TY - THES A1 - Raffelsbauer, Diana T1 - Identification and characterization of the inlGHE gene cluster of Listeria monocytogenes T1 - Identifizierung und Charakterisierung des inlGHE-Genclusters von Listeria monocytogenes N2 - In the present study, a new gene cluster of Listeria monocytogenes EGD containing three internalin genes was identified and characterized. These genes, termed inlG, inlH and inlE, encode proteins of 490, 548 and 499 amino acids, respectively, which belong to the class of large, surface-bound internalins. Each of these proteins contains a signal peptide, two regions of repeats (Leucine-rich repeats and B repeats), an inter-repeat region and a putative cell wall anchor sequence containing the sorting motiv LPXTG. PCR analysis revealed the presence of the inlGHE gene cluster in most L. monocytogenes serotypes. A similar gene cluster termed inlC2DE localised to the same position on the chromosome was described in a different L. monocytogenes EGD isolate. Sequence comparison of the two clusters indicates that inlG is a new internalin gene, while inlH was generated by a site-specific recombination leading to an in-frame deletion which removed the 3'-terminal end of inlC2 and a 5'-portion of inlD. The genes inlG, inlH and inlE seem to be transcribed extracellularly and independent of PrfA. To study the function of the inlGHE gene cluster several in-frame deletion mutants were constructed which lack the genes of the inlGHE cluster individually or in combination with other inl genes. When tested in the mouse model, the inlGHE mutant showed a significant reduction of bacterial counts in liver and spleen in comparison to the wild type strain, indicating that the inlGHE gene cluster plays an important role in virulence of L. monocytogenes. The ability of this mutant to invade non-phagocytic cells in vitro was however two- to three-fold higher than that of the parental strain. To examine whether deletion of the single genes from the cluster has the same stimulatory effect on invasiveness as deletion of the complete gene cluster, the single in-frame deletion mutants inlG, inlH and inlE were constructed. These mutants were subsequently reverted to the wild type by introducing a copy of the corresponding intact gene into the chromosome by homologous recombination using knock-in plasmids. To determine a putative contribution of InlG, InlH and InlE in combination with other internalins to the entry of L. monocytogenes into mammalian cells, the combination mutants inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE were constructed. Transcription of the genes inlA, inlB and inlC in these mutants was studied by RT-PCR. Deletion of inlGHE enhances transcription of inlA and inlB, but not of inlC. This enhancement is not transient but can be observed at different time-points of the bacterial growth curve. Deletion of inlA also increases transcription of inlB and vice-versa. In contrast, the amounts of inlA and inlB transcripts in the single deletion mutants inlG, inlH and inlE were similar to those from the wild type. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde ein neues Gencluster von Listeria monocytogenes EGD mit drei Internalingenen identifiziert und charakterisiert. Diese als inlG, inlH und inlE bezeichneten Gene codieren für Proteine mit 490, 548 bzw. 499 Aminosäuren, die zur Klasse der großen, oberflächengebundenen Internaline gehören. Jedes dieser Proteine enthält ein Signalpeptid, zwei Repeat-Regionen (Leucin-reiche Repeats und B-Repeats), eine Inter-Repeat-Region, und eine mögliche Zellwandankersequenz mit dem Motiv LPXTG. PCR-Analyse zeigte das Vorkommen des inlGHE-Genclusters in den meisten L. monocytogenes-Serotypen. Ein ähnliches, als inlC2DE bezeichnetes Gencluster wurde in der gleichen Position auf dem Chromosom eines anderen L. monocytogenes EGD Isolats beschrieben. Ein Sequenzvergleich beider Clusters zeigte, dass inlG ein neues Internalingen ist, während inlH durch eine in-frame-Deletion vom 3'-Ende von inlC2 und einem 5'-Teil von inlD entstanden ist. Die Gene inlG, inlH und inlE werden vorwiegend extrazellulär und PrfA-unabhängig transkribiert. Um die Funktion des inlGHE-Genclusters zu untersuchen, wurden verschiedene in-frame-Deletionsmutanten hergestellt, aus denen die Gene des inlGHE-Clusters entweder einzeln oder in Kombination mit anderen Internalingenen deletiert wurden. Im Maumodell