TY - THES A1 - Dusik, Verena T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 in der inneren Uhr von Drosophila melanogaster T1 - Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster N2 - Circadianes und Stress-System sind zwei physiologische Systeme, die dem Organismus helfen sich an Veränderungen ihrer Umwelt anzupassen. Während letzteres spontane und schnelle Antworten auf akute, unvorhersehbare Umweltreize liefert, sagt das circadiane System täglich wiederkehrende Ereignisse vorher and bereitet den Organismus so vorzeitig auf diese nahende Umweltveränderung vor. Dennoch, trotz dieser unterschiedlichen Reaktionsmechanismen agieren beide Systeme nicht komplett autonom. Studien der vergangen Jahre belegen vielmehr eine Interaktion beider Systeme. So postulieren sie zum einem Unterschiede in der Stressantwort in Abhängigkeit von der Tageszeit zu der der Reiz auftritt und weisen zugleich auf eine Zunahme von gestörten biologischen Tagesrhythmen, wie zum Beispiel Schlafstörungen, in Folge von unkontrollierten oder exzessiven Stress hin. Ebenso liefern kürzlich durchgeführte Studien an Vertebraten und Pilzen Hinweise, dass mit p38, eine Stress-aktivierte Kinase, an der Signalweiterleitung zur inneren Uhr beteiligt ist (Hayashi et al., 2003), sogar durch dieses endogene Zeitmesssystem reguliert wird (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) und deuten damit erstmals eine mögliche Verbindung zwischen Stress-induzierten und regulären rhythmischen Anpassungen des Organismus an Umweltveränderungen an. Molekulare und zelluläre Mechanismen dieser Verknüpfung sind bisher noch nicht bekannt. Während die Rolle von p38 MAPK bei der Stress- und Immunantwort in Drosophila melanogaster gut charakterisiert ist, wurden Expression und Funktion von p38 in der inneren Uhr hingegen bislang nicht untersucht. Die hier vorliegende Arbeit hatte daher zum Ziel mittels immunhistochemischer, verhaltensphysiologischer und molekularer Methoden eine mögliche Rolle der Stress-aktivierten Kinase im circadianen System der Fliege aufzudecken. Antikörperfärbungen sowie Studien mit Reporterlinien zeigen deutliche Färbesignale in den s-LNv, l-LNv und DN1a und erbringen erstmals einen Nachweis für p38 Expression in den Uhrneuronen der Fliege. Ebenso scheint die Aktivität von p38 MAPK in den DN1a uhrgesteuert zu sein. So liegt p38 vermehrt in seiner aktiven Form in der Dunkelphase vor und zeigt, neben seiner circadian regulierten Aktivierung, zusätzlich auch eine Inaktivierung durch Licht. 15-Minuten-Lichtpulse in der subjektiven Nacht führen zu einer signifikanten Reduktion von aktivierter, phosphorylierter p38 MAPK in den DN1a von Canton S Wildtypfliegen im Vergleich zu Fliegen ohne Lichtpuls-Behandlung. Aufzeichnungen der Lokomotoraktivität offenbaren zusätzlich die Notwendigkeit von p38 MAPK für wildtypisches Timing der Abendaktivität sowie zum Erhalt von 24-Stunden-Verhaltensrhythmen unter konstanten Dauerdunkel-Bedindungen. So zeigen Fliegen mit reduzierten p38 Level in Uhrneuronen einen verzögerten Beginn der Abendaktivität und stark verlängerte Freilaufperioden. In Übereinstimmung mit Effekten auf das Laufverhalten scheint darüber hinaus die Expression einer dominant-negativen Form von p38b in Drosophila’s wichtigsten Uhrneuronen eine verspätete nukleäre Translokation von Period zur Folge zu haben. Westernblots legen zusätzlich einen Einfluss von p38 auf den Phosphorylierungsgrad von Period nahe und liefern damit einen mögliche Erklärung für den verspäteten Kerneintritt des Uhrproteins. Abschließende Stützung der Westernblotergebnisse bringen in vitro Kinasenassays und deuten auf p38 als eine potentielle „Uhrkinase“ hin, welche auch in vivo Period an Serin 661 sowie weiteren potentiellen Phosphorylierungsstellen phosphorylieren könnte. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit eindeutig auf eine bedeutende Rolle von p38, neben dessen Funkion im Stress-System, auch im circadianen System der Fliege hin und offenbaren damit die Möglichkeit, dass p38 als Schnittstelle zwischen beider Systeme fungiert. N2 - The circadian and the stress system are two distinct physiological systems that help the organism to adapt to environmental challenges. While the latter elicits reactive responses to acute environmental changes, the circadian system predicts daily occurring alterations and prepares the organism in advance. However, despite of these differences both responses are not mutually exclusive. Studies in the last years obviously prove a strong interaction between both systems showing a strong time-related stress response depending on the time of day of stressor presentation on the one hand and increased disturbances of daily rhythms, like sleep disorders, in consequence of uncontrolled or excessive stress on the other. In line with this fact, recent studies in vertebrates and fungi indicate that p38, a stress-activated Kinase, is involved in signaling to the circadian clock (Hayashi et al., 2003) and in turn is additionally regulated by this timekeeping system (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) providing an interesting link between stress-induced and regularly rhythmic adaptations of the organism to environmental changes. However, little is known about molecular and cellular mechanisms of this interconnection. In Drosophila melanogaster the role of p38 MAPK is well characterized in terms of immune and stress response, p38 expression and function in the circadian clock has not been reported so far. Therefore, the present thesis aimed to elucidate a putative role of the stress-activated Kinase in the fly’s circadian system using an immunohistochemical, behavioral as well as molecular approach. Surprisingly, for the first time antibody as well as reporterline studies cleary prove p38 expression in Drosophila clock neurons showing visible staining in s-LNvs, l-LNvs and DN1as. Moreover p38 MAPK in DN1as seems to be activated in a clock-dependent manner. p38 is most active under darkness and, besides its circadian activation, additionally gets inactivated by light. 