TY - THES A1 - Karatas-Wulf, Emine Ufuk T1 - Proteinkinase C (PKC) vermittelte Oberflächenexpression von Glutamattransportern in kultivierten zerebellären Körnerzellen der Maus T1 - Protein kinase C-dependent trafficking of glutamate transporters GLT1v (EAAT2b) and EAAC1 in cultured cerebellar granule cells depends on their electrophysiologic state N2 - Der Glutamattransporter GLT1v, eine Spleißvariante von GLT1, kommt hauptsächlich im Zytoplasma von Neuronen vor. Es wurde gezeigt, dass GLT1v ein putatives PDZDomänen- Bindungsmotiv am C-Terminus enthält und mit PICK1, ein mit PKC interagierendes Protein, interagiert. Es ist daher denkbar, dass durch Interaktion zwischen GLT1v und PICK1 die GLT1v-Translokation über eine PKC-abhängigen Phosphorylierung reguliert wird. In der vorliegenden Untersuchung wurden kultivierte zerebelläre Körnerzellen aus der Maus benutzt, um mittels Immunzytochemie und Biotinilierung/Westernblot zu zeigen, ob eine GLT1v-Translokation über einen PKC-abhängigen Signalweg reguliert wird und sollte dies der Fall sein, ob diese Regulation vom elektrophysiologischen Status der zerebellären Körnerzellen abhängt. Vergleichstudien wurden mit EAAC1 durchgeführt. Die Körnerzellen wurden in einem Medium mit 27 mM KCl (chronisch depolarisierte Körnerzellen) und mit 5 mM KCl (ruhende Körnerzellen) kultiviert. Eine 30 minütige PKC-Aktivierung durch Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) ergab in ruhenden Körnerzellen eine 41 % bzw. 31 % (signifikante) Zunahme in der Zelloberflächenexposition von GLT1v bzw. EAAC1 im Vergleich zur Kontrolle. Vergleicht man Körnerzellen nach PMA- mit solchen nach 30 minütiger Staurosporinbehandlung (PKC-Inhibitor), so beträgt die Oberflächenzunahme nach der PMA-Behandlung bei GLT1v bzw. EAAC1 115% bzw. 69%. Zerebelläre Körnerzellen, die mit 27 mM KCl kultiviert wurden (chronische Depolarisation), ergaben demgegenüber keine signifikanten Änderungen in der Oberflächenexpression von GLT1v und EAAC1, beim Vergleich der verschiedenen experimentellen Bedingungen (PMA, Staurosporin). Die immunzytochemischen Untersuchungen ergaben, dass bei ruhenden Körnerzellen (5mM KCl) nach PKC-Aktivierung mittels PMA zahlreiche, große Varikositäten (präsynaptische Elemente der Neuriten) auftreten, die eine intensive Immunreaktivität für GLT1v und EAAC1 zeigen. Wir konnten auch nachweisen, dass beide Transporter in getrennten Vesikelpopulationen vorkommen. Die Immunelektronenmikroskopie am Kleinhirn der adulten Maus hat ergeben, dass GLT1v und EAAC1 in Varikositäten der Parallelfasern von Körnerzellen lokalisiert sind. Dieses in situ Ergebnis stimmt somit mit den kultivierten Körnerzellen überein. Insgesamt lassen die Untersuchungen den Schluss zu, dass die Oberflächenexpression von GLT1v und EAAC1 (1) ähnlich reguliert zu werden scheint, (2) in Varikositäten von glutamatergen Körnerzellen stattfindet, aus denen Glutamat freigesetzt wird, und (3) vom elektrophysiologischen Status der zerebellären Körnerzellen abhängt. N2 - The glutamate transporter GLT1v, a splice variant of GLT1, is present mainly in the cytoplasm of neurons. It is shown that GLT1v contains a putative PDZ domain binding motif and interacts with PICK1, a protein kinase C (PKC) interacting protein. The interaction between GLT1v and PICK1 could regulate trafficking of GLT1v via PKC dependent phosphorylation. In the present study we used cultured cerebellar granule cells (CGCs) from mice to demonstrate, applying immunocytochemistry and biotinylation/ Western blotting, whether GLT1v trafficking is regulated by PKC and if so, whether this depends on the electrophysiologic state of CGCs. Comparative studies were performed with EAAC1. The CGCs were cultured in high-potassium medium (chronic depolarization of CGCs) and in low-potassium medium (resting CGCs). Stimulation of PKC by phorbolester resulted in resting CGCs in a 41% and 31% (significant) increase of cell surface localization of GLT1v and EAAC1, respectively, compared to controls, and a 115% and 69% increase, respectively, compared to staurosporine inhibition. No significant changes were observed in chronically depolarizing CGCs. In resting CGCs stimulation of PKC enhanced the formation of large varicosities in neurites showing intense immunoreactivity for GLT1v and EAAC1. We showed also that both transporters were contained in different vesicle populations, and were localized in situ in varicosities of CGC parallel fibres. These findings provide evidence that the surface exposition of GLT1v and EAAC1 (1) seems to be similarly regulated, (2) takes place in varicosities of glutamatergic CGCs, where glutamate is thought to be released, and (3) depends on the electrophysiologic state of CGCs. KW - GLT1v KW - EAAC1 KW - PKC KW - zerebelläre Körnerzellen KW - GLT1v KW - EAAC1 KW - PKC KW - zerebelläre Körnerzellen KW - GLT1v KW - EAAC1 KW - PKC KW - cerebellar granule cells Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23993 ER - TY - THES A1 - Al-Khatib, Mohammed T1 - Die pterygospinösen Strukturen beim Menschen und anderen Primaten T1 - The pterygospinous Structures in Human and other Primates N2 - Die pterygospinösen Strukturen zwischen Lamina lateralis des Processus pterygoideus und einer Spina ossis sphenoidalis können in unterschiedlicher Ausprägung vorliegen. Meist