TY - THES A1 - Dellinger, Eva T1 - Expression von Myotubularin und seiner Mutanten im bakteriellen System T1 - Expression of myotubularin and its mutations in a bacterial system N2 - Die X-gebundene Myotubuläre Myopathie (XLMTM) ist eine sehr seltene und schwere angeborene Muskelschwäche, die durch Mutationen im MTM 1 Gen verursacht wird. In der histopathologischen Untersuchung ist auffällig, dass die Muskelfasern fetalen Myotuben ähneln. Das Gen MTM 1 wurde auf Xq28 lokalisiert und kodiert für das Protein Myotubularin. Die Myotubularine stellen eine große Familie eukaryotischer Lipid-Phosphatasen und Anti-Phosphatasen dar. Da der direkte Nachweis von Myotubularin in Muskelbiopsien von Patienten aufgrund der sehr niedrigen Expression nicht gelingt, weder durch immunhistochemische Methoden noch im Western-Blot oder durch einen spezifischen Enzymtest, steht ein funktioneller Test für die gefundenen Genmutationen nicht unmittelbar zur Verfügung. In der Arbeit sollte versucht werden, zunächst Wildtyp-Myotubularin im bakteriel-len System zu exprimieren, im Western-Blot nachzuweisen und die Phosphatase-Enzymaktivität in vitro zu messen. Als Substrat für Myotubularin wurde p-Nitrophenolphosphat verwendet. In der Durchfüh-rung des experimentellen Teils zeigten sich verschiedene Probleme, aus denen sich jedoch interessante Schlüsse ziehen liessen. Zum ei-nen konnte der Verdacht bekräftigt werden, dass Myotubularin keine Dual-spezifische Phosphatase ist, wie zunächst angenommen wurde. Problematisch war auch, dass der E.coli M15 Bakterienstamm an-scheindend selbst so viele eigene Phosphatasen produzierte, die das Substrat p-Nitrophenolphosphat dephosphorylierten. Diese Hintergrundgrundaktivität störte die eigentliche Aktivitätsmessung des Myotubularins und machte diese kaum verwertbar. Ebenso zeigte sich, dass das Myotubularin in dem untersuchten bakteriellen System nicht in größeren Mengen exprimiert wurde. Letzendlich ergab dies die Schlussfolgerung, dass zukünftige Untersuchungen berücksichtigen sollten, dass eukaryontische Expressionssysteme sich offensichtlich besser für die Mitglieder der Genfamilie der Myotubularine eigenen und dass Myotubularine Lipidphopshatasen sind mit in vivo sehr spe-zifischen Substraten (Phopshatidyl-Inositolphosphate). Jedes artifizielle Substrat sollte diese natürlichen Strukturen möglichst nachahmen. N2 - X-linked myotubular myopathy ist a very rare and severe muscle diseasse. It is cause by a mutation in the MTM1 gene. The musclefibres have a significant similarity to fetal mytotubes. The gene MTM1 was located on Xq28 und is encoding a protein called myotubularin. The myotubularin family consists of eucaryontic lipid phosphatases and anti-phosphatases. The detection of myotubularin in biopsies ist not possible, neither by immunological methods nor by Western Blot or specific enzyme-testing. The goal was to express myotubularin in a bacterial system, to detect it by western blot and to measure the phosphatase activity in vitro. As a substrate for myotubularin p-nitrophenophosphate was used. Several problems occured during testing, which lead to some interesting conclusions. For one, the suspicion that myotubularin ist no dual-specific phosphatase could be confirmed. Another problem was, that the M 15 e. coli bacteria itself seemed to produce phosphatases, that dephosphorylate p-nitrophenolphosphate. That made screening the activity of myotubularin nearly impossible. Also, myotubularin was not expressed in large amounts in M 15 e-coli cells. In the end it turned out that for further tests, an eukaryontic system should be used for expression, and that myotubularine is a lipid-phosphatase with very specific substrates in vivo. Every artifical substrate should imitate that natural structure als closely as possible. KW - Molekulargenetik KW - Erbkrankheit KW - Muskelentwicklung KW - Myotubuläre Myopathie KW - MTM KW - Myotubular Myopathy KW - MTM Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25366 ER - TY - THES A1 - Golitschek, Robert von T1 - Charakterisierung von genomischer Instabilität mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung beim Werner-Syndrom T1 - characterization of genomic instability in Werner syndrome fibroblast cultures with spectral karyotyping. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals Metaphasen von Fibroblastenkulturen (AA, WL, SCH, H-51) von Patienten mit der klinischen Verdachtsdiagnose Werner Syndrom (WS) mit der Spektralen Karyotypisierung (SKY) analysiert. Die Auswertung bestätigte in allen vier Zelllinien (ZLL) die zuvor mit konventionellen Methoden (z.B. mit G- und R-Bänderung) etablierten zytogenetischen Charakteristika des WS in Form des „Variegated Translocation Mosaicism“ (VTM) und der im zeitlichen Verlauf einer Zellkultur vorherrschenden zytogenetischen, dominanten Klone, deren Eigenschaften mit den drei Schlagwörtern „clonal attenuation“, „clonal succession“ und „clonal expansion“ bereits durch Salk et al. [28] treffend umschrieben wurden. Alle ZLL wurden nach 7 oder 8 Passagen seneszent, einer für WS-Fibroblasten typischen, reduzierten Lebensspanne. In der genaueren Analyse der aberranten Metaphasen war SKY den konventionellen Methoden deutlich überlegen. Während bei Salk et al. in 1005 Metaphasen 271 Brüche entdeckt wurden, wurden mit SKY in 69 Metaphasen 108 Brüche eindeutig klassifiziert, was außerdem eine detailliertere Einteilung der Klone in unterschiedliche, teilweise singuläre Subklone erforderlich machte. Die bisher noch nie in WS-Zellen festgestellten trizyklischen Chromosomenaustausche und dreifach-rekombinanten Chromosomen zeigten die Fähigkeit der SKY-Methode, komplexe genomische Veränderungen genau darzustellen. Zudem wurde erstmals ein pseudotetraploider Subklon T mit 87-90 Chromosomen entdeckt, der aus der Mutterkultur WL stammte und ein ungewöhnliches Wachstumspotential von etwa 45 Populationsverdoppelungen (PD) erreichte und die durchschnittlichen 20 PD von WS-Fibroblasten um mehr als das Doppelte überschritt, aber unter den 54 PD von Kontrollfibroblasten lag. Eine Tetrasomie wurde für alle autosomalen Chromosomen außer den Chromosomen 4 und 6 festgestellt, die jeweils dreimal, die Geschlechtschromosomen X und Y jeweils zweimal vertreten waren. Die Translokationen waren identisch mit denen von Klon a aus WL, allerdings in jeweils zweifacher Ausführung. 