TY  - THES
A1  - Batzilla, Julia
T1  - Complete genome sequence of Yersinia enterocolitica subspecies palearctica serotype O:3: Identification of novel virulence-associated genes and evolutionary aspects
T1  - Die komplette Genomsequenz von Yersinia enterocolitica Subspezies palearctica Serotyp O:3: Identifikation neuer Virulenz-assoziierter Gene und evolutionäre Aspekte
N2  - Yersinia enterocolitica subsp. palearctica Serobiotyp O:3/4 ist verantwortlich für 80-90 % aller Yersiniosen beim Menschen in Deutschland und Europa. Y. enterocolitica Infektionen zeigen vielfältige Krankheitsbilder wie Gastroenteritis, Lymphadenitis und verschiedene Spätkomplikationen wie reaktive Arthritis. Das wichtigste Tierreservoir stellt das Hausschwein dar. Rohes Schweinefleisch in Metzgereien in Deutschland und anderen Regionen in Nord-Ost Europa ist häufig mit Yersinien kontaminiert (Bayern: 25 %). Da sich Serobiotyp O:3/4-Stämme geografisch und phylogenetisch deutlich von dem bisher sequenzierten Serobiotyp O:8/1B Stamm 8081 unterscheiden, wurde eine komplette Genomsequenzierung des europäischen Serobiotyp O:3/4 DSMZ Referenzstammes Y11 (aus Patientenstuhl isoliert) durchgeführt. Um einen genaueren Einblick in die Y. enterocolitica subsp. palearctica Gruppe zu erhalten, wurden zusätzlich zwei weitere Serobiotyp O:3/4 Isolate (Stamm Y8265, Patientenisolat, und Stamm Y5307, mit reaktiver Arthritis assoziiertes Patientenisolat), sowie ein eng verwandtes Y. enterocolitica subsp. palearctica Serobiotyp O:5,27/3 Isolat, Stamm Y527P, und zwei Biotyp 1A Isolate (ein Isolat nosokomialer Herkunft (Serogruppe O:5) und ein Umwelt-Isolat (O:36)) unvollständig sequenziert. Die nicht mausvirulenten Stämme wurden mit dem mausvirulenten Y. enterocolitica subsp. enterocolitica Serobiotyp O:8/1B Stamm 8081 verglichen, um genetische Besonderheiten von Stamm Y11 und der Y. enterocolitica subsp. palearctica Gruppe zu identifizieren. Besonderer Fokus lag hierbei auf dem pathogenen Potential von Stamm Y11, um neue potentielle Virulenz Faktoren und Fitnessfaktoren zu identifizieren, darunter vor allem solche, die eine Rolle bei der Wirtsspezifität von Serobiotyp O:3/4 spielen könnten. Y. enterocolitica subsp. palearctica Serobiotyp O:3/4 Stämmen fehlen einige der Charakteristika der mausvirulenten Gruppe Y. enterocolitica subsp. enterocolitica, beispielsweise die Yersiniabactin kodierende‚ High-Pathogenicity Island (HPI), das Yts1 Typ 2 Sekretionssystem und das Ysa Typ 3 Sekretionssystem. Die Serobiotyp O:3/4-Stämme haben ein anderes Repertoir von Virulenz Faktoren erworben, darunter Gene bzw. genomische Inseln für das Ysp Typ 3 Sekretionssystem, Rtx-ähnliches putatives Toxin, Insektizid-Toxine und ein funktionelles PTS System für die Aufnahme von N-acetyl-galactosamin, dem aga-Operon. Nach dem Transfer des aga-Operons in Y. enterocolitica subsp. enterocolitica O:8/1B konnte Wachstum auf N-acetyl-galactosamin festgestellt werden. Neben diesen Genen können möglicherweise auch zwei Prophagen (PhiYep-2 und PhiYep-3) und eine asn tRNA assoziierte genomische Insel (GIYep-01) zur Pathoadaptation von Y. enterocolitica subsp. palearctica Serobiotyp O:3/4 beitragen. Der PhiYep-3 Prophage und die GIYep-01 Insel weisen Rekombinationsaktivität auf, und PhiYep-3 wurde nicht in allen untersuchten Serobiotyp O:3/4 Stämmen gefunden. Y. enterocolitica subsp. palearctica Serobiotyp O:5,27/3 Stamm Y527P ist genetisch eng verwandt zu allen Serobiotyp O:3/4 Isolaten, wohingegen die Biotyp 1A Isolate ein mehr Mosaik-artiges Genom aufweisen und potentielle Virulenzgene sowohl mit Serobiotyp O:8/1B als auch O:3/4 gemeinsam haben, was einen gemeinsamen Vorfahren impliziert. Neben dem pYV Virulenz-Plasmid fehlen den Biotyp 1A Isolaten klassische Virulenzmarker wie das Ail Adhesin, das YstA Enterotoxin und das Virulenz-assoziierte Protein C (VapC). Interessanterweise gibt es keine beträchtlichen Unterschiede zwischen den bekannten Virulenzfaktoren des nosokomialen Isolats und dem Umweltisolat der Biotyp 1A-Gruppe, abgesehen von einem verkürzten Rtx Toxin-ähnlichem Genkluster und Überresten eines P2-ähnlichen Phagen im Krankenhausisolat der Serogruppe O:5.