ist ein Ligamentum pterygospinosum, gelegentlich ein Arcus osseus oder ein Musculus pterygospinosus vorhanden. In einzelnen Fällen können mehrere Varianten parallel vorliegen. Die knöchernen Verbindengen kommen bei Altweltaffen immer vor, beim Menschen nur noch vereinzelt. Diese Strukturen können einen operativen lateralen Zugang zur Tiefe der Fossa infratemporalis behindern. Durch radiologische Methoden können präoperativ die pterygospinösen Strukturen dargestellt werden. N2 - The ptergyspinous complex is found as a muscle or a ligament or as an osseus arc between the lateral lamina of the ptergoid process and the sphenoid spina. Old world monkeys always have an osseus arc, in new world monkeys and human an osseus arc is only found in some cases. The pterygospinous structures can hinder a surgical lateral approach to the depth of the infratemporal fossa. Radiological methods can help to seek such bars before the surgical intervention. KW - pterygospinöse Strukturen KW - pterygospinöser Komplex KW - Musculus und Ligamentum pterygospinosus KW - pterygospinous complex KW - pterygoalar bars KW - pterygospinous muscle or ligament Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22163 ER - TY - THES A1 - Kroiß, Matthias T1 - Die subzelluläre Verteilung des Regulatorproteins RS1 in Nierenepithelzellen T1 - The sucbcellular distribution of the regulatory protein RS1 in renal epithelial cells N2 - Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazelluläre Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antikörper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden dafür erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellulär an Vesikeln sowie an einem perinukleären Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukleären Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde überwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erhöht und gegenläufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit früher gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schlüssigen Konzept zusammenführt. N2 - RS1 is a negative regulator of solute transporters such as the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 on the transcriptional and posttranscriptional level. RS1 has been shown to reduce SGLT1-mediated substrate uptake upon coexpression in Xenopus oocytes. This effect is paralleled by decreased membrane surface area and can be counteracted by coexpressed dominant negative dynamin. In this study, I used immunofluorescence microscopy to determine the subcellular distribution of RS1 and SGLT1 in two renal epithelial cell lines (HEK293, LLC-PK1) that express RS1 and SGLT1 endogenously. I found that RS1 was present i) at the plasma membrane, ii) within the nucleus, iii) in small vesicles and iv) at the trans-Golgi network (TGN). At the TGN, RS1 was colocalized with clathrin and dynamin. Incubation of cells with brefeldin A abolished the association of RS1 with the TGN. SGLT1 was likewise present at the TGN although the majority of SGLT1 resided in elongated endosomes. The presence of both RS1 and SGLT1 at the TGN suggests that their functional interaction may involve adaptor proteins such as the Golgi localized, gamma-ear-containing, Arf binding (GGA) proteins. Indeed, RS1 contains a unique acidic cluster dileucine motif on its ubiquitin binding associated (UBA) domain, which we found by 3D modeling to be exposed to the surface of RS1. Taken together with previous data, this study leads to a testable model of RS1 function on the posttranscriptional level. KW - Glucose KW - Transporter KW - Regulation KW - Niere KW - Zellkultur KW - glucose KW - transporter KW - regulation KW - kidney KW - cell culture Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20712 ER - TY - THES A1 - Shatskaya, Natalia T1 - Identification of amino acids within the substrate binding region of organic cation transporters (OCTZs) that are involved in binding of corticosterone T1 - Identifizierung der Aminosaüren in der Substratbindungstelle der organischen Kationentransporter, die in Kortikosteronbindung involviert sind N2 - The polyspecific organic cation transporters (OCT) are involved in the elimination and distribution of drugs, environmental toxins, and endogenous organic cations including monoamine neurotransmitters. Steroid hormones inhibit organic cation transport by the three OCT subtypes with different affinities showing distinct species difference; for example, the IC50 values for corticosterone inhibition of cation uptake by transporters rOCT1 and rOCT2 are ~150μM and ~4 μM, respectively. By introducing domains and amino acids from rOCT2 into rOCT1, we identified three amino acids in the presumed 10th TMD of rOCT2 which are responsible for the higher affinity of corticosterone in comparison to rOCT1. This is the first study which revealed the components of the binding site for corticosterone in OCTs. The evidence is presented that these amino acids (alanine 443, leucine 447, and glutamine 448 in rOCT1 and isoleucine 443, tyrosine 447, and glutamate 448 in rOCT2) are probably located within the substrate binding region of OCTs since the affinity of transported cations was increased together with the affinity of corticosterone. In the double mutant rOCT1(L447Y/Q448E) the IC50 value for the inhibition