TY - THES A1 - Rajab, Suhaila T1 - Untersuchung von Sub-Millisekunden Dynamiken und allosterischer Kommunikation in Ligandenbindedomänen ionotroper Glutamatrezeptoren T1 - Investigation of sub-millisecond dynamics and allosteric communication in ionotropic glutamate receptor ligand binding domains N2 - Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle und vermitteln den Großteil der exzitatorischen Signalweiterleitung im gesamten zentralen Nervensystem. Darüber hinaus spielen iGluRs eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Funktion, einschließlich Lernprozessen und Gedächtnisbildung. Da eine Fehlfunktion dieser Rezeptoren mit zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden ist, stellen iGluRs zudem wichtige Zielproteine für die pharmakologische Wirkstoffentwicklung dar. Im Allgemeinen wird zwischen drei Untergruppen ionotroper Glutamatrezeptoren unterschieden, welche aufgrund ihrer Selektivität für einen bestimmten Liganden benannt sind: AMPA-, Kainate-, und NMDA-Rezeptoren. Die iGluRs jeder dieser Untergruppen bestehen in der Regel aus vier Untereinheiten, welche wiederum aus vier semiautonomen Domänen aufgebaut sind: (i) die aminoterminale Domäne (ATD), (ii) die Ligandenbindedomäne (LBD), (iii) die Transmembrandomäne (TMD) und (iv) die carboxyterminale Domäne (CTD). Die Ligandenbindedomäne, welche wiederum aus zwei Lobes (D1 und D2) besteht und in ihrer Struktur einer Muschelschale ähnelt, vollzieht bei Bindung eines Neurotransmitters eine Konformationsänderung, wobei sie sich um den gebundenen Agonisten herumschließt. Diese Konformationsänderung der LBD wird auf die Transmembrandomäne, welche den membranüberspannenden Ionenkanal ausbildet, übertragen, was in einer Umlagerung der Transmembranhelices und infolgedessen der Öffnung des Ionenkanals resultiert. Die Konformationsänderung der LBD ist demnach die treibende Kraft, welche dem Öffnen und Schließen des Ionenkanals zugrunde liegt. Aus diesem Grund stellt die isolierte Ligandenbindedomäne, welche als lösliches Protein hergestellt werden kann, ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der strukturellen und funktionellen Zusammenhänge innerhalb des Funktionsmechanismus ionotroper Glutamatrezeptoren dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Konformationsdynamiken der in Escherichia coli-Bakterien exprimierten isolierten Ligandenbindedomänen der drei homologen Untergruppen – AMPA-, Kainate- und NMDA-Rezeptoren – sowohl als Monomer als auch als Dimer untersucht. Hierbei wurden im ungebundenen Apo-Zustand der Proteine signifikante Kinetiken im Bereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden festgestellt, welche bei Bindung eines Agonisten sowie bei Dimerisierung erheblichen Veränderungen zeigen. Darüber hinaus wurde allosterische Kommunikation zwischen den LBDs der NMDA-Untergruppe untersucht, wobei in der Tat ein deutlicher allosterischer Effekt in Bezug auf die Konformationsdynamiken der Proteine gemessen werden konnte. Weiterhin wurde ein PET-FCS-basiertes Verfahren zur Messung der Dissoziationskonstante der Bindung eines Liganden an die LBD eines AMPA-Rezeptors entwickelt. Zuletzt wurde außerdem ermittelt, ob ein Unterschied zwischen vollen und partiellen Agonisten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Konformationsdynamiken einer AMPA-Rezeptor LBD besteht, was nachgewiesenermaßen nicht der Fall ist. Alle Messungen wurden auf Einzelmolekülebene auf Zeitskalen von Nanosekunden bis Millisekunden basierend auf Fluoreszenzfluktuationen unter Verwendung des photoinduzierten Elektronentransfers (PET) in Kombination mit Korrelationsspektroskopie (PET-FCS) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden PET-basierte Fluoreszenzsonden entwickelt, um Konformationsänderungen auf einer räumlichen Skala von einem Nanometer zu detektieren. Durch die Experimente innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PET-FCS-Methode eine vielversprechende Ergänzung zu allen bisher bestehenden Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamiken der Ligandenbindedomäne ionotroper Glutamatrezeptoren darstellt und daher eine aussichtsreiche Möglichkeit zur Erweiterung des zukünftigen Verständnisses der Funktionsweise von iGluRs bietet. N2 - Ionotropic glutamate receptors (iGluRs) are ligand-gated ion channels that mediate most of the excitatory signal transmission