TY  - THES
A1  - Zunker, Katrin
T1  - Untersuchungen zur Rolle der Mikrosatelliteninstabilität in hereditären Melanomen von Xiphophorus sowie zur Integrität von Elementen der Zellzykluskontrolle/DNA-Reparatur
T1  - Genomic stability in hereditary malignant melanoma of Xiphophorus
N2  - Die Bedeutung der genomischen Instabilität in humanen melanocytischen Läsionen ist Gegenstand vieler dermatologischer Studien und bis heute ungeklärt. Ist die Mikrosatelliteninstabilität bloße Begleiterscheinung der unkontrolliert proliferierenden Tumorzellen oder wird ihr ein pathogenetischer Mechanismus zuteil? In Fischen der Gattung Xiphophorus können durch klassische Kreuzungsexperimente melanocytische Läsionen verschiedener Malignitätsgrade induziert werden. Diese Läsionen sind auf Grund ihres genetisch kontrollierten Hintergrundes eindeutig definiert und reproduzierbar - und damit im Vorteil gegenüber der unsicheren Klassifikation humaner Hautläsionen. In der vorliegenden Arbeit wurde hauptsächlich der Frage nachgegangen, ob MIN+ ein obligates molekulares Ereignis für die Progression von Melanomen bis zum terminalen Stadium darstellt. Dieser Fragestellung wurde unter Verwendung PCR-basierter Mikrosatellitenanalysen sowie Multilocus DNA-Fingerprint Analysen nachgegangen. 23 Tumoren unterschiedlicher Malignität wurden im Vergleich zum tumorfreien Normalgewebe desselben Fisches an 12 Genloci unbekannter chromosomaler Lokalisation auf Mikrosatelliteninstabilität untersucht. Es wurde insgesamt eine Zahl von 263 informativen Loci erzielt, von denen sich nur 20 ( = 7.6%) als instabil erwiesen. Mittels der Multilocus-Fingerprint Analysen wurden 8 Melanome und deren korrespondiere Normalgewebe mit drei Sonden hybridisiert. Nur einer von 12 analysierbaren MLFPs zeigte eine genetische Aberration in Form einer Deletion einer einzelnen Bande im Tumorgewebe. Mit diesem Ergebnis wurde das in der Mikrosatellitenanalyse erhaltene Resultat einer nicht signifikanten Mikrosatelliteninstabilität im Xiphophorus-Melanom-Modell System bestätigt. Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die Abwesenheit eines MIN+-Phänotypen in den Melanomen von Xiphophorus darauf hinweist, daß der Erwerb von MIN weder ein notwendiges Kriterium für die Initiation eines Tumors noch für seine Progression darstellt. Ein anderer Pfad der Tumorinitiation ist die direkte Schädigung oder der Verlust von Tumorsuppressorgenen, von in Mismatch Repair involvierten Genen oder durch die Transformation von Proto-Onkogenen zu Onkogenen. In dieser Arbeit wurde die Expression von drei Genen, die in der Regulation des Zellzyklus Schlüsselrollen spielen (rb, p53, cdkn2a), sowie einer Komponente des MMR-Systems (MSH2) auf RNA-Ebene untersucht. Ihre Expressionsstärke wurde in folgenden Geweben miteinander verglichen: Maligne Melanome, benigne Läsionen, tumorfreie Kontrollgewebe und die Xiphophorus-Melanomzellinie (PSM). MSH2 und p53 wurden in allen untersuchten Geweben auf gleichem Niveau exprimiert. Die vergleichende Expressionsanalyse des vermeintlichen "melanoma susceptibility gene" cdkn2a im Melanom-Modell und der PSM-Zellinie bestätigte die bereits vorbeschriebene Überexpression des Zellzyklusinhibitors in malignen Melanomen von Xiphophorus-Hybriden. Die Untersuchung des Expressionsmusters von Rb in den oben genannten Geweben ergab eine verminderte Transkription dieses Gens in malignen Melanomen. Eine mögliche Interpretation dieses Ergebnisses wäre, einen Defekt in Rb oder pRB zu Grunde zu legen und die Hochregulation von cdkn2a entsprechend einer negativen Rückkopplungsschleife als physiologische Konsequenz anzusehen.
N2  - Microsatellite instability is a feature of many tumours and is indicative of a generalized genomic instability of cancer cells. Whether this phenomenon is essential for tumorigenesis and whether it is an early or late step is still a matter of debate. In the Xiphophorus melanoma model, the primary steps leading to tumour formation are known and include overexpression of a mutationally altered epidermal growth factor receptor and the resulting defects in signalling. We have analysed the late stages of melanoma progression for microsatellite instability. Although several types of microsatellite allele alteration in DNA from tumours relative to DNA from non-tumour tissue were found, the frequency was rather low (7.6%). Thus, although the tumours show a wide range of malignancy and agressiveness, genomic instability that becomes apparent as microsatellite instability does not appear to be an obligatory step for melanoma progression.
KW  - Mikrosatellit
KW  - Melanom
KW  - Fisch
KW  - genetischer Fingerabdruck
KW  - Zellzykluskontrolle
KW  - Microsatellite
KW  - genomic stability
KW  - fish
KW  - hereditary melanoma
KW  - cell cycle control
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21736
ER  - 
TY  - THES
A1  - Willmes, Christoph
T1  - Therapie kutaner Tumoren : Identifizierung molekularer Biomarker der ex vivo Chemosensitivität des malignen Melanoms und Evaluierung der Wirkungsweise von Interferonen und Artemisininen auf das Merkelzellkarzinom
T1  - Treatment of cutaneous tumors
N2  - Für Patienten mit malignem Melanom im Stadium der Fernmetastasierung gibt es bis heute lediglich Therapieoptionen mit sehr eingeschränkten Erfolgsaussichten. Diese Tatsache bestätigt die Notwendigkeit von Biomarkern zur Vorhersage des Erfolgs verschiedener Therapien. Der ATP-basierende ex vivo Chemosensitivitätsassay hat sich als erfolgreiche Methode zur individuellen Vorhersage eines Chemotherapieerfolgs herausgestellt. Tatsächlich zeigte der Assay ein heterogenes Sensitivitätsprofil gegen verschiedene Chemotherapeutika und ließ in getesteten Patienten ein ex vivo wirksames Chemotherapieregime identifizieren, das anschließend auch klinische Therapieerfolge bei Verwendung der Therapie mit dem besten individuellen Chemosensitivitätsindex(BICSI) zeigte. Um diesen sehr aufwendigen Assay zukünftig zu umgehen, sollten in der vorliegenden Arbeit prädiktive molekulare Biomarker der Chemosensitivität identifiziert werden. Hierfür wurden im Voraus durch einen Microarray die Kandidaten Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LOXL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicle-associated membrane protein 5 (VAMP5) und Serine protease inhibitor B1 (SERPINB1) als differentiell exprimierte Gene in chemosensitivem gegenüber chemoresistentem Gewebe identifiziert. Die relative Expression dieser Kandidatengene wurde daraufhin in bis zu 128 verschiedenen Melanomgeweben mit dem Chemosensitivitätsindex verschiedener Chemotherapeutika korreliert. Hierbei konnte eine signifikante Korrelation zwischen SerpinB1 mit der Chemosensitivität gegenüber der Therapiekombination mit Paclitaxel und Cisplatin auf Gen- aber nicht auf Proteinebene identifiziert werden. Weiterhin konnte eine differentielle Expression ebenfalls in chemosensitiven und -resistenten Melanomzelllinien nachgewiesen werden, die allerdings im Vergleich mit dem analysierten Gewebe in gegensätzlicher Richtung verlief. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SerpinB1 ein vielversprechender Marker für die Chemosensitivität gegenüber Paclitaxel und Cisplatin ist, dessen funktionelle Bedeutung aber unklar bleibt. Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und hoch aggressiver Tumor der mit dem Merkelzellpolyomavirus (MCV) in Zusammenhang steht. Da MCC Zelllinien zur Aufrechterhaltung ihrer Viabilität die MCV T-Antigene benötigen, könnte der Einsatz von Interferonen (IFN) ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung dieser Krebserkrankung sein. In der vorliegenden Arbeit haben wir daher die Effekte von IFNs auf MCC Zelllinien, mit besonderer Berücksichtigung der MCV+ Linien, untersucht. IFNs vom Typ I (hier Multiferon, ein Mix verschiedener IFN α Subtypen, und IFN β) wirkten stark inhibierend auf die zelluläre Viabilität. Die Zellzyklusanalyse zeigte eine Erhöhung des sub-G Anteils der Zellen nach Behandlung mit IFN, was auf Apoptose als ausschlagebenden Grund schließen ließ. Diese Effekte waren für die Behandlung mit IFN β weniger stark ausgeprägt. Der inhibitorische Effekt von Typ I IFNs auf MCV+ MCC Zelllinien war assoziiert mit einer verringerten Expression des viralen großen T-Antigens (LTA) und einer Erhöhung in der Expression von promyelocytic leukemia protein (PML), das dafür bekannt ist, die Funktion des LTA störend zu beeinflussen. Zusätzlich führte die intratumorale Anwendung von Multiferon in vivo zu einer Regression im Wachstum von MCV+, aber nicht MCV- MCC Xenotransplantaten. Die Ergebnisse zeigen das Typ I IFNs einen starken antitumoralen Effekt haben, der zum Teil durch die Regulierung des LTA herbeigeführt wird. Neben diesen direkten Effekten der IFNs auf die Zellproliferation induzieren diese auch die Expression von MHC Klasse I Molekülen in MCC Zelllinien. Die Durchflusszytometrie zeigte eine Induktion der MHC Klasse I Expression in drei MHC I negativen MCC Zelllinien und eine Erhöhung der Expression, die vor der Behandlung eine geringe Menge an MHC I aufwiesen. Diese Effekte konnten auch in den in vivo Xenotransplantaten beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit IFN sowohl direkte als auch indirekte Effekte auf das MCC hat und eine breite Anwendung in Patienten mit MCV+ und MCV- Tumoren finden kann. Neben IFNs sind auch Artemisinin und seine Derivate bekannt für ihre antitumoralen und antiviralen Eigenschaften. Daher haben wir den Effekt des Artemisininderivats Artesunate auf MCV+ und MCV- MCC Zelllinien getestet. Tatsächlich konnten wir auch hier einen antiproliferativen Effekt des Stoffes nachweisen, der stärker auf MCV+ als auf MCV- Zelllinien wirkte und bei ersteren wiederum mit einer reduzierten LTA Expression einherging. Im Vergleich dazu blieben Fibroblasten von der Behandlung unbeeinflusst. Das verringerte Tumorwachstum konnte ebenfalls für in vivo Xenotransplantationsmodelle gezeigt werden. Auf Grundlage dieser Erkenntnis sollte eine genauere Untersuchung dieses alten Naturheilstoffes für die Behandlung von MCC Patienten in Betracht gezogen werden.
N2  - For melanoma patients with distant metastases all available therapeutic options demonstrate only very limited efficacy up to date. This fact substantiates the need of predictive markers for therapy response. For example, ex-vivo chemosensitivity testing by an ATP-based luminescence assay is a promising tool to predict the individual outcome of different chemotherapy regimens. Indeed, this assay demonstrates a heterogeneous chemosensitivity against different cytotoxic drugs which correlates with chemotherapy outcome in terms of therapy response and overall survival; for the treatment of the patient the drug with the best individual chemosensitivity index(BICSI) is used. To circumvent this elaborate assay in the future, we want to identify and characterize predictive molecular biomarkers of specific chemosensitivity. Initially, predictive biomarker aspirants were identified by a microarray comparing chemosensitive and chemoresistant melanoma cell lines. To this end, we found Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LoxL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicleassociated membrane protein 5 (Vamp 5) and Serine protease inhibitor B1 (SerpinB1) as differential expressed in chemosensitive versus chemoresistant melanoma cells. Furthermore, we correlated the relative expression of our candidates with the chemosensitivity index of different chemotherapy regimes in up to 128 melanoma tissues so far. Importantly, we found a significant correlation between SerpinB1 gene but not protein expression and chemosensitivity towards Paclitaxel and Platin. Moreover, we also detected a differential expression of SerpinB1 in melanoma cell lines which however was running in reverse direction compared to the analyzed tissues. In conclusion, SerpinB1 seems to be a promising biomarker for prediction of Paclitaxel and Platin chemosensitivity. Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and highly aggressive skin cancer associated with the Merkel cell polyomavirus (MCV). As MCC cell lines demonstrate oncogene addiction to the MCV T-antigens, pharmacological interference of the large T-antigen(LTA) may represent an effective therapeutic approach for this deadly cancer. In this study, we investigated the effects of interferons (IFNs) on MCC cell lines, especially on MCV positive (MCV+) lines. Type I IFNs (i.e. Multiferon, a mix of different IFN α subtypes, and IFN β) strongly inhibited the cellular viability. Cell cycle analysis demonstrated increased sub-G fractions for these cells upon IFN treatment indicating apoptotic cell deathν these effects were less pronounced for IFN β. Notably, this inhibitory effect of type I IFNs on MCV+ MCC cell lines was associated with a reduced expression of the MCV LTA as well as an increased expression of promyelocytic leukemia protein (PML), which is known to interfere with the function of the LTA. In addition, the intra-tumoural application of multiferon resulted in a regression of MCV+ but not MCV- MCCs in vivo. Together, our findings demonstrate that type I IFNs have a strong antitumour effect, which is at least in part explained by modulation of the virally encoded LTA. Moreover, in addition to directly affecting MCC cell proliferation, IFNs strongly reinduce MHC class I expression in MCC cells. Flowcytometry demonstrated a re-induction of MHC class I expression upon IFN treatment in three MHC class I- MCV+ cell lines and an increase in MHC class I expression in cell lines that were characterized by a weak expression prior to treatment. Importantly, the increase or induction of MHC class I expression could also be demonstrated in vivo in xenotransplantation models. These results imply that IFN treatment has both a direct and an indirect effect in MCC and should be applicable in a general manner, i.e. irrespective of the MCV status of the patient. Beside IFN, Artemisinins are also known for their antitumoral and antiviral properties. In consequence, we tested the effect of Artesunate, i.e., an Artemisinin drivate, on MCV+ and MCV- MCC cell lines. In this regard, we could demonstrate an antiproliferative effect which was stronger on MCV+ cell lines, and which was associated with a reduced expression of the viral LTA. In contrast, fibroblasts were uneffected by Artenusate treatment. The reduced tumor growth could also be shown in vivo by intra-tumoral injection of Artesunate in MCV+ xenotransplantation models. According to these findings, a more detailed investigation of this ancient natural drug for the treatment of MCC patients should be considered.
KW  - Interferon
KW  - Melanom
KW  - Qinghaosu
KW  - Chemosensitivität
KW  - Merkelzellkarzinom
KW  - Chemosensitivity
KW  - Merkel cell carcinoma
KW  - Merkel-Zellkarzinom
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83470
ER  - 
TY  - THES
A1  - Wende, Elisabeth Sophie
T1  - Untersuchungen zur Rolle der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk bei der Migration melanozytärer Zellen
T1  - A role for the melanoma-inducing receptor tyrosine kinase Xmrk in the migration of melanocytic cells
N2  - Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen.