15 minutes light pulse applied during the dark phase lead to a significant reduction in phosphorylated and activated p38 MAPK in Canton S wildtype flies compared to flies without light pulse treatment. In addition, locomotor activity recordings reveal that p38 is essential for a wild-type timing of evening activity and for maintaining ~24h behavioral rhythms under constant darkness. Flies with reduced p38 activity in clock neurons show delayed evening activity onsets and drastically lengthened the period of their free-running rhythms. In line with these effects on locomotor behavior, the nuclear translocation of the clock protein Period is significantly delayed on the expression of a dominant-negative form of p38b in Drosophila’s most important clock neurons. Western Blots reveal that p38 affects the phosphorylation degree of Period, what is likely the reason for its effects on nuclear entry of Period. In vitro kinase assays additionally confirm the Western Blot results and point to p38 as a potential “clock kinase” phosphorylating Period at Serin 661 and putative phosphorylation sites. Taken together, the results of the present thesis clearly indicate a prominent role of p38 in the circadian system of the fly besides its function in stress-input pathways und open up the possibility of p38 MAPK being a nodal point of both physiological systems. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - MAP-Kinase KW - Innere Uhr KW - MAPK KW - p38 KW - Phosphorylierung KW - Mitogen-aktivierte Proteinkinase KW - Drosophila melanogaster KW - Circadiane Rhythmen KW - Drosophila Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124636 ER - TY - THES A1 - Engelhardt [geb. Christiansen], Frauke T1 - Synaptic Connectivity in the Mushroom Body Calyx of Drosophila melanogaster T1 - Synaptische Konnektivität im Pilzkörper Kalyx in Drosophila melanogaster N2 - Learning and memory is considered to require synaptic plasticity at presynaptic specializations of neurons. Kenyon cells are the intrinsic neurons of the primary olfactory learning center in the brain of arthropods – the mushroom body neuropils. An olfactory mushroom body memory trace is supposed to be located at the presynapses of Kenyon cells. In the calyx, a sub-compartment of the mushroom bodies, Kenyon cell dendrites receive olfactory input provided via projection neurons. Their output synapses, however, were thought to reside exclusively along their axonal projections outside the calyx, in the mushroom body lobes. By means of high-resolution imaging and with novel transgenic tools, we showed that the calyx of the fruit fly Drosophila melanogaster also comprised Kenyon cell presynapses. At these presynapses, synaptic vesicles were present, which were capable of neurotransmitter release upon stimulation. In addition, the newly identified Kenyon cell presynapses shared similarities with most other presynapses: their active zones, the sites of vesicle fusion, contained the proteins Bruchpilot and Syd-1. These proteins are part of the cytomatrix at the active zone, a scaffold controlling synaptic vesicle endo- and exocytosis. Kenyon cell presynapses were present in γ- and α/β-type KCs but not in α/β-type Kenyon cells. The newly identified Kenyon cell derived presynapses in the calyx are candidate sites for an olfactory associative memory trace. We hypothesize that, as in mammals, recurrent neuronal activity might operate for memory retrieval in the fly olfactory system. Moreover, we present evidence for structural synaptic plasticity in the mushroom body calyx. This is the first demonstration of synaptic plasticity in the central nervous system of Drosophila melanogaster. The volume of the mushroom body calyx can change according to changes in the environment. Also size and numbers of microglomeruli - sub-structures of the calyx, at which projection neurons contact Kenyon cells – can change. We investigated the synapses within the microglomeruli in detail by using new transgenic tools for visualizing presynaptic active zones and postsynaptic densities. Here, we could show, by disruption of the projection neuron - Kenyon cell circuit, that synapses of microglomeruli were subject to activity-dependent synaptic plasticity. Projection neurons that could not generate action potentials compensated their functional limitation by increasing the number of active zones per microglomerulus. Moreover, they built more and enlarged microglomeruli. Our data provide clear evidence for an activity-induced, structural synaptic plasticity as well as for the activity-induced reorganization of the olfactory circuitry in the mushroom body calyx. N2 - Synaptische Plastizität an den präsynaptischen Spezialisierungen von Neuronen sind nach allgemeinem Verständnis die Grundlage für Lern- und Gedächtnisprozesse. Kenyon Zellen sind die intrinsischen Zellen des Zentrums für olfaktorisches Lernen im Gehirn von Arthropoden – den Pilzkörper Neuropilen. An den Präsynapsen der Kenyon Zellen wird eine olfaktorische Gedächtnisspur vermutet. Im Kalyx, einer Substruktur der Pilzkörper, erhalten die Kenyon Zell Dendriten ihren olfaktorischen Input durch Projektionsneurone. Ihre Präsynapsen wiederum befinden sich ausschließlich in ihren axonalen Kompartimenten außerhalb des Kalyx, nämlich in den Loben der Pilzkörper. Mit Hilfe von hochauflösenden bildgebenden Techniken und neuen transgenen Methoden, ist es uns in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster gelungen, Kenyon Zell Präsynapsen im Kalyx zu identifizieren. Diese Präsynapsen enthalten synaptische Vesikel, die nach Stimulation ihren Inhalt freisetzen können. Sie weisen noch weitere Gemeinsamkeiten mit den meisten anderen Präsynapsen auf: Ihre Aktiven Zonen, die Orte der Transmitterfreisetzung, enthalten die Proteine Bruchpilot und Syd-1. Diese sind Teil der Zytomatrix an der Aktiven Zone, ein Proteingerüst das Endo- und Exozytose der synaptischen Vesikel kontrolliert. Die Präsynapsen im Kalyx wurden in γ- and α/β-Typ Kenyon Zellen aber nicht in α/β-Typ Kenyon Zellen gefunden. Die neu identifizierten Kenyon Zell Präsynapsen beherbergen potentiell eine Gedächtnisspur für olfaktorisch assoziatives Lernen. Möglicherweise wird im olfaktorischen Nervensystem von Fruchtfliegen rücklaufende neuronale Aktivität benötigt, um Gedächtnis abzurufen, so wie es auch für Säuger beschrieben ist. Darüber hinaus zeigen wir synaptische Plastizität im Kalyx. Dies ist die erste Beschreibung überhaupt von synaptischer Plastizität im zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster. Das Volumen des Kalyx kann sich als Antwort auf äußere Einflüsse verändern. Genauso auch Größe und Anzahl der Mikroglomeruli, Substrukturen des Kalyx, in denen Projektionsneurone und Kenyon Zellen aufeinander treffen. Wir untersuchten die Synapsen in Mikroglomeruli detailliert, mithilfe von neuen transgenen Methoden, die es erlauben, präsynaptische Aktive Zonen sowie Postsynaptische Spezialisierungen zu visualisieren. Mittels Beeinträchtigung der Kommunikation zwischen Projektionsneuronen und Kenyon Zellen, konnten wir synaptische Plastizität in Mikroglomeruli zeigen. Projektionsneurone, die nicht in der Lage waren, Aktionspotentiale zu erzeugen, kompensierten ihre funktionelle Einschränkung durch den vermehrten Einbau von Aktiven Zonen in Mikroglomeruli. Außerdem produzierten sie mehr und vergrößerte Mikroglomeruli. Unsere Daten zeigen deutlich eine aktivitätsinduzierte Veränderung des olfaktorischen neuronalen Netzes, sowie strukturelle synaptische Plastizität im Kalyx. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Drosophila melanogaster KW - mushroom body KW - calyx KW - Geruch KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Kalyx Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85058 ER - TY - THES A1 - Ernst, Roman T1 - Visuelle Mustererkennung und Parameterextraktion bei Drosophila melanogaster T1 - Visual pattern recognition and parameter extraction in Drosophila melanogaster N2 - In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht. N2 - The results of operant conditioning experiments at the flight simulator suggest that Drosophila melanogaster can extract four parameters from visual patterns: pattern area, vertical position of the center of gravity, separatedness and horizontal/vertical pattern orientation. It can not be excluded that the fly can extract additional parameters. Spontaneous pattern preferences and conditioned preferences show different relationships with pattern parameters. The fly treats separated pattern elements as a compound figure. Retinal transfer is not observed even when patterns are presented at two different vertical training positions. Patterns are generalized if the positions of the centers of gravity of corresponding patterns are retained between training and test although training and test patterns do not overlap retinally. In this case there is no retinotopy of pattern memory on the pixel level but possibly on the level of the pattern parameter 'center of gravity'. Flies can not be trained to discriminate certain patterns that differ only by the vertical position of their centers of gravity. However, when tested with different patterns with corresponding centers of gravity they prefer the previously unpunished position of the center of gravity. The extraction of center of gravity and pattern area are modelled with a simple artificial neuronal filter. The architecture of this filter is based on an algorithm for the computation of the common center of gravity of multiple elements. KW - Taufliege KW - Mustererkennung KW - Visuelle Wahrnehmung KW - visuelle Mustererkennung KW - Musterlernen KW - Parameterextraktion KW - Generalisierung KW - neuronales Filter KW - Drosophila melanogaster KW - visiual pattern recognition KW - pattern conditioning KW - parameter extraction KW - generalization KW - neuronal filter KW - Drosophila melanogaster Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1156 ER - TY - THES A1 - Gruber, Franz Andreas T1 - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster T1 - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden. N2 - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference. KW - Taufliege KW - Futterentzug KW - Klassische Konditionierung KW - Konditionierung KW - Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Osmolarität KW - Drosophila melanogaster KW - zuckerkonditioniertes Verhalten KW - klassische Konditionierung KW - Futterentzug KW - Drosophila melanogaster KW - sugar-conditioned behaviour KW - classical conditioning KW - food deprivation KW - starvation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - THES A1 - Hampel, Stefanie T1 - Funktionelle Analyse des Einflusses von putativen T-Beta-H-positiven Neuronen auf das ethanolinduzierte Verhalten von Drosophila melanogaster T1 - Functional analysis of putative TbH neurons involved in ethanol induced behavior of Drosophila melanogaster N2 - Es sollten neuronale Netzwerke in Drosophila melanogaster identifiziert werden, die in die Entwicklung von ethanolinduziertem Verhalten involviert sind. Mittels der Tyramin-beta-Hydroxylase (TbH) wird der letzte Schritt der Biosynthese von Oktopamin aus Tyramin gewährleistet. TbHM18 Mutanten entwickeln eine reduzierte Ethanoltoleranz und haben keine nachweisbaren Oktopamin Konzentrationen (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). Die molekulargenetische Ursache dieser Mutante wurde näher untersucht. Wahrscheinlich ist die Deletion von einem Teil des Intron 1, des Exon 2 und einem Teil des Intron 2 des TbH-Gens verantwortlich für den Verlust der Tyramin-beta-Hydroxylase. Die Deletion der kodierenden Sequenz führt jedoch nicht zu einem Leserasterschub in der Aminosäuresequenz. Demzufolge könnte ein verkürztes Protein hergestellt werden. Ferner gibt es zwei Transkripte des TbH-Gens, woraus eventuell zwei Proteine exprimiert werden könnten. Ein Protein wäre die Tyramin-beta-Hydroxylase und das andere könnte eine Dopamin-beta-Hydroxylase sein. Um möglicherweise spezifische putative Subsets von TH-positiven Neuronen zu markieren, wurden verschiedene GAL4-Treiberlinien mit Hilfe unterschiedlicher Fragmente der Promoterregion des TbH-Gens hergestellt. Mittels des GAL4/UAS Systems konnte die Neurotransmitterausschüttung in putativen TbH-positiven Neuronen der TbH-GAL4-Linien inhibiert werden. Auf diese Weise sollte die Funktion der putativen TbH-positiven Neurone während der Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz untersucht werden. Das Transgen Tetanustoxin wurde mit der 1.3TbH-GAL4 Treiberlinie in einem bestimmten Set von Neuronen exprimiert. Die Inhibition der Synaptobrevin-abhängigen Neurotransmission in den 1.3TH-GAL4-positiven Neuronen beeinflusst nicht das ethanolinduzierte Verhalten. Hingegen das Ausschalten der Erregbarkeit der Zellen mit Hilfe eines UAS-Kir2.1 Transgens resultiert in erhöhter Resistenz gegenüber Ethanol. Das heißt, dass Synaptobrevin-unabhängige zelluläre Mechanismen der Zellen notwendig sind, um ethanolinduziertes Verhalten zu regulieren. Die 1.3TbH-GAL4-Linie exprimiert in einem sehr spezifischen Subset von Neuronen GAL4, bzw. Effektoren. Insgesamt werden ≈ 10 Zellen detektiert. Davon liegen die Somata zweier Neurone caudal und projizieren in die Region der ersten und vierten Bande des Fächerförmigen Körpers. Weitere kleine Ansammlungen von acht Zellen können um den Ösophagus und im Bereich des Subösophagialganglion verzeichnet werden. Die mit GFP