zeigte eine inlGHE-Mutante nach oraler Infektion eine signifikante Reduktion der Bakterienzahl in der Leber und Milz, die auf eine wichtige Rolle des inlGHE-Genclusters in der Virulenz von L. monocytogenes hindeutet. Die Fähigkeit dieser Mutante, in nicht-phagocytische Zellen in vitro einzudringen, ist zwei bis dreifach höher als die des Wildtyp-Stammes. Um zu untersuchen, ob die Deletion von Einzelgenen des inlGHE-Genclusters einen ähnlichen stimulatorischen Effekt auf die Invasivität ausübt wie die Deletion des kompletten Genclusters, wurden die Einzeldeletionsmutanten inlG, inlH and inlE hergestellt. Diese Mutanten wurden anschließend zum Wildtyp revertiert, indem eine Kopie des entsprechenden intakten Gens durch homologe Rekombination ins Chromosom mit Hilfe von Knock-in-Plasmiden eingeführt wurde. Um eine mögliche Rolle von InlG, InlH und InlE in Verbindung mit anderen Internalinen bei der Aufnahme von L. monocytogenes in Säugerzellen zu untersuchen, wurden die Mutanten inlA/GHE, inlB/GHE, inlC/GHE, inlA/B/GHE, inlB/C/GHE, inlA/C and inlA/C/GHE hergestellt. Die Transkription der Gene inlA, inlB and inlC in diesen Mutanten wurde durch RT-PCR untersucht. Deletion von inlGHE erhöht die Transkription von inlA und inlB, aber nicht die von inlC. Diese Erhöhung ist nicht vorübergehend sondern kann zu verschiedenen Zeitpunkten der Wachstumskurve beobachtet werden. Deletion von inlA verstärkt ebenfalls die Transcription von inlB und umgekehrt. Im Gegensatz dazu waren die Mengen an inlA- und inlB-Transkripten in den Einzeldeletionsmutanten inlG, inlH and inlE ähnlich wie die des Wildtyps. KW - Listeria monocytogenes KW - Molekulargenetik KW - Listeria monocytogenes KW - Virulenz KW - Internalin KW - inlGHE KW - Invasion KW - Leucin-reiche repeat protein KW - Listeria monocytogenes KW - virulence KW - internalin KW - inlGHE KW - invasion KW - leucine-rich repeat protein Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180595 ER - TY - THES A1 - Leimeister, Cornelia T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems T1 - Identification and characterization of genes involved in development of the kidney and the urogenital system N2 - Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung. N2 - Studies on kidney development provide insights into general processes of embryogenesis like inductive interactions, mesenchymal condensation, mesenchymal-epithelial interactions, cell fate determination as well as differentiation and thereby into the basis of congenital malformations. Once induced by the ureteric bud, the metanephrogenic mesenchyme gives rise to the functional units of the kidney - the nephrons - and the renal stroma. These morphogenetic processes rely on complex regulatory changes in gene expression, which to date are not understood in detail. The present thesis aimed to identify known and primarily novel genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Gene expression of induced versus uninduced mesenchyme from murine kidney anlagen was compared using ddPCR together with transfilter organ culture. Several candidates were assayed for differential expression by northern blot hybridization and selected for further characterization. As one of the known genes, sFRP2 was verified to be induced within the metanephrogenic mesenchyme. In situ hybridization of whole-mount mouse embryos and paraffin sections revealed specific and dynamic expression patterns for sFRP2 as well as for the related genes sFRP1 and sFRP4 in the developing kidney and other tissues. The detailed sFRP gene expression analysis was performed to guide functional studies for this recently identified novel gene family. Preliminary investigations of the ddPCR products C0-5, J6-3 and M2-4 revealed that they are all derived from novel genes with distinct expression patterns during kidney development. While C0-5 expression dynamically switches from the ureteric bud to the nephron precursors and the collecting system, J6-3 specifies the stromal cell lineage and M2-4 is already detectable in the condensing mesenchyme with subsequent expression in epithelial derivatives. Isolation and analysis of the C0-5 cDNA resulted in the identification of a collagen-like protein in mice and humans that is located upstream of the EWS gene of the human chromosome 22q12. Additionally, a novel gene family related to hairy and the E(spl)-complex genes has been