N2  - Yersinia enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:3/4 comprises about 80-90 % of all human patient isolates in Germany and Europe and is responsible for sporadic cases worldwide. Even though this serobiotype is low pathogenic, Y. enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:3/4 is involved in gastroenteritis, lymphadenitis and various extraintestinal sequelae as reactive arthritis. The main animal reservoir of this serobiotype are pigs, causing a high rate of O:3/4 contaminations of raw pork in butcher shops in Germany (e.g. Bavaria 25 %) and countries in north-east Europe. As Y. enterocolitica O:3/4 is geographically and phylogenetically distinct from the so far sequenced mouse-virulent O:8/1B strain, complete genome sequencing has been performed for the European serobiotype O:3/4 DSMZ reference strain Y11, which has been isolated from a patient stool. To gain greater insight into the Y. enterocolitica subspecies palearctica group, also draft genome sequences of two other human O:3/4 isolates (strains Y8265, patient isolate, and Y5307, patient isolate associated with reactive arthritis), a closely related Y. enterocolitica palearctica serobiotype O:5,27/3 (strain Y527P), and two biotype 1A strains (a nosocomial strain of serogroup O:5 and an environmental serogroup O:36 isolate) have been performed. Those strains were compared to the high-pathogenic Y. enterocolitica subsp. enterocolitica serobiotype O:8/1B strain 8081 to address the peculiarities of the strain Y11 and the Y. enterocolitica subspecies palearctica group. The main focus was to unravel the pathogenic potential of strain Y11 and thus to identify novel putative virulence genes and fitness factors, especially those that may constitute host specificity of serobiotype O:3/4. Y. enterocolitica subspecies palearctica serobiotype O:3/4 strains lack most of the mouse-virulence-associated determinants of Y. enterocolitica subsp. enterocolitica serotype O:8, for example the HPI, Yts1 type 2 and Ysa type three secretion systems. In comparison, serobiotype O:3/4 strains obviously acquired a different set of genes and genomic islands for virulence and fitness such as the Ysp type three secretion system, an RtxA-like putative toxin, insecticidal toxins and a functional PTS system for N-acetyl-galactosamine uptake, named aga-operon. The aga-operon is able to support the growth of the Y. enterocolitica subsp. enterocolitica O:8/1B on N-acetyl-galactosamine after transformation with the aga operon. Besides these genes, also two prophages, PhiYep-2 and PhiYep-3, and a asn tRNA-associated GIYep-01 genomic island might influence the Y. enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:3/4 pathoadaptation. The PhiYep-3 prophage and the GIYep-01 island show recombination activity and PhiYep-3 was not found in all O:3/4 strains of a small strain collection tested. Y. enterocolitica subsp. palearctica serobiotype O:5,27/3 strain Y527P was found to be closely related to all serobiotype O:3/4 strains, whereas the biotype 1A isolates have more mosaic-segmented genomes and share putative virulence genes both with serobiotypes O:8/1B and O:3/4, which implies their common descent. Besides the pYV virulence plasmid, biotype 1A strains lack classical virulence markers as the Ail adhesin, the YstA enterotoxin, and the virulence-associated protein C. Interestingly, there are no notable differences between the known virulence factors present in nosocomial and environmental strains, except the presence of a truncated Rtx toxin-like gene cluster and remnants of a P2-like prophage in the hospital serogroup O:5 isolate.
KW  - Genanalyse
KW  - Yersinia enterocolitica
KW  - Genomsequenzierung
KW  - Genome Sequencing
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69668
N1  - Die praktische Durchführung der Arbeit wurde durch Hernn Prof. Dr. Dr. J. Heesemann am Max von Pettenkofer-Institut in München betreut.
ER  - 
TY  - THES
A1  - Liang, Chunguang
T1  - Tools for functional genomics applied to Staphylococci, Listeriae, Vaccinia virus and other organisms
N2  - Genome sequence analysis A combination of genome analysis application has been established here during this project. This offers an efficient platform to interactively compare similar genome regions and reveal loci differences. The genes and operons can be rapidly analyzed and local collinear blocks (LCBs) categorized according to their function. The features of interests are parsed, recognized, and clustered into reports. Phylogenetic relationships can be readily examined such as the evolution of critical factors or a certain highly-conserved region. The resulting platform-independent software packages (GENOVA and inGeno), have been proven to be efficient and easy to handle in a number of projects. The capabilities of the software allowed the investigation of virulence factors, e.g., rsbU, strains’ biological design, and in particular pathogenicity feature storage and management. We have successfully investigated the genomes of Staphylococcus aureus strains (COL, N315, 8325, RN1HG, Newman), Listeria spp. (welshimeri, innocua and monocytogenes), E.coli strains (O157:H7 and MG1655) and Vaccinia strains (WR, Copenhagen, Lister, LIVP, GLV-1h68 and parental strains). Metabolic network analysis Our YANAsquare package offers a workbench to rapidly establish the metabolic network of such as Staphylococcous aureus bacteria in genome-scale size as well as metabolic networks of interest such as the murine phagosome lipid signalling network. YANAsquare recruits reactions from online databases using an integrated KEGG browser. This reduces the efforts in building large metabolic networks. The involved calculation routines (METATOOL-derived wrapper