77 der 10 Chromosomen beinhalteten in den 69 Metaphasen ≥6 Brüche und waren in jeweils mindestens 3 der 4 ZLL an Chromosomenaberrationen beteiligt. V.a. Chromosom 16 war mit 17 Bruchpunkten bzw. in 23 von 78 aberranten Chromosomen am häufigsten involviert. Zudem war es an zwei der drei dreifach-rekombinierten Chromosomen und bei einem der zwei trizyklischen Chromosomenaustausche beteiligt. Dies weist auf eine möglicherweise große Bedeutung von Chromosom 16 in Rekombinationsprozessen hin. Auffällig war eine nicht-zufällige Bruchpunktverteilung. Die Bruchpunkte 3q11→q12, 9q13, 15q15, 16q12→q13 und 16q22 waren mögliche hot spots für Bruchereignisse und trugen Rechnung für ≈21% der Bruchereignisse. V.a. 16q22 brach am häufigsten (11mal), war als einziger Bruchpunkt in allen 4 Zelllinien vorhanden und maßgeblich für die hohe Beteiligung des Chromosoms 16 an strukturellen Aberrationen verantwortlich. 16q22 wurde in vorherigen Untersuchungen bisher noch nicht als einer der bevorzugten Bruchpunkte in WS festgestellt. Einige der bei Salk et al. genannten hot spots wurden in dieser Arbeit bestätigt, jedoch mit unterschiedlichem Verteilungsmuster. Dies hängt möglicherweise mit der höheren Sensitivität von SKY, aber auch mit der in dieser Arbeit relativ niedrigen Anzahl an Metaphasen zusammen. Für SKY bestehen weitere mannigfaltige Anwendungsmöglichkeiten , die in der zytogenetischen Forschung nicht nur auf dem Gebiet des WS Fortschritte erzielen können. SKY ist zudem eine sichere Methode, erfordert jedoch einen hohen zeitlichen und materiellen Aufwand, die die Anwendungsmöglichkeiten wiederum limitieren. Als diagnostisches Instrument erscheint SKY daher nur in Fällen sinnvoll, in denen nach der Anwendung konventioneller Methoden weiterhin Unsicherheiten bezüglich der Diagnose bestehen. Mit der Eigenschaft komplexe Rearrangements mit hoher Sensitivität zweifelsfrei nachzuweisen, kann es jedoch als der Gold-Standard bei unklaren Fällen gelten. N2 - Four werner snydrome (ws) fibroblast cultures were analyzed by spectral karyotyping (sky) in this thesis work. There were multiple, pseudotetraploid clones in all cultures, mostly marked by random balanced reciprocal translocations and were therefore clearly showing "variegated translocation mosaicism", the cytogenetic hallmarks of werner syndrome fibroblasts in vitro. One culture contained two clones with three-way exchanges involving the chromosomes 2, 3, 16 and X, 2, 13. Two cultures contained threetime-recombinant chromosomes: der(3)t(3;11;4)(q22;?;q34), der(10)t(10;13;16)(q22;q31;q22), der(16)t(6;16;11)(q24;p13→q22;p15). In 69 metaphases 108 chromosomal breaks were detected, which shows the high sensitivity of sky. In the most extensive study in 1981 Salk et al. detected 271 breaks in 1005 metaphases. The most frequent breakpoint was 16q22(11 times)and was in all cultures immanent. It corresponds to FRA16B, possibly reflecting difficulties of WS cells in replicating AT-rich repetitive DNA structures. All cultures ceased proliferation after 7 or 8 in vitro passages, but a single clone with exceptional growth potential emerged in one of the senescing cultures. Due to its identical translocations, the derivation of this near tetraploid clone (tetrasomy of all autosomes except chromosomes 4 and 6) could be traced to the most prevalent pseudodiploid clone of the parental mass culture. The proliferation of the subclone ceased after 45 population doublings and exceeded the normal average proliferation rate of WS cells which is normally 20. The tetraploidization in combination with certain chromosome rearrangements and selective chromosome dosage may overcome the severely limited in vitro lifespan of WS fibroblasts. The results cleary show the ability of the sky method to confirm and enhance the knowledge of the cytogentic characteristics of ws cells due to its high sensitivity. As a diagnostic tool it should only be used in cases where conventional methods like g- or r-banding failed. KW - Progeria adultorum KW - werner syndrom KW - spektrale karyotypisierung KW - zytogenetik KW - pseudotetraploidisierung KW - 16q22 KW - werner syndrome KW - spectral karyotyping KW - cytogenetics KW - pseudotetraploidization KW - 16q22 Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24957 ER - TY - THES A1 - Stahl, Sonja T1 - Molekulare Mechanismen der Neurodegeneration in der Grosshirnrinde von Kathepsin B und L-Doppelknockoutmäusen T1 - Molecular mechanisms of neurodegeneration in cathepsin B- and L- deficient brains N2 - Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine führt zu einer frühzeitigen Neurodegeneration in Mäusen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- Mäusen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erhöht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erhöhten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E lässt eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung während der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten. N2 - Cathepsins