N2  - Malignant melanoma is a tumor of the skin with increasing incidence and high mortality rates. As the biomolecular events underlying melanoma development are poorly understood, specific therapeutics for this disease are few. The Xiphophorus system is suitable for studying melanoma development. In this model, presence of the RTK Xmrk is sufficient to initiate melanoma formation by activating proliferative and anti-apoptotic pathways and interfering with differentiation. This work demonstrates that Xmrk is also able to induce migration of the melanocytic cell line Melan a-Hm. Cells transformed by Xmrk migrate in amoeboid fashion, independently of MAPK or PI3K pathways. However, kinases FAK and Fyn are involved in Melan a-Hm migration, possibly as a signal-integrating protein complex similar to the role that has been described for FAK and Src in various systems. The results from this work serve to extend the Xiphophorus model to other aspects of melanoma development and may help to better understand the molecular basis of melanoma.
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Melanom
KW  - Zellmigration
KW  - Src-Proteine
KW  - Xiphophorus
KW  - fokale Adhäsionskinase (FAK)
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70945
ER  - 
TY  - THES
A1  - Teutschbein, Janka
T1  - Identifizierung und Charakterisierung von Genen und Proteinen in der Xmrk-induzierten Entwicklung von Melanomen
T1  - Identification and characterization of genes and proteins in Xmrk-induced melanomagenesis
N2  - Melanome stellen die gefährlichste Form von Hautkrebs mit der höchsten Mortalitätsrate dar. Der Transformation normaler Melanozyten zu malignen Melanomen liegen komplexe molekulare und biochemische Veränderungen zu Grunde. Im Xiphophorus-Melanom-Modell ist die onkogene Rezeptortyrosinkinase "Xiphophorus melanoma receptor kinase" (Xmrk) der alleinige Auslöser der Melanominitiation und -progression. Die Aufklärung der Xmrk-vermittelten Signaltransduktion kann zum besseren Verständnis von Ereignissen, die auch bei der humanen Melanomentwicklung eine Rolle spielen, beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe der Microarray-Technologie die Regulation der Genexpression durch Xmrk analysiert. Zu den nach Rezeptoraktivierung am stärksten herabregulierten Genen gehörten "son of sevenless homolog 1" (Sos1) und "ubiquitin-conjugating enzyme E2I" (Ube2i); stark hochreguliert waren "early growth response 1" (Egr1), "cysteine-rich protein 61" (Cyr61), "dual-specificity phosphatase 4" (Dusp4), "fos-like antigen 1" (Fosl1), "epithelial membrane protein" (Emp1), Osteopontin (Opn), "insulin-like growth factor binding protein 3" (Igfbp3) und "tumor-associated antigen L6" (Taal6). Die für die Regulation dieser Gene verantwortlichen Signalwege wurden durch die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren und siRNA identifiziert, wobei für die SRC-Kinase FYN eine zentrale Bedeutung bei der Xmrk-abhängigen Regulation der Genexpression festgestellt wurde. Darüber hinaus wurde die Expression der Gene in humanen Melanomzelllinien im Vergleich zu normalen humanen Melanozyten untersucht. Als besonders vielversprechende Kandidaten stellten sich dabei DUSP4 und TAAL6 heraus, deren Rolle in der humanen Melanominduktion und -progression Gegenstand zukünftiger Studien sein wird. In einem anderen Ansatz zur Aufklärung des Signalnetzwerkes sollten Zielproteine von Xmrk durch Protein-Protein-Interaktionsstudien mit Hilfe des Split-Ubiquitin-Systems ermittelt werden. Aufgrund ungünstiger Expressions- oder Faltungseigenschaften von Xmrk in diesem System war es aber nicht möglich, den Rezeptor als Köderprotein einzusetzen. Das für die Xmrk-vermittelte Melanomentstehung zentrale Protein FYN konnte jedoch als Köder etabliert und seine Wechselwirkung mit der Tyrosinkinase FAK analysiert werden. Es wurde gezeigt, dass der phosphorylierte Tyrosinrest an Position 397 von FAK für die Interaktion einer N-terminal trunkierten FAK-Variante mit FYN notwendig ist und dass diese Phosphorylierung in Hefe gewährleistet zu sein scheint. Die Suche nach neuen Interaktionspartnern von FYN mittels der Split-Ubiquitin-Technologie könnte Einblicke in weitere FYN-abhängige Ereignisse bieten, die zur Aufklärung seiner zentralen Rolle bei der Tumorentstehung dienen könnte.
N2  - Melanoma is the most aggressive type of skin cancer with the highest mortality rate. The transformation of melanocytes to malignant melanoma is based on complex molecular and biochemical alterations. In the Xiphophorus melanoma model, the oncogenic receptor tyrosine kinase Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) is the sole trigger of melanoma initiation and progression. Elucidating Xmrk-dependent signaling pathways may contribute to a better understanding of processes that play a role in human melanomagenesis, too. Here, the regulation of gene expression by Xmrk was analyzed using a microarray approach. The genes with the strongest down-regulation in response to receptor activation included son of sevenless homolog 1 (Sos1) and ubiquitin-conjugating enzyme E2I (Ube2i), whereas early growth response 1 (Egr1), cysteine-rich protein 61 (Cyr61), dual-specificity phosphatase 4 (Dusp4), fos-like antigen 1 (Fosl1), epithelial membrane protein (Emp1), Osteopontin (Opn), insulin-like growth factor binding protein 3 (Igfbp3), and tumor-associated antigen L6 (Taal6) were strongly up-regulated. The pathways regulating expression of these genes were identified by applying small molecule inhibitors and siRNA. Interestingly, the SRC-family kinase FYN was found to be a key-player in Xmrk-dependent gene regulation. Furthermore, expression of the genes in human melanoma cell lines compared to normal human melanocytes was investigated. The most promising candidates, which might be important for melanoma induction and progression, were DUSP4 and TAAL6. Their potential suitability as diagnostic and prognostic melanoma markers will be addressed in future studies. In addition to gene expression analysis, protein-protein interactions were to be assayed by the split-ubiquitin-system in order to identify novel Xmrk targets. Unfortunately, inappropriate expression or folding of the receptor in this system precluded it from working as bait. However, the FYN protein, which has a central role in Xmrk-mediated signaling, was established as bait and its association with FAK was analyzed in more detail. A phosphorylated tyrosine residue at position 397 of FAK was demonstrated to be necessary for the interaction of an N-terminally truncated FAK variant with FYN, and this phosphorylation event seems to be feasible in yeast. In future, a split-ubiquitin based screen for novel interaction partners of FYN might provide insights into FYN-dependent processes and help to understand its central role in tumor development.
KW  - Melanom
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Microarray
KW  - Onkogen
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
KW  - Yeast-Two-Hybrid-System
KW  - Xiphophorus
KW  - Rezeptortyrosinkinase
KW  - Xmrk
KW  - Protein-Protein-Interaktion
KW  - Split-Ubiquitin-System
KW  - Microarray
KW  - EGFR
KW  - oncogene
KW  - melanoma
KW  - protein-protein interaction
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27516
ER  - 
TY  - THES
A1  - Staus, Madlen
T1  - Glutathione-dependent reprogramming in melanoma
T1  - Glutathion-abhängige Reprogrammierung im Melanom
N2  - These days, treatment of melanoma patients relies on targeted therapy with BRAF/MEK inhibitors and on immunotherapy. About half of all patients initially respond to existing therapies. Nevertheless, the identification of alternative therapies for melanoma patients with intrinsic or acquired resistance is of great importance. In melanoma, antioxidants play an essential role in the maintenance of the redox homeostasis. Therefore, disruption of the redox homeostasis is regarded as highly therapeutically relevant and is the focus of the present work. 
