the diversity of compounds on the bees’ body surfaces by far exceeds the chemical diversity of profiles in other hymenopterans. Because stingless bees filter but do not modify resin-derived compounds, species from Borneo, Australia and Costa Rica all resemble the characteristic resin of typical trees in their regions of origin. This chemical similarity reveals a strong correlation between the diversity of tree resins and the diversity of cuticular terpenes among stingless bees in a given habitat. Because different tree species are found in different tropical regions, the chemical composition of tree resins varies between tropical regions as does the composition of cuticular terpenes in bee species from these regions. Cuticular terpenes are however most common among stingless from Borneo, with 100 % of species studied having resin-derived terpenes in their chemical profiles. They are least common in Costa Rica, with only 40 % of species having terpenes. Likewise, resin collection was found to be highest in Tetragonilla collina colonies of Borneo where occasionally up to 90 % of foragers collected resin. By contrast, resin collection was only performed by 10 % of foragers of a given colony in Australia and by a maximum of 40 % in Costa Rica. The dominance of resin and resin-derived compounds in the chemical ecology of bees from Borneo may mirror the dominance of a particular Southeast Asian tree family: the highly resinous dipterocarps. Such a correlation between the chemistry of bees and the chemistry of tree resins therefore underlines the close relationship between stingless bees and the trees of their habitat. Cuticular terpenes are assumed to protect bees against predators and/or microbes. Sesquiterpenes, a specific group of terpenes, most vary between species and impair inter-specific aggression by reducing aggressive behavior in species without sesquiterpenes, thereby providing a novel mechanism to achieve interspecific tolerance among insects. Reduced interspecific aggression may also be an important factor enabling the non-aggressive aggregation of nests from stingless bee colonies of up to four different species, because such aggregations frequently comprise both species with and species without sesquiterpenes. Given its various functions, resin represents a highly important resource for stingless bees which directly affects their chemical ecology, defensive properties and inter-specific communication. It remains to be investigated how the bees influence the resin-derived terpene profiles on their body surface and in their nests, particularly how they manage to exclude entire groups of terpenes. Whether bees actually need a high diversity of different resin sources and therefore tree species to maintain the homeostasis of their colonies or whether they would do equally well with a limited amount of resin sources available, should also be addressed in future studies. Answers to this question will directly impair bee and forest management in (sub)tropical regions. KW - stachellose Biene KW - Harze KW - Terpene KW - stachellose Bienen KW - stingless bees KW - resin KW - terpenes Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51588 ER - TY - THES A1 - Weiland, Romy T1 - Facial reactions in response to gustatory and olfactory stimuli in healthy adults, patients with eating disorders, and patients with attention-deficit hyperactivity disorder T1 - Mimische Reaktionen auf Geschmacks- und Geruchsreize bei gesunden Erwachsenen, Patientinnen mit Essstörungen und Patientinnen mit Aufmerksamkeitsdefizit/Hyperaktivitätsstörung N2 - The aim of this project was to investigate whether reflex-like innate facial reactions to tastes and odors are altered in patients with eating disorders. Qualitatively different tastes and odors have been found to elicit specific facial expressions in newborns. This specificity in newborns is characterized by positive facial reactions in response to pleasant stimuli and by negative facial reactions in response to unpleasant stimuli. It is, however, unclear, whether these specific facial displays remain stable during ontogeny (1). Despite the fact that several studies had shown that taste-and odor-elicited facial reactions remain quite stable across a human’s life-span, the specificity of research questions, as well as different research methods, allow only limited comparisons between studies. Moreover, the gustofacial response patterns might be altered in pathological eating behavior (2). To date, however, the question of whether dysfunctional eating behavior might alter facial activity in response to tastes and odors has not been addressed. Furthermore, changes in facial activity might be linked to deficient inhibitory facial control (3). To investigate these three research questions, facial reactions in response to tastes and odors were assessed. Facial reactions were analyzed using the Facial Action Coding System (FACS, Ekman & Friesen, 1978; Ekman, Friesen, & Hager, 2002) and electromyography. N2 - Ziel dieses Projektes war es zu untersuchen, ob spezifische, mimische Reaktionen auf Geschmacks- und Geruchsreize bei Patientinnen mit Essstörungen verändert sind. Bei Neugeborenen rufen qualitativ verschiedene Geschmacksreize und Geruchsreize spezifische mimische Reaktionsmuster hervor. Diese Spezifität zeichnet sich infolge angenehmer Reize durch positive mimische Reaktionen und infolge unangenemher Reize durch negative mimische Reaktionen aus. Es ist jedoch unklar, ob diese spezifischen Reaktionsmuster während der ontogentischen Entwicklung stabil bleibe (1). Trotz der Befunde, dass geschmacks- und geruchsinduzierte mimische Reaktionen bei Erwachsenen relativ stabil bleiben, erlauben spezifische Forschungsfragen und verschiedene Methoden nur einen begrenzten Vergleich zwischen den Studien. Darüber hinaus könnten die