of [3H]MPP (0.1 μM) uptake by corticosterone (24 ± 4 μM) was significantly higher compared to the IC50 value for inhibition of [14C]TEA (10 μM) uptake (5.3 ± 1.7 μM), indicating an allosteric interaction between transported substrate and corticosterone. The data suggest that more than one compound can bind simultaneously to the substrate binding region. These results confirm previous suggestion that binding of substrates and inhibitors to OCTs involves interaction with a comparatively large surface that may include multiple binding domains rather than with a structurally restricted single binding site. N2 - Die polyspezifischen Transporter für organische Kationen (OCT) spielen eine wichtige Rolle bei der Ausscheidung von Medikamenten, Toxinen und endogenen organischen Kationen, zu denen auch monoamine Neurotransmitter gehören. Der durch OCT vermittelte Transport von organischen Kationen kann von Steroidhormonen gehemmt werden, die für drei OCT Subtypen deutlich unterschiedliche Affinität aufweisen: Zum Beispiel, IC50 Werte der Hemmung des Transportes von organischen Kationen durch Corticosteron betragen ~ 150 μM für rOCT1 und ~ 4 μM für rOCT2. Mithilfe des Austausches von rOCT1 Domänen und einzelnen Aminosäuren gegen die entsprechenden Elemente des rOCT2 Moleküls haben wir in der 10th TMD von rOCT2 drei Aminosäuren identifiziert, die für die höhere Affinität des rOCT2 Transporters zu Corticosteron verantwortlich sind. In dieser Arbeit wurden zum ersten Mal die Aminosäuren identifiziert, die zu der Bindungsstelle eines OCT Transporters für Corticosteron gehören. Die Ergebnisse der Untersuchungen deuten darauf hin, dass diese drei Aminosäuren (Alanin 443, Leucin 447 und Glutamin 448 in rOCT1 und Isoleucin 443, Tyrosin 447 und Glutamat 448 in rOCT2) hochwahrscheinlich in der ubstratbindungstasche von OCT liegen, da zusammen mit der Erhöhung der Affinität zu Corticosteron stieg auch die Affinität zu transportierenden Substraten. Für die doppelte Mutante rOCT1(L447Y/Q448E) unterscheiden sich die IC50 Werte für die Hemmung des [3H]MPP (0,1 μM) und des [14C]TEA (10 μM) Transportes durch Corticosteron um Faktor 4 (24 ± 4 μM bzw. 5,3 ± 1,7 μM), was eine allosterische Interaktion zwischen transportierenden Substraten und Corticosteron vermuten lässt. Die Daten deuten darauf hin, dass mehr als eine Substanz sich gleichzeitig an die Substratbindungsregion binden kann. Die gewonnenen Erkenntnisse bestätigen unsere vorigen Vorstellungen, dass die Bindung von Substraten und Hemmstoffen zu OCT die Interaktion mit der relativ großen Oberfläche des Proteins vorsieht, die vermutlich nicht auf eine einzige Bindungsstelle beschränkt ist, sondern eher mehrere Bindungsdomäne. KW - Kation KW - Ionentransport KW - Bindestelle KW - Corticosteroide KW - Aminosäuren KW - OCT KW - corticosterone KW - mutationen KW - OCT KW - corticosterone KW - mutation analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20430 ER - TY - THES A1 - Elfeber, Katrin T1 - Immunologischer Nachweis des Natrium-Glukose-Kotransporters SGLT1 im mikrovaskulären System des Gehirns, des Herzens und des Skelettmuskels T1 - Immunological evidence for the location of the sodium/glucose cotransporter SGLT1 in the microvascular system of brain, heart and sceletal muscle N2 - Glukose ist einer der Hauptenergielieferanten der Säugetierzellen. Aus diesem Grund wird die Glukoseaufnahme durch erleichterte Diffusion durch die GLUT (SLC2) Familie, sowie durch die Familie der sekundär aktiven Transporter SGLT (SLC5A) gesichert. In dieser Arbeit wurde ein polyklonaler Antikörper gegen SGLT1 aus Kaninchen hergestellt. Dieser Antikörper wurde für die Innunhistologie sowie für Western blots eingesetzt. Man sah eine Anfärbung von Bürstensaummembranen an Dünndarm- und Nierentubulusepithelzellen, aber in diesen Geweben nicht an Mikrogefäßen. Darüberhinaus konnten wir SGLT1 an der basolateralen Membran von Speicheldrüsenazini sehen, auch hier konnten wir SGLT1 in den Kapillaren nicht sehen. Überraschenderweise konnte SGLT1 in der Blut-Hirn-Schranke nachgewiesen werden. Auch konnte man die Lokalisation von SGLT1 in den Kapillaren des Herzens und des Skelettmuskels zeigen. Die physiologische und pathophysiologische Bedeutung dieser Lokalisationen liegt noch im Unklaren. N2 - Glucose is one of the main energy sources of mammalian cells. Therefore glucose uptake is complicatedly regulated by facilated glucose uptake via transporters of the GLUT (SLC2) family and secondary active transporters of the SGLT (SLC5A) family. For this work, a polyclonal antibody against rat SGLT1 was raised in rabbits. This antibody was used in immunohistochemistry and western blots. Brush border membranes of small intestine and kidney epithelial cells were stained, but no microvessels in these tissues. Futhermore we could see SGLT1 in the basolateral membrane of the acini of salivary glands, here we could not dectect SGLT1 in capillary endothelial cells. Surprisingly we were able to detect SGLT in the blood-brain-barrier. We were also able to show the location of SGLT1 in the capillaries of heart and sceletal muscle. The physiologial and pathophysiological impact of this locations remains to be determined. KW - Glukose KW - Endothel KW - Gehirn KW - Herz KW - Muskel KW - glucose KW - endothelium KW - brain KW - heart