B and L are lysosomal cysteine proteases which have been implicated in a variety of pathological processes such as cancer, tumor angiogenesis, and neurodegeneration. However, only a few protein substrates have thus far been described and the mechanisms by which cathepsins B and L regulate cell proliferation, invasion, and apoptosis are poorly understood. Combined deficiency of both cathepsins results in early-onset neurodegeneration in mice reminiscent of neuronal ceroid lipofuscinoses in humans. Therefore, we intended to quantify protein changes in brain lysosomes of double deficient mice. A combination of subcellular fractionation and LC-MS/MS using isobaric tagging for relative and absolute quantitation (iTRAQTM) allowed us to simultaneously assess wildtype and cathepsin B-/-L-/- cerebral lysosomes. Altogether, 19 different proteins were significantly increased in cathepsin B-/-L-/- lysosomes. Most elevated proteins had previously been localized to neuronal biosynthetic, recycling/endocytic or lysosomal compartments. The increase of calcyon, the Delta/Notch-like epidermal growth factor-related receptor, neurochondrin, phospholipase D3, Rab14, cathepsin D, and apolipoprotein E suggests a potential role for cathepsins B and L in axon outgrowth and synapse formation during postnatal development of the central nervous system. KW - Kathepsin B KW - Kathepsin L KW - Nervendegeneration KW - Kathepsin KW - Neurodegeneration KW - DNER KW - Rab14 KW - Calcyon KW - Cathepsin KW - neurodegeneration KW - DNER KW - Rab14 KW - Calcyon Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21606 ER - TY - THES A1 - Sanftl, Petra T1 - Erklärungsversuche der Ursachen des Down-Syndroms nach der Erstbeschreibung im Jahre 1866 bis zur Entdeckung der Trisomie 21 im Jahre 1959 T1 - Efforts to explain Down´s Syndrome´s cause from the initial description in 1866 to the discovery of Trisomy 21 in 1959 N2 - Die vorliegende Arbeit liefert einen historischen Abriss über Erklärungsmodelle des Down- Syndroms im Zeitraum von 1866 bis 1959. Es wird dargestellt, wie ausgehend von Einzelsymptomen das Syndrom Down definiert wurde und welche Thesen in Bezug auf Ätiologie und Pathogenese aufgestellt werden. Dem Down-Syndrom liegt nach heutigem Wissen eine autosomale Chromosomenaberration zugrunde. Statt einer zweifachen Ausführung des Autosoms 21 liegt ein weiteres Chromosom 21 vor, man spricht von einer Trisomie 21. Der Phänotyp des Down-Syndroms ist schon seit mindestens 150 Jahren bekannt, möglicherweise existierten sogar bereits im Zeitalter der Jungsteinzeit die ersten Krankheitsfälle. Der Erstbeschreiber J. L. H. Down war medizinischer Leiter eines Heimes für geistig Behinderte und stellte eine scheinbare Ähnlichkeit zwischen seinen Patienten und bestimmten Menschenrassen fest. In den folgenden Jahrzehnten wurden verschiedenste Theorien zur Ätiopathogenese der Trisomie 21 aufgestellt. 1959, mehr als 20 Jahren nachdem Waardenburg (1932) auf die Möglichkeit einer Chromosomenaberration hinwies, entdecken Lejeune und seine Mitarbeiter ein zusätzliches Chromosom im Karyogramm von Down-Patienten: 47 Chromosomen anstelle von 46 Chromosomen, Trisomie. N2 - This paper gives an historical synopsis of theories about Down´s Syndrome in the period from 1866 to 1959. Starting from singular symptoms the clinical picture of Down´s Syndrome was defined. Various theories concerning etiology and pathogenesis of Trisomy 21 are illustrated. As we know today, Down´s Syndrome bases on an autosomal chromosome aberration. In stead of two autosomes 21 there´s a third autosome 21, the so-called “trisomy 21”. The phenotypical Down´s Syndrome is known for at least more than 150 years, the first cases may have even existed in the Neolithic period. J. L. Down, who was the first to describe the disease pattern, was the medical director of a asylum for mentally retarded people. He discovered an apparent resemblance between his patients and certain human races. In the following decades various theories on the etiology of Trisomy 21 were proposed. In 1959, more than 20 years after Waardenburg suggested the idea of a chromosome aberration, Lejeune and his assistants discovered an additional chromosome in the karyogram of patients with Down´s Syndrome: 47 chromosomes instead of 46 chromosomes, trisomy. KW - Down Syndrom KW - Trisomie 21 KW - Chromosomenaberration KW - Langdon Down KW - Ätiologie KW - Down´s Syndrome KW - Trisomy 21 KW - chromosome aberration KW - Langdon Down KW - etiology Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22470 ER - TY - THES A1 - Kern, Christine T1 - Zytogenetische Analysen von multiplen Chromosomen- Translokationen bei der Maus mit spektraler Karyotypenanalyse T1 - Cytogenetic analysis of multiple chromosomal translocations of the mouse with spectral karyotyping N2 - Das Mausmodell war in der Säugetiergenetik schon immer ein interessantes Forschungsobjekt, insbesondere die in bestimmten geographischen Gebieten vorkommenden Mauspopulationen mit zahlreichen Robertson`schen Translokationen. Mit Kreuzungsversuchen von Mauspopulationen mit unterschiedlichen Robertson`schen Translokationen lassen sich chromosomale Interaktionen in der Meiosephase und morphogenetische Auswirkungen von dadurch entstandenen Mono- oder Trisomien untersuchen. Mit Hilfe der Spektralen Karyotypisierung gelang es in dieser Arbeit die chromosomale Anordnung in der Meiose bei Mauspopulationen mit Robertson`schen Translokationen exakt darzustellen. Hierbei wurde diese Technik an Meiosezellen der Maus etabliert. Es konnten dabei interessante Lagebeziehungen zwischen Meioseformationen und frei liegenden Chromosomen beobachtet werden. Auch fiel die