gustofazialen Reaktionsmuster bei Patientinnen mit Essstörungen verändert sein (2). Diese Frage wurde jedoch bisher nicht untersucht. Weiterhin könnten Veränderungen in den mimischen Reaktionen bei essgestörten Patientinnen durch eine defizitäre Hemmungskontrolle bedingt sein (3). Zur Klärung dieser drei Fragestellungen wurden mimische Reaktionen auf Geschmacks- und Geruchsreize erfasst. Die Mimikanalyse erfolgte mit Hilfe des Facial Action Coding Systems (FACS, Ekman & Friesen, 1978; Ekman, Friesen, & Hager, 2002) und des Elektromyogramms. KW - Mimik KW - Geschmack KW - Geruch KW - Essstörung KW - Aufmerksamkeits-Defizit-Syndrom KW - facial expressions KW - gustation KW - olfaction KW - eating disorders KW - ADHD Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51759 ER - TY - THES A1 - Hahn, Tim T1 - Integrating neurobiological markers of depression: an fMRI-based pattern classification approach T1 - Integration neurobiologischer Marker depressiver Erkrankungen mittels fMRT-basierter Musterklassifikation N2 - While depressive disorders are, to date, diagnosed based on behavioral symptoms and course of illness, the interest in neurobiological markers of psychiatric disorders has grown substantially in recent years. However, current classification approaches are mainly based on data from a single biomarker, making it difficult to predict diseases such as depression which are characterized by a complex pattern of symptoms. Accordingly, none of the previously investigated single biomarkers has shown sufficient predictive power for practical application. In this work, we therefore propose an algorithm which integrates neuroimaging data associated with multiple, symptom-related neural processes relevant in depression to improve classification accuracy. First, we identified the core-symptoms of depression from standard classification systems. Then, we designed and conducted three experimental paradigms probing psychological processes known to be related to these symptoms using functional Magnetic Resonance Imaging. In order to integrate the resulting 12 high-dimensional biomarkers, we developed a multi-source pattern recognition algorithm based on a combination of Gaussian Process Classifiers and decision trees. Applying this approach to a group of 30 healthy controls and 30 depressive in-patients who were on a variety of medications and displayed varying degrees of symptom-severity allowed for high-accuracy single-subject classification. Specifically, integrating biomarkers yielded an accuracy of 83% while the best of the 12 single biomarkers alone classified a significantly lower number of subjects (72%) correctly. Thus, integrated biomarker-based classification of a heterogeneous, real-life sample resulted in accuracy comparable to the highest ever achieved in previous single biomarker research. Furthermore, investigation of the final prediction model revealed that neural activation during the processing of neutral facial expressions, large rewards, and safety cues is most relevant for over-all classification. We conclude that combining brain activation related to the core-symptoms of depression using the multi-source pattern classification approach developed in this work substantially increases classification accuracy while providing a sparse relational biomarker-model for future prediction. N2 - Während depressive Erkrankungen bislang größtenteils auf der Basis von Symptomen auf der Verhaltensebene und den jeweiligen Krankheitsverläufen diagnostiziert werden, hat das Interesse an der Verwendung neurobiologischer Marker bei psychischen Erkrankungen in den letzten Jahren stark zugenommen. Da jedoch die momentan verfügbaren Klassifikationsansätze zumeist auf Informationen eines einzelnen Biomarkers beruhen, ist die Vorhersage von auf der Symptomebene so komplexen Erkrankungen wie Depressionen in der Praxis deutlich erschwert. Dementsprechend konnte keiner der einzelnen bisher untersuchten Biomarker eine Vorhersagegüte erreichen, die für die praktische Anwendung eines solchen Ansatzes im klinischen Alltag ausreichend wäre. Vor diesem Hintergrund schlagen wir deshalb zur Verbesserung der Klassifikationsgüte einen Algorithmus vor, der Messdaten vielfältiger depressionsrelevanter neuronaler Prozesse integriert. Zunächst wurden hierzu die Kernsymptome depressiver Erkrankungen aus standardisierten Klassifikationssystemen ermittelt. Anschließend entwickelten wir drei experimentelle Paradigmen, welche die Messung neuronaler Korrelate der mit den depressiven Kernsymptomen assoziierten psychologischen Prozesse mittels funktioneller Kernspintomographie ermöglichen. Um die resultierenden 12 hochdimensionalen Biomarker zu integrieren, entwickelten wir basierend auf der Kombination von Gauß-Prozess Klassifikatoren und Entscheidungsbäumen einen zweistufigen Mustererkennungsalgorithmus für multiple, hochdimensionale Datenquellen. Dieser Ansatz wurde an einer Gruppe von 30 gesunden Probanden und 30 unterschiedlich schwer betroffenen und unterschiedlich medizierten stationären depressiven Patienten evaluiert. Insgesamt ermöglicht der Ansatz eine hohe Klassifikationsgüte auf Einzelfallebene. Insbesondere die Integration der verschiedenen Biomarker führte zu einer Klassifikationsgüte von 83%, wohingegen die alleinige Klassifikationsgüte der 12 einzelnen Biomarker mit bestenfalls 72% deutlich geringer ausfiel. Somit konnte der entwickelte Klassifikationsansatz in einer heterogenen, im Alltag aber typisch anzutreffenden depressiven Patientenstichprobe, eine Klassifikationsgüte erreichen, die mit der bislang bestmöglichen durch einzelne Biomarker erreichten Klassifikationsgüte in selektiven Einzelstichproben vergleichbar ist. Darüber hinaus zeigte die Analyse des empirischen Prädiktionsmodells, dass die Kombination der neuronalen Aktivität während der Verarbeitung von