KW - muscle Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19221 ER - TY - THES A1 - Fahr, Martin Siegfried T1 - Akzessorische Gelenke zwischen Basiokziput und Atlas bzw. Dens axis in der Medianebene T1 - Accessory joints between basiocciput and atlas/axis in the median plane N2 - Der vordere kraniozervikale Übergang wurde an 99 Kopf-Hals-Präparaten aus dem Präpariersaal mittels MRT, CT und Sägeschnitten untersucht. Weiterhin wurden 110 Schädel, 56 Atlas- und 33 Axispräparate vermessen. Es fand sich in 70% der Präparate das Vorliegen einer Osteoarthrose (Ostheoarthritis) der Art. atlanto-axialis mediana; diese Erkrankung war durch die Bildung von maximalen Osteophyten, Vergrößerung der Gelenkflächen, Verlängerung der Gelenkhöhle und Verminderung des Abstandes zum Hinterhauptsbein charakterisiert. In drei Fällen hatten sich sehr große (giant), nach kranial gerichteten Osteophyten mit knöchernen Kontaktzonen zum Basiokziput gebildet. Die Kontaktzonen waren - wie sich feingeweblich zeigte – echte, erworbene, akzessorische, atlanto-okzipitale Gelenke in der Medianebene. In 11 Fällen lagen - wie die MRT- und CT- Schnittbilder zeigten – Reste des Proatlas bzw. der hypochondralen Spange vor: 3 mal als Condylus occipitalis tertius und knöchernen Kontaktzonen zu Atlas bzw. Axis und 7 mal als freie, überknorpelte Ossikel. Auch hier kann - wie die histologische Kontrolle zeigte – bei den Kontaktzonen von echten, allerdings angeborenen akzessorischen (atlantookzipitalen und odonto-okzipitalen) Gelenken in der Medianebene gesprochen werden. Der Casus mit Vorkommen eines Condylus occipitalis tertius und gleichzeitiger Bildung eines Osteophyten der Densspitze, die zusammen eine knöcherne Kontaktzone und akzessorische Gelenkkammern ausgebildet hatten, kann als „gemischter“ Fall bezeichnet werden. N2 - To explore the many osseous irregularities that are found in the area between the basiocciput, the anterior arch of the atlas and the tip of the dens axis we studied 99 cadaver specimens using magnetic resonance tomography (MRT), computed tomography (CT), median saw-cut sections, and histological sections. Additionally, dry specimens of the skull (n = 110), atlas (n = 56), and axis (n = 33) were investigated. In the median plane, the dry and cadaver specimens exhibited osteoarthritis-related osseous outgrowths and osteophytes of the articular surfaces of the median atlanto-axial joint (n = 63), and the presence of congenitally developed free ossicles (n = 22) and of third occipital condyles (n = 3). The largest osteophytes (giant osteophytes) (n = 4) of the anterior arch of the atlas formed osseous contact zones with the basiocciput that were visible histologically as real joints and were designated accessory median atlanto-occipital joints. The third occipital condyles also formed osseous contact zones, visible histologically as real joints, with the anterior arch of the atlas or with the tip of the dens, and were designated accessory atlanto-occipital or occipito-odontoid joints. Frequent free ossicles, incorporated into the accessory joint, were found by histological examination to be covered with hyaline cartilage. KW - Basiokziput KW - Atlas KW - Dens axis KW - TOC (Condylus occipitale tertius) KW - Osteoarthrose KW - Basiocciput KW - Atlas KW - Axis KW - TOC (third occipital condyle) KW - Osteoarthritis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17912 ER - TY - THES A1 - Koppatz, Stefan T1 - Funktionelle Charakterisierung von Chimären der organischen Kationentransporter zur Aufklärung der Bedeutung der großen extrazellulären Schleife T1 - Functional characterisation of chimeras of the organic cation transporters to understand the meaning of the large extracellular loop N2 - Die OCT-Transporterfamilie spielt bei der Ausscheidung von Arzneimitteln und Neurotransmittern in Leber und Niere eine wichtige Rolle. Die Transporter der OCT-Familie weisen neben 12 membranspannenden a-Helices eine große extrazelluläre Schleife zwischen der ersten und der zweiten Transmembrandomäne auf. In der vorliegenden Arbeit wurde der Versuch unternommen, die Funktion der großen extrazellulären Schleife aufzuklären. Es wurden Chimären charakterisiert, bei denen die großen extrazellulären Schleifen von zwei Subtypen der organischen Kationentransporter der Ratte (rOCT1 und rOCT2) ausgetauscht wurden. Außerdem wurde untersucht, ob die Transportfunktion erhalten bleibt, wenn die entsprechende extrazelluläre Schleife eines organischen Anionentransporters (rOAT1) oder eines Glucosetransporters der gleichen Superfamilie (hGLUT1) an die Position der großen extrazellulären Schleife von rOCT1 eingefügt wird. Bei den Transportmessungen an den Chimären wurde die essentielle Bedeutung der großen extrazellulären Schleife für die Expression bzw. die Funktion der OCT gezeigt. Die Daten deuten darauf hin, dass die große extrazelluläre Schleife der organischen Kationentransporter eine strukturelle Funktion besitzt. Sie sprechen nicht für eine direkte Beteiligung an der Substratbindungstasche dieser Transporter, legen aber nahe, dass die Schleife die Konformation der Substratbindungstasche beeinflusst. N2 - The OCT transporterfamily plays an important role in the elimination of medicaments and neurotransmitters in liver and kidney. The transporters of the OCT