identified. Because of this relationship and a characteristic YRPW tetrapeptide they were designated as Hey genes for "hairy and E(spl) related with YRPW motif". Compared to hairy/E(spl) or the mammalian Hes proteins they show novel features of DNA-binding and protein interaction. Moreover, their expression patterns frequently correlate with those of members of the Delta-Notch signaling pathway suggesting that Hey genes may participate in this pathway in cell fate decisions and boundary formation. Analysis of Dll1 knockout mice partly confirmed this assumption for Hey1 and Hey2 during somitogenesis. This screen has shown that transfilter organ culture in combination with ddPCR is a powerful tool to identify genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Expression and sequence analysis of the novel genes implies a function during development of the kidney and other tissues that can now be studied in further detail. The collection of more than 50 additional candidates for novel genes regulated during nephrogenesis provides a rich resource for future analysis of the networks governing kidney development KW - Niere KW - Entwicklung KW - Molekulargenetik KW - Niere KW - Urogenitalsystem KW - Differential Display PCR KW - Entwicklung KW - In situ Hybridisierung KW - Somitogenese KW - Neurogenese KW - Mesenchym KW - Maus KW - Delta KW - kidney KW - urogenital system KW - differential display PCR KW - development KW - in situ hybridization KW - somitogenesis KW - neurogenesis KW - mesenchyme KW - mouse Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690 ER - TY - THES A1 - Froschauer, Alexander T1 - Identifizierung und molekulare Analyse Xmrk-gekoppelter Gene in der geschlechtsbestimmenden Region des Genoms von Xiphophorus maculatus T1 - Identification and molecular analysis of Xmrk linked genes in the sex determining region of the Xiphophorus maculatus genome N2 - Fische der Gattung Xiphophorus stellen eines der am besten untersuchten Modellsysteme zur Untersuchung genetischer Geschlechtsbestimmung innerhalb dieser Klasse von mehr als 24.000 Arten dar. X. maculatus kann männliche (XX/ XY) oder weibliche (WY/ YY) Heterogametie aufweisen. Zusätzlich sind atypische Geschlechtsbestimmungssysteme beschrieben worden, die auf autosomale Modifikatoren zurückgeführt wurden. Obwohl kürzlich das Mastergen der Geschlechtsbestimmung im Medaka (Oryzias latipes) als ein Mitglied der Dmrt-Genfamilie identifiziert wurde, konnte Dmrt1bY als Mastergen der Geschlechtsbestimmung von Xiphophorus und anderen Fischen ausgeschlossen werden. Xiphophorus wurde zum wissenschaftlichen Modellsystem, da bestimmte zwischenartliche Kreuzungshybride maligne Melanome entwickeln. Das dafür verantwortliche Onkogen Xmrk und sein physiologisches Gegenstück egfrb liegen eng gekoppelt (< 0,6 cM) in der Geschlechtsbestimmungsregion von X. maculatus. Die Kopplungsgruppe umfasst noch weitere Loci wie den geschlechtsbestimmenden Locus SD, den Locus RY für rötliche und gelb-bräunliche Farbmuster und den Locus Mdl, der außer schwarzen Pigmentflecken auch noch den Bildungsort und die Schwere der Melanome in Hybriden mit X. helleri steuert. Die enge Kopplung dieser Loci entspricht einem physikalischen Abstand von ca. 1 Megabase (Mb) und ermöglicht eine Strategie der positionellen Klonierung der von diesen Loci kodierten Gene. Die Analyse großer Cosmid- und BAC- (Bacterial Artificial Chromosome) Contigs, welche im Rahmen dieser Arbeit erstellt wurden und die mehr als 1 Mb sowohl des X- als auch des Y-Chromosoms des Platys X. maculatus abdecken, zeigte eine hohe Dichte von Retroelementen und anderen repetitiven Sequenzen, besonders im Bereich des dominanten Onkogens Xmrk und in einer durch das duplizierte Gen ps-criptY gekennzeichneten, Y-spezifischen Region. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eines dieser Elemente (XIR) spezifisch auf dem Y-Chromosom akkumuliert, was möglicherweise einen frühen Schritt der Differenzierung der Geschlechtschromosomen des Platys darstellt. Es konnten mehrere Duplikationsereignisse in diese Region nachgewiesen werden. Erstens wurde egfrb dupliziert, dessen Kopie zum Onkogen Xmrk wurde. Zweitens konnte die mehrfache Duplikation eines Melanocortin-Rezeptorgens mc4r nachgewiesen werden, von dem 9 Kopien auf dem X-Chromosom in einer Tandem-ähnlichen Struktur vorliegen und mindestens 9 Kopien auf dem Y-Chromosom. Mindestens 11 der insgesamt 19 Kopien besitzen nicht unterbrochene offene Leseraster, deren konzeptionelle Translationsprodukte die strukturellen Charakteristika funktionaler Rezeptoren zeigen. Drittens wurde das autosomale Gen cript dupliziert und liegt nun in jeweils einer Kopie (ps-cript1) direkt stromabwärts von Xmrk auf beiden Geschlechtschromosomen und in einer zusätzlichen Kopie auf dem Y-Chromosom (ps-criptY), wo es eine Region mit Syntenie zum menschlichen Chromosom 2p markiert. Andere potentielle Gene zeigen Homologien zu den menschlichen Genen CHRNA, CHRND und TMEFF und lassen auf eine syntenische Region zum menschlichen Chromosom 2q schließen. Diese Region ist involviert in autosomale Geschlechtsumkehr im Mensch, allerdings wurde noch kein dafür verantwortliches Gen identifiziert. Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse der Analyse von Sequenzen in der geschlechtsbestimmenden Region von X. maculatus bilden die Basis für ein tieferes Verständnis der Mechanismen, die zur Plastizität der von der Xmrk-SD-Region vermittelten Eigenschaften führen. Auf dieser Grundlage sollten zukünftige Arbeiten zur Identifizierung des Mastergens der Geschlechtsbestimmung führen. Die Identifizierung dieses neuen Gens könnte außerdem zur Aufklärung anderer Geschlechtsbestimmungsmechanismen innerhalb der Fische beitragen, was besonders im Hinblick auf kommerziell genutzte Arten z.B. in der Aquakultur großen Nutzen bringen kann. Einige der analysierten Gene der Xmrk-Region zeigen geschlechtsspezifische Expressionsmuster, allerdings steht die funktionelle Analyse noch am Anfang. Phänotypen, die mit Pigmentmusterbildung und dem Zeitpunkt der sexuellen Reifung in Zusammenhang stehen, könnten auf den in dieser Arbeit identifizierten Melanocortin-Rezeptoren (mc4r) beruhen. Ihre strukturellen Eigenschaften und Expressionsmuster weisen auf ihre mögliche Rolle in einem oder mehreren dieser Vorgänge hin. Verglichen mit den nicht duplizierten Melanocortin-Rezeptoren anderer Vertebraten könnte die ungewöhnlich hohe Anzahl an Kopien als Grundlage für evolutionäre Veränderungen dieser Gene dienen. Obwohl ihre Funktionalität noch gezeigt werden muss, könnten diese Kopien typische evolutionäre Veränderungen duplizierter Gene wie die Übernahme einer neuen Funktion durch das Codieren neuer Proteine nach Mutationen, die Reduktion ihrer Funktion durch die auf weniger Gewebe eingeschränkte Expression und den Verlust ihrer Funktion durch Mutationen, die das Leseraster unterbrechen, zeigen. N2 - Fishes of the genus Xiphophorus provide one of the best analysed model systems with respect to genetic sex determination among this class of more than 24,000 species. Within certain species, systems with male (XX/ XY) or female (WY/ YY) heterogamety are known, in X. maculatus even within a same population. In addition, atypical sex determination sytems caused by autosomal modifiers have been described. Although the master sex determining gene of the Medakafish (Oryzias latipes) was recently identified as a member of the Dmrt gene family, Dmrt1bY could be excluded to be the master sex determining gene of Xiphophorus and other fish outside the genus Oryzias. Xiphophorus came into the light of science because of the formation of malignant melanoma in certain interspecific crossings of this genus. The dominant oncogene Xmrk and its proto-oncogenic counterpart egfrb reside in the subtelomeric regions of both X and Y sex chromosomes of X. maculatus. They are closely linked (< 0.6 cM) to the sex determination locus SD, the locus for the development of reddish and brownish colour patterns RY and the locus Mdl, responsible not only for black pigmentation patterns in X. maculatus but also for the onset and severity of the melanomas in hybrids with X. helleri. The close linkage that represents a region of about 1 Mb containing various loci that influence such different biological processes like tumor formation and sex determination made possible a strategy of positional cloning of genes involved in these phenotypes. Analysis of large gonosomal cosmid and BAC (Bacterial Artificial Chromosome) contigs established during this work that cover more than 1 Mb of both X and Y sex chromosomes of the Southern platyfish (X. maculatus) revealed a high density of retroelements and other repetitive sequences, particularly around the dominant oncogene Xmrk and within a male-specific region marked