or native Java implementation) readily obtain all possible flux modes (EM/EP) for metabolite fluxes within the network. Advanced layout algorithms visualize the topological structure of the network. In addition, the generated structure can be dynamically modified in the graphic interface. The generated network as well as the manipulated layout can be validated and stored (XML file: scheme of SBML level-2). This format can be further parsed and analyzed by other systems biology software, such as CellDesigner. Moreover, the integrated robustness-evaluation routine is able to examine the synthesis rates affected by each single mutation throughout the whole network. We have successfully applied the method to simulate single and multiple gene knockouts, and the affected fluxes are comprehensively revealed. Recently we applied the method to proteomic data and extra-cellular metabolite data of Staphylococci, the physiological changes regarding the flux distribution are studied. Calculations at different time points, including different conditions such as hypoxia or stress, show a good fit to experimental data. Moreover, using the proteomic data (enzyme amounts) calculated from 2D-Gel-EP experiments our study provides a way to compare the fluxome and the enzyme expression. Oncolytic vaccinia virus (VACV) We investigated the genetic differences between the de novo sequence of the recombinant oncolytic GLV-1h68 and other related VACVs, including function predictions for all found genome differences. Our phylogenetic analysis indicates that GLV-1h68 is closest to Lister strains but has lost several ORFs present in its parental LIVP strain, including genes encoding CrmE and a viral Golgi anti-apoptotic protein, v-GAAP. Functions of viral genes were either strain-specific, tissue-specific or host-specific comparing viral genes in the Lister, WR and COP strains. This helps to rationally design more optimized oncolytic virus strains to benefit cancer therapy in human patients. Identified differences from the comparison in open reading frames (ORFs) include genes for host-range selection, virulence and immune modulation proteins, e.g. ankyrin-like proteins, serine proteinase inhibitor SPI-2/CrmA, tumor necrosis factor (TNF) receptor homolog CrmC, semaphorin-like and interleukin-1 receptor homolog proteins. The contribution of foreign gene expression cassettes in the therapeutic and oncolytic virus GLV-1h68 was studied, including the F14.5L, J2R and A56R loci. The contribution of F14.5L inactivation to the reduced virulence is demonstrated by comparing the virulence data of GLV-1h68 with its F14.5L-null and revertant viruses. The comparison suggests that insertion of a foreign gene expression cassette in a nonessential locus in the viral genome is a practical way to attenuate VACVs, especially if the nonessential locus itself contains a virulence gene. This reduces the virulence of the virus without compromising too much the replication competency of the virus, the key to its oncolytic activity. The reduced pathogenicity of GLV-1h68 was confirmed by our experimental collaboration partners in male mice bearing C6 rat glioma and in immunocompetent mice bearing B16-F10 murine melanoma. In conclusion, bioinformatics and experimental data show that GLV-1h68 is a promising engineered VACV variant for anticancer therapy with tumor-specific replication, reduced pathogenicity and benign tissue tropism.
N2  - Genom Sequenz Analyse Im Zuge der vorliegenden Doktorarbeit wurden verschiedene Programme zur Genomanalyse kombiniert, um eine effiziente Plattform zum interaktiven Vergleich lokaler Ähnlichkeiten bzw. Unterschiede in Genomen bereitzustellen. Damit können Gene und Operons schnell untersucht und “local collinear blocks” entsprechend ihrer Funktion kategorisiert werden. Phylogenetische Beziehungen, wie beispielsweise die Evolution spezifischer Elemente oder stark konservierter Regionen können leicht überprüft werden. Die hierfür entwickelte plattformunabhängige Software (GENOVA und inGeno) hat sich in mehreren Projekten als effizient und leicht handhabbar bewährt. Die Programme erlauben die Untersuchung von Virulenzfaktoren auf Sequenz- oder Annotationsebene. Während der vorliegenden Doktorarbeit konnten so die Genome von verschiedenen Staphylococcus aureus, Listeria spp., Escherichia coli und Vaccinia Stämmen untersucht werden. Metabolische Netzwerk Analyse Unser “YANAsquare” Programmpaket bietet eine Oberfläche um schnell metabolische Netzwerke vom genomweiten Anzatz bis hinunter zum Einzelnetzwerk zu analysieren. Dafür greift YANA mit Hilfe des integrierten KEGG-Browsers auf Onlinedatenbanken zu, um die notwendigen Informationen zum metabolischen Reaktionsweg bereitzustellen und reduziert so maßgeblich den Arbeitsaufwand beim Beschreiben von Netzwerke. Die implementierten Methoden zur Berechnung (METATOOL, eigene Implementation in Java) des Netzwerkes liefern exakt alle die möglichen Elementarmoden (EM/EP) für die Metabolite zurück. Durch den Einsatz von fortgeschrittenen Layout Algorithmen wird anschliessend die Darstellung der Netzwerktopologie möglich. Außerdem kann in der grafischen Darstellung das generierte Netzwerklayout dynamisch verändert werden. Das Speichern der Daten erfolgt im XML (SBML level-2) Format und erlaubt so die Weiterverwendung in anderen systembiologischen Programmen, wie dem “CellDesigner”. Mit Hilfe einer gen-Knockout Simulations Methode kann der Einfluss von einzelnen Mutationen im gesamten Netzwerk auf die Syntheseraten untersucht werden. Wir konnten mit dieser Methode Einzel- sowie Mehrfachgenknockouts und deren Effekte auf die Elementarmoden analysieren. Die Methode wurde ebenfalls auf Proteomdaten und extrazelluläre Metabolite von Staphylokokken