family exhibit a large extracellular loop between the first and the second transmembrane domain beside 12 membrane-stretching a-helices. In the available work the attempt was undertaken to clear up the function of the large extracellular loop. Chimeras were characterized, with which the large extracellular loops were exchanged by two subtypes of the organic cation transporters of the rat (rOCT1 and rOCT2). In addition it was examined whether the transportation function remains, if the appropriate extracellular loop of an organic anion transporter (rOAT1) or a glucose transporter of the same superfamily (hGLUT1) is inserted to the position of the large extracellular loop by rOCT1. With the transportation measurements of the chimeras the essential meaning of the large extracellular loop for the expression and/or the function of the OCT was shown. The data point on the fact that the large extracellular loop of the organic cation transporters possesses a structural function. They speak not for a direct participation in the substrate binding bag of these transporters, put however near that the loop affects the conformation of the substrate binding bag. KW - OCT KW - extrazelluläre Schleife KW - Chimären KW - Expressionsmessungen KW - SLC22 KW - OCT KW - extracellular loop KW - chimeras KW - expression messurements KW - SLC22 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16247 ER - TY - THES A1 - Langenhan, Tobias T1 - Ciliary neurotrophic factor (CNTF) im olfaktorischen System von Ratten und Mäusen T1 - Ciliary neurotrophic factor (CNTF) in the olfactory system of rats and mice N2 - Das olfaktorische System ist aufgrund seiner lebenslangen regenerativen Kapazität, seines Reichtums an neurotrophen Faktoren und der relativ guten Zugänglichkeit für Manipulationen ein attraktiver Gegenstand neurobiologischer Forschung. In der vorliegenden Arbeit wurde die Lokalisation und mögliche Funktion des ziliären neurotrophen Faktors (CNTF) in der primären Geruchsbahn mit Hilfe immunhistochemischer Methoden untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CNTF-Ir bei Ratten und Mäusen in den olfaktorischen Gliazellen (Ensheathingzellen) lokalisiert ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen belegten ein zytoplasmatisches und nukleäres Vorkommen der CNTF-Ir innerhalb der EC. Ein neues und überraschendes Ergebnis der Arbeit ist, dass CNTF in individuellen olfaktorischen Neuronen vorkommt. Bislang wurde CNTF lediglich in Gliazellen des zentralen und peripheren Nervensystems nachgewiesen. Die weitere Charakterisierung der epithelialen CNTF-ir Neurone kennzeichnete diese als reife olfaktorische Nervenzellen. Die CNTF-Ir war mit dem olfaktorischen Markerprotein (OMP) kolokalisiert, einem Marker ausschließlich reifer ON und wies keine Kolokalisation mit dem Growth associated protein 43 (GAP-43) auf, dessen Expression unreife Riechsinneszellen kennzeichnet. CNTF könnte einerseits an lebenslang fortwährenden De- und/oder Regenerationsvorgängen des olfaktorischen Epithels beteiligt sein. Die Exposition der Riechschleimhaut gegenüber infektiösen, physikalischen und chemischen Noxen bedingt den ständigen Verlust olfaktorischer Neurone und deren lebenslange Regeneration aus neuronalen Vorläuferzellen im olfaktorischen Epithel. Die Zellkerne CNTF-ir ON wiesen in der Mehrzahl keine degenerativen Veränderungen wie Kondensierung und Fragmentierung auf, wie es bei geschädigten und untergehenden Zellen beobachtet wird. Im olfaktorischen Epithel zeigte sich des weiteren keine neuronale Kolokalisation von CNTF mit der aktivierten Caspase-3, einem Exekutorenzym der Apoptose, wie man es bei apoptotisch degenerierenden Neuronen findet. Nach Läsionen des olfaktorischen Epithels von Mäusen, die nekrotische Zelluntergänge auslösen, konnte kein gesteigertes Vorkommen von CNTF-ir ON gezeigt werden. Eine Einbindung von CNTF in die Mechanismen neuronaler Degeneration erscheint nach den Ergebnissen verschiedener Experimente wenig wahrscheinlich. Eine zweite Erklärung für das individuelle neuronale Auftreten der CNTF-Ir bot die Annahme, dass CNTF mit der Expression olfaktorischer Rezeptorproteine vergesellschaftet sein könnte. Dreidimensionale Rekonstruktionen von Paaren von BO bei Ratten und Mäusen zeigte, dass die Axone CNTF-ir ON in Glomeruli olfactorii projizierten, die bilateralsymmetrisch in beiden BO eines Tieres lokalisiert waren. Diese Symmetrie findet man ebenfalls bei den Projektionen der ON, die das gleiche olfaktorische Rezeptorprotein exprimieren. Die Lokalisation der CNTF-ir innervierten Glomeruli war interindividuell ähnlich, ihre Anzahl wies jedoch erhebliche Unterschiede auf. Dieses Phänomen lässt sich mit Befunden vergleichen, die im Rahmen von olfaktorischen Aktivitätsstudien bei Mäusen und Ratten erhoben wurden. Dabei beobachtete man eine Erhöhung der Anzahl aktivierter Glomeruli mit steigenden Geruchsstoffkonzentrationen. Auffallend war eine deutliche Übereinstimmung des Verteilungsmusters der CNTF-ir Glomeruli mit dem in der Literatur dargestellten Verteilungsmuster von Glomeruli, die durch Uringerüche aktiviert werden. Die räumliche Rekonstruktion der BO und die Darstellung der Position der CNTF-ir innervierten Glomeruli legt demnach eine neue mögliche Funktion von CNTF im olfaktorischen System nah: dessen Einbindung in