erhebliche Stabilität der Multivalent- Formationen der F1- Tochtergeneration auf. Die Spektrale Karyotypisierung erwies sich hierbei als äußerst effizientes Verfahren, das aufgrund seiner relativ unkomplizierten Handhabung, seiner sehr guten Reproduzierbarkeit und universellen Einsetzbarkeit als Screening Verfahren ideal erscheint Um die dabei gewonnenen Ergebnisse richtig interpretieren zu können sind sicherlich weitere Untersuchungen auf molekularer Ebene nötig. N2 - The mouse model has always been an interesting field of research in the mammalian genetic, especially mice populations with robertsonian translocations. Crossbreeding experiments of mice population with different robertsonian translocations allow examination of chromosomal interactions in the meiotic process and morphogenetic effects of resulting chromosomal aberrations. With spectral karyotyping it was possible to describe the chromosomal arrangement in the meiotic process of mice population with robertsonian translocations. This technique was established for meiotic cells in this work. An interesting spatial relationship between the meiotic ring formation and particular chromosomes during the meiotic process was observed. Additionally, the multivalent- meiotic formations were found to be highly stable. To interpret the results of this study more in detail further molecular analysis will be necessary. This technique proved to be an efficient procedure. Use as a screening technique is possible due to the streamlined work-flow, high reproducibility and its universal applicability. KW - Robertsonsche Translokation KW - spektrale Karyotypenanalyse KW - robertsonian translocation KW - spectral karyotyping Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21097 ER - TY - THES A1 - Förster, Tanja T1 - Molekulargenetik des Hereditären Angioödems T1 - Molecular genetics of hereditary angioedema N2 - Das Hereditäre Angioödem (HAE) ist eine seltene autosomal dominante Erkrankung, die durch einen angeborenen quantitativen oder funktionellen Defekt des C1-Inhibitors (C1-INH) verursacht wird. Das C1-INH-Protein, ein Serin Protease Inhibitor (Serpin) ist der einzige Inhibitor der C1s und C1r Komponenten des klassischen Wegs der Komplementaktivierung. Weiterhin reguliert er die Aktivierung der Faktoren XI und XII im intrinsischen Teil der Blutgerinnung und die Generierung von Kallikrein im Kontaktsystem. Durch die fehlende Kontrolle dieser Systeme kommt es zur vermehrten Bildung vasoaktiver Substanzen, die für die charakteristischen Symptome wie rezividierende, nicht juckende Schwellungen der Haut und Schleimhäute sowie krampfartige Schmerzen im Abdomen verantwortlich sind. HAE-Attacken werden durch psychologischen und/oder physiologischen Stress ausgelöst und manifestieren sich häufig isoliert im Kehlkopfbereich, wobei die Gefahr des Erstickens durch ein Larynx- oder Glottisödem droht. Die vorliegende Arbeit beschreibt die C1-INH-Genanalyse von 208 Familien mit 359 Mitgliedern, die aufgrund der Differentialdiagnose HAE zwischen 1999 und 2005 von spezialisierten klinischen Zentren eingesandt wurden. Bei 32 Patienten wurden durch Southern-Blot und dHPLC Untersuchungen große Deletionen des C1-INH-Gens nachgewiesen. Weiterhin wurden durch Komplett-Sequenzierung der 8 Exons und angrenzenden Intronbereiche des Gens identifiziert. Bei 96 Familien mit 172 Mitgliedern wurden 80 verschiedene Punktmutationen nachgewiesen, die bei Abschluss der vorliegenden Arbeit nicht in der Literatur beschrieben waren. Die HAE-Datenbank kann als Folge auf insgesamt 279 bekannte Mutationen im C1-INH-Gen erweitert werden. Da viele Patienten Missense-Mutationen unbekannter Kausalität aufwiesen, wurden 29 anhand ihrer Lokalisation oder Homologie ausgewählte Mutationen durch zielgerichtete Mutagenese in einen Expressionvektor eingefügt und anschließend in HEK-293 Zellen exprimiert. Die Funktion der rekombinanten Proteine wurde mittels eines C1-INH-Aktivitäts-Assays überprüft. Während bei den meisten rekombinant exprimierten mutanten Proteinen die Kausalität für das HAE durch sehr geringe C1-INH-Restaktivitäten bestätigt werden konnten, zeigten einige mutante Proteine kaum beeinträchtige Aktivitäten. Die zugrunde liegenden Punktmutationen dürften deshalb sehr seltene Polymorphismen sein. Um weiteren Aufschluss über die Auswirkungen der verschiedenen Mutationen zu erhalten, wurden diese in ein 3D-Modell des C1-INH eingebaut und mit einem wildtypischen C1-INH-Modell verglichen. Das verfügbare Modell, das nicht auf Strukturdaten, sondern auf der Homolgie zu anderen Serpinen beruht und nur die Serpindomäne erfasst, erwies sich jedoch bei einigen inaktivierenden Mutationen als unzureichend bzw. unvollständig. Die C1-INH-Gendiagnostik konnte in den meisten Fällen eine Mutation bei den betroffenen Familien nachweisen und auch Mutationsträger vor der Erstmanifestation lebensbedrohender Symptome identifizieren. Die rekombinante Expression und Aktivitätsmessung mutanter C1-INH-Proteine ist ein nützliches Hilfsmittel um die Kausalität von Missense-Mutationen aufzuklären und liefert wertvolle Einblicke in die Funktion individueller Aminosäuren im C1-INH-Protein. N2 - Hereditary Angioedema (HAE) is a rare autosomal dominant disease due to quantitative or functional deficiency of the C1 inhibitor (C1-INH) protein. The C1-INH protein, a serine protease inhibitor (serpin), is the sole inhibitor of the C1r and C1s components of the classical complement pathway and the major regulator of factors XI and XII in the intrinsic blood coagulation and of plasma kallikrein in the contact system. With C1-INH deficiency, proper control of these systems is lacking and vasoactive peptides are generated