angewandt, um Änderungen bezüglich der Flussverteilung zu untersuchen. Die Simulationen zu verschieden Zeitpunkten und unter verschiedenen Stessbedingungen zeigen große Übereinstimmung mit experimentell erhobenen Daten. Onkolytischer Vaccinia Virus (VACV) Wir haben die genetischen Unterschiede zwischen der de novo Sequenz des rekombinanten onkolytischen Virus GLV-1h68 und anderen VACVs untersucht und gefundene Unterschiede funktionell charakterisiert. Die phylogenetische Analyse zeigt das GLV-1h68 mit dem Lister Stamm am nächsten verwandt ist. Auffällig ist dabei der Verlust von einigen open reading frames (ORFs), die noch im Eltern LIVP Stamm vorhanden sind (CrmE, v-GAAP). Beim Vergleich der Funktion viraler Gene aus Lister, WR und COP Stämmen treten stamm-, gewebe- und wirtsspezifische Gene auf. Diese Tatsache ermöglicht die Optimierung der onkolytischen Virusstämme für den Einsatz bei humanen Krebstherapien. Die beim Vergleich identifizierten Unterschiede zwischen den ORFs enthalten Gene für die Wirtsselektion, Virulenz und immunmodulierende Proteine (Ankyrin ähnliche Proteine, Serine-Proteinasen Inhibitor SPI-2/CrmA, Tumor Nekrose Faktor (TNF) Rezeptorhomolog CrmC, semaphorinähnliche und Interleukin-1 rezeptorhomologe Proteine). An den Loki F14.5L, J2R und A56R des GLV-1h68 Virus wurden die Vorteile der eingesetzten fremden Genexpressionskassetten untersucht. So zeigt GLV-1h68 mit F14.5L-Inaktivierung gegenüber der F14.5L-Revertanten Viren eine reduzierte Virulenz. Das erlaubt die Schlussfolgerung, dass die Insertion von fremden Genexpressionskassetten in nicht-essentielle Loki zur Verminderung der Virulenz von VACVs führt, besonders, wenn der nicht-essentielle Lokus selbst ein Virulenzgen enthält. Das Replikationsvermögen, welches ausschlaggebend für die onkolytische Aktivität des Virus ist, wird trotz der verminderten Virulenz nicht eingeschränkt. Die reduzierte Pathogenität des GLV-1h68 Virus wurde durch experimentelle Daten unserer Kollaborationspartner in männlichen Mäusen mit Ratten C6 Gliom und in immunokompetenten Mäusen mit B16-F10 Mausmelanom nachgewiesen. Zusammenfassend zeigen experimentelle und bioinformatisch gewonnene Daten, dass GLV-1h68 eine vielversprechende VACV Variante für die Krebstherapie mit tumorspezifischer Replikation, verringerter Pathogenität und hoher Gewebsspezifität ist.
KW  - Genanalyse
KW  - Bioinformatik
KW  - Systembiologie
KW  - bacterial
KW  - virulence
KW  - systems biologie
KW  - genomic
KW  - algorithm
KW  - metabolic
KW  - network
KW  - pathway
KW  - flux
KW  - Bacterial
KW  - genomics
KW  - algorithm
KW  - tool
KW  - metabolic
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48051
ER  - 
TY  - THES
A1  - Braasch, Ingo
T1  - Evolution by genome duplication: insights from vertebrate neural crest signaling and pigmentation pathways in teleost fishes
T1  - Evolution durch Genomverdoppelung: Erkenntnisse aus Analysen der Signalwege in der Neuralleiste der Vertebraten und in den Pigmentzellen im Fisch
N2  - Gene and genome duplications are major mechanisms of eukaryotic genome evolution. Three rounds of genome duplication have occurred in the vertebrate lineage, two rounds (1R, 2R) during early vertebrate evolution and a third round, the fish-specific genome duplication (FSGD), in ray-finned fishes at the base of the teleost lineage. Whole genome duplications (WGDs) are considered to facilitate speciation processes and to provide the genetic raw material for major evolutionary transitions and increases in morphological complexity. In the present study, I have used comparative genomic approaches combining molecular phylogenetic reconstructions, synteny analyses as well as gene function studies (expression analyses and knockdown experiments) to investigate the evolutionary consequences and significance of the three vertebrate WGDs. First, the evolutionary history of the endothelin signaling system consisting of endothelin ligands and receptors was reconstructed. The endothelin system is a key component for the development of a major vertebrate innovation, the neural crest. This analysis shows that the endothelin system emerged in an ancestor of the vertebrate lineage and that its members in extant vertebrate genomes are derived from the vertebrate WGDs. Each round of WGD was followed by co-evolution of the expanding endothelin ligand and receptor repertoires. This supports the importance of genome duplications for the origin and diversification of the neural crest, but also underlines a major role for the co-option of new genes into the neural crest regulatory network. Next, I have studied the impact of the FSGD on the evolution of teleost pigment cell development and differentiation. The investigation of 128 genes showed that pigmentation genes have been preferentially retained in duplicate after the FSGD so that extant teleost genomes contain around 30% more putative pigmentation genes than tetrapods. Large parts of pigment cell regulatory pathways are present in duplicate being potentially involved in teleost pigmentary innovations. There are also important differences in the retention of duplicated pigmentation genes among divergent teleost lineages. Functional studies of pigment synthesis enzymes in zebrafish and medaka, particularly of the tyrosinase family, revealed lineage-specific functional evolution of duplicated pigmentation genes in teleosts, but also pointed to anciently conserved gene functions in vertebrates. These results suggest that the FSGD has facilitated the evolution of the teleost pigmentary system, which is the most complex and diverse among vertebrates. In conclusion, the present study supports a major role of WGDs for phenotypic evolution and biodiversity in vertebrates, particularly in fish.