by the duplicated gene ps-criptY. In addition, one of these elements (XIR) has been shown to accumulate specifically on the Y-chromosome, probably reflecting an early step in sex chromosome differentiation in the platyfish. Repetitive elements can also mediate genetic variability as it is observed in this region for the multitude of pigment patterns and melanoma phenotypes and probably for the different sex determining mechanisms, too. Several duplication events could be observed in this region. First, the duplication of egfrb generated a second copy which became the oncogene Xmrk. Second, a melanocortin receptor gene was found to be duplicated 9 times on the X chromosome in a tandem like structure and at least 9 copies were found to reside on the Y. At least 11 copies still have a non-corrupted open reading frame, the conceptual translation products of which show the structural characteristics of functional receptors. Third, the autosomal gene cript is duplicated once on the X (ps-cript1) and twice on the Y chromosome (ps-cript1, ps-criptY), marking there a male-specific region syntenic to the human chromosome 2p. Other putative genes identified on the gonosomal contigs present homologies to the human genes CHRNA, CHRND and TMEFF and indicate a region syntenic to the human chromosome 2q. A so far unidentified gene involved in autosomal sex reversal in human has been mapped to this chromosomal region. The presented work of cloning sequences around the primary sex-determining locus SD of Xiphophorus maculatus provides the basis for a further understanding of the plasticity of the Xmrk-SD region and future experiments on the identification of the primary sex-determining gene in this genus and possibly in other fish species. This could be of special interest for commercially bred fish species in aquaculture. Some of the putative genes identified in the Xmrk region show sexually dimorphic expression patterns, albeit functional analysis is still at the beginning. Loci involved in melanoma formation, pigment patterning and puberty that are mapped to the Xmrk-SD region might be represented by different copies of the melanocortin receptor genes identified in this work. Their structural features as well as their differential expression patterns suggest a possible role in establishing these phenotypes. Compared to non-duplicated melanocortin receptors (mc4r) of other vertebrates, the high copy number on the gonosomes of X. macculatus could serve as evolutionary scenario. Although their functionality has to be proven, these copies might show typical features of duplicated genes in terms of neo-functionalization (in frame mutations, insertions/ deletions), sub-functionalization (reduced number of tissues in which they are expressed) and non-functionalization (pseudogenes). Thus, the further analysis of the mc4r genes of X. maculatus with respect to their function is expected to lead to a deeper understanding of general mechanisms that affect this fast evolving region of the sex chromosomes. KW - Platy KW - Geschlechtschromosom KW - Molekulargenetik KW - Xiphophorus KW - Fisch KW - Bacterial Artificial Chromosome KW - Geschlechtschromosomen KW - Genduplikation KW - Xiphophorus KW - fish KW - Bacterial Artificial Chromosome KW - sex chromosomes KW - gene duplication Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7005 ER - TY - THES A1 - Alcantarino Menescal, Luciana T1 - In vivo characterization of genetic factors involved in Xmrk driven melanoma formation in Medaka (Oryzias latipes): a closer look at braf, Stat5 and c-myc T1 - In vivo Charakterisierung genetischer Faktoren mit Einfluss auf Xmrk induzierte Melanome in Medaka (Oryzias latipes): Untersuchung von braf, Stat5 und c-myc. N2 - Melanoma arises from the malignant transformation of melanocytes and is one of the most aggressive forms of human cancer. In fish of the genus Xiphophorus, melanoma development, although very rarely, happens spontaneously in nature and can be induced by interspecific crossing. The oncogenic receptor tyrosine kinase, Xmrk, is responsible for melanoma formation in these fishes. Since Xiphophorus are live-bearing fishes and therefore not compatible with embryonic manipulation and transgenesis, the Xmrk melanoma model was brought to the medaka (Oryzias latipes) system. Xmrk expression under the control of the pigment cell specific mitf promoter leads