neutralen Gesichtern, großen monetären Belohnungen und Sicherheitssignalen zur optimalen Gesamtklassifikation führt. Zusammenfassend lässt sich schlussfolgern, dass der im Rahmen dieser Arbeit entwickelte, zweistufige Mustererkennungsalgorithmus für multiple, hochdimensionale Datenquellen die Klassifikationsgüte substantiell verbessert und erstmals die Konstruktion eines effizienten relationalen Biomarker-Modells für zukünftige Vorhersagen ermöglicht. KW - Patientenklassifikation KW - Depression KW - Biomarker KW - Neurobiologie KW - Algorithmus KW - Gauss Prozess Klassifikation KW - Klassifikations- und Regressionsbaum KW - Systematik KW - Automatische Klassifikation KW - Magnetische Resonanz KW - Gaussian Process Classification Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49962 ER - TY - THES A1 - Ruchty, Markus T1 - Sensory basis of thermal orientation in leaf-cutting ants T1 - Sensorische Grundlagen der thermischen Orientierung bei Blattschneiderameisen N2 - Leaf-cutting ants have a highly developed thermal sense which the insects use to regulate the own body temperature and also to optimize brood and fungus development. Apart from the already described temperature guided behaviors inside the nest it is unknown to what extent the ants may use their thermal sense outside the nest. As part of the present thesis, the question was addressed whether leaf-cutting ants (Atta vollenweideri) are able to learn the position of a warm object as landmark for orientation during foraging. Using absolute conditioning, it was shown that ten training trials are sufficient to elicit the association be-tween food reward and the temperature stimulus. In the test situation (without reward) a significantly higher amount of ants preferred the heated site compared to the unheated con-trol. Importantly, thermal radiation alone was sufficient to establish the learned association and served as orientation cue during the test situation (chapter IV). Based on the experi-mental design used in the previous chapter, the localization of thermosensitive neurons, which detect the underlying thermal stimuli, is restricted to the head or the antennae of the ants. The antennal sensillum coeloconicum is a potential candidate to detect the thermal stimuli during the orientation behavior. In chapter V the sensillum coeloconicum of Atta vollenweideri was investigated concerning its gross morphology, fine-structure and the phy-siology of the associated thermosensitive neuron. The sensillum is predominantly located on the apical antennal segment (antennal tip) where around 12 sensilla are clustered, and it has a peg-in-pit morphology with a double walled, multiporous peg. The sensory peg is deeply embedded in a cuticular pit, connected to the environment only by a tiny aperture. The sen-sillum houses three receptor neurons of which one is thermosensitive whereas the sensory modality of the other two neurons remains to be shown. Upon stimulation with a drop in temperature, the thermosensitve neuron responds with a phasic-tonic increase in neuronal activity (cold-sensitive neuron) and shows rapid adaptation to prolonged stimulation. In ad-dition, it is shown that thermal radiation is an effective stimulus for the thermosensitive neuron. This is the first evidence that sensilla coeloconica play an important role during the thermal orientation behavior described in chapter IV. During the test situation of the classic-al conditioning paradigm, the ants showed rapid antennal movements, indicating that they scan their environment in order to detect the heated object. Rapid antennal movements will result in rapid discontinuities of thermal radiation that re-quire thermosensitive neurons with outstanding sensitivity and high temporal resolution. In Chapter VI the question was addressed whether the thermosensitive neuron of the sensilla coeloconica fulfils these preconditions. Extracellular recordings revealed that the neuron is extremely sensitive to temperature transients and that, due to the response dynamics, an estimated stimulus frequency of up to 5 Hz can be resolved by the neuron. Already a tem-perature increase of only 0.005 °C leads to a pronounced response of the thermosensitive neuron. Through sensory adaptation, the sensitivity to temperature transients is maintained over a wide range of ambient temperatures. The discovered extreme sensitivity, the high temporal resolution and the pronounced adaptation abilities are further evidence support-ing the idea that sensilla coeloconica receive information of the thermal environment, which the ants may use for orientation. In order to understand how the ants use their thermal environment for orientation, it is ne-cessary to know where and how thermal information is processed in their central nervous system. In Chapter VII the question is addressed where in the brain the thermal information, specifically received by the thermosensitive neuron of sensilla coeloconica, is represented. By selectively staining single sensilla coeloconica, the axons of the receptor neurons could be tracked into the antennal lobe of Atta vollenweideri workers. Each of the three axons termi-nated in a single functional unit (glomerulus) of the antennal lobe. Two of the innervated glomeruli were adjacent to each other and are located lateral, while the third one was clear-ly separate and located medial in the antennal lobe. Using two-photon Ca2+ imaging of an-tennal lobe projection neurons, the general representation of thermal information in the antennal lobe was studied. In 11 investigated antennal lobes up to six different glomeruli responded to temperature stimulation in a single specimen. Both, warm- and cold-sensitive glomeruli could be identified. All thermosensitive glomeruli were located in the medial half of the antennal lobe. Based on the correlative