N2  - Gen- und Genomverdopplungen sind wichtige Mechanismen der Genomevolution in Eukaryonten. Im Verlauf der Evolution der Wirbeltiere gab es drei wichtige Genomduplikationen. Zwei Genomverdopplungen (1R, 2R) fanden während der sehr frühen Vertebratenevolution statt. In der Linie der Fische kam es an der Basis der Teleostier zu einer weiteren, fischspezifischen Genomduplikation (FSGD). Man nimmt an, dass Genomduplizierungen Artbildungsprozesse begünstigen und dass sie zusätzliches genetisches Material für wichtige evolutionäre Übergänge und für die Steigerung morphologischer Komplexität erzeugen. In der vorliegenden Arbeit wurden Methoden der vergleichenden und funktionellen Genomik gewählt, um die Auswirkungen und die Bedeutung der drei Genomverdopplungen bei Vertebraten zu untersuchen. Dazu wurden molekularphylogenetische Stammbaumanalysen und Synteniedaten mit Genexpressionsstudien und Knockdown-Experimenten kombiniert. Zunächst wurde die Evolution des Endothelin-Signalsystems rekonstruiert. Dieses besteht aus Endothelin-Liganden und -Rezeptoren und hat eine Schlüsselrolle in die Entwicklung der Neuralleiste. Die Neuralleiste und die von ihr abgeleiteten Zelltypen sind wirbeltierspezifische Innovationen. Die Analyse zeigt, dass das Endothelin-System in einem gemeinsamen Vorfahren der Vertebraten entstanden ist. Die in den Genomen rezenter Vertebraten vorkommenden Komponenten des Endothelin-Systems sind durch die drei Genomverdoppelungen entstanden. Nach jeder der Duplizierungen kam es zur Ko-Evolution der Liganden- und Rezeptorenfamilien. Die Evolution des Endothelin-System unterstreicht daher die Bedeutung der Genomduplizierungen für den Ursprung und die Diversifizierung der Neuralleiste. Sie weist aber auch auf eine wichtige Rolle für die Integrierung neuer Gene in das regulatorische Netzwerk der Neuralleiste hin. Im Weiteren wurde der Einfluss der FSGD auf die Evolution der Pigmentzellentwicklung und differenzierung in Teleostiern untersucht. Die evolutionäre Analyse von 128 Genen zeigte, dass Pigmentierungsgene nach der FSGD bevorzugt in zwei Kopien erhalten geblieben sind. Daher besitzen rezente Teleostier im Vergleich zu Landwirbeltieren zusätzlich ca. 30% mehr Gene mit potentiellen Funktionen für die Pigmentierung. Große Teile der regulatorischen Signalwege in den Pigmentzellen liegen daher als zwei Kopien vor. Diese waren möglicherweise an der Evolution von Innovationen in der Körperfärbung von Teleostiern beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden auch wichtige Unterschiede zwischen verschiedenen Fischgruppen im Erhalt duplizierter Pigmentierungsgene gefunden. Funktionelle Studien bei Zebrafish und bei Medaka an Enzymen der Pigmentsynthese, insbesondere der Tyrosinase-Familie, gaben Hinweise darauf, dass die funktionelle Evolution duplizierter Pigmentierungsgene in Fischen linienspezifisch verlaufen kann. Die Studien ergaben außerdem, dass bestimmte Funktionen der Pigmentsyntheseenzyme innerhalb der Vertebraten konserviert sind. Die Evolution des Pigmentierungssystems der Fische, welches das vielfältigste und komplexeste innerhalb der Wirbeltiere ist, wurde somit maßgeblich durch die FSGD beeinflusst. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit darauf hin, dass die Verdopplung ganzer Genome ein wichtiger Mechanismus der phänotypische Evolution bei Vertebraten ist und damit in besonderem Maße zur ihrer Biodiversität beiträgt.