Phänomene der Aktivität olfaktorischer Nervenzellen und plastischer Prozesse, die an der ersten Synapse der Geruchsbahn stattfinden. In der vorliegenden Arbeit konnte durch die Anwendung von klassischen Methoden der anatomisch-histologischen Forschung die Lokalisation von CNTF in der primären Geruchsbahn geklärt werden. Die Befunde führten zu weiteren Hypothesen hinsichtlich seiner funktionellen Einbindung in die olfaktorische Informationsverarbeitung, denen in zukünftigen Studien nachgegangen werden wird. N2 - The olfactory system is bestowed with a set of remarkable features that render it an intriguing object for neurobiological research. It possesses the livelong capacity to regenerate, it displays an extraordinary wealth of neurotrophic factors and it is easily accessible to experimental manipulations. The current study aimed to deliver a comprehensive description of the localization and possible function of ciliary neurotrophic factor (CNTF) in the primary olfactory pathway by means of immunohistochemical methods. It could be shown that CNTF-immunoreactivity in rats and mice was localized in olfactory glia cells (ensheathing cells); using electron microscopy it was demonstrated that CNTF-immunoreactivity occurred both in the cytoplasm and the nucleus of ensheathing cells. Additionally, it was shown that CNTF can be also found in individual olfactory sensory neurons (OSN). Thus far, CNTF was known to be localized in peripheral and central glial cells only. Further characterization of neuroepithelial CNTF-occurrence revealed that CNTF-immunoreactive OSN are mature neurons displaying colocalization with the olfactory marker protein (OMP), a distinct marker protein for mature OSN. This was in line with absent colocalization of CNTF with Growth associated protein 43 (GAP-43) immunoreactivity, a marker of maturing OSN. CNTF could be implicated in the ongoing processes and neurode- and regeneration that take place in the olfactory epithelium. The olfactory mucosa is constantly exposed to the outer environment including noxious substances such as infectious agents, and extreme physical or chemical conditions. Hence, a permanent loss of OSN occurs which is counterbalanced with constant regeneration of neurons from neural precursor cells residing in the epithelium. Nuclei of CNTF-immunoreactive OSN did not display degenerative signs such as condensation or fragmentation that mark harmed degenerating cells. In addition to that no colocalization of CNTF and the apoptotic executor enzyme activated capsase-3 could be found in the olfactory epithelium. Even after chemical lesions of the olfactory epithelium of mice that cause necrotic cell death no enhanced incidence of CNTF-immunoreactive OSN was noted. Therefore, an implication of CNTF in neuronal degenerative processes in the olfactory mucosa seems unlikely. An alternative explanation for the individual neuronal localization of CNTF-immunoreactivity relied on the assumption that CNTF could be associated with the expression of olfactory receptor proteins (ORP). Three-dimensional reconstructions of rat and mice olfactory bulb pairs demonstrated the axonal projections of CNTF-immunoreactive OSN in olfactory glomeruli, which where found to be located at bilaterally symmetrical positions. This symmetry is also notable for OSN that express the identical ORP. The localization of CNTF-immunoreactive glomeruli was interindividually similar although they substantially differed in their numbers between animals. This phenomenon is reminiscent of results from olfactory activity studies obtained from rats and mice. It was observed that an increasing number of olfactory glomeruli is recruited due to an elevation of the odour concentration that the animals was exposed to. The distribution pattern of CNTF-immunoreactive glomeruli was comparable to glomerular activity maps elicited by urine odours. Hence, the three-dimensional reconstruction of olfactory bulbs and the localization of CNTF-immunoreactive glomeruli indicate a possible role for CNTF in activity-dependent processes of OSN and in neuroplastic mechanisms that occur at the first synapse of the primary olfactory pathway. In the current dissertation the localization of CNTF in the primary olfactory pathway was untangled by means of classical anatomical-histological techniques. The results yielded further hypotheses regarding the functional relationship of CNTF with olfactory information processing, which will be followed by future investigations. KW - CNTF KW - neurotrophe Faktoren KW - Neuroregeneration KW - Olfaktion KW - Geruchssystem KW - CNTF KW - neurotrophic facors KW - neuroregeneration KW - olfaction KW - olfactory system Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16009 ER - TY - THES A1 - Zeller, Michael-Wulf T1 - Untersuchungen zum Scherstress-responsiven Element des PDGF-Promotors T1 - research on the shearstress-responsive element of the PDGF promotor N2 - Untersuchungen zum Scherstress-responsiven Element des PDGF-Promotors Zellen sind im menschlichen Organismus ständig mechanischen Kräften ausgesetzt. Eine dieser Kräfte ist die spezielle Schubkraft, die durch Flüssigkeitsstrom auf Zellen ausgeübt wird und als Scherstress bezeichnet wird. Die Stimulation von Zellen durch Scherstress führt zu diversen Reaktionen, die