evidence of the general representation of thermal information and the results from the single sensilla stainings, it is assumed that thermal information received by sensilla coeloconica is processed in the medial of the three target glomeruli. This part of the thesis shows the important role of the antennal lobe in temperature processing and links one specific thermosensitive neuron to its target region (a single glomerulus). In chapter V it was shown that the sensilla coeloconica are clustered at the antennal tip and have an extraordinary peg-in-pit morphology. In the last chapter of this thesis (Chapter VIII) the question is addressed whether the morphology of the sensilla coeloconica predicts the receptive field of the thermosensitive neuron during the detection of thermal radiation. The sensory pegs of all sensilla coeloconica in the apical cluster have a similar orientation, which was not constraint by the shape of the antennal tip where the cluster is located. This finding indicates that the sensilla coeloconica function as a single unit. Finally the hypothesis was tested whether a single sensillum could be direction sensitive to thermal radiation based on its eye-catching morphology. By stimulating the thermosensitive neuron from various angles around the sensillum this indeed could be shown. This is the last and most significant evi-dence that the sensilla coeloconica may be adapted to detect spatially distributed heated objects in the environment during the thermal landmark orientation of ants. N2 - Blattschneiderameisen besitzen einen hochgradig entwickelten Temperatursinn, den sie hauptsächlich zur Regulation ihrer Körpertemperatur, aber auch zur Optimierung der Brut- und Pilzentwicklung einsetzen. Abgesehen von temperaturgesteuerten Verhaltensweisen innerhalb des Nests ist nicht bekannt, ob die Tiere ihren Temperatursinn auch außerhalb des Nests einsetzen können. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird der Frage nachgegan-gen, ob Blattschneiderameisen (Atta vollenweideri) die Position eines warmen Objektes de-tektieren können und ob sie das Objekt anschließend als erlernte Landmarke zur Orientie-rung während des Furagierens nutzen können. Mit Hilfe eines absoluten Konditionierungs-paradigmas konnte gezeigt werden, dass nach zehn Trainingsdurchläufen die Assoziation zwischen Futter und einem thermischem Stimulus von den Tieren gebildet wird. In der unbe-lohnten Testsituation entscheiden sich die signifikant höhere Anzahl der Tiere für die er-wärmte Seite. Alleine die thermische Strahlung des erwärmten Körpers ist bereits ausrei-chend, um die Assoziation zu bilden und während des Tests als Orientierungssignal zu dienen (Kapitel IV). Durch die Art und Weise der Durchführung des Experiments im vorangegangenen Kapitel, konnte der Ort, an dem sich die nötigen thermosensitiven Neurone befinden, auf den Kopf bzw. die Antennen der Tiere beschränkt werden. Aufgrund ihrer Position auf den Antennen gelten die Sensilla coeloconica als potentielle Kandidaten für die Detektion der notwendigen Stimuli während des thermischen Orientierungsverhaltens. In Kapitel V dieser Arbeit wird das Sensillum coeloconicum in Bezug auf seine Morphologie, seine Ultrastruktur und die Physiologie des assoziierten thermosensitiven Neurons untersucht. Sensilla coeloconica be-finden sich hauptsächlich auf dem letzen Antennensegment, der Antennenspitze, in einer Gruppe von bis zu 12 einzelnen Sensillen. Morphologisch kann das Sensillum als Grubensensillum klassifiziert werden und es enthält einem doppelwandigen Zapfen, der von zahlreichen Poren durchzogen ist. Der Zapfen ist tief in eine kutikuläre Grube eingelassen und nur über eine winzige Apertur mit der Umwelt verbunden. Das Sensillum beherbergt drei Rezeptorneurone, von denen eines thermosensitiv ist, während die sensorische Modali-tät der anderen beiden Neurone bis auf weiteres unklar ist. Als Antwort auf eine Abnahme in der Stimulustemperatur generiert das thermosensitive Neuron eine phasisch-tonische Erhö-hung der neuronalen Aktivität (kältesensitives Neuron) und adaptiert sehr schnell an anhaltende Stimulationen. Zusätzlich kann gezeigt werden, dass thermische Strahlung ein wirksa-mer Stimulus für das thermosensitive Neuron ist. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind ein erster Hinweis darauf, dass die Sensilla coeloconica eine wichtige Rolle während des thermischen Orientierungsverhaltens spielen. Bei der klassischen Konditionierung wurden schnelle Antennenbewegungen bei den Ameisen festgestellt, die sich in der Testsituation zwischen dem warmen Objekt und dem Kontrollob-jekt entscheiden mussten. Diese schnellen Bewegungen könnten bedeuten, dass die Tiere Ihre Umgebung nach dem konditionierten warmen Objekt absuchen. Solche schnellen An-tennenbewegungen führen zu schnellen Temperaturänderungen und die Detektion dieser Stimuli setzt thermosensitive Neurone mit besonderer Sensitivität und erhöhtem zeitlichen Auflösungsvermögen voraus. In Kapitel VI wird untersucht, ob das thermosensitive Neuron der Sensilla coeloconica diese Voraussetzungen erfüllt. Extrazelluläre Ableitungen zeigen, dass das Neuron extrem sensitiv auf Temperaturänderungen reagiert und dass aufgrund der Antwortdynamik Stimulationsfrequenzen von bis zu fünf Hertz aufgelöst werden können. Schon eine Temperaturänderung von 0.005 °C führt zu einer ausgeprägten Antwort des thermosensitiven Neurons. Durch sensorische Adaption bleibt diese erhöhte Sensitivität über einen großen Umgebungstemperaturbereich erhalten. Die außergewöhnliche Sensitivi-tät, die hohe zeitliche Auflösung sowie die Adaptionsfähigkeit des thermosensitiven Neurons sind weitere Hinweise darauf, dass die Sensilla coeloconica in der Lage sind Stimuli zu rezi-pieren, welche zur thermischen Orientierung genutzt werden könnten. Um zu verstehen, wie sich die