An adequate supply of cysteine is essential for the production of the most important intracellular antioxidants, such as glutathione. In the present work, it was investigated whether the depletion of cysteine and glutathione is therapeutically useful. Depletion of glutathione in melanoma cells could be achieved by blocking cysteine supply, glutathione synthesis, and NADPH regeneration. As expected, this led to an increased level of reactive oxygen species (ROS). Surprisingly, however, these changes did not impair the proliferation and survival of the melanoma cells. In contrast, glutathione depletion led to cellular reprogramming which was characterized by the induction of mesenchymal genes and the repression of differentiation markers (phenotypic switch). This was accompanied by an increased migration and invasion potential which was favored by the induction of the transcription factor FOSL1. To study in vivo reprogramming, Gclc, the first and rate-limiting enzyme in glutathione synthesis, was knocked out by CRISPR/Cas9 in murine melanoma cells. The cells were devoid of glutathione, but were fully viable and showed a phenotypic switch, the latter only in MITF-expressing B16F1 cells and not in MITF-deficient D4M3A.781 cells. Following subcutaneous injection into immunocompetent C57BL/6 mice, Gclc knockout B16F1 cells grew more aggressively and resulted in an earlier tumor onset than B16F1 control cells.
In summary, this work demonstrates that inhibition of cysteine supply and thus, glutathione synthesis leads to cellular reprogramming in melanoma. In this context, melanoma cells show metastatic capabilities, promoting a more aggressive form of the disease.
N2  - Die Behandlung von Melanompatienten beruht heutzutage auf der gerichteten Therapie mit BRAF/MEK Inhibitoren und auf der Immuntherapie. Circa die Hälfte aller Patienten spricht zunächst auf die vorhandenen Therapien an. Dennoch ist die Identifizierung alternativer Therapieansätze für Melanompatienten mit intrinsischer oder erworbener Resistenz von großer Wichtigkeit. Im Melanom spielen Antioxidanzien eine essenzielle Rolle zur Aufrechterhaltung der Redox-Homöostase. Eine Störung der Redox-Homöostase wird daher als therapeutisch hochrelevant betrachtet und steht im Fokus der vorliegenden Arbeit. 
Eine ausreichende Versorgung mit Cystein ist essenziell zur Produktion der wichtigsten intrazellulären Antioxidanzien wie dem Glutathion. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Depletion von Cystein und Glutathion therapeutisch nützlich ist. Eine Depletion von Glutathion in Melanomzellen konnte durch eine Blockierung der Cysteinversorgung, der Glutathionsynthese und der NADPH-Regeneration erreicht werden. Dies führte wie erwartet zu einem erhöhten Level von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). Überraschenderweise beeinträchtigten diese Veränderungen jedoch nicht die Proliferation und das Überleben der Melanomzellen. Im Gegenteil führte die Glutathion-Depletion zu einer zellulären Reprogrammierung, die durch die Induktion mesenchymaler Gene und der Repression von Differenzierungsmarkern gekennzeichnet war (phenotypic switch). Dies ging mit einem erhöhten Migrations- und Invasionspotential einher, welches durch die Induktion des Transkriptionsfaktors FOSL1 begünstigt wurde. Für die Untersuchung der Reprogrammierung in vivo wurde Gclc, das erste und geschwindigkeitsbestimmende Enzym der Glutathionsynthese, mittels CRISPR/Cas9 in murinen Melanomzellen ausgeknockt. Die Zellen waren voll lebensfähig und zeigten erwartungsgemäß reduzierte Glutathionlevel und einen phenotypic switch. Letzterer zeigte sich jedoch nur in MITF-exprimierenden B16F1 Zellen und nicht in MITF-defizienten D4M3A.781 Zellen. Nach subkutaner Injektion in immunkompetente C57BL/6 Mäuse wuchsen die Gclc-knockout B16F1 Zellen aggressiver und führten zu einer früheren Tumorentstehung als B16F1 Kontrollzellen. 
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die Hemmung der Cysteinversorgung und somit der Glutathionmenge im Melanom zu einer Reprogrammierung führt, bei der Melanomzellen metastasierende Fähigkeiten aufweisen und somit zu einer aggressiveren Form der Erkrankung führen.
KW  - Melanom
KW  - Glutathion
KW  - Cystein
KW  - Phenotypic switch
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168424
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schrama, David
T1  - T-Zell-priming außerhalb sekundärer lymphatischer Gewebe
T1  - T-cell priming outside of secondary lymphoid tissue
N2  - T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht.
N2  - Cellular immune responses are initiated by direct interaction of naïve T cells with professional antigen presenting cells, i.e., dendritic cells. In general, this interaction takes place in secondary lymphoid organs: immature dendritic cells capture antigen in the periphery, and while homing to the secondary lymphoid organs they mature and process the antigen. In these organs they present peptides derived from the antigen together with co-stimulatory molecules to the naïve T cells and thereby initiate an antigen-specific T cell response. In the present work we tested if situations can be created allowing priming outside secondary lymphoid organs. To this end, a murine model in which lymphotoxin-alpha was specifically accumulated at the tumor site and a human model where in vitro generated, matured and antigen pulsed dendritic cells were injected intradermal into the patients were investigated. In the murine model the accumulation of lymphotoxin-alpha at the tumor site led to the eradication of the tumor. This therapeutic success was mediated by T cells and associated with the induction of a tertiary lymphoid tissue characterized by compartmentalized T and B cell aggregates and the presence of high endothelial venules. Moreover, with dendritic cells and naïve T cells present in these tissues requirements for in loco priming were fulfilled. Indeed, targeted lymphotoxin-alpha enlarged the T cell-infiltrate within the tumor. In vitro assays demonstrated the tumor-specificity of the therapy-induced infiltrate. In the human model skin biopsies taken from melanoma patients receiving dendritic cell based vaccination and participating at a clinical I study were investigated. The patients provided informed consent to participate in this experimental procedure and to donate skin biopsies for immunological monitoring. Skin biopsies were taken from the injection sites in which autologous, in vitro generated, maturated and antigen-pulsed dendritic cells were injected. Several reports including one about patients from the present patient cohort demonstrated the induction and/or enhancement of tumor specific T cell responses subsequent to dendritic cells based vaccination therapy. Our analysis demonstrated that most of the injected dendritic cells were entrenched at the injection site. The mere presence of mature dendritic cells in the skin caused the induction of high endothelial venules. In case the dendritic cells were pulsed with antigen the T cell infiltrate was enlarged and consisted both of naïve and central memory T cells. These cells were presumably attracted by the overexpression of the T cell attractant chemokines DC-CK1 and SDF-1 leading to an oligoclonal T cell infiltrate composed partially of tumor specific T cells. As T cell clones detected within the injections sites were not present among the peripheral blood lymphocytes, these clones were at least expanded in the injection sites. Notably, one clone could be detested in metastases of one patient excised after the vaccination. In both models manipulation of the microenvironment, i.e. targeting lymphotoxin-alpa to the tumor or injecting mature dendritic cells into the skin, respectively, induced structures like high endothelial venules which should enable in loco priming. Accordingly, these changes induced a tumor antigen specific T cell infiltrate. Thus, these results imply that T cells can be primed outside of secondary lymphoid tissues. Generally, the contact between mature, antigen presenting dendritic cells and the respective antigen specific T cells should be the only necessity for priming. Notably, the possibility of in vitro priming sustains this thesis. In vivo secondary lymphoid organs enable this contact. The present work, however, demonstrates that this contact can also take place in different tissue caused by manipulation of the respective microenvironment.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Priming
KW  - Melanom
KW  - Melanom
KW  - T-Zelle
KW  - priming
KW  - tertiäres lymphatisches Gewebe
KW  - Immunoconjugate
KW  - melanoma
KW  - T-cell
KW  - priming
KW  - tertiary lymphoid tissue
KW  - immunoconjugate
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15060
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmitt, Alexandra
T1  - Role of Peroxiredoxin 6 in human melanoma
T1  - Die Funktion von Peroxiredoxin 6 im humanen Melanom
N2  - Peroxiredoxin 6 (PRDX6) is a bifunctional enzyme comprising a peroxidase and a Ca2+-independent phospholipase (iPLA2) activity. This renders the enzyme capable of detoxifying reactive oxygen species (ROS) and of catalyzing the liberation of arachidonic acid (AA) from cellular membranes. Released AA can be further metabolized to bioactive lipids including eicosanoids, which are involved in inflammation, cell growth, differentiation, invasion and proliferation. Human melanoma cells are often characterized by imbalances in both ROS and lipid levels, which can be generated by oncogenic signaling, altered metabolism or UV irradiation. 