von Wanderungsvorgängen, über Umbau des Zytoskeletts bis hin zur gesteigerten Expression verschiedener Gene reichen. Für die Induktion des Gens der B-Kette des Plättchen-Wachstumsfaktors (PDGF) wurde von Resnick 1993 ein sechs Basenpaare langes cis-aktives Scherstress-responsives Promotorelement (SSRE) identifiziert, das an der Transkriptionsinduktion des Gens durch Scherstress beteiligt ist. In der hier vorliegenden Arbeit sollten die Eigenschaften dieses SSRE gezeigt werden, indem ein Reportergen-Assay mit dem grün fluoreszierenden Proteins EGFP in Zellen der Linie ECV304 ausgetestet wurde. Eine Fragestellung der Arbeit bestand darin, zu prüfen ob das SSRE notwendig und ausreichend für die Scherstressresponsivität eines Promotors ist und ob die Expressionsstärke des Reporterproteins EGFP mit der Stärke und Dauer der Scherstressstimulation korreliert. Zudem sollte der Effekt verschiedenar-tiger pharmakologischer Substanzen auf den PDGF-Promotor unter Scherstress gezeigt werden. Dazu wurde ein neues arithmetisches Verfahren entwickelt, das erlaubt, Zellen unter Einwirkung von Scherkraft angemessen zu vermessen und statistisch auszuwerten. Durch den Einsatz des EGFP und einer hochsensitiven ICCD-Photonenkamera war es möglich, die Messung der Expressionskinetik des Reportergens in Echtzeit durchzufüh-ren. Dabei konnte gezeigt werden, dass in ECV304-Zellen unter Scherstress von 0,5, 12 und 30 dyn/cm² die Expression des intakten PDGF-Promotors mit der Stärke und Dauer der Scherstressstimulation korreliert. Dieser Effekt ist nicht zu beobachten, wenn das SSRE aus dem PDGF-Promotor entfernt wird. Ebenfalls zu keiner Steigerung der Genexpression kommt es, wenn das Reportergen hinter den Promotor des Cytomegalie-Virus (CMV) geschaltet ist, der kein bekanntes Scherstress-responsives Promotor-Element enthält. Inseriert man in den CMV-Promotor das SSRE, so zeigt der Promotor unter Scherstress-Einwirkung ebenfalls eine gesteiger-te Expression, die allerdings hinter der des PDGF-Vollkonstrukts zurückbleibt. Es konnte damit gezeigt werden, dass das SSRE in einen nicht Scherstress-responsiven Promotor verbracht diesen für Strömungskräfte suszeptibel macht. Der PDGF-Promotor enthält eine bekannte Phorbolester-Bindungsstelle. In der vorlie-genden Arbeit konnte gezeigt werden, dass ECV304-Zellen bei Inkubation in mit Phor-bolester versetztem Medium die Transkription des Reportergens deutlich steigern. Ebenfalls zu einer Steigerung der Expression des PDGF-Vollkonstrukts kommt es bei appliziertem Scherstress von 12 dyn/cm² und gleichzeitiger Hemmung der Proteinkinase C (PK-C). Zwar zeigt die Hemmung mit Chelerythrin eine schwächere Lichtintensitäts-zunahme, wie sie beim Einsatz von Calphostin C, beide Messungen ergaben aber eine Steigerung der Lichtintensität gegenüber der Messung des PDGF-Vollkonstrukts bei 12 dyn/cm² in normalem Kulturmedium. N2 - Cells of the human body are always influenced by mechanical power. One of these is the so called shear stress caused by liquids like blood running on the surface of cells. Some promotors of genes of the human body are susceptible to the shear stress especially endothelial cells. This dissertation shows the influence of shear stress on the expression of the PDGF gene in human endothelial cells under different rates of shear stress. To do so a special reporter gene assay a work station and a special algorithmus were established that gave the possibility to look at living cells in real time. In the second part of the examination the influence of different pharmaka like calphostin C, chelerythrine, phorbolic ester and cycloheximide was mesured. KW - Scherstress KW - SSRE KW - PDGF KW - ECV304 KW - shear stress KW - SSRE KW - PDGF KW - ECV304 Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15779 ER - TY - THES A1 - Öllinger, Rupert T1 - Polymerisationseigenschaften des Synaptonemalkomplexproteins SYCP1 und Charakterisierung von Bindungspartnern : Architektur meiotischer Chromosomen T1 - Polymerization Properties of the Synaptonemal Complex Protein SYCP1 and Characterization of Binding Partners N2 - Das Synaptonemalkomplexprotein SYCP1 ist eine Strukturkomponente des Synaptonemalkomplexes (SC) von Saeugern, einer meiosespezifischen Struktur, die wesentlich fuer die Synapse, Rekombination und Segregation homologer Chromosomen ist. Der SC besteht aus zwei lateralen Elementen (LEs) und einer zentralen Region (CR), in deren Mitte das zentrale Element (CE) liegt. Dabei sind die LEs den Achsen der homologen Chromosomen aufgelagert und werden in der CR durch Transversalfilamente (TFs) mit dem CE verbunden. Im Protein SYCP1 (125 kDa) flankieren zwei nicht-helikale terminale Domaenen eine ausgedehnte zentrale „Coiled-Coil“-Domaene. Fuer diese Domaene wird angenommen, dass sie die die Kluft zwischen LEs und CE ueberbrueckt, wobei die C-Termini in den LEs verankert sind und die N-Termini im CE lokalisiert wurden. Um die molekulare Architektur des SC besser zu verstehen und die Bedeutung von SYCP1 für die Zusammenlagerung des SC aufzudecken, wurden die Polymerisationseigenschaften von SYCP1 erforscht. Dazu wurde das Protein in somatischen Zellen exprimiert. In diesem experimentellem Ansatz polymerisierte SYCP1 autonom zu filamentoesen Strukturen, welche sich auf ultrastruktureller Ebene als alternierende