Tiere anhand ihrer thermischen Umwelt orientieren, ist es nötig zu wissen, wo im Zentralnervensystem die thermische Information prozessiert wird. In Kapitel VII wird analysiert, in welchem Bereich des Gehirns die thermische Information der Sensilla coeloconica repräsentiert ist. Mittels selektiver Färbung einzelner Sensilla coeloconica können die Axone der Rezeptorneurone im Gehirn verfolgt werden. Jedes der drei Axone endet in jeweils einer funktionellen Einheit (Glomerulus) im Antennallobus. Zwei der innervierten Glomeruli sind direkt benachbart und liegen im lateralen Teil des Antennallobus während der dritte Glomerulus im medialen Bereich zu finden ist. Mit Hilfe von zwei-Photonen Ca2+ Imaging der Projektionsneurone wurde die Repräsentation von thermischer Information im Antennallobus untersucht. In 11 untersuchten Antennalloben antworten bis zu sechs einzelne Glomeruli auf die Temperaturstimulation. Sowohl warm- als auch kalt-sensitive Glomeruli konnten identifiziert werden. Alle thermosensitiven Glomeruli tende Stimulationen. Zusätzlich kann gezeigt werden, dass thermische Strahlung ein wirksa-mer Stimulus für das thermosensitive Neuron ist. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind ein erster Hinweis darauf, dass die Sensilla coeloconica eine wichtige Rolle während des thermischen Orientierungsverhaltens spielen. Bei der klassischen Konditionierung wurden schnelle Antennenbewegungen bei den Ameisen festgestellt, die sich in der Testsituation zwischen dem warmen Objekt und dem Kontrollob-jekt entscheiden mussten. Diese schnellen Bewegungen könnten bedeuten, dass die Tiere Ihre Umgebung nach dem konditionierten warmen Objekt absuchen. Solche schnellen An-tennenbewegungen führen zu schnellen Temperaturänderungen und die Detektion dieser Stimuli setzt thermosensitive Neurone mit besonderer Sensitivität und erhöhtem zeitlichen Auflösungsvermögen voraus. In Kapitel VI wird untersucht, ob das thermosensitive Neuron der Sensilla coeloconica diese Voraussetzungen erfüllt. Extrazelluläre Ableitungen zeigen, dass das Neuron extrem sensitiv auf Temperaturänderungen reagiert und dass aufgrund der Antwortdynamik Stimulationsfrequenzen von bis zu fünf Hertz aufgelöst werden können. Schon eine Temperaturänderung von 0.005 °C führt zu einer ausgeprägten Antwort des thermosensitiven Neurons. Durch sensorische Adaption bleibt diese erhöhte Sensitivität über einen großen Umgebungstemperaturbereich erhalten. Die außergewöhnliche Sensitivi-tät, die hohe zeitliche Auflösung sowie die Adaptionsfähigkeit des thermosensitiven Neurons sind weitere Hinweise darauf, dass die Sensilla coeloconica in der Lage sind Stimuli zu rezipieren, welche zur thermischen Orientierung genutzt werden könnten. KW - Neurobiologie KW - Temperatur KW - Orientierung KW - Neurobiologie KW - soziale Insekten KW - Elektrophysiologie KW - Infrared radiation KW - thermal orientation KW - social insects KW - imaging KW - neurobiology Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48906 ER - TY - THES A1 - Maier-Peuschel, Monika T1 - Characterization of allosteric mechanisms on the M2 and M4 mACh receptor using the FRET-technique T1 - Charakterisierung allosterischer Mechanismen am M2 und M4 mACh Rezeptor unter Anwenduntg der FRET-Technik N2 - Allosteric modulators have been proposed as promising new compounds to modify protein function. Allosteric binding sites have been discovered for several G-protein-coupled receptors, including M1-5 muscarinic receptors. Since these receptors play a pivotal role in the regulation of a plethora of organ functions, it is particularly important to investigate the mechanisms of allosteric modulation. To study molecular mechanisms of allosteric modulation in the M2 muscarinic receptor, a new FRET-based sensor was designed. CFP fused to the C-terminus of the receptor and a small fluorescent compound FlAsH, which labels a specific binding sequence in the third intracellular loop, were used as donor and acceptor fluorophores, respectively. The first part of the study was to design a functional FRET receptor sensor. After several optimization steps the constructs FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP and HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP were generated which showed good cell-surface expression, robust changes in FRET and the ability to deliver reproducible data. The second part of this thesis sought to elucidate the mechanisms of the allosteric ligand binding and their effects on the receptor conformation. The described modifications, which were introduced in the wild type M2 mAChR to create the FRET sensor can alter receptor functionality and influence receptor expression. Radioligand binding studies revealed that the used transfection method provided sufficient receptor expression but, unfortunately, about 60 % of the FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP receptor remains in the cytosol. However, this was sufficient to perform FRET experiments. Patch clamp GIRK-measurements with acetylcholine evinced that the new M2-sensor was able to activate Gi-proteins. Also, radioligand-binding assays with the second construct HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP showed ligand affinity comparable to the wildtype receptor. Furthermore inhibition of forskolin-stimulated cAMP production was indistinguishable from the behaviour of the wildtype receptor. According to that, the full functionality of both receptor constructs could be confirmed. FRET measurements with the full muscarinic receptor agonists carbachol and acetylcholine confirmed that the FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP receptor construct showed rapid changes in FRET upon addition of both ligands, which were concentration-dependent. Concentration response curves and the resulting EC50 values of both agonists