to melanoma formation with 100% penetrance in medaka. Xmrk is an orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) and activates several downstream signaling pathways. Examples of these pathways are the direct phosphorylation of BRAF and Stat5, as well as the enhanced transcription of C-myc. BRAF is a serine-threonine kinase which is found mutated at high frequencies in malignant melanomas. Stat5 is a transcription factor known to be constitutively activated in fish melanoma. C-myc is a transcription factor that is thought to regulate the expression of approximately 15% of all human genes and is involved in cancer progression of a large number of different tumors. To gain new in vivo information on candidate factors known to be involved in melanoma progression, I identified and analysed BRAF, Stat5 and C-myc in the laboratory fish model system medaka. BRAF protein motifs are highly conserved among vertebrates and the results of this work indicate that its function in the MAPK signaling is maintained in medaka. Transgenic medaka lines carrying a constitutive active version of BRAF (V614E) showed more pigmented skin when compared to wild type. Also, some transiently expressing BRAF V614E fishes showed a disrupted eye phenotype. In addition, I was able to identify two Stat5 copies in medaka, named Stat5ab/a and Stat5ab/b. Sequence analysis revealed a higher similarity between both Stat5 sequences when compared to either human Stat5a or Stat5b. This suggests that the two Stat5 copies in medaka arose by an independent duplication processes. I cloned these two Stat5 present in medaka, produced constitutive active and dominant negative gene versions and successfully established transgenic lines carrying each version under the control of the MITF promoter. These lines will help to elucidate questions that are still remaining in Stat5 biology and its function in melanoma progression, like the role of Stat5 phosphorylation on tumor invasiveness. In a third project during my PhD work, I analysed medaka C-myc function and indentified two copies of this gene in medaka, named c-myc17 and c-myc20, according to the chromosome where they are located. I produced conditional transgenic medaka lines carrying the c-myc17 gene coupled to the hormone binding domain of the estrogen receptor to enable specific transgene activation at a given time point. Comparable to human C-myc, medaka C-myc17 is able to induce proliferation and apoptosis in vivo after induction. Besides that, C-myc17 long-term activation led to liver hyperplasia. In summary, the medaka models generated in this work will be important to bring new in vivo information on genes involved in cancer development. Also, the generated transgenic lines can be easily crossed to the melanoma developing Xmrk medaka lines, thereby opening up the possibility to investigate their function in melanoma progression. Besides that, the generated medaka fishes make it possible to follow the whole development of melanocytes, since the embryos are transparent and can be used for high throughput chemical screens. N2 - Melanome entstehen durch die krankhafte Transformation von Melanozyten und sind eine der aggressivsten Krebsarten beim Menschen. In Fischen der Gattung Xiphophorus können, wenn auch sehr selten, spontan Melanome entstehen oder durch spezielle Artenkreuzungen induziert werden. Grundlage für das Entstehen der Melanome in diesen Fischen ist die Rezeptortyrosinkinase Xmrk. Da alle Xiphophorus-Arten lebendgebärend sind und keine Manipulationen an Embryonen vorgenommen werden können, wurde ein Xmrk Melanommodel für Medaka (Oryzias latipes) etabliert. Die Expression von Xmrk in Pigmentzellen dieser Fischart resultiert mit 100%iger Penetranz in Melanomen. Das Xmrk ist ein Ortholog des menschlichen „epidermal growth factor“ (EGFR) und aktiviert verschiedene nachgeschaltete Signalwege. Beispiele für diese Aktivierungen sind die Phosphorylierung von BRAF, Stat5 und die erhöhte Expression von c-myc. BRAF ist eine Serin-Threoninkinase, welche oft in malignen Melanomen mutiert ist. Stat5 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher dauerhaft in Fischtumoren aktiviert ist. C-myc ist ein Transkriptionsfaktor, welcher etwa 15% aller menschlichen Gene sowie die Entstehung vieler menschlicher Tumore reguliert. Um neue Einsichten in die Funktion der Kanidatengene im Prozess der Melanomentstehung