throughout the central nervous system. In addition, iGluRs play a crucial role in neural development and function, including learning and memory. Since receptor malfunction contributes to a variety of neurological diseases, iGluRs are key targets for drug development in pharmacology. Furthermore, ionotropic glutamate receptors are divided into three major subgroups, all of which are named due to their selectivity for a certain ligand: AMPA, Kainate and NMDA. Members of each subgroup usually consist of four subunits, which in turn comprise four semi-autonomous domains: (i) the amino terminal domain (ATD), (ii) the ligand binding domain (LBD), (iii) the transmembrane domain (TMD), and (iv) the carboxy terminal domain (CTD). Upon binding a neurotransmitter the ligand binding domain, which adopts a clamshell-like structure consisting of two domains (D1 and D2), undergoes a conformational change by closing around the ligand and trapping it within the binding cleft. The conformational change of the LBD is then transferred to the transmembrane domain which forms the membrane-spanning ion channel, which results in rearrangement of the transmembrane helices and consequently in opening of the ion channel. Accordingly, the conformational change of the LBD is the driving force underlying opening and closing of the ion channel. The isolated ligand binding domain can be produced as soluble protein and represents a well-established model system for exploring structural and functional relationships within the functional mechanism of ionotropic glutamate receptors. As part of this thesis, ligand binding domains of all three homologues – AMPAR, KainateR and NMDAR – have been expressed in Escherichia coli bacterial cells and conformational dynamics of the proteins both as monomer and as dimer have been investigated. In the unbound apo state of the proteins, significant kinetics have been observed in the nanosecond to microsecond time range which undergo considerable changes upon agonist binding or dimerization. In addition, allosteric communication between LBDs of the NMDA subgroup has been investigated, whereby a distinct allosteric effect regarding the conformational dynamics of the protein could actually be measured. Furthermore, a PET-FCS-based tool for measuring the dissociation constant of a ligand for an AMPA receptor LBD has been developed. Finally, it has been investigated whether full and partial agonists have different effects on the conformational dynamics of an AMPA receptor LBD, which has been found clearly not to be the case. All measurements have been performed at the single-molecule level on time scales from nanoseconds to milliseconds based on fluorescence fluctuations using photoinduced electron transfer (PET) fluorescence quenching in combination with correlation spectroscopy (PET-FCS). To this end, PET-based fluorescence probes have been engineered to monitor conformational changes on the one-nanometer scale. The experiments that have been carried out within this thesis introduce PET-FCS as a promising tool to complement all previously existing methods for studying conformational dynamics of ionotropic glutamate receptor ligand binding domains and hence offer a promising opportunity to expand future understanding of how iGluRs work. KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Glutamatrezeptor KW - Einzelmolekülspektroskopie KW - Proteinsynthese KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - photoinduced electron transfer KW - Ionotrope Glutamatrezeptoren KW - ionotropic glutamate receptors KW - Ligandenbindedomäne KW - ligand binding domain Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244946 ER - TY - THES A1 - Göhler, Antonia T1 - Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung T1 - Studying carbohydrate binding proteins with high temporal and spatial resolution N2 - Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine. N2 - The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins. KW - Fluoreszenz KW - Glykoproteine KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Anisotropie KW - dSTORM-Mikroskopie KW - Galektine KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - anisotropy KW - glycoproteins KW - galectins KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - dSTORM Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665 ER -