were similar to those already published in literature. In addition, the orthosteric antagonists atropine and methoctramine inhibited the FRET changes induced by the agonists. This inhibition was significantly faster than the washout kinetics, pointing to an active displacement of the agonists by the antagonists. Allosteric ligands gallamine, tacrine and dimethyl-W84 did not alter receptor conformation when added without an orthosteric ligand. However, when applied in addition to muscarinic agonists, all three substances inhibited the FRET-signal. The extent of this inhibition was dependent on the used concentration of the allosteric ligands. These results reveal that conformational changes brought about by allosteric ligands can be measured with the FRET technique. Furthermore real-time FRET-based kinetic measurements could be performed in living cells and showed that the allosteric ligands gallamine and dimethyl-W84 alter receptor conformation significantly faster than the antagonists atropine and methoctramine. This data indicate that allosteric ligands actively induce the conformational changes in the receptor. N2 - Allosterische Modulatoren, welche es ermöglichen die Funktionen einiger Proteine zu verändern, scheinen eine vielversprechende neue Substanzgruppe zu sein. Bereits bei mehreren GPCR konnten allosterische Bindungsstellen identifiziert werden, so auch in der Gruppe der muscarinischen Acetylcholin-Rezeptoren. Da gerade diese Rezeptorgruppe eine große Rolle im Organismus spielt und dort viele verschiedene Organfunktionen beeinflusst, stellt das Aufdecken der Mechanismen allosterischer Liganden gerade hier ein wichtiges Ziel dar. Um die Mechanismen allosterischer Bindung am M2-muscarinergen Rezeptor auf molekularer Ebene zu untersuchen, wurde ein FRET-Rezeptor Sensor hergestellt. Die GFP-Mutante CFP wurde dazu mit dem C-terminalen Ende des Rezeptors verbunden, und die Bindungssequenz für das FlAsH-Molekül, ein sogenannter Hairpin-binder, wurde in die Aminosäuresequenz der dritten intrazellulären Schleife eingebracht. Diese beiden Fluorophore fungieren als Donor und Akzeptorpaar im FRET-Sensor-Konstrukt. Da es bis jetzt keine Daten zu einem solchen muscarinischen FRET-Rezeptor-Sensor gibt, musste zunächst ein funktionelles Konstrukt erstellt werden. Nach Optimierung von Expression und FRET-Signalstärke gelang es mit den Konstrukten FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP und HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP zwei Sensoren herzustellen, welche den nötigen Anforderungen entsprechen. Im zweiten Teil der Doktorarbeit sollten dann die Mechanismen der allosterischen Rezeptormodifikatoren genauer beleuchtet werden. Durch die extensive Modifikation am M2 mAChR Konstrukt musste zunächst, die Funktionalität des Rezeptors sichergestellt werden. Durch Radioliganden-Bindungs-Experimente stellte sich heraus, dass nach Transfektion der Rezeptor sehr gut in der Zelle exprimiert wird, doch zu 60% im Zellinneren verbleibt. Dies reichte jedoch aus, um FRET-Experimente durchzuführen. Messungen mit der Patch-Clamp Methode zeigten, dass der M2-Rezeptor Sensor in der Lage ist, Gi-Proteine zu aktivieren. Außerdem zeigten Radioliganden Bindungs Assays, dass die Liganden Affinität des zweiten Konstruktes HA-FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP vergleichbar mit der des Wildtyp-Rezeptors ist. Desweiteren ist das Konstrukt weiterhin in der Lage das FRET-Signal von Forskolin-stimulierten cAMP zu inhibieren. Somit scheint die Funktionalität beider Rezeptorkonstrukte, trotz Modifikationen, erhalten geblieben zu sein. FRET-Experimente unter Zugabe der Agonisten Acetylcholin und Carbachol zeigten auf, dass das FLAG-M2-sl3-FlAsH-GSGEG-CFP Rezeptor-Konstrukt konzentrationsabhängige und schnelle Änderungen des FRET-Signals aufweist. Auch die dabei ermittelten Werte der Konzentrations-Wirkungs-Kurven stimmten mit bereits veröffentlichten Werten überein. Die Antagonisten Atropin und Methoctramin führten zu einer Blockade des durch den Agonisten induzierten Signals, welches gleichzeitig schneller als das Auswaschen des Agonisten war. Alleinige Zugabe der gewählten allosterischen Liganden, Gallamin, Tacrin und Dimethyl-W84 änderte das FRET-Signal nicht. Erst durch vorherige Stimulation mit einem orthosterischen Agonisten waren sie in der Lage, das FRET-Signal des Agonisten zu blockieren. Die Stärke dieser Inhibition hing von der Konzentration des jeweiligen allosterischen Liganden ab. Diese Ergebnisse offenbaren, dass die Konformationsänderungen des Rezeptors nach Zugabe eines allosteren Liganden mit der FRET-Methode gemessen werden kann. Darüber hinaus konnte durch kinetische Messungen aufgedeckt werden, dass die allosteren Liganden Gallamin und W84 die Konformation des Rezeptors schneller ändern, als die Antagonisten Atropin und Methoctramin. Dieses Ergebnis bekräftigt die Annahme, dass allosterische Liganden aktiv eine bestimmte Konformationsänderung des Rezeptors herbeiführen. KW - Allosterie KW - Acetylcholinrezeptor KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - muskarinische Rezeptoren KW - muscarinic m ACh receptors Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49237 ER - TY - THES A1 - Bender, Markus T1 - Studies on platelet cytoskeletal dynamics and receptor regulation in genetically modified mice T1 - Untersuchungen zur Zytoskelettdynamik und Rezeptorregulation in Blutplättchen genetisch modifizierter Mäuse N2 - Blutplättchen werden von Megakaryozyten im Knochenmark in einem Prozess produziert, an dem Aktin beteiligt ist. Aktin-Depolymerisierungsfaktor (ADF) und Cofilin sind Aktin-bindende Proteine, die als entscheidende Regulatoren im Aktinumsatz agieren, indem sie das Schneiden und Depolymerisieren von Filamenten unterstützen. Die Bedeutung von ADF/Cofilin und des Aktinumsatzes in der Bildung