KW  - Molekulare Evolution
KW  - Fische
KW  - Entwicklungsbiologie
KW  - Evolutionsbiologie
KW  - Genanalyse
KW  - Pigmentierung
KW  - Melanin
KW  - Vertebrat
KW  - Neuralleiste
KW  - Gen-/Genomverdoppelung
KW  - gene/genome duplication
KW  - fish
KW  - vertebrate
KW  - neural crest
KW  - pigmentation
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35702
ER  - 
TY  - THES
A1  - El-Masri, Harun
T1  - A genetic analysis of somitogenesis in the Medaka (Oryzias latipes)
T1  - Genetische Analyse der Somitogenese in Medaka (Oryzias latipes)
N2  - Somites are repeated epithelial segments that are generated in a rhythmic manner from the presomitic mesoderm (PSM) in the embryonic tailbud. Later, they differentiate into skeletal muscle, cartilage and dermis. Somitogenesis is regulated by a complex interplay of different pathways. Notch/Delta signaling is one of the pathways well characterized in zebrafish through mutants affected in its different components. Previous work in mouse, chicken and zebrafish has shown that also additional components are required during somitogenesis, most importantly through an FGF and Retinoic acid (RA) gradient, as well as Wnt signaling. However, no zebrafish mutants with defects in these pathways showing specific somite malformations are described. This was explained by functional redundancies among related genes that have resulted from a whole genome duplication which occurred in a teleost fish ancestor 350 million years ago. As distinct duplicates exist in different teleost species, a large scale mutagenesis screen in the medaka (Oryzias latipes) has been performed successfully in Kyoto, Japan. I analyzed nine of the isolated medaka mutants that show variable aspects of somitic phenotypes. This includes a complete or partial loss of somite boundaries (e.g. bms and sne), somites with irregular sizes and shapes (e.g. krz and fsl) or partially fused and enlarged somites (e.g. dpk). Although some of these medaka mutants share characteristics with previously described zebrafish somite mutants, most of the mutants represent unique phenotypes, not obtained in the zebrafish screens. In-situ hybridization analyses with marker genes implicated in the segmentation clock (e.g. her7), establishment of anterior-posterior (A-P) polarity (e.g. mesp) and differentiation of somites (e.g. myf5, lfng) revealed that the medaka mutants can be separated into two classes. Class I shows defects in tailbud formation and PSM prepatterning, and lateron somite boundary formation was impaired in these mutants. A unique member of this class with a novel phenotype is the doppelkorn (dpk) mutant that has single fused or enlarged somites. This phenotype has not been reported till now in zebrafish somite mutants. In-situ analyses on dpk showed that stabilization of the cyclically expressed somitogenesis clock genes must be affected in this mutant. This is accompanied by a disrupted regulation of A-P polarity genes like mesp. This suggests that dpk is a mutant deficient in the wave front, which is necessary for the down-regulation of oscillating genes in the anterior PSM. Furthermore, as the initiation of oscillation of all three cyclic her genes was unaffected in dpk embryos, I could exclude that this mutant in affected in the Notch/Delta pathway. Another mutant that belongs to this class is the samidare (sam) mutant. Morphologically, sam mutants are similar to zebrafish after eight (aei). In both cases, the first 7-9 somites are formed properly, but after this somite formation ceases. Different to the situation in aei, sam mutant embryos presented an additional defect in the mid-hindbrain boundary (MHB) region. Similar MHB defects were described in the zebrafish fgf8 mutant acerebellar (ace). In ace zebrafish mutant, somites were only slightly defective, although FGF signaling has been shown to be important for somite formation in chicken, mouse and zebrafish. This was explained by functional redundancy between fgf8 and fgf24 ligands in the tailbud of zebrafish. Thus, it is interesting to suggest that the sam mutant, based on the parallel defects in somites and MHB, is a potential member of the FGF signaling pathway muatnts. It was shown that FGF plays a crucial role during MHB formation in medaka. In addition, I showed that fgf8 acts non-redundantly during tailbud formation and somitogenesis in medaka. Furthermore, I showed that FGF signaling regulates somite size also in medaka and that fgfr1 is the only FGF receptor expressed in the tailbud and somites. In class II medaka somite mutants, PSM prepatterning appears normal, whereas A-P polarity, boundary formation, epithelialization or the later differentiation of somites appears to be affected. Such mutants have not been isolated so far in zebrafish, mice or chicken. Therefore, medaka class II somite mutants seem to be a novel group of mutants that opens new perspectives to analyze A-P polarity regulation, determination and boundary formation in the presence of a normally functioning clock in the PSM. Identifying the encoding genes for all analyzed medaka somite mutants will contribute to the understanding of the molecular interactions of different signaling pathways involved during somitogenesis, and is expected to result in the identification of new components.