elektronendichte Balken offenbarten, die ueber TFs verbunden waren. Dieser Aufbau glich parallel aneinander gereihten Stapeln von SCs, so genannten Polykomplexen (PCs). Die Analyse der Orientierung der SYCP1 Molekuele innerhalb der PCs erwies, dass diese hochorganisiert vorliegen und die Organisation von SYCP1 innerhalb von PCs und SCs identisch ist. Folglich kann sich SYCP1 sogar in Abwesenheit anderer SC-Proteine zu Strukturen zusammenlagern, die der CR entsprechen und muss dementsprechend beim Aufbau der CR des SC den grundlegenden Faktor darstellen. Für eine genauere Analyse wurden ausgewaehlte Mutanten von SYCP1 exprimiert. Moleküle mit modifizierter Laenge der zentralen alpha-helikalen Domaene resultierten in der Bildung von PCs mit veränderter Weite der CR. Dies beweist, dass die „Coiled-Coil“-Domaene den Abstand der CR eines PC bestimmt und impliziert dieselbe Funktion in der SC-Bildung. Darueber hinaus wurde gezeigt, dass SYCP1 Molekuele mit Deletion des nicht-helikalen N-Terminus immer noch in der Lage sind, PCs zu bilden, diese Eigenschaft aber stark eingeschraenkt ist. Das bezeugt die Bedeutung des N-Terminus sowohl in der PC-Bildung als auch im Aufbau des CE von SCs, weist aber dabei auch dem vorderen Teil der „Coiled-Coil“-Domaene eine wichtige Rolle zu. Im Gegensatz dazu war bei Mutanten mit Deletion des nicht-helikalen C-Terminus die PC-Bildung vollstaendig blockiert, was auf eine große Bedeutung dieser Domaene fuer die Polymerisation hinweist. Ein weiterer Hauptgegenstand der Arbeit war die Charakterisierung von Bindungspartnern von SYCP1. Über Immungoldlokalisation auf Maushoden konnten die Proteine Syce1 und Cesc1 als erste ausschliessliche Komponenten des CE des SC bestimmt werden. Zusaetzlich wurde die Interaktion dieser Proteine mit dem N-Terminus von SYCP1 verifiziert. SYCP1 bildet also die Grundstruktur des CE aus und rekrutiert Syce1 und Cesc1. N2 - The synaptonemal complex protein 1 (SYCP1) is a structural component of the mammalian synaptonemal complex (SC), a meiosis-specific nuclear structure essential for synapsis, recombination and segregation of homologous chromosomes. The SC is a tripartite structure consisting of two lateral elements (LEs) and the central region (CR) with a central element (CE) in its middle. The LEs are attached to the axes of homologous chromosomes and are connected with the CE by transversal filaments (TFs). The protein SYCP1 (125 kDa) contains a long central á-helical domain, which is predicted to mediate dimerization in a parallel coiled-coil structure, flanked by two non-helical ends. The coiled-coil is thought to cross the gap between the LEs and the CE, the C-termini are anchored in the LEs and the N-termini have been localized to the CE. In order to better understand the molecular architecture of the SC and the role of SYCP1 in SC-assembly the polymerization properties of SYCP1 were investigated. To this end the protein was expressed in somatic cells. In this approach SYCP1 is able to form stable filamentous structures autonomously, which on the ultrastructural level represent alternating lines connected by TFs. This composition resembles multimeric SC-like complexes arranged in parallel, so called polycomplexes (PCs). By determining the orientation of SYCP1 molecules it was proven that PCs are highly ordered structures with the same arrangement of SYCP1 molecules as in SCs. These results demonstrate that SYCP1 is able to assemble into structures closely resembling the CR of SCs even in the absence of other SC-proteins, which signifies that SYCP1 is the primary determinant of SC assembly which in turn plays a key role in synapsis of homologous chromosomes. For a more detailed analysis, selected mutated constructs of SYCP1 were expressed. Mutations that modified the length of the central alpha-helical domain resulted in the formation of PCs consisting of repeat units of altered width, verifying that the coiled-coil domain determines the distance between the lines of the PC. This result implies the same function of this domain in SC assembly. Moreover, it was observed that SYCP1 molecules lacking the non-helical N-terminus are still able to form PCs, albeit at a strongly reduced level. This shows the importance of the N-terminus both in SYCP1 autoassembly and in the formation of the CE of SCs, but also implies a significant role of the N-terminal part of the coiled-coil domain. In contrast, when the non-helical C-terminus was deleted, filament formation was eliminated indicating a major role of the C-terminus in SYCP1 autoassembly. Another major topic of this work was the characterization of SYCP1 binding partners. By immunogold localization on mouse testis the proteins Syce1 and Cesc1 could be identified as the first exclusive components of the CE of SCs. Furthermore, the interaction of these proteins with the N-terminal region of SYCP1 was validated. Hence, SYCP1 forms the basic structure of the CE and recruits Syce1 and Cesc1. KW - Synaptinemal-Komplex KW - Coiled coil KW - Skleroproteine KW - Synaptonemalkomplex KW - Meiose KW - Keimzellentwicklung KW - Sturkturprotein KW - Coiled-Coile KW - synaptonemal complex KW - meiosis KW - germ cell development KW - structural protein KW - coiled-coil Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15456 ER -