In previous studies, a comparative proteome analysis of the Xiphophorus fish melanoma model revealed a strong upregulation of Prdx6 in benign and malignant lesions compared to healthy skin. As the Xiphophorus melanoma model displays in many respects molecular characteristics that are similar to human melanoma, I investigated the functional role of PRDX6 in human melanoma cells.
The first part of the study deals with the regulation of PRDX6 in melanocytes and human melanoma cells. I could demonstrate that the protein level of PRDX6 was strongly enhanced by the induction of the EGFR orthologue Xmrk from the Xiphophorus fish as well as the human EGFR. The upregulation of PRDX6 was further shown to be mediated in a PI3K-dependent and ROS-independent manner.
The main part of the thesis comprises the investigation of the functional role of PRDX6 in human melanoma cells as well as the analysis of the underlying mechanism. I could show that knockdown of PRDX6 enhanced the oxidative stress response and led to decreased proliferation of melanoma cells. This cell growth effect was mainly mediated by the iPLA2 activity of PRDX6. Under conditions of strongly enhanced oxidative stress, the peroxidase activity became also important for cellular proliferation. Furthermore, the anti-proliferative effect in cells with lowered PRDX6 levels was the result of reduced cellular AA content and the decrease in the activation of SRC family proteins. Similarly, supplementation with AA led to regeneration of SRC family kinase activity and to an improvement in the reduced proliferation after knockdown of PRDX6. Since AA can be further processed into the prostaglandin PGE2, which has a pro-tumorigenic function in some cancer types, I further examined whether this eicosanoid is involved in the proliferative function of PRDX6. In contrast to AA, PGE2 was not consistently required for melanoma proliferation. 
In summary, I could demonstrate that PRDX6 plays a major role in AA-dependent lipid signaling in melanoma cells and thereby regulates proliferation. Interestingly, the proliferation relevant iPLA2 activity can be pharmacologically targeted, and melanoma cell growth was clearly blocked by the inhibitor BEL. Thus, I could identify the phospholipase activity of PRDX6 as a new therapeutically interesting target for melanoma treatment.
N2  - Peroxiredoxin 6 (PRDX6) ist ein bifunktionales Enzym, welches neben seiner Peroxidase-Aktivität auch eine Ca2+-unabhängige Phospholipase-Aktivität besitzt. Aufgrund dieser beiden Aktivitäten ist das Enzym in der Lage, sowohl oxidativen Stress zu bekämpfen als auch die Freisetzung von Arachidonsäure aus zellulären Membranen zu katalysieren. Freie Arachidonsäure (AA) dient der Generierung von bioaktiven Lipiden wie zum Beispiel Eicosanoiden, welche an Entzündungsreaktionen, Zellwachstum, Differenzierung, Invasion und Proliferation beteiligt sind. Humane Melanomzellen zeichnen sich oft durch ein gestörtes Gleichgewicht reaktiver Sauerstoffspezies und zellulärer Lipide aus. Dieses Ungleichgewicht kann durch onkogene Signalgebung, einen veränderten Metabolismus oder UV-Bestrahlung hervorgerufen werden. 
Eine vorangegangene Proteomanalyse des Xiphophorus-Fisch-Melanommodells zeigte, dass im Vergleich zur gesunden Haut die Menge an PRDX6 in benignen und malignen Läsionen stark erhöht ist. Da das Xiphophorus-Melanommodell in vielerlei Hinsicht die molekulare Situation des humanen Melanoms wiederspiegelt, habe ich die funktionale Rolle von PRDX6 in humanen Melanomzellen untersucht. 
Der erste Teil der Studie beschäftigt sich mit der Regulierung von PRDX6 in Melanozyten und humanen Melanomzellen. Ich konnte nachweisen, dass die Menge an PRDX6 Protein durch die Induktion des EGFR Orthologs Xmrk aus Xiphophorus Fischen, sowie des humanen EGFR stark erhöht wurde. Auch konnte ich zeigen, dass die Heraufregulierung von PRDX6 von der Signalgebung der PI3 Kinase, aber nicht von reaktiven Sauerstoffspezies abhängig war.
Der Hauptteil der vorliegenden Forschungsarbeit befasst sich mit der Ermittlung der funktionalen Rolle von PRDX6 in humanen Melanomzellen und der Analyse des  zugrundeliegenden Mechanismus. Ich konnte nachweisen, dass ein Knockdown von PRDX6 die oxidative Stress-Antwort verstärkte und die Proliferation von Melanomzellen reduzierte. Der Effekt auf das zelluläre Wachstum wurde hierbei hauptsächlich durch die iPLA2-Aktivität von PRDX6 verursacht. Bei stark erhöhtem oxidativem Stress konnte auch eine Relevanz der Peroxidase-Aktivität für die zelluläre Proliferation nachgewiesen werden. Auch ging der anti-proliferative Effekt mit einer Abnahme zellulärer AA und der Reduktion aktiver Kinasen der SRC-Familie einher. Die Zugabe von AA zu Zellen mit PRDX6-Knockdown führte zur Regeneration der SRC-Kinase-Aktivität und konnte die Proliferation wieder verbessern. Da AA zum Prostaglandin PGE2 prozessiert werden kann, welches in einigen Krebsarten pro-tumorigene Funktionen erfüllt, untersuchte ich, ob dieses Eicosanoid auch für die proliferative Funktion von PRDX6 relevant ist. Im Gegensatz zu AA wies PGE2 jedoch keine kontinuierliche pro-proliferative Funktion auf. 
Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass PRDX6 eine entscheidende Rolle im AA- Stoffwechsel von Melanomzellen spielt und hierdurch die Proliferation reguliert. Interessanterweise ist die proliferationsrelevante iPLA2-Aktivität pharmakologisch hemmbar, und auch das Wachstum der Melanomzellen wurde durch den Inhibitor BEL deutlich inhibiert. Mit der Phospholipase-Aktivität von PRDX6 konnte ich somit einen neuen therapeutisch nutzbaren Angriffspunkt für das Melanom identifizieren.