markierten Neurone exprimieren wahrscheinlich kein Oktopamin. Ferner resultierte die Inhibition der synaptischen Transmission von 6.2TbH-GAL4-positiven Neuronen, mit Hilfe von Tetanustoxin, in einer erhöhten Ethanolsensitivität. Ebenfalls zu einer ethanolinduzierten Verhaltensänderung führt die Inaktivierung der 6.2TbH-GAL4 Zellen mittels eines UAS-Kir2.1 Transgens. Dabei entwickeln die Fliegen eine erhöhte Ethanolresistenz. Somit wäre möglich, dass die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Resistenz über verschiedene zelluläre Mechanismen reguliert werden. Die 6.2TbH-GAL4-Linie ermöglicht die Transgen-Expression in 65-70 Neuronen. Diese innerverieren u.a. das Subösophagialganglion, den Ösophagus, den Ellipsoid Körper, das laterale und das dorso-laterale Protocerebrum. Fünf der Neurone, die sich durch die 6.2TbH-GAL4 Treiberlinie markieren lassen, exprimieren Oktopamin. Dazu gehört ein VUM-Neuron und vier große caudale Zellen. Eine weitere putativ oktopaminerge GAL4-Linie Tdc2-GAL4 wurde mit der UAS-Kir2.1 Effektorlinie gekreuzt und die Nachkommen im Inebriometer gemessen. Bei Inaktivierung der Erregbarkeit der Tdc2-positiven Neurone resultiert dies in einer erhöhten Ethanolsensitivität, hingegen in keiner Veränderung der Toleranz. Die reduzierten Levels an Oktopamin spielen dabei wahrscheinlich eine Rolle. Hingegen regulieren eventuelle neurosekretorische Zellen über andere Mechanismen die Ethanolresistenz, wie die 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 Fliegen zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Neuronencluster für verschiedene ethanolinduzierte Verhaltensantworten verantwortlich sind. Da wahrscheinlich neurosekretorische Zellen des PI die Ethanolresistenz beeinflussen (RODAN et al. 2002), hingegen den Zentralkomplex-innervierende Zellen eher für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz notwendig sind (URIZAR et al. 2007). N2 - We wanted to identify neuronal networks in Drosophila melanogaster that are involved in the development of ethanol sensitivity and/or tolerance. The tyramine-beta-hydroxylase (TbH) catalyzes the last step in the biosynthesis of tyramine into octopamine. The TbHM18 mutant develdops a reduced ethanol tolerance, because they have no concentrations of octopamine in their bodies (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). We investigated the molecular reason of the mutant. Probably the deletion of a part of intron 1, exon 2 and a part of intron 2 of the TbH gene is responsible for the loss of the tyramine-beta-hydroxylase. The deletion of the coding sequence does not result in a frame shift of the aminoacid sequence and because of this a truncated protein could be expressed. Further there are two transcripts of the TbH gene, from that two proteins could be expressed. One protein could be the tyramine-beta-hydroxylase and the other, a dopamine-beta-hydroxylase. For possibly marking specific putative subsets of TbH-positive neurons, different GAL4 driver lines were generated with different promoter fragments out of the TbH gene. Via the GAL4/UAS system the neurotransmitter release could be inhibited in putative TbH-positive neurons. In this manner the function of the putative TbH-positive neurons should be analyzed during the development of ethanol sensitivity and tolerance. The transgene tetanustoxin was expressed in a specific subset of 1.3TbH-GAL4 positive neurons. The ethanol induced behaviour is not influenced by inhibition of synaptobrevin-dependent neurotransmission in 1.3TbH-GAL4 positive neurons. Blocking the excitability of cells by using a UAS-Kir2.1 transgene results in increased ethanol resistence. That means that synaptobrevin-independent cellular mechanisms of cells are necessary for regulating ethanol induced behaviour. The 1.3TbH-GAL4 line expresses GAL4 in a very specific subset of neurons as well as effectors. All in all about 10 cells can be detected. Two somata of these cells are located caudal which project to the first and fourth layer of the fanshaped body. Eight more cells are localized frontal around the esophagus and in the subesophagial region. Probably the GFP-marked neurons do not express octopamine. Furthermore the inhibition of synaptic transmission with tetanustoxin of 6.2TbH-GAL4 positive neurons results in an increased ethanol sensitivity. Also the inactivation of 6.2TbH-GAL4 cells with an UAS-Kir2.1 transgene leads to an ethanol-induced change of behaviour and there the flies develop an increased ethanol resistence. It could be possible that the development of ethanol sensitivity and tolerance is regulated by different cellular mechanisms. The 6.2TbH-GAL4 line enables transgene expression in 65-70 neurons. These are innervating for example the SOG, esophagus, ellipsoid body, lateral and the dorsolateral protocerebrum. Five of these 6.2TbH-GAL4 driven neurons express octopamine, which include four big caudal cells and probably one VUM-neuron. An additional putative octopaminergic GAL4-line, the Tdc2-GAL4 line was crossed to the UAS-Kir2.1 effector line and the offspring measured for ethanol sensitivity and tolerance in the inebriometer. Inactivation of the excitability of the Tdc2-positive neurons results in an increased ethanol sensitivity, but on the other hand to no change of ethanol tolerance. The reduced octopamine levels do probably play a role in this. However the potential neurosecretory cells regulate the ethanol resistence by different mechanisms, like 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 flies show. The inhibition of neurotransmission with three other TbH-GAL4 lines (600TbH-GAL4, 4.6TbH-GAL4, 6.6TbH-GAL4) show no divergence of ethanol-induced behaviour compared to wildtype flies. There, the specific expression pattern of 600TbH-GAL4 line includes five cells in the pars intercerebralis and a brain surrounding glia layer. Further the 6.6TbH-GAL4 line enables expression of effector genes in eight cells and in a surrounding layer of the brain as well. The expression of 600TbH-GAL4 line and 6.6TbH-GAL4 line do not overlap with the octopaminergic expression pattern of our colocalization studies. The expression of UAS- effector genes driven by 4.6TbH-GAL4 line can be provided in approxymatly 67 neurons of the adult brain. With this GAL4-line the structures of the ellipsoid body, antennal lobes, pars intercerebralis and a big commissur are innervated. Seven cells can be detected caudal, but the region that they are projecting to is unknown. It could be shown that