N2  - Die Somitogenese stellt einen entscheidenden Prozess bei der Entwicklung von Wirbeltierembryonen dar. Somiten sind transiente Strukturen, die sich im Verlauf der Embryonalentwicklung zu Skelettmuskulatur, Dermis und Wirbelkörper differenzieren. Somiten entstehen in einem sich regelmäßig wiederholenden Zyklus aus Stammzellen des präsomitischen Mesoderms (PSM), einer Wachstumszone am caudalen Ende des Embryos. Ein wichtiger Bestandteil der Somitogenese ist ein molekularer Oszillator, das so genannte „Segmentierungs-Uhrwerk“. Die periodische Segmentierung des präsomitischen Mesoderms wird reguliert durch eine Reihe komplexer Interaktionen von unterschiedlichen Signale wegen. Der Notch/Delta Signalweg spielt dabei eine zentrale Bedeutung, da hierbei Komponenten entdeckt wurden, die während der Somitogenese zyklisch im PSM exprimiert werden. Außer dem Notch/Delta Signalweg spielen auch ein FGF und Retinolsäure Gradient, sowie Wnt Signale eine wichtige Rolle bei der Somitogenese. Trotz mehrerer Mutagenese Screens im Zebrafisch wurden bislang keine Mutanten im FGF oder Wnt Signalweg entdeckt, die einen spezifischen Somiten Defekt besitzen. Die wurde durch eine funktionelle Redundanz unterschiedlicher Gene erklärt, die durch eine Duplikation im Genom von Teleostieren vor 350 Millionen Jahren enstanden ist. Da unterschiedliche Duplikate in verschiedenen Fischspezies existieren, wurde in den letzten Jahren ein grosser Mutagenese Screen bei Medaka (Oryzias latipes) in Kyoto, Japan durchgeführt. In meiner Arbeit habe ich neue Somitogenese Mutanten aus dieser Screen isoliert und Phänotypisch charakterisiert. Die neun isolierten Mutanten zeigten unterschiedliche Somiten Phänotypen. Einige Mutanten hatten wenige oder gar keine Somitengrenzen (z.B bms oder sne), andere hatten unregelmäßige Somiten Formen (z.B. krz oder fsl) oder unterschiedlich große Somiten (z.B dpk). Manche dieser Medaka wiesen Änlichkeiten Mutanten zu im Zebrafisch beschriebenen Somiten Mutanten auf. Die Mehrzahl der Mutanten zeigten jedoch Phänotypen, die bis jetzt noch nicht in Zebrafisch Screens gefunden worden. In-Situ Analysen mit Hilfe unterschiedlicher, neu isolierter Somitenmarker, wie z.B. her7 einem Bestandteil des molekularen Oszillators, mesp einem anterior-posterioren Gen oder den Somitendifferenzierungsgenen lfng oder myf5 erlaubten, die Medaka Mutanten in zwei unterschiedliche Gruppen zuzuordnen. Gruppe I zeigt Defekte in der Bildung der Schwanzknospe und der Musterbildung im PSM. Ein besonderes Beispiel dieser Gruppe ist die Mutante doppelkorn (dpk), die einen bislang nicht beschriebenen Somitenphänotyp besitzt. In-situ Analysen von dpk zeigten, dass zyklische Gene im anterioren PSM dieser Mutante nicht stabilisiert werden und auch A-P Polaritätsgene fehlerhaft reguliert werden. Das deutet darauf hin, dass in der dpk Mutante ein Faktor der sogenannten „Wavefront“ betroffen sein könnte, der wichtig ist für die Regulation von oszillierenden Genen im anterioren PSM ist. Ich konnte zeigen, daß der wichtige Notch/Delta Signalweg in dieser Mutante nicht betroffen ist, weil alle unterschiedlichen zyklischen Gene, her1, her5 und her7, eine normale dynamische initiation ihrer Expression zeigten. Gruppe II Mutanten zeigen Defekte bei der Bildung der Somitengrenzen und Epithelialisierung der Somiten trotz normales, Musterbildung im PSM. Solche Mutanten wurden bislang weder in Zebrafisch, noch in Maus oder Hühnchen gefunden. Deshalb sollten nach der molekularen Identifiezierung der mutierten Gene neue Faktoren erhalten werden, die vor allem für die Regulation später Somitogenese-phasen wichtig sind.
KW  - Japankärpfling
KW  - Somit
KW  - Genanalyse
KW  - Somiten
KW  - Präsomitisches Mesoderm
KW  - Medaka
KW  - FGF Signalweg
KW  - Notch/Delta Signalweg
KW  - Somites
KW  - Presomitic meoderm
KW  - Medaka
KW  - FGF pathway
KW  - Notch/Delta pathway
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14515
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zhou, Qingchun
T1  - Molecular analysis of the sex-determining region of the Y chromosome in the platyfish Xiphophorus maculatus
T1  - Molekulare Analyse der geschlechtsbestimmenden Region des Y Chromosoms von Xiphophorus maculatus
N2  - A large variety of sex determination systems have been described in fish. However, almost no information is available about sex determination in the classical fish models, the zebrafish Danio rerio and the pufferfish Takifugu rubripes. A DNA-binding protein gene called dmrt1bY (or DMY) has been recently described as an outstanding candidate for the primary sex-determining gene in the medaka fish Oryzias latipes. But this gene is not the universal master sex-determining gene in teleost fish, since dmrt1bY is not found in most other fishes. Hence, other fish models need to be examined including the platyfish Xiphophorus maculatus. Xiphophorus maculatus has three types of sex chromosomes (X, Y and W; females are XX, WX or WY; males are XY or YY). Its gonosomes are at an early stage of differentiation. The sex-determining locus on the sex chromosomes is flanked by two receptor tyrosine kinase genes, the Xmrk oncogene and its protooncogenic progenitor gene egfrb, which both delimit a region of about 0.6 centiMorgans. This situation should allow the positional cloning of the sex-determining gene (SD) of the platyfish. For this purpose, Bacterial Artificial Chromosome (BAC) contigs were assembled from a BAC library of XY males constructed in our laboratory, using the oncogene Xmrk, egfrb, as well as a Y-specific pseudogene called ps-criptY as starting points. The ps-criptY sequence was found to be closely linked to the SD gene, since no recombination was observed between SD and ps-criptY in more than 400 individuals tested. Two major BAC contigs for the X chromosome (about 2.5 Mb) and three major BAC contigs for the Y chromosome (about 3.5 Mb) were built up and analyzed by strategic sequencing. These are some of the largest contigs ever assembled for the sex chromosomes of a non-mammalian vertebrate