KW  - Melanom
KW  - Peroxiredoxin 6
KW  - peroxiredoxin 6
KW  - Melanom
KW  - melanoma
KW  - Arachidonsäure
KW  - arachidonic acid
KW  - Prostaglandin E2
KW  - prostaglandin E2
KW  - Melanomzellen
KW  - melanoma cells
KW  - Peroxiredoxin
KW  - Arachidonsäure
KW  - Prostaglandin E2
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111465
ER  - 
TY  - THES
A1  - Robubi, Armin
T1  - RAF Kinases: Pathway, Modulation and Modeling
T1  - RAF Kinase: Signalweg, Modulation und Modellierung
N2  - The Ras/RAF/MEK/ERK cascade is a central cellular signal transduction pathway involved in cell proliferation, differentiation, and survival where RAF kinases are pivotal kinases implicated in cancer. The development of specific irreversible kinase inhibitors is a rewarding but difficult aim. CI-1033 was developed to irreversibly inhibit erbB receptor tyrosine kinases by reacting to the Cys113 residue (p38alpha MAP kinase numbering) of the kinase domain. In this study we tried a similar approach to target the RAF oncoproteins which posses a similar cysteine at position 108 in the hinge region between the small n-lobe and the large c-lobe of the kinase domain. A novel synthetic approach including a lyophilization step allowed us the synthesis of a diphenyl urea compound with an epoxide moiety (compound 1). Compound 1 possessed inhibitory activity in vitro. However our time kinetics experiments and mass spectroscopic studies clearly indicate that compound 1 does not react covalently with the cysteine residue in the hinge region. Moreover, in cell culture experiments, a strong activation of the RAF signaling pathway was observed, an effect which is known from several other RAF kinase inhibitors and is here reported for the first time for a diphenyl urea compound, to which the clinically used unspecific kinase inhibitor BAY 43-9006 (Sorafinib, Nexavar) belongs. Although activation was apparently independent on B- and C-RAF hetero-oligomerization in vitro, in vivo experiments support such a mechanism as the activation did not occur in starved knockout cells lacking either B-RAF or C-RAF. Furthermore, we developed a mathematical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade demonstrating how stimuli induce different signal patterns and thereby different cellular responses, depending on cell type and the ratio between B-RAF and C-RAF. Based on biochemical data for activation and dephosphorylation, we set up differential equations for a dynamical model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade. We find a different signaling pattern and response result for B-RAF (strong activation, sustained signal) and C-RAF (steep activation, transient signal). We further support the significance of such differential modulatory signaling by showing different RAF isoform expression in various cell lines and experimental testing of the predicted kinase activities in B-RAF, C-RAF as well as mutated versions. Additionally the effect of the tumor suppressor DiRas3 (also known as Noey2 or ARHI) on RAF signaling was studied. I could show that DiRas3 down-regulates the mitogenic pathway by inhibition of MEK, a basis for a refined model of the Ras/RAF/MEK/ERK cascade.
N2  - Die Ras/RAF/MEK/ERK Kaskade ist ein zentraler zellulärer Signalweg, der bei der Regulierung der Proliferation, Differenzierung und Überleben der Zelle eine entscheide Rolle spielt. Dabei kommt den RAF Kinasen eine Schlüsselrolle bei der Tumorgenese zu. Die Entwicklung von spezifischen irreversiblen Kinasehemmern stellt einen attraktiven, jedoch schwierigen Ansatz zur Tumorsupression dar. CI-1033 wurde erfolgreich mit dem Ziel entwickelt, ErbB-Rezeptor-Tyrosinkinasen irreversibel zu inhibieren, indem es kovalent mit dem Cys113 (p38alpha MAP Kinase Nummerierung) in der Kinase-Domäne reagiert. In dieser Arbeit wird ein vergleichbarer Ansatz gegen die RAF-Onkoproteine verfolgt, die einen analogen Cystein-Rest in der Position 108 aufweisen. Dieser ist in der Hinge-Region zwischen dem kleinen n-lobe und dem großen c-lobe der Kinase-Domäne lokalisiert. Ein neuer synthetischer Ansatz, der einen Lyophilisierungsschritt mit einschloss, erlaubte hierfür die Synthese einer Diphenylharnstoff-Verbindung mit einer Epoxidgruppe (Verbindung 1). Verbindung 1 zeigt in vitro tatsächlich eine inhibitorische Aktivität gegen RAF-Kinasen. Jedoch zeigen unsere zeitkinetischen Experimente, sowie unsere massenspektrometrischen Analysen, dass Verbindung 1 keine kovalente Bindung mit dem Cystein-Rest in der Hinge-Region bildet. Außerdem stellten wir in Zellkulturexperimenten eine starke Aktivierung des RAF-induzierten Signalweges fest; ein Effekt, der bereits für andere RAF-Kinase-Inhibitoren beschrieben wurde, jedoch hier erstmalig auch für eine Diphenylharnstoff-Verbindung, zu der auch BAY 43-9006 (Sarafinib, Nexavar) gehört. BAY 43-9006 ist ein unspezifischer, für die Behandlung von Krebs zugelassener, Kinase Inhibitor. Obwohl die Aktivierung in vitro scheinbar unabhängig von einer Heterooligomerisierung von B-RAF und C-RAF war, unterstützen in vivo Experimente einen solchen Mechanismus, da in gehungerten knockout Zellen, in denen B-RAF oder C-RAF fehlte, keine Aktivierung beobachtet werden konnte. Des Weiteren zeigten wir in einem mathematischen Modell, wie abhängig vom B-RAF/C-RAF-Verhältnis verschiedene Zellantworten durch unterschiedliche Stimuli induzierbar werden. Basierend auf biochemischen Daten über Aktivierung und Dephosphorylierung sowie auf den Differentialgleichungen unseres Rechenmodells fanden wir eine unterschiedliche Signalkinetik für B-RAF (starke Aktivierung, anhaltendes Signal) und C-RAF (schwache Aktivierung, transientes Signal). Die Bedeutung dieser differenzierten Signalmodifikation wurde auch durch unterschiedliche Expression der RAF Isoformen in verschiedenen Zelllinien und durch die experimentelle Messung der Kinaseaktivität von B- und C-RAF sowie mutierte Formen überprüft. Zusätzlich wurde der Effekt des Tumorsupressorproteins DiRas3 (auch bekannt als Noey2 oder ARHI) auf den RAF-Signalweg untersucht. Wir konnten zeigen, dass DiRas3 den mitogenen Signalweges durch Inhibierung der mitogen-aktivierten Proteinkinase Kinase (MEK) negativ reguliert, eine Basis für ein verfeinertes Modell der Ras/RAF/MEK/ERK Kaskade.