different clusters of neurons are responsible for several ethanol-induced behavioural responses. Because neurosecretory cells of the pars intercerebralis seem to influence the ethanol resistance (RODAN et al. 2002), but central complex- innervating cells are necessary rather for the development of ethanol sensitivity and tolerance (URIZAR et al. 2007). KW - Taufliege KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25600 ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Hieke, Marie T1 - Synaptic arrangements and potential communication partners of \(Drosophila’s\) PDF-containing clock neurons within the accessory medulla T1 - Synaptische Konstellationen und potentielle Kommunikationspartner von \(Drosophila’s\) PDF-enthaltenden Uhrneuronen innerhalb der akzessorischen Medulla N2 - Endogenous clocks regulate physiological as well as behavioral rhythms within all organisms. They are well investigated in D. melanogaster on a molecular as well as anatomical level. The neuronal clock network within the brain represents the center for rhythmic activity control. One neuronal clock subgroup, the pigment dispersing factor (PDF) neurons, stands out for its importance in regulating rhythmic behavior. These neurons express the neuropeptide PDF (pigment dispersing factor). A small neuropil at the medulla’s edge, the accessory medulla (AME), is of special interest, as it has been determined as the main center for clock control. It is not only highly innervated by the PDF neurons but also by terminals of all other clock neuron subgroups. Furthermore, terminals of the photoreceptors provide light information to the AME. Many different types of neurons converge within the AME and afterward spread to their next target. Thereby the AME is supplied with information from a variety of brain regions. Among these neurons are the aminergic ones whose receptors’ are expressed in the PDF neurons. The present study sheds light onto putative synaptic partners and anatomical arrangements within the neuronal clock network, especially within the AME, as such knowledge is a prerequisite to understand circadian behavior. The aminergic neurons’ conspicuous vicinity to the PDF neurons suggests synaptic communication among them. Thus, based on former anatomical studies regarding this issue detailed light microscopic studies have been performed. Double immunolabellings, analyses of the spatial relation of pre- and postsynaptic sites of the individual neuron populations with respect to each other and the identification of putative synaptic partners using GRASP reenforce the hypothesis of synaptic interactions within the AME between dopaminergic/ serotonergic neurons and the PDF neurons. To shed light on the synaptic partners I performed first steps in array tomography, as it allows terrific informative analyses of fluorescent signals on an ultrastructural level. Therefore, I tested different ways of sample preparation in order to achieve and optimize fluorescent signals on 100 nm thin tissue sections and I made overlays with electron microscopic images. Furthermore, I made assumptions about synaptic modulations within the neuronal clock network via glial cells. I detected their cell bodies in close vicinity to the AME and PDFcontaining clock neurons. It has already been shown that glial cells modulate the release of PDF from s-LNvs’ terminals within the dorsal brain. On an anatomical level this modulation appears to exist also within the AME, as synaptic contacts that involve PDF-positive dendritic terminals are embedded into glial fibers. Intriguingly, these postsynaptic PDF fibers are often VIIAbstract part of dyadic or even multiple-contact sites in opposite to prolonged presynaptic active zonesimplicating complex neuronal interactions within the AME. To unravel possible mechanisms of such synaptic arrangements, I tried to localize the ABC transporter White. Its presence within glial cells would indicate a recycling mechanism of transmitted amines which allows their fast re-provision. Taken together, synapses accompanied by glial cells appear to be a common arrangement within the AME to regulate circadian behavior. The complexity of mechanisms that contribute in modulation of circadian information is reflected by the complex diversity of synaptic arrangements that involves obviously several types of neuron populations N2 - Endogene Uhren steuern sowohl physiologische als auch verhaltensbedingte Rhythmen bei allen Organismen. In D. melanogaster sind sie nicht nur auf molekularer sondern auch auf anatomischer Ebene bereits gut erforscht. Das neuronale Uhrnetzwerk im Gehirn stellt das Zentrum der Steuerung der rhythmischen Aktivität dar. Eine Uhrneuronengruppe sticht allein schon durch ihre besonderen anatomischen Eigenschaften hervor. Diese Neurone exprimieren das Neuropeptid PDF (pigment dispersing factor), welches zudem besonderen Einfluss auf die Lokomotionsaktivität der Fliege hat. Ein kleines Neuropil am Rande der Medulla, die akzessorische Medulla (AME) ist von besonderem Interesse, da neben seiner intensiven Innervation durch die PDF-Neurone auch Terminale aller anderen Uhrneuronengruppen zu finden sind. Zudem wird sie durch Terminale der Photorezeptoren mit Informatonen über die Lichtverhätnisse versorgt. Die AME erreichen des Weiteren Informationen aus vielen anderen Hirnregionen. Eine Vielzahl von Neuronentypen laufen in ihr zusammen, um sich anschließend wieder in verschiedenste Hirnareale zu verteilen. So wird die AME auch durchzogen von Fasern mit aminergem Inhalt, dessen Rezeptoren wiederum auf den PDF-Neuronen zu finden sind. Die vorliegende Arbeit gibt Aufschluss über vermutliche synaptische Partner und anatomische Anordnungen innerhalb des neuronalen Uhrnetzwerkes, insbesondere innerhalb der AME. Solch Wissen stellt eine Grundvoraussetzung dar, um zirkadianes Verhalten verstehen zu können. Die auffällige Nähe der aminergen Neurone zu den PDF Neuronen lässt eine synaptische Interaktion zwischen ihnen vermuten. Deshalb wurden basierend auf vorangegangen Studien detailiertere Untersuchungen dieser Thematik durchgeführt. So wird die Hypothese über synaptische Interaktionen innerhalb der AME zwischen dopaminergen/ serotonergen Neuronen und den PDF Neuronen bestärkt mittels Doppelimmunofärbungen, gegenüberstellende Analysen über die räumlichen Nähe von prä- und postsynaptischen Stellen der jeweiligen Neuronenpopulationen und durch die Identifikation vermutlicher synaptischer Partner unter Verwendung von GRASP. Zur möglichen