species. The molecular analysis of the ps-criptY contig was the major objective of this work. The Y-specific ps-criptY contig has been extended over 1 Mb in this work with 58 identified molecular markers. Approximatively 700 kb of non-redundant sequences has been obtained from this contig by strategic sequencing. Numerous Y-linked markers from the contig including ps-criptY were also detected on the X chromosome. Nevertheless, major structural differences were observed between the X and Y chromosomes. Particularly, a large region, which is present at one copy on the X chromosome and contains several candidate genes, was found to be duplicated on the Y chromosome. Evidence for an inversion in the sex-determining region and for the Y-specific accumulation of a repeated sequence called XIR was also obtained. Such events might correspond to an initiation of differentiation between both types of gonosomes. Accumulation of transposable elements was also observed in the ps-criptY contig. A DNA transposable element, helitron, was isolated from the sex-determining region of X. maculatus. Three copies of helitron are located on the ps-criptY contig and one copy on the X-linked contig (helitron has roughly 15 copies per haploid genome). No in-frame stop codon, truncation or intron was found in these four copies, which present high nucleotide identities to each other. This suggests that helitron elements might be active or have been recently active in X. maculatus. A consensus open reading frame of helitron was also assembled from medaka (Oryzias latipes) genomic sequences. Two candidate genes from the ps-criptY contig are also located on the W chromosome in the X. maculatus Usumacinta strain (heterogamety). These markers show the relationship between the different types of gonosomes and allow to compare the male and female heterogameties in the platyfish. Several gene candidates were identified in the ps-criptY contig. However, some of them such as msh2, cript, igd and acr probably correspond to pseudogenes. Interestingly, a novel gene, called swimy, is exclusively expressed in spermatogonia of the adult testis. Swimy is a gene encoding a DNA-binding protein with several putative DNA-binding domains. The data suggest that swimy is a very promising candidate for the master SD gene. Another novel gene, which is called fredi and encodes a novel helix-turn-helix protein, is predominately expressed in the adult testis and currently under scrutiny. There is no doubt that the master SD gene of X. maculatus will be identified by positional cloning. Further molecular analysis of the contigs built in this work will shed new light on the molecular mechanism of sex determination and the evolution of sex chromosomes in fish.
N2  - In Fischen wurde eine große Anzahl Geschlechtsbestimmungssysteme beschrieben. Allerdings gibt es kaum Informationen über die Geschlechtsbestimmung der klassischen Modellorganismen, des Zebrafisches Danio rerio und des Pufferfisches Takifugu rubripes. Das für ein DNA-bindendes Protein kodierende Gen dmrt1bY (oder DMY) wurde kürzlich als ein herausragender Kandidat für das primäre Geschlechts-bestimmungsgen im Medaka Oryzias latipes beschrieben. Dieses Gen ist jedoch nicht das universelle Geschlechtsbestimmungsgen der echten Knochenfische (Teleostei), da dmrt1bY in den meisten anderen Fischen nicht identifiziert werden konnte. Deshalb dienen andere Fische wie der Platy Xiphophorus maculatus als Modelle. Xiphophorus maculatus besitzt drei Geschlechtschromosomen X, Y und W in einem frühen Stadium der Differenzierung (Weibchen sind XX, WX oder WY, Männchen XY oder YY). Der geschlechtsbestimmende Locus wird flankiert von zwei Rezeportyrosinkinase-Genen, dem Onkogen Xmrk und seinem Vorläufer, dem Proto-onkogen egfrb. Sie markieren eine Region von ca. 0.6 centiMorgan, was die positionelle Klonierung des geschlechtsbestimmenden Gens SD des Platys erlauben sollte. Zu diesem Zweck wurden BAC- (Bacterial Artificial Chromosome-) Contigs der X- und Y-Chromosomen aus einer genomischen Bibliothek erstellt, wobei Xmrk, egfrb und das Y-spezifische Pseudogen ps-criptY als Startpunkte gewählt wurden. Ps-criptY ist eng an SD gekoppelt, wie die Analyse von über 400 Individuen zeigte. Zwei BAC-Contigs des X-Chromosoms (ca. 2.5 Mb) und drei BAC-Contigs des Y-Chromosoms (ca. 3.5 Mb) wurden erstellt und durch strategisches Sequenzieren analysiert. Dies sind einige der größten geschlechtschromosomalen Contigs, die je für eine Wirbeltierart außerhalb der Säuger erstellt wurden. Der Aufbau und die molekulare Analyse des BAC-Contigs um ps-criptY war Hauptziel dieser Arbeit. Dieses Y-spezifische Contig wurde durch die Analyse von 58 molekularen Markern in dieser Arbeit um über eine Megabase erweitert. Fast 700 kb nicht-redundanter Sequenz konnten durch strategisches Sequenzieren analysiert werden. Obwohl eine Vielzahl von Markern des Y-Chromosoms inklusive ps-criptY ebenfalls auf dem X-Chromosom detektiert wurden, konnten große strukturelle Unterschiede der Geschlechtschromosomen nachgewiesen werden. Im besonderen konnte die Duplikation einer großen Region des X-Chromosoms, die mehrere Genkandidaten enthält, auf dem Y-Chromosom gezeigt werden. Außerdem konnte die Inversion dieser Region inklusive einer Akkumulation der repetitiven Sequenz XIR konnte belegt werden. Solche Ereignisse entsprechen einer beginnenden Differenzierung zwischen heteromorphen Geschlechtschromosomen. Außerdem wurde die Akkumulation transposabler Elemente im ps-criptY-Contig beobachtet. Eines dieser Elemente, helitron, konnte aus der geschlechtsbestimmenden Region von X. maculatus isoliert werden. Von den vier Kopien der geschlechts-