KW  - Systembiologie
KW  - RAf
KW  - BAY 43-9006
KW  - Sorafinib
KW  - Nexavar
KW  - DiRas3
KW  - Noey2
KW  - ARHI
KW  - Diphenylharnstoff
KW  - Krebs
KW  - Melanom
KW  - Kinase Inhibitor
KW  - RAF
KW  - BAY 43-9006
KW  - Sorafinib
KW  - Nexavar
KW  - DiRas3
KW  - Noey2
KW  - ARHI
KW  - diphenyl urea
KW  - cancer
KW  - melanoma
KW  - kinase inhibitor
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26953
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reinboth, Jennifer
T1  - Cellular Factors Contributing to Host Cell Permissiveness in Support of Oncolytic Vaccinia Virus Replication
T1  - Beteiligung zellulärer Faktoren an der Permissivität von Wirtszellen in Unterstützung der onkolytischen Vaccinia Virus Replikation
N2  - In initial experiments, the well characterized VACV strain GLV-1h68 and three wild-type LIVP isolates were utilized to analyze gene expression in a pair of autologous human melanoma cell lines (888-MEL and 1936 MEL) after infection. Microarray analyses, followed by sequential statistical approaches, characterized human genes whose transcription is affected specifically by VACV infection. In accordance with the literature, those genes were involved in broad cellular functions, such as cell death, protein synthesis and folding, as well as DNA replication, recombination, and repair. In parallel to host gene expression, viral gene expression was evaluated with help of customized VACV array platforms to get better insight over the interplay between VACV and its host. Our main focus was to compare host and viral early events, since virus genome replication occurs early after infection. We observed that viral transcripts segregated in a characteristic time-specific pattern, consistent with the three temporal expression classes of VACV genes, including a group of genes which could be classified as early-stage genes. In this work, comparison of VACV early replication and respective early gene transcription led to the identification of seven viral genes whose expression correlated strictly with replication. We considered the early expression of those seven genes to be representative for VACV replication and we therefore referred to them as viral replication indicators (VRIs). To explore the relationship between host cell transcription and viral replication, we correlated viral (VRI) and human early gene expression. Correlation analysis revealed a subset of 114 human transcripts whose early expression tightly correlated with early VRI expression and thus early viral replication. These 114 human molecules represented an involvement in broad cellular functions. We found at least six out of 114 correlates to be involved in protein ubiquitination or proteasomal function. Another molecule of interest was the serine-threonine protein kinase WNK lysine-deficient protein kinase 1 (WNK1). We discovered that WNK1 features differences on several molecular biological levels associated with permissiveness to VACV infection. In addition to that, a set of human genes was identified with possible predictive value for viral replication in an independent dataset. A further objective of this work was to explore baseline molecular biological variances associated with permissiveness which could help identifying cellular components that contribute to the formation of a permissive phenotype. Therefore, in a subsequent approach, we screened a set of 15 melanoma cell lines (15-MEL) regarding their permissiveness to GLV-1h68, evaluated by GFP expression levels, and classified the top four and lowest four cell lines into high and low permissive group, respectively. Baseline gene transcriptional data, comparing low and highly permissive group, suggest that differences between the two groups are at least in part due to variances in global cellular functions, such as cell cycle, cell growth and proliferation, as well as cell death and survival. We also observed differences in the ubiquitination pathway, which is consistent with our previous results and underlines the importance of this pathway in VACV replication and permissiveness. Moreover, baseline microRNA (miRNA) expression between low and highly permissive group was considered to provide valuable information regarding virus-host co-existence. In our data set, we identified six miRNAs that featured varying baseline expression between low and highly permissive group. Finally, copy number variations (CNVs) between low and highly permissive group were evaluated. In this study, when investigating differences in the chromosomal aberration patterns between low and highly permissive group, we observed frequent segmental amplifications within the low permissive group, whereas the same regions were mostly unchanged in the high group. Taken together, our results highlight a probable correlation between viral replication, early gene expression, and the respective host response and thus a possible involvement of human host factors in viral early replication. Furthermore, we revealed the importance of cellular baseline composition for permissiveness to VACV infection on different molecular biological levels, including mRNA expression, miRNA expression, as well as copy number variations. The characterization of human target genes that influence viral replication could help answering the question of host cell response to oncolytic virotherapy and provide important information for the development of novel recombinant vaccinia viruses with improved features to enhance replication rate and hence trigger therapeutic outcome.
N2  - Die Replikationseffizienz von VACVs spielt eine maßgebliche Rolle für deren antitumorale Wirkung und onkolytische Effizienz. Ferner hängt die Permissivität einer Wirtszelle gegenüber der Behandlung mit onkolytischen VACVs maßgeblich von einer erfolgreichen viralen Replikation und Vermehrung ab. Darauf basierend, war der Fokus der vorliegenden Arbeit, zelluläre Eigenschaften zu erforschen, welche die VACV-Replikation beeinflussen und die Wirtszell-Permissivität gegenüber einer Behandlung mit VACV prognostizieren können. Für initiale Genexpressionsanalysen wurden zwei autologe, humane Melanom-Zelllinien (888-MEL und 1936 MEL), sowie der ausgiebig charakterisierte VACV-Stamm GLV-1h68 und drei wildtypische LIVP Isolate verwendet. Mit Hilfe von Microarray Analysen und einem sequenziellen statistischen Ansatz konnten humane Gene charakterisiert werden, deren Transkription eigens durch VACV-Infektion beeinflusst wird. Erwartungsgemäß zeigten diese Gene eine Anreicherung in globalen zellulären Signalwegen und Funktionen. Die frühe virale Gentranskription kann als repräsentative Bestimmungsgröße für virale Replikation betrachtet werden. Darauf basierend resultierte der Vergleich von früher VACV Replikation und entsprechender früher Gentranskription in der Identifikation von sieben viralen Genen, deren Expression und Replikation stark korrelierten. Aus diesem Grund wurde die frühe Expression der sieben VACV-Gene als kennzeichnend für virale Replikation angesehen und diese Gene als virale Replikations-Indikatoren (VRIs) definiert. Zur Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Wirts-Transkription und viraler Replikation wurde die frühe virale VRI-Expression mit der frühen humanen Genexpression in Beziehung gesetzt. Mit Hilfe von Vergleichsanalysen wurden 114 humane Transkripte identifiziert, deren frühes Expressionsmuster eng mit demjenigen der VRIs korrelierte und dementsprechend ebenso mit der viralen Replikation. Von den 114 Korrelaten spielen mindestens sechs eine Rolle in der Protein-Ubiquitinierung oder in der proteasomalen Signalgebung. Ein weiteres Molekül, welches besonderes Interesse weckte, war die Serin-Threonin Proteinkinase WNK Lysin-defizientes Protein 1 (WNK1). Für WNK1 wurden Unterschiede, die mit der VACV-Infektions-Permissivität zusammenhängen, auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen nachgewiesen. Desweiten wurde in dieser Arbeit eine Anzahl humaner Gene identifiziert, welche virale Replikation in einem unabhängigen Datensatz prognostizieren konnten. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, molekularbiologische Unterschiede, welche mit Infektions-Permissivität von Zellen assoziiert sind, auf Basisebene zu ergründen. Diese könnten dabei helfen, zelluläre Komponenten zu identifizieren, welche einen so genannten permissiven Phänotyp kennzeichnen. Aus diesem Grund wurden in einem weiteren Versuchsansatz 15 Melanom-Zelllinien (15-MEL) bezüglich ihrer Permissivität gegenüber GLV-1h68 anhand von GFP Expression untersucht. Die vier Zelllinien mit der höchsten und diejenigen vier mit der niedrigsten Permissivität wurden je einer Gruppe zugeordnet (hochpermissive und niedrigpermissive Gruppe). Die Gruppen hoher und niedriger Permissivität wurden bezüglich ihrer Basislevel-Transkription verglichen. Unterschiedlich exprimierte Gene waren, zumindest zum Teil, in globale zelluläre Prozesse involviert. Darüber hinaus wurde microRNA (miRNA) Basislevel-Expression von hoch- und niedrigpermissiver Gruppe untersucht. In dieser Arbeit wurden sechs miRNAs identifiziert, deren Basislevel-Expression zwischen niedrig und hochpermissiver Gruppe differiert. Abschließend wurden Veränderungen der Kopienzahl von Genen (copy number variations, CNVs) im Vergleich zwischen niedrig- und hochpermissiver Gruppe untersucht. Betrachtung chromosomaler Veränderungen zeigte eine Anreicherung von Segment-Amplifikationen in der niedrigpermissiven Gruppe, während gleiche Abschnitte der hochpermissiven Gruppe größtenteils keine Veränderungen aufwiesen. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine mutmaßliche Korrelation zwischen viraler Replikation, früher Genexpression und der entsprechenden Wirtsantwort gezeigt werden und somit eine mögliche Beteiligung humaner Wirtsfaktoren an der viralen Replikation. Zusätzlich wurden wichtige Aspekte der Basiskomposition von Zellen für die Permissivität gegenüber VACV-Infektion auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen aufgedeckt, einschließlich mRNA-Expression, miRNA-Expression sowie Kopienzahl-Variationen. Die Charakterisierung humaner Zielgene, welche die virale Replikation beeinflussen, könnte dabei helfen, die Wirtszellantwort auf onkolytische Virotherapie aufzuklären und wichtige Informationen zu liefern für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Vaccinia-Viren mit verbesserten Eigenschaften und verbesserter Replikationseffizienz und somit einem gesteigerten Therapieerfolg.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Microarray