in excess and are responsible for the characteristic symptoms like recurrent non pruritic swellings of the skin or mucosa as well as painful crampi of the abdomen. HAE episodes are triggered by psychological and/or physiological stress and often manifest in the laryngeal region with the risk of suffocation. This thesis describes the genetic analysis of the C1-INH gene in 208 families with 359 members which were suspicious for HAE and were sent from specialised outpatient clinics from 1999 to 2005. In 32 patients large deletions of the C1-INH gene were detected by Southern-Blot and dHPLC. Sequencing of all 8 exons and flanking intronic regions revealed 93 point mutations and small deletions/insertions. In 96 families with 172 members 80 different point mutations were detected which have not been published in the literature yet. As a result the HAE-database can be enlarged to 279 known mutations in the C1-INH gene. A large number of patients presented with missense mutations of unknown causality. On the basis of their localisation or homology, 29 mutations were chosen and inserted into an expression vector by site-directed mutagenesis and expressed in HEK-293 cells. The activity of the recombinant proteins was measured by a functional C1-INH assay. While most recombinant proteins resulted in almost no detectable activity thus verifying their causality for HAE, some mutant proteins showed only a reduced activity compared to wildtype. The underlying point mutations are therefore likely to be rare polymorphisms. In order to gain further insight into the effects of different mutations they were modelled into a 3D-model of the C1-INH protein and compared to a wildtype model of the C1-INH. While the model demonstrated remarkable structural alterations for some mutations it failed to do so for other clearly inactivating mutations. Since no 3D-crystallography of C1-INH is available yet, the model is based on sequence similarity of the serpin domain to other serpins with apparent limitations. Routine genetic analysis of the C1-INH gene has identified mutations in most of the HAE families and has characterised several HAE carriers prior to manifestation of life threatening symptoms. Recombinant expression and measurement of the activity of mutated C1-INH proteins is a useful tool to elucidate the causality of missense mutations and helps to characterize the role of individual amino acid residues within the C1-INH protein. KW - Gefäßkrankheit KW - Ödem KW - Erbkrankheit KW - Molekulargenetik KW - Hereditäres Angioödem KW - HAE KW - C1-Inhibitor KW - C1INH KW - Serpin KW - Hereditary Angioedem KW - HAE KW - C1 Inhibitor KW - C1INH KW - Serpin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20340 ER - TY - THES A1 - Gramer, Gwendolyn Christine T1 - Familienanamnese, genetisches Risikoprofil und Risikofaktoren der Glaukome - Eine Untersuchung von 2170 Patienten mit Glaukom oder Okulärer Hypertension T1 - Familiy history, genetic risk and risk factors in the glaucomas - Evaluation of 2170 patients with glaucoma or ocular hypertension N2 - Bei 2170 Patienten mit Glaukom oder Okulärer Hypertension wurden die Häufigkeit eines Glaukoms in der Familienanamnese, das genetische Risikoprofil, sowie okuläre und allgemeine Risikofaktoren untersucht, um aus der Korrelation dieser Faktoren mit dem Schweregrad des Gesichtsfeldausfalls und dem Alter bei Diagnosesstellung Rückschlüsse auf die Bedeutung dieser Faktoren für die Pathogenese und Prognose der Glaukome ziehen zu können. Um zu untersuchen, bei welchen Verwandten die höchste Findungswahrscheinlichkeit einer Glaukomerkrankung besteht, haben z. B. 1335 Patienten mit GCS 5312 Verwandte mit einem standardisierten Fragebogen befragt. Die 10 wichtigsten neuen Erkenntnisse aus dieser Untersuchung sind: 1. Es besteht verglichen zum GCS, bei dem 40 % aller Patienten ein Glaukom in der Familienanamnese haben, kein signifikanter Unterschied in der Häufigkeit eines Glaukoms in der Familienanamnese bei Patienten mit NTG, OH, GCS mit engem KW und PG. Alle Glaukomformen haben somit eine genetische Disposition. 2. Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese sind zum Zeitpunkt der Diagnosestellung signifikant jünger als Patienten ohne Glaukom in der Familienanamnese. Kenntnisse über die genetische Disposition der Glaukome führten somit früher zu Screeninguntersuchungen. 3. Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese haben keine schlechtere Prognose für den Erhalt des Gesichtsfeldes als Patienten ohne Glaukom in der Familienanamnese. 4. Bei allen Glaukomformen besteht bei Untersuchung von Geschwistern und Müttern von Glaukompatienten die höchste Findungswahrscheinlichkeit einer Glaukomerkrankung. 5. Verglichen zum GCS besteht ein signifikanter Unterschied im Alter bei Diagnosestellung und damit im Erkrankungsbeginn bei unterschiedlichen Glaukomformen, was für die Wahl des ersten Untersuchungszeitpunkts bedeutend ist. 6. Eine rein altersabhängige Wahl des Screeningzeitpunkts bei GCS zwischen 51. und 60. Lebensjahr führte nicht zur Frühdiagnostik, da in diesem Diagnosezeitraum gleich häufig Patienten mit beginnendem, fortgeschrittenem und schwerem Gesichtsfeldausfall diagnostiziert wurden. 7. Die zeitliche Dynamik des Gesichtsfeldverfalls ist bei unterschiedlichen Glaukomformen unterschiedlich und abhängig von der Höhe des unbehandelten IOD max. Bei 20% der GCS und 40% der NTG Patienten liegen so schwere beidseitige Gesichtsfeldausfälle vor, dass sie kein Fahrzeug steuern können. 