Identifikation der synaptischen Partner unternahm ich erste Schritte in der Array Tomographie, welche hochinformative Analysen von fluoreszierenden Signalen auf einem ultrastrukturellen Level ermöglicht. Dazu testete ich verschieden Wege der Gewebepräparation, um Flureszenzsignale zu erhalten bzw. zu optimieren und bildete erste Überlagerungen der Fluoreszenz- und Elektronenmikrskopbilder. Die Auswertung der elektronenmikroskopischen Bilder erlaubten Mutmaßungen über mö- gliche synaptische Modulationen innerhalb des neuronalen Uhrnetzwerkes durch Gliazellen. Ihre Zellkörper fand ich in unmittelbarer Nähe zu den PDF Neuronen. Im dorsalen Hirn wurden neuronale Modulationen an den kleinen PDF Neuronen durch Gliazellen bereits festgestellt. Auf anatomischer Ebene scheint diese Modulation auch innerhalb der AME zu erfolgen, da synaptische Kontakte, welche PDF-positive Dendriten involvieren, von Gliafasern umgeben sind. Interessanterweise sind diese postsynaptischen PDF Fasern dabei oftmals Teil dyadischer oder sogar multipler Kontakte, die sich gegenüber einer ausgedehnten aktiven Zone befinden. Um mögliche Mechanismen solcher synaptischer Anordnungen zu erklären, versuchte ich den ABC Transporter White im Hirn von Drosophila zu lokalisieren. Seine Präsenz in Gliazellen würde auf einen Recyclingmechanismus hindeuten, welcher eine schnelle Wiederbereitstellung des Transmiters ermöglichen würde. Zusammengefasst scheinen Synapsen mit postsynaptischen PDF-Neuronen in Begleitung von Gliazellen, ein gebräuchliches synaptisches Arrangement innerhalb der AME dazustellen. Diese komplexe Diversität der synaptischen Anordnung reflektiert die komplexen Mechanismen, welche der Verarbeitung der zirkadianen Informationen zugrunde liegen KW - Taufliege KW - Chronobiologie KW - Endogene Rhythmik KW - PDF neurons KW - glia cells KW - circadian clock KW - accessory medulla KW - sleep KW - aminergic neurons KW - synapses KW - Gliazelle KW - Aminerge Nervenzelle KW - Pigmentdispergierender Faktor KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175988 ER - TY - THES A1 - Horn [née Bunz], Melanie T1 - The impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on fitness: Influence of day length, humidity and food composition T1 - Auswirkungen von Drosophila melanogaster`s Innerer Uhr auf die Fitness: Einfluss von Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Ernährung N2 - We are living in a system that underlies permanent environmental changes due to the rotation of our planet. These changes are rhythmic with the most prominent one having a period of about 24 hours, but also shorter and longer rhythms characterize our environment. To cope with the ever-changing environmental conditions, it is thought to be beneficial if an organism can track and anticipate these changes. The so called endogenous clocks enable this and might provide a fitness advantage. To investigate and unravel the mechanism of endogenous clocks Chronobiologists have used different model organisms. In this thesis Drosophila melanogaster was used as model organism with its about 150 clock neurons representing the main endogenous clock of the fly in the central brain. The molecular mechanisms and the interlocked feedback loops with the main circadian key players like period, timeless, clock or cycle are under investigation since the 1970s and are characterized quite well so far. But the impact of a functional endogenous clock in combination with diverse factors and the resulting fitness advantages were analysed in only a few studies and remains for the most part unknown. Therefore the aim of this thesis was to unravel the impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on the fitness of the fly. To achieve this goal different factors – like day length, humidity and food composition – were analyzed in wild type CS and three different period mutants, namely perL, perS and per01, that carry a point mutation altering or abolishing the free-running period of the fruit fly as well as a second arrhythmic strain, clkAR. In competition assay experiments wild type and clock mutant flies competed for up to 63 generations under a normal 24 hour rhythm with 12 hours light/day and 12 hours darkness/night (LD12:12) or T-cycles with 19 or 29 hours, according to the mutants free-running period, or constant light (LL) in case of the arrhythmic mutant as well as under natural-like outdoor conditions in two consecutive years. Overall the wild type CS strain was outcompeting the clock mutant strains independent of the environmental conditions. As the perL fly strain elongated their free-running period, the competition experiments were repeated with naturally cantonized new fly strains. With these experiments it could be shown that the genetic background of the fly strains – which are kept for decades in the lab, with backcrosses every few years – is very important and influences the fitness of flies. But also the day length impacts the fitness of the flies, enabling them to persist in higher percentage in a population under competition. Further factors that might influence the survival in a competing population were investigated, like e.g. mating preferences and locomotor activity of homo- and heterozygous females or sperm number of males transferred per mating. But these factors can still not explain the results in total and play no or only minor roles and show the complexity of the whole system with still unknown characteristics. Furthermore populations of flies were recorded to see if the flies exhibit a common locomotor activity pattern or not and indeed a population activity pattern could be recorded for the first time and social contact as a Zeitgeber could be verified for Drosophila melanogaster. In addition humidity and its impact on the flies´ fitness as well as a potential Zeitgeber was examined in this thesis. The flies experienced different relative humidities for eclosion and wing expansion and humidity cycle phase shifting experiments were performed to address these two different questions of fitness impact and potential Zeitgeber. The fruit fly usually ecloses in the morning hours when the relative humidity is quite high and the general assumption was that they do so to prevent desiccation. The results of this thesis were quite clear and demonstrate that the relative humidity has no great effect on the fitness of the flies according to successful eclosion or wing expansion and that temperature might be the more important factor. In the humidity cycle