von Blutplättchen ist gegenwärtig nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden Mäuse untersucht, die eine konstitutive ADF-Defizienz und/oder die eine konditionale n-Cofilin Defizienz (Cre/loxP) aufweisen. Um Cofilin nur in Megakaryozyten und Blutplättchen auszuschalten, wurden Cofilinfl/fl Mäuse mit PF4-Cre Mäusen verpaart. ADF- oder n-Cofilin-defiziente Mäuse hatten keinen oder nur einen geringen Phänotyp in Blutplättchen. Eine Defizienz von ADF und n-Cofilin führte hingegen zu einem beinahe kompletten Verlust der Blutplättchen, was mit Defekten in der Bildung von Plättchenzonen in Knochenmark-Megakaryozyten einherging. Weitere Untersuchungen an in vitro und ex vivo kultivierten Megakaryozyten zeigten eine Reduzierung der Bildung von Proplättchen und das Fehlen der typischen Verdickungen der Proplättchen. Diese Daten zeigen redundante aber essentielle Funktionen von ADF und n-Cofilin im terminalen Schritt der Plättchenbildung in vitro und in vivo, und belegen erstmals eine wichtige Rolle des Aktinumsatzes in diesem Prozess. Im zweiten Teil dieser Dissertation wurden die Mechanismen untersucht, die für die zelluläre Regulierung des Hauptkollagenrezeptors auf Blutplättchen, Glykoprotein VI (GPVI), verantwortlich sind. Nach einer Gefäßwandverletzung wird subendotheliales Kollagen freigelegt, wodurch GPVI die Aktivierung von Blutplättchen vermittelt, und damit zur Blutstillung (Hämostase), aber auch zum Verschluss eines verletzten Gefäßes beitragen kann, was letztendlich zu einem Myokardinfarkt oder einem Schlaganfall führen kann. Deshalb ist GPVI ein attraktives Zielprotein für eine anti-thrombotische Therapie, insbesondere weil frühere Studien gezeigt haben, dass anti-GPVI Antikörper eine irreversible Herunterregulierung des Rezeptors auf zirkulierenden Blutplättchen mittels Internalisierung und Abspaltung induzieren. Es wird vermutet, dass Metalloproteinasen der ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain) - Familie das Abspalten vermitteln, jedoch fehlt in vivo der Beweis dafür. Um die Mechanismen des Abspaltungsprozesses des GPVI Rezeptors in vivo besser verstehen zu können, wurden zwei Mauslinien, GPVI- und konditionale ADAM10-defiziente Mäuse, generiert und zusätzlich sogenannte „low TACE (TNFalpha converting enzyme)“ Mäuse analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass GPVI in vitro von ADAM10 oder TACE in Abhängigkeit der Signalwege, die zum Abspalten des Rezeptors führen, geschnitten werden kann. Darüberhinaus wurde GPVI in vivo nach Antikörperverabreichung in ADAM10-defizienten Mäusen und „low TACE“ Mäusen herunterreguliert, was vermuten lässt, dass entweder beide Metalloproteinasen an diesem Prozess beteiligt sind oder noch eine zusätzliche Metalloproteinase für die GPVI Regulation in vivo verantwortlich ist. N2 - Platelets are produced by bone marrow megakaryocytes in a process involving actin dynamics. Actin-depolymerizing factor (ADF) and cofilin are actin-binding proteins that act as key regulators in actin turnover by promoting filament severing and depolymerization. The overall significance of ADF/cofilin function and actin turnover in platelet formation is presently unclear. In the first part of this thesis, platelet formation and function were studied in mice constitutively lacking ADF and/or mice with a conditional deficiency (Cre/loxP) in n-cofilin. To delete cofilin exclusively in megakaryocytes and platelets, cofilinfl/fl mice were crossed with PF4 (platelet factor 4)-Cre mice. While a single-deficiency in ADF or n-cofilin resulted in no or only a minor platelet formation defect, respectively, a double-deficiency in ADF and n-cofilin led to an almost complete loss of platelets. Bone marrow megakaryocytes of ADF/n-cofilin-deficient mice showed defective platelet zone formation. Interestingly, in vitro and ex vivo megakaryocyte differentiation revealed reduced proplatelet formation and absence of platelet-forming swellings. These data establish that ADF and n-cofilin have redundant but essential roles in the terminal step of platelet formation in vitro and in vivo. In the second part of the thesis, mechanisms underlying cellular regulation of the major platelet collagen receptor, glycoprotein VI (GPVI), were studied. GPVI mediates platelet activation on exposed subendothelial collagens at sites of vascular injury, and thereby contributes to normal hemostasis but also to occlusion of diseased vessels in the setting of myocardial infarction or stroke. Thus, GPVI is an attractive target for anti-thrombotic therapy, particularly because previous studies have shown that anti-GPVI antibodies induce irreversible down-regulation of the receptor in circulating platelets by internalization and ectodomain shedding. Metalloproteinases of the ADAM (a disintegrin and metalloproteinase domain) family are suspected to mediate this ectodomain shedding, but in vivo evidence for this is lacking. To study the mechanism of GPVI regulation in vivo, two mouse lines, Gp6 knock-out and Adam10fl/fl, PF4-Cre mice, were generated and in addition low TACE (TNFalpha converting enzyme) mice were analyzed. It was shown that GPVI can be cleaved in vitro by ADAM10 or TACE depending on the shedding-inducing signaling pathway. Moreover, GPVI was down-regulated in vivo upon antibody injection in ADAM10-deficient and low TACE mice suggesting that either both or an additional metalloproteinase is involved in GPVI regulation in vivo. KW - Zellskelett KW - Thrombozyt KW - Metalloproteinasen KW - Actin-bindende Proteine KW - Platelets KW - Cytoskeleton KW - Metalloproteases KW - Actin binding proteins Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48390 ER - TY - THES A1 - von Hayn, Kathrin T1 - Untersuchungen zur Ca2+-abhängigen Regulation von cAMP in intakten vaskulären Myocyten T1 - Analysis of the Ca2+-dependent regulation