KW  - Melanom
KW  - onkolytische Virotherapie
KW  - Vaccinia Virus Replikation
KW  - vaccinia virus
KW  - microarray
KW  - malignant melanoma
KW  - oncolytic virotherapy
KW  - vaccinia virus replication
KW  - Onkolyse
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85392
ER  - 
TY  - THES
A1  - Regneri, Janine
T1  - Transcriptional regulation of cancer genes in the Xiphophorus melanoma system
T1  - Transkriptionelle Regulation von Krebsgenen im Xiphophorus-Melanommodell
N2  - The Xiphophorus melanoma system is a useful animal model for the study of the genetic basis of tumor formation. The development of hereditary melanomas in interspecific hybrids of Xiphophorus is connected to pigment cell specific overexpression of the mutationally activated receptor tyrosine kinase Xmrk. In purebred fish the oncogenic function of xmrk is suppressed by the molecularly still unidentified locus R. The xmrk oncogene was generated by a gene duplication event from the Xiphophorus egfrb gene and thereby has acquired a new 5’ regulatory sequence, which has probably altered the transcriptional control of the oncogene. So far, the xmrk promoter region was still poorly characterized and the molecular mechanism by which R controls xmrk-induced melanoma formation in Xiphophorus still remained to be elucidated. To test the hypothesis that R controls melanoma development in Xiphophorus on the transcriptional level, the first aim of the thesis was to gain a deeper insight into the transcriptional regulation of the xmrk oncogene. To this end, a quantitative analysis of xmrk transcript levels in different Xiphophorus genotypes carrying either the highly tumorigenic xmrkB or the non-tumorigenic xmrkA allele was performed. I was able to demonstrate that expression of the tumorigenic xmrkB allele is strongly increased in malignant melanomas of R-free backcross hybrids compared to benign lesions, macromelanophore spots, and healthy skin. The expression level of the non-tumorigenic xmrkA allele, in contrast, is not influenced by the presence or absence of R. These findings strongly indicate that differential transcriptional regulation of the xmrk promoter triggers the tumorigenic potential of these xmrk alleles. To functionally characterize the xmrk promoter region, I established a luciferase assay using BAC clones containing the genomic regions where xmrk and egfrb are located for generation of reporter constructs. This approach showed for the first time a melanoma cell specific transcriptional activation of xmrkB by its flanking regions, thereby providing the first functional evidence that the xmrk oncogene is controlled by a pigment cell specific promoter region. Subsequent analysis of different deletion constructs of the xmrkB BAC reporter construct strongly indicated that the regulatory elements responsible for the tumor-inducing overexpression of xmrkB in melanoma cells are located within 67 kb upstream of the xmrk oncogene. Taken together, these data indicate that melanoma formation in Xiphophorus is regulated by a tight transcriptional control of the xmrk oncogene and that the R locus acts through this mechanism. As the identification of the R-encoded gene(s) is necessary to fully understand how melanoma formation in Xiphophorus is regulated, I furthermore searched for alternative R candidate genes in this study. To this end, three genes, which are located in the genomic region where R has been mapped, were evaluated for their potential to be a crucial constituent of the regulator locus R. Among these genes, I identified pdcd4a, the ortholog of the human tumor suppressor gene PDCD4, as promising new candidate, because this gene showed the expression pattern expected from the crucial tumor suppressor gene encoded at the R locus.
N2  - Fische der Gattung Xiphophorus sind ein gut etabliertes Modellsystem zur Analyse der genetischen Grundlagen der Tumorentwicklung. Die Entwicklung hereditärer Melanome in bestimmten interspezifischen Xiphophorus-Hybriden wird durch die pigmentzellspezifische Überexpression des Onkogens xmrk ausgelöst. Dieses Gen codiert für eine durch Mutationen aktivierte Rezeptortyrosinkinase. In den reinerbigen Elterntieren wird die onkogene Funktion von xmrk durch den Regulator-Locus R unterdrückt, welcher jedoch auf molekularer Ebene noch nicht identifiziert wurde. Das Onkogen xmrk ist durch eine Genduplikation aus dem Protoonkogen egfrb entstanden und hat dabei eine neue regulatorische 5‘ Region erhalten, welche mit hoher Wahrscheinlichkeit die transkriptionelle Regulation des Onkogens verändert hat. Die Promotorregion von xmrk war allerdings bisher nur unzureichend charakterisiert und der molekulare Mechanismus, durch den der R-Locus die xmrk-induzierte Melanomentwicklung kontrolliert, war noch weitgehend unbekannt. Um zu analysieren, ob der R-Locus die Melanomentwicklung in Xiphophorus auf transkriptioneller Ebene kontrolliert, war das erste Ziel dieser Arbeit die transkriptionelle Regulation des xmrk Onkogens genauer zu untersuchen. Zu diesem Zweck habe ich eine quantitative Analyse der xmrk Expressionslevel in Geweben verschiedener Xiphophorus-Genotypen durchgeführt, welche entweder das stark tumorigene xmrkB oder das nicht tumorigene xmrkA Allel besitzen. Ich konnte zeigen, dass im Vergleich zu benignen Läsionen, Macromelanophoren und gesunder Haut, die Expression des tumorigenen xmrkB Allels in den malignen Melanomen der R-defizienten Rückkreuzungshybride stark erhöht ist. Das Expressionslevel des xmrkA Allels wird hingegen nicht durch den R-Locus beeinflusst. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine differenzielle transkriptionelle Regulierung des xmrk Promotors für die Unterschiede im onkogenen Potential dieser Allele verantwortlich ist. Um die xmrk Promotorregion funktional zu charakterisieren, habe ich in der hier vorliegenden Studie einen Luciferase-Assay etabliert, für den BAC-Klone, welche die xmrk- oder egfrb-Region enthalten, zur Herstellung von Reporterkonstrukten verwendet wurden. Mit Hilfe dieses Ansatzes konnte ich zum ersten Mal eine melanomzellspezifische Aktivierung des xmrkB Gens durch seine regulatorischen Regionen zeigen. Dies liefert den ersten funktionalen Beweis, dass das xmrk Onkogen tatsächlich durch einen pigmentzellspezifischen Promotor kontrolliert wird. Durch die nachfolgende Analyse einer Deletionsserie des xmrkB Reporterkonstrukts konnte gezeigt werden, dass die regulatorischen Elemente, welche die starke Überexpression von xmrk in Melanomzellen steuern, in den proximalen 67 kb der xmrk 5‘ Region lokalisiert sind. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Melanomentwicklung in Xiphophorus durch eine strikte transkriptionelle Kontrolle des xmrk Onkogens reguliert wird und dass der Regulator-Locus R seine tumorsuppressive Funktion über diesen Mechanismus ausübt. Da die Identifizierung des R-Locus-Gens entscheidend ist, um die Melanomentwicklung in Xiphophorus vollständig zu verstehen, habe ich im zweiten Teil dieser Arbeit drei Gene, welche in derselben genomischen Region liegen in der R lokalisiert wurde, genauer untersucht, um zu testen, ob es sich bei einem dieser Gene um eine entscheidende tumorsuppressive Komponente des R-Locus handelt. Von diesen Genen wurde pdcd4a, welches das Ortholog zum humanen Tumorsuppressorgen PDCD4 ist, als vielversprechendes neues Kandidatengen identifiziert, da das Expressionsmuster von pdcd4a mit dem zu erwartenden Expressionsmuster des am R-Locus codierten Tumorsuppressorgens übereinstimmt.
KW  - Melanom
KW  - Schwertkärpfling
KW  - Chromatophor
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor
KW  - Onkogen
KW  - Tumorsuppressorgen
KW  - Hybrid
KW  - transkriptionelle Regulation
KW  - melanoma
KW  - Xiphophorus
KW  - xmrk
KW  - transcriptional control
KW  - pigment cell
KW  - Hautkrebs
KW  - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-82319
ER  -