phase shifting experiments it could be revealed that relative humidity cannot act as a Zeitgeber for Drosophila melanogaster, but it influences and therefore masks the activity of flies by allowing or surpressing activity at specific relative humidity values. As final experiments the lifespan of wild type and clock mutant flies was investigated under different day length and with different food qualities to unravel the impact of these factors on the fitness and therefore survival of the flies on the long run. As expected the flies with nutrient-poor minimum medium died earlier than on the nutrient-rich maximum medium, but a small effect of day length could also be seen with flies living slightly longer when they experience environmental day length conditions resembling their free-running period. The experiments also showed a fitness advantage of the wild type fly strain against the clock mutant strains for long term, but not short term (about the first 2-3 weeks). As a conclusion it can be said that genetic variation is important to be able to adapt to changing environmental conditions and to optimize fitness and therefore survival. Having a functional endogenous clock with a free-running period of about 24 hours provides fitness advantages for the fruit fly, at least under competition. The whole system is very complex and many factors – known and unknown ones – play a role in this system by interacting on different levels, e.g. physiology, metabolism and/or behavior. N2 - Wir leben in einem System, welches durch die Erdrotation permanenten Veränderungen der Umwelt unterliegt. Diese Veränderungen sind rhythmischer Natur, wobei die wichtigste Veränderung einen Rhythmus von circa 24 Stunden aufweist. Aber auch kürzere und längere Rhythmen charakterisieren unsere Umwelt. Um mit den permanenten Veränderungen klar zu kommen geht man davon aus, dass es von Vorteil ist wenn ein Organismus die Veränderungen wahrnehmen und vorausahnen kann. Die sogenannten Inneren Uhren ermöglichen dies und stellen möglicherweise einen Fitness Vorteil dar. Um den Mechanismus von Inneren Uhren zu untersuchen und aufzudecken benutzen Chronobiologen verschiedene Modellorganismen. In dieser Arbeit wurde Drosophila melanogaster, mit ihren etwa 150 Uhrneuronen welche die Innere Uhr im Zentralen Nervensystem darstellen, als Modellorganismus verwendet. Der molekulare Mechanismus und die ineinandergreifenden Rückkopplungsschleifen mit den Hauptakteuren period, timeless, clock und cycle werden seit den 1970ern erforscht und wurden bisher recht gut charakterisiert. Aber der Einfluss einer funktionellen Inneren Uhr in Kombination mit diversen Faktoren und die daraus resultierenden Fitness Vorteile wurden in nur wenigen Studien untersucht und bleiben zu großen Teilen unbekannt. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Drosophilas Innere Uhr auf die Fitness der Taufliege aufzudecken. Um dieses Ziel zu erreichen wurden verschiedene Faktoren – wie z.B. Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Futterqualität – in Wildtyp CS und drei verschiedenen period Mutanten – namentlich perL, perS und per01, welche alle eine Punktmutation tragen, welche die Freilauf-Periodenlänge verändert oder zu Arrhythmizität führt – sowie einem weiteren arrhythmischen Fliegenstamm, clkAR, untersucht. In Konkurrenzversuchen konkurrierten Wildtyp und Uhrmutanten über bis zu 63 Generationen unter normalen 24 Stunden Rhythmen mit jeweils 12 Stunden Licht/Tag und 12 Stunden Dunkelheit/Nacht oder unter T-Zyklen mit 19 oder 29 Stunden, entsprechend der Freilauf-Periodenlänge der Mutanten, oder Dauerlicht (LL) im Falle der arrhythmischen Mutante, sowie unter naturähnlichen Bedingungen im Feldversuch in zwei aufeinanderfolgenden Jahren. Im Gesamten war der Wildtyp den Uhrmutanten überlegen, unabhängig von den Umweltbedingungen. Da die perL Mutanten Ihre Freilauf-Periodenlänge deutlich verlängerten, wurden die Konkurrenzexperimente mit auf natürlicher Weise mit dem Wildtyp CS rückgekreuzten Fliegenstämmen wiederholt. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der Fliegenstämme – welche teils für Jahrzehnte im Labor gehalten und nur wenige Male rückgekreuzt werden – sehr wichtig ist und die Fitness der Fliegen beeinflusst. Aber auch die Länge der Tage (19 h, 24 h oder 29 h) beeinflusst die Fitness der Fliegen und ermöglicht es Ihnen in höherem Anteil in einer Population unter Konkurrenz zu bestehen. Weitere Faktoren, welche das Überleben unter Konkurrenz möglicherweise beeinflussen können, wie z.B. eine Paarungspräferenz und Laufaktivität von homo- und heterozygoten Weibchen oder die Anzahl an Spermien, die pro Paarung übertragen werden, wurden untersucht. Diese Faktoren allein konnten jedoch die Ergebnisse der Konkurrenzversuche nicht erklären und spielen dabei keine oder nur geringfügige Rollen und stellen ein Beispiel für die Komplexität des ganzen Systems mit noch weiteren unbekannten Faktoren dar. Im Weiteren wurde das Laufverhalten von ganzen Fliegenpopulationen aufgezeichnet, um zu erforschen, ob eine Fliegenpopulation einen gemeinsamen Freilauf an Laufaktivität aufweist oder nicht. Und tatsächlich konnte zum ersten Mal das Laufverhalten von ganzen Populationen aufgezeichnet werden und Sozialer Kontakt als Zeitgeber für Drosophila melanogaster bestätigt werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit relative Luftfeuchtigkeit und deren Auswirkung auf die Fitness der Fliegen, als auch als potentieller Zeitgeber untersucht. Die Fliegen wurden zum Schlupf und zur Entfaltung der Flügel unterschiedlichen Luftfeuchtigkeiten ausgesetzt und es wurden Phasenverschiebungsversuche mit Luftfeuchtigkeitszyklen durchgeführt, um diese zwei verschiedenen Fragen nach Fitness und potentiellem Zeitgeber zu beantworten. Die Fruchtfliege schlüpft normalerweise in den Morgenstunden, wenn die Luftfeuchtigkeit relativ hoch ist, weshalb im Allgemeinen angenommen wird, dass dies zu diesem Zeitpunkt des Tages geschieht, um eine Austrocknung zu verhindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit waren sehr eindeutig und demonstrierten, dass die relative Luftfeuchtigkeit keinen großen Einfluss auf die Fitness der Fliegen in Bezug auf den Schlupferfolg und korrektes Entfalten der Flügel hat und dass die Temperatur wohl eher der ausschlaggebende Faktor sein könnte. In den Phasenverschiebungsversuchen mit Luftfeuchtigkeitszyklen konnte aufgedeckt werden, dass relative Luftfeuchtigkeit keinen Zeitgeber für Drosophila melanogaster darstellt, aber die Laufaktivität der Fliegen beeinflusst und maskiert, indem das Laufverhalten bei bestimmten relativen Luftfeuchtigkeiten zugelassen oder unterdrückt wird. Außerdem wurde die Lebenserwartung der Wildtyp und Uhrmutanten Fliegenstämme unter verschiedenen Tageslängen und mit unterschiedlicher Futterqualität untersucht, um den Einfluss dieser Faktoren auf die Fitness und somit das Überleben der Fliegen auf Dauer zu charakterisieren. Wie erwartet starben die Fliegen auf dem nährstoffarmen Minimalmedium früher als auf dem nährstoffreichen Maximalmedium, aber es konnte auch ein kleiner Effekt der Tageslänge gezeigt werden. Hierbei lebten die Fliegen etwas länger, wenn die Tageslänge die Freilauf-Periodenlänge der Fliegen widerspiegelte. Diese Versuche zeigten auch einen Fitness Vorteil der Wildtyp Fliegen gegenüber der Uhrmutanten auf lange Sicht, jedoch nicht zu Beginn (in den ersten ca. 2-3 Wochen). Abschließend kann zusammengefasst werden, dass genetische Variation wichtig ist, um sich an Veränderungen in der Umwelt anzupassen und die eigene Fitness und somit Überleben zu steigern. Eine funktionelle Innere Uhr mit einer Periodenlänge von etwa 24 Stunden zu besitzen stellt einen Fitness Vorteil für die Fliegen dar, zumindest unter Konkurrenzbedingungen. Das ganze System ist sehr komplex und viele Faktoren – bekannte und noch unbekannte – spielen eine Rolle in diesem System, welches auf verschiedenen Ebenen interagiert, wie z.B. auf physiologischer, metabolistischer oder auf der Verhaltensebene. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - Tageslänge KW - Luftfeuchtigkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Fitness Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211415 ER - TY - THES A1 - Hovhanyan, Anna T1 - Functional analyses of Mushroom body miniature (Mbm) in growth and proliferation of neural progenitor cells in the central brain of Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des Mushroom body minature (Mbm) in das Wachstum und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im zentralen Gehirn von Drosophila melanogaster N2 - Zellwachstum und Zellteilung stellen zwei miteinander verknüpfte Prozesse dar, die dennoch grundsätzlich voneinander zu unterscheiden sind. Die Wiederaufnahme der Proliferation von neuralen Vorläuferzellen (Neuroblasten) im Zentralhirn von Drosophila nach der spät-embryonalen Ruhephase erfordert zunächst Zellwachstum. Der Erhalt der regulären Zellgröße ist eine wichtige Voraussetzung für die kontinuierliche Proliferation der Neuroblasten über die gesamte larvale Entwicklungsphase. Neben extrinsischen Ernährungssignalen ist für das Zellwachstum eine kontinuierliche Versorgung mit funktionellen Ribosomen notwendig, damit die Proteinsynthese aufrechterhalten werden kann. Mutationen im mushroom body miniature (mbm) Gen wurden über einen genetischen Screen nach strukturellen Gehirnmutanten identifiziert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der funktionellen Charakterisierung des Mbm Proteins als neues nukleoläres Protein und damit seiner möglichen Beteiligung in der Ribosomenbiogenese. Der Vergleich der relativen Expressionslevel von Mbm und anderen nuklearen Proteinen in verschiedenen Zelltypen zeigte eine verstärkte Expression von Mbm in der fibrillären Komponente des Nukleolus von Neuroblasten. Diese Beobachtung legte die Vermutung nahe, dass in Neuroblasten neben generell benötigten Faktoren der Ribosomenbiogenese auch Zelltyp-spezifische Faktoren existieren. Mutationen in mbm verursachen Proliferationsdefekte von Neuroblasten, wirken sich jedoch nicht auf deren Zellpolarität, die Orientierung der mitotischen Spindel oder die Asymmetrie der Zellteilung aus. Stattdessen wurde eine Reduktion der Zellgröße beobachtet, was im Einklang mit einer Beeinträchtigung der Ribosomenbiogenese steht. Insbesondere führt der Verlust der Mbm Funktion zu einer Retention der kleinen ribosomalen Untereinheit im Nukleolus, was eine verminderte Proteinsynthese zur Folge hat. Interessanterweise wurden Störungen der Ribosomenbiogenese nur in den Neuroblasten beobachtet. Zudem ist Mbm offensichtlich nicht erforderlich, um Wachstum oder die Proliferation von Zellen der Flügelimginalscheibe und S2-Zellen zu steuern, was wiederum dafür spricht, dass Mbm eine Neuroblasten-spezifische Funktion erfüllt. Darüber hinaus wurden die transkriptionelle Regulation des mbm-Gens und die funktionelle Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen analysiert. Mbm Transkription wird von dMyc reguliert. Ein gemeinsames Merkmal von dMyc Zielgenen ist das Vorhandensein einer konservierten „E-Box“-Sequenz in deren Promotorregionen. In der Umgebung der mbm-Transkriptionsstartstelle befinden sich zwei „E-Box“-Motive. Mit Hilfe von Genreporteranalysen konnte nachgewiesen werden, dass nur eine von ihnen die dMyc-abhängige Transkription vermittelt. Die dMyc-abhängige Expression von Mbm konnte auch in Neuroblasten verifiziert werden. Auf posttranslationaler Ebene wird Mbm durch die Proteinkinase CK2 phosphoryliert. In der C-terminalen Hälfte des Mbm Proteins wurden in zwei Clustern mit einer Abfolge von sauren Aminosäuren sechs Serin- und Threoninreste als CK2- Phosphorylierungsstellen identifiziert. Eine Mutationsanalyse dieser Stellen bestätigte deren Bedeutung für die Mbm Funktion in vivo. Weiterhin ergaben sich Evidenzen, dass die Mbm-Lokalisierung durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung gesteuert wird. Obwohl die genaue molekulare Funktion von Mbm in der Ribosomenbiogenese noch im Unklaren ist, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die besondere Rolle von Mbm in der Ribosomenbiogenese von Neuroblasten um Zellwachstum und Proliferation zu regulieren. N2 - Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of proliferation of central brain progenitor cells (neuroblasts) after the late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis. Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts. Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm. Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels. At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal half of the Mbm protein were identified as CK2 phosphorylation sites. Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation. Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation. KW - Taufliege KW - Mbm KW - Neuroblast KW - cell growth KW - proliferation KW - ribosome biogenesis KW - CK2 KW - Myc KW - Vorläuferzellen KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91303 ER -