8. Die Untersuchung des Alters bei Diagnosestellung in Korrelation zum Stadium der Erkrankung ergibt, dass das NTG verglichen zum GCS nicht wie bisher angenommen eine Erkrankung des älteren Menschen ist, sondern eine Erkrankung ist, die häufiger als das GCS erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert wird. 9. Patienten mit NTG haben entgegen der bisherigen Annahme nicht häufiger Herzerkrankungen als Patienten mit GCS oder Patienten mit anderen Glaukomformen. Die Häufigkeit von Herzerkrankungen ist sowohl bei GCS als auch bei NTG rein altersabhängig. 10. Patienten mit NTG haben alterskorrigiert verglichen zu Patienten mit GCS eine um 63,5% höhere Wahrscheinlichkeit an Migräne zu leiden, wobei Frauen häufiger an Migräne erkrankt sind als Männer. Dies kann erklären, warum bei NTG Frauen häufiger erkrankt sind. Eine vaskuläre Dysregulation ist ein Risikofaktor für NTG. Durch humangenetische Untersuchungen könnte die Risikogruppe der Patienten mit Glaukom in der Familienanamnese möglicherweise auf eine Hochrisikogruppe von Personen mit Mutationen in Glaukomgenen eingegrenzt werden. Da Mutationen in den drei bisher bekannten Glaukomgenen jedoch nur bei 10% aller Glaukompatienten gefunden werden, ein GL in der FA hingegen bei 40% der Patienten vorliegt, definiert das Vorliegen eines Glaukoms in der Familienanamnese die Zielgruppe für ein effektives Glaukomscreening. Eine bessere Information der Bevölkerung, dass bei Vorliegen eines Glaukoms in der Familienanamnese Screeninguntersuchungen, besonders bei den Geschwistern der Patienten, erforderlich sind, kann zur Verbesserung der Frühdiagnose und damit der Prognose der Glaukomerkrankung beitragen. N2 - In 2170 patients with glaucoma or ocular hypertension the frequency of family history of glaucoma was evaluated. In addition the genetic risk profile in the glaucomas as well as ocular and general risk factors were assessed. From the correlation of these factors with the stage of visual field loss and the age of patients at diagnosis it was possible to gain information on the significance of these factors for the pathogenesis and prognosis of the glaucomas. In order to identify the groups of relatives with the highest detection probability for glaucoma, e.g. 1335 patients with primary open angle glaucoma (POAG) interviewed 5312 relatives by means of a detailed standardized questionnaire. The 10 most important new results from this evaluation are: 1. In POAG 40% of all patients have a family history of glaucoma. There is no significant difference in the frequency of family history of glaucoma between patients with POAG and patients with NTG, OH, PACG and PG. Therefore all types of glaucoma show a genetic disposition. 2. Patients with a family history of glaucoma are significantly younger at the time of diagnosis than patients without family history of glaucoma. This signifies that knowledge of the genetic disposition of the glaucomas led to earlier glaucoma screening. 3. Patients with family history of glaucoma do not have a higher risk of visual field progression than patients without family history of glaucoma. 4. In all types of glaucoma the highest detection probability for glaucoma was found in patients' siblings and mothers. 5. Compared to POAG there is a significant difference in the age at diagnosis between different types of glaucoma. This means that there is a difference in the onset of the disease and consequently in the adequate age for glaucoma screening between different glaucomas. 6. Age related screening for POAG in patients aged 51 to 60 years does not lead to early detection of glaucoma. This result is derived from the fact, that in this time period an equal proportion of patients with beginning, moderate and severe visual field loss were diagnosed with glaucoma. 7. The time dynamic of visual field loss progression differs between different types of glaucoma and depends on the level of the maximal intraocular pressure before treatment. 20% of patients with POAG and 40% of patients with NTG would not meet the driving standard because of severe bilateral visual field defects. 8. Evaluation of age at diagnosis in correlation to stage of visual field loss at diagnosis shows, that NTG is not a disease of the elderly compared to POAG, as has been described in literature previously, but that NTG is a disease with late diagnosis and consequently severe visual field defects at detection. 9. Patients with NTG do not show a higher frequency of heart disease compared to patients with POAG and other types of glaucoma. The frequency of heat disease is solely age dependant in NTG as well as in GCS. 10. Patients with NTG have a 63.5% higher probability to have migraine than patients with POAG. Women have a higher frequency of migraine than men. This could explain why NTG is more frequent in women than men. Vascular dysregulation seems to be a risk factor for NTG. Genetic testing could restrict the risk group of patients with family history of glaucoma to a high risk group of patients with mutations in glaucoma genes. Mutations in the three glaucoma genes detected so far are only found in 10% of all patients with glaucoma, whereas a family history of glaucoma is found in 40% of all patients. This signifies that family history of glaucoma does so far best identify people who should undergo glaucoma screening tests. Better information of the population that glaucoma screening is essential in people with family history of glaucoma and especially in siblings of glaucoma patients can lead to earlier diagnosis and therefore to a better prognosis of glaucoma. KW - Glaukom KW - Familienanamnese KW - Risikofaktoren KW - Genetik KW - Screening KW - glaucoma KW - family history of glaucoma KW - risk factors KW - genetic risk KW - screening Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19979 ER - TY - THES A1 - Milenkovic, Vladimir M. T1 - Structural and functional analysis of bestrophin N2 - Morbus Best (OMIM 153700), auch als vitelliforme Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) bezeichnet, ist eine autosomal dominant vererbte Makuladystrophie mit juvenilem Beginn. Die Erkrankung geht einher mit einer Ansammlung von Lipofuscin-ähnlichem Material im sowie unterhalb des retinalen Pigmentepithels (RPE). Das bei Morbus Best mutierte VMD2- Gen kodiert für ein 585 Aminosäuren langes Transmembranprotein, genannt Bestrophin, und wird vorwiegend im RPE exprimiert. Das Protein hat eine komplexe Membrantopologie mit 4-6 putativen Transmembrandomänen (TMD) und ist vermutlich in den Ca2+-abhängigen Transport von Chloridionen durch die Plasmamembran involviert. Die überwiegende Mehrheit der krankheitsassoziierten Veränderungen bei M. Best Patienten sind Missense-Mutationen, die innerhalb der hochkonservierten N-terminalen Hälfte des Proteins nahe der mutmaßlichen Transmembrandomänen akkumulieren. Der Zusammenhang zwischen Pathologie und identifizierter Mutationen bzw. der Chloridkanal- Funktion von Bestrophin-1 ist noch unklar. Um die biologische Funktion von Bestrohin-1 weiter aufzuklären und die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der BMD besser zu verstehen, wurde mit Hilfe des GAL4-basierenden Hefe-Zwei-Hybridsystems (Y2H) nach interagierenden Partnern von Bestrophin-1 gesucht. Ein Screen in einer bovinen RPE cDNABank mit verschiedenen verkürzten Fragmenten von Bestrophin-1 ergab 53 mögliche interagierende Partner. Allerdings schlossen anschließende Verifikationsexperimente die Kandidatengene aus. Somit deuten die Resultate dieser umfangreichen YH2-Studie daraufhin, dass Bestrophin für das herkömmliche Zwei-Hybrid-System nicht geeignet ist. Zum einen könnte dies daran liegen, dass das Protein ein integraler Bestandteil der Membran ist und zum anderen, dass möglicherweise der Transport der gewählten Bestrophin-Fragmente zum Nukleus nicht stattfindet. Dies gilt jedoch als Grundvoraussetzung für eine Proteininteraktion im Hefe-2-Hybridsystem. Bestrophin gehört zu einer großen Familie von integralen Membranproteinen, von der bis heute bereits über 100 Mitglieder bei verschiedenen Organismengruppen wie denSäugern, Insekten und Würmern identifiziert werden konnten. Als auffälligste Besonderheit in der Familie der Bestrophine zeigt sich neben einer nicht-variablen RFP-Domäne (Arginin- Phenylalanin-Prolin) eine evolutionär hochkonservierte N-terminale Region. Um die phylogenetische Beziehung der Bestrophine zu untersuchen sowie den Aufbau und die Funktion von konservierten Motiven innerhalb der Familienmitglieder zu identifizieren, wurde diese konservierte N-terminale Region sowohl bioinformatisch wie auch Chapter Two: Zusammenfassung 4 phylogenetisch weiter untersucht. Die phylogenetische Analyse der Bestrophin Homologen brachte vier evolutionär konservierte Familienmitglieder in Säugern hervor, die jeweils eine starke Homologie zu den Proteinen VMD2, VMD2-L1 bis VMD2-L3 des Menschen zeigen. Die signifikante Ähnlichkeit der Proteinsequenz innerhalb der vier Familienmitglieder lässt die Schlussfolgerungen zu, dass zum einen jedes einzelne Familienmitglied ihre eigene evolutionär konservierte Funktion hat und zum anderen dass die Divergenz des Bestrophins in verschiedene Familienmitglieder zeitlich vor der Divergenz der verschiedenen Säugerspezien erfolgt sein muss. N2 - Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species. KW - Makuladegeneration KW - Membranproteine KW - Molekularbiologie KW - VMD2 KW - bestrophin KW - VMD2 KW - bestrophin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19372 ER - TY - THES A1 - Böhm, Christian T1 - Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom-Zelllinien transgener TGFalpha/p53+/-Mäuse T1 - Cytogenetic tests of pancreatic carcinoma cell lines of p53 deficient mice overexpressing TGFalpha N2 - Sechs verschiedene Tumorzelllinien aus duktalen Pankreaskarzinomen transgener TGFalpha/p53+/-M?se wurden molekular-zytogenetisch durch Spectral Karyotyping analysiert, um Hinweise auf sekund?e genetische Ver?derungen zu erhalten, die f? die Tumorgenese in diesem Mausmodell verantwortlich sind. Es wurden haupts?hlich numerische Abberationen mit hypertriploiden bis hypotetraploiden Karyotypen detektiert, wohingegen durchschnittlich nur 4,3 Strukturaberrationen pro Metaphase nachgewiesen werden konnten. Fast immer stellten sich einige kleine Markerchromosomen dar, die durch SKY nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Auff?ligste Ver?derung der Zelllinie TD2 (MMUPaTu7 und 8=7B) war ein gro?s Markerchromosom, dessen proximaler Anteil mit drei charakteristischen dunklen Banden aus Material von Chromosom 11 bestand, w?rend der distale Abschnitt zu Chromosom 5 geh?te. Durch FISH-Analyse mit spezifischen BAC-Proben f? das Chromosom 11 konnte hierf? eine Amplifikation der Kandidatengene Egfr und c-Rel festgestellt werden. Auch in den anderen Zelllinien traten geh?ft Strukuraberrationen des Chromosoms 11 auf, f? die ebenfalls eine Beteiligung dieser Genloci postuliert werden kann. Weitere strukturelle Ver?derungen betrafen Chromosom 15 mit c-Myc-Amplifikationen in Form von extrachromosomalen "double minutes", welche in h?eren Passagen der Zelllinie TD2 als homogeneously stained regions (HSR) integriert an variablen Positionen des Chromosoms 6 sichtbar wurden. In den analysierten Metaphasen trat zus?zlich h?fig ein vergrößertes Chromosom 8 auf, allerdings im Bandenmuster mit unterschiedlichen Amplifikationseinheiten, wobei ein Gewinn des dort lokalisierten Transkriptionsfaktors Jun-B m?lich w?e. F? eine genauere Charakterisierung der in die verschiedenen Strukturaberrationen involvierten Kandidatengene sind gezielte FISH-Analysen mit lokusspezifischen BAC-Proben oder andere weiterf?rende molekular-genetische Untersuchungen erforderlich. KW - Pankreaskarzinom KW - Spectral Karyotyping KW - transgene TGFalpha-Mäuse KW - pancreatic carcinoma KW - spectral karyotyping KW - p53-deficient mice overexpressing TGFalpha Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18623 ER - TY - THES A1 - Rost, Simone Esther T1 - Molekulare Ursachen Vitamin K-abhängiger Gerinnungsstörungen T1 - Molecular Causes of Vitamin K-dependent Coagulation Disorders N2 - Vitamin K ist ein essentieller Cofaktor für die posttranslationale Gamma-Carboxylierung von sog. Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren, Knochenproteinen, Zellwachstum-regulierenden und weiteren Proteinen mit noch unbekannter Funktion. Defekte im Vitamin K-Stoffwechsel führen einerseits zu zwei verschiedenen Formen des familiären Mangels aller Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren (VKCFD1 und 2) und andererseits zur Resistenz oder Hypersensitivität gegenüber Cumarinderivaten, wie Warfarin, die als Vitamin K-Antagonisten zur Antikoagulationstherapie bei thromboembolischen Erkrankungen, aber auch zur Bekämpfung von Ratten und Mäusen eingesetzt werden. Die Aufklärung und Charakterisierung der molekularen Ursachen dieser Erkrankungen wird in dieser Doktorarbeit anhand von Veröffentlichungen dokumentiert. Ausgehend von der Charakterisierung zweier Familien mit dem VKCFD2-Phänotyp, wird die Kartierung des VKCFD2-Locus auf dem kurzen Arm von Chromosom 16 beschrieben. Durch eine systematische Mutationssuche in der ca. 130 Gene umfassenden Kandidatenregion von Chromosom 16 konnte das für diese Erkrankung und die Warfarinresistenz ursächliche Gen ausfindig gemacht werden. Dabei handelt es sich um das Gen für die entscheidende Komponente der Vitamin K-Epoxid-Reduktase (VKORC1), die den Recycling-Prozess von Vitamin K im sog. Vitamin K-Zyklus katalysiert. Die Charakterisierung des VKORC1-Proteins umfasst dessen subzelluläre Lokalisation, den Vergleich orthologer Proteine in verschiedenen Species und die funktionelle Charakterisierung von rekombinant exprimiertem VKORC1. Durch positionsspezifische Mutagenesen und anschließende Expression in humanen Nierenzellen konnten mehrere für die Funktion der VKORC1 relevante Aminosäuren identifiziert werden. Die posttranslationale Modifikation der Vitamin K-abhängigen Proteine wird von der Gamma-Glutamyl-Carboxylase (GGCX) katalysiert. Defekte in diesem Enzym wurden von zwei verschiedenen Arbeitsgruppen als Ursache für die erste Form der VKCFD-Erkrankung nachgewiesen. In dieser Doktorarbeit werden drei weitere, von unserer Arbeitsgruppe identifizierte Mutationen im GGCX-Gen beschrieben, unter denen sich ein nachgewiesener Founder-Effekt an Position 485 des Proteins befindet. Die Arg485Pro-Variante wurde rekombinant in Insektenzellen exprimiert und konnte mittels kinetischer Studien als VKCFD1-verursachende Mutation verifiziert werden. N2 - Vitamin K is an essential cofactor for the posttranslational gamma-carboxylation of the so-called vitamin K-dependent coagulation factors, bone proteins, cell growth regulating proteins and others of unknown function. Defects in vitamin K metabolism cause two different forms of combined deficiency of vitamin K-dependent coagulation factors (VKCFD type 1 and type 2) as well as resistance or hypersensitivity to coumarin derivates, such as warfarin, which act as vitamin K antagonists. Coumarins are used for anticoagulation therapy of thromboembolic diseases and in higher dosis also for rodent pest control. The aim of this thesis is to characterize the molecular basis of these diseases. This work has led to six publications. The VKCFD type 2 phenotype as described in two unrelated families was used to perform a homozygosity mapping of the VKCFD2 locus on the short arm of chromosome 16. A systematic mutation screening in the candidate region on chromosome 16 comprising approximately 130 putative genes resulted in the identification of the gene causative for VKCFD2 and the allelic phenotype warfarin resistance. This gene encodes the first identified component of the vitamin K epoxide reductase (VKORC1) which catalyzes the reduction of vitamin K epoxide as an important part of the so-called vitamin K cycle. Characterization of the VKORC1 protein includes its subcellular localization, comparison of orthologous proteins in different species and functional studies of the recombinant VKORC1. Amino acids which are relevant for protein structure or function were identified by site-directed mutagenesis experiments and subsequent expression in human embryonic kidney cells (HEK293). Posttranslational modification of the vitamin K-dependent proteins is catalysed by the gamma-glutamyl carboxylase (GGCX), an enzyme of the endoplasmic reticulum. Mutations in the gene encoding this enzyme were demonstrated to be causative for VKCFD type 1 by two different working groups. Our working group identified three additional mutations in the GGCX gene. Recurrent mutations at position 485 of the protein were shown to result from a founder effect. The Arg485Pro variant was recombinantly expressed in insect cells using the baculovirus system and could be verified as a causative mutation for the VKCFD1 phenotype by kinetic studies. KW - Koagulopathie KW - Vitamin-K-Gruppe KW - Genanalyse KW - Vitamin K KW - Blutgerinnung KW - VKORC1 KW - Warfarin KW - Gamma-Carboxylase KW - phylloquinone KW - blood coagulation KW - VKCFD KW - coumarin KW - gamma-carboxylation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17589 ER -