of cAMP in intact vascular smooth muscle cells N2 - Die Regulation des Tonus glatter Muskelzellen wird entscheidend von den beiden antagonistisch wirkenden second messengern cAMP und Ca2+ beeinflusst. Ein Ziel dieser Arbeit war herauszufinden, ob diese beiden Botenstoffe auch direkten Einfluss aufeinander haben können und welche Enzyme in diesem Fall an den Prozessen beteiligt sind. cAMP-Signale in intakten Zellen konnten wir in Echtzeit mit Hilfe des FRET-basierten cAMP-Sensors Epac1-camps beobachten; Ca2+-Signale durch Markieren der Zellen mit Fura-2. Anstiege der intrazellulären Ca2+-Konzentration in VSMCs wurden durch Aktivierung von endogen exprimierten, Gq-gekoppelten P2Y6-Rezeptoren mit Uridindiphosphat (UDP) ausgelöst. Durch eine zusätzliche in-vitro Kalibrierung des Epac1-camps konnten darüber hinaus absolute cAMP-Konzentrationen in einzelnen lebenden Zellen berechnet werden. Während ein Anstieg der Ca2+-Konzentration auf nicht vorstimulierte VSMCs keinen signifikante Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Konzentrationen hatte, bewirkte die Aktivierung der purinergen Rezeptoren einen deutlichen Rückgang der intrazellulären cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs. Dieser Effekt konnte sowohl durch die Komplexierung von Ca2+ mit BAPTA-AM als auch durch die Überexpression der Ca2+-insensitiven AC4 antagonisiert werden. Adenylatcyclase-Aktivitäts-Assays in VSMC-Membranen zeigten ebenfalls einen Rückgang der Cyclaseaktivität nach Zugabe von 2 und 5 μM freiem Ca2+. Die Hemmung der einzigen Ca2+-regulierbaren PDE1 mit dem selektiven PDE1-Inhibitor 8-Methoxymethyl-IBMX (8-MM-IBMX) hatte im Gegensatz dazu keinen Einfluss auf die durch UDP verursachte Änderung der cAMP-Konzentration in vorstimulierten VSMCs. Schließlich bewirkte die Herunterregulation der Ca2+-inhibierbaren AC5 und 6 mit siRNA einen signifikante Hemmung des durch UDP verursachten Effekts. Fasst man alle diese Ergebnisse zusammen, so lässt sich folgende Schlussfolgerung ziehen: Der durch purinerge Stimulation verursachte Rückgang der cAMP-Konzentration in mit Isoproterenol vorstimulierten VSMCs wird durch eine Hemmung der Ca2+-hemmbaren AC5 und 6 vermittelt. Dadurch sind zwei für die Regulation des Tonus wichtige Signalwege in VSMCs miteinander verbunden, die sich somit gegenseitig entscheidend beeinflussen können. Ein weiterer Bestandteil dieser Arbeit war die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, das glattmuskelspezifisch den cAMP-Sensor Epac1-camps exprimiert. Mit Hilfe eines solchen Tiermodells könnten in Zukunft cAMP-Änderungen in intakten Geweben und vielleicht sogar in lebenden Tieren beobachtet werden. Durch Anwendung des Cre-loxP-Rekombinationssystems gelang es eine glatt¬muskelspezifische, für den Epac1-camps transgene Mauslinie zu generieren. Mit isolierten VSMCs dieser Tiere konnten bereits erste FRET-Messungen durchgeführt und agonistinduzierte cAMP-Änderungen beobachtet werden. N2 - Regulation of smooth muscle tone is crucially determined by the antangonistic second messengers cAMP and Ca2+. One aim of this work was to investigate, if these two mediators can also affect each other directly and which enzymes take part in these processes. For observing cAMP signals in living cells with a temporally high resolution, we used the fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based cAMP sensor Epac1-camps. For monitoring changes in intracellular Ca2+, cells were labeled with Fura-2. Rises in intracellular Ca2+ were achieved by activation of on vascular smooth muscle cells (VSMCs) endogenously expressed Gq-coupled P2Y6 receptors with uridine diphosphate (UDP). Additional, in-vitro calibration of the Epac1-camps allowed the calculation of absolute cAMP concentrations in single living cells. An increase of Ca2+ concentrations in non-prestimulated VSMCs did not significantly influence intracellular cAMP concentrations. Activation of purinergic receptors of isoproterenol-prestimulated cells with UDP provoked a clear decrease of intracellular cAMP concentrations. This effect was blocked by the complexation of Ca2+ with BAPTA-AM as well as by overexpression of Ca2+-insensitive AC4. Furthermore, adenylyl cyclase activity assays in the presence of 2 and 5 μM free Ca2+ in VSMC membranes showed a decline in cyclase activity. Inhibition of PDE1, the only Ca2+-dependent phosphodiesterase (PDE), with the selective PDE1 inhibitor 8-methoxymethy-IBMX, in contrast, had no effect on UDP-evoked changes in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. Finally, knockdown of Ca2+-inhibitable AC5 and 6 with siRNA significantly inhibited the UDP-evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs. To merge all these results, one can draw the following conclusion: The purinergically evoked decrease in cAMP concentrations in isoproterenol-prestimulated VSMCs is caused by an inhibition of AC5 and 6 which is mediated by Ca2+. This mechanism interlinks two essential antagonistic signaling pathways for the regulation of smooth muscle tone. An additional part of this work was to develop a transgenic mouse model, which expresses smooth-muscle-specifically Epac1-camps. In the future, these animals could provide the possibility to observe cAMP signals in intact tissues or even in living animals. With the help of the Cre-loxP recombination system, we achieved to generate such a smooth-muscle-specific transgene. Afterwards FRET measurements in isolated vascular smooth muscle cells of these animals were possible and we were also able to observe agonist-induced cAMP changes in these isolated cells. KW - Glatte Muskulatur KW - Cyclo-AMP KW - Calcium KW - Calcium KW - cAMP KW - vaskuläre glatte Muskelzellen KW - FRET KW - calcium KW - cAMP KW - vascular smooth muscle cells KW - FRET Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47709 ER -