in vivo zu erlangen, habe ich Orthologe von BRAF, Stat5 und C-myc bei Medaka identifiziert und analysiert. Die Domänen des BRAF Proteins sind hoch konserviert in allen Vertebraten. Weiterhin deuten die Ergebnisse meiner Arbeit auf eine Beibehaltung der Funktionen im MAPK Signalweg hin. Transgene Medakalinien, welche eine dauerhaft aktive Version des BRAF Gens (V614E) exprimieren, weisen einerseits eine stärkere Hautpigmentierung auf. Weiterhin treten in diesen Fischen Veränderungen der Augen auf. In einem weiteren Projekt meiner Arbeit gelang es mir, zwei Kopien des Stat5 Gens im Medaka zu identifizieren, Stat5ab/a und Stat5ab/b. Sequenzanalysen zeigten eine höhere Übereinstimmung zwischen den beiden Genkopien, als zwischen denen von Medaka und Menschen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die beiden Medaka Gene durch eine unabhängige Duplikation entstanden. In meiner Arbeit habe ich beide Gene des Medakas kloniert und jeweils eine konstitutiv aktive und eine dominant negative Version der Gene hergestellt. Weiterhin konnte ich erfolgreich für jede Genversion eine transgene Medakalinie etablieren, welche die verschiedenen Genvarianten unter der Kontrolle des pigmentzellspezifischen Promoters des mitf Gens exprimieren. Diese Linien werden in Zukunft helfen, den Einfluss von Stat5 Signalen auf den Prozess der Melanomverbreitung und dessen Invasivität zu erklären. In einem dritten Projekt meiner Doktorarbeit untersuchte ich das Vorkommen und die Funktion der C-myc Gene des Medakas. Ich konnte zwei Genkopien identifizieren, c-myc17 und c-myc20, welche auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Ich konnte induzierbare, stabil transgene Linien herstellen, welche ein Fusionsprotein aus C-myc17 und der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors von Maus exprimiert. Diese Linie ermöglichte eine induzierbare Aktivität des Transgens. Vergleichbar zum menschlichen MYC ist C-myc17 fähig, nach Aktivierung Proliferation und Apoptose in vivo auszulösen. Dauerhafte Aktivierung über einen längeren Zeitraum führt in diesen Linien zu Hyperplasie in Leber. Die verschiedenen Fischmodelle, die während dieser Arbeit generiert wurden, werden essentiell sein, um neue Einsichten in die Rolle diese Faktoren während der Krebsentwicklung in vivo zu erlangen. Weiterhin ermöglichen diese transgenen Linien durch einfaches Auskreuzen auf Xmrk Linien, deren Einfluss auf die Verbreitung von Melanomen zu untersuchen. Letztendlich sind mit diesen Linien auch Untersuchungen der Entwicklung von Pigmentzellen über Zeit möglich, da die Embryonen transparent sind und sich für chemisches Hochdurchsatz-Screening eignen. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Myc KW - Molekulargenetik KW - melanoma KW - medaka KW - BRAF KW - Stat5 KW - c-myc KW - melanoma KW - medaka KW - BRAF KW - Stat5 KW - c-myc Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70762 ER - TY - THES A1 - Motsch, Isabell T1 - Lamin A and lamin C are differentially dysfunctional in autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy T1 - Lamin A und Lamin C sind funktional unterschiedlich von der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie betroffen N2 - Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is a rare genetic disorder characterised by early contractures of the elbows, Achilles tendons and spine, slowly progressive muscle wasting and cardiomyopathy associated with cardiac conduction defect. The autosomal dominant form is caused by mutations in the LMNA gene which gives rise to lamin A and lamin C proteins by alternative splicing. These A-type lamins, together with B-type lamins, form the nuclear lamina, a network of intermediate filament proteins underlining the nuclear envelope. In order to ascertain the role lamin A and C separately contribute to the molecular phenotype, we analysed ten LMNA mutations and one single nucleotide polymorphism (SNP) in transfection studies in COS7 fibroblasts and, partially, in C2C12 myoblasts. The EGFP or DsRed2 tagged lamins were exogenously expressed either individually or both A-types together and examined by light and electron microscopy. The protein mobility of lamin A mutants was determined by FRAP analysis. Additionally, a co-immunoprecipitation binding assay of in vitro synthesised A-type lamins and emerin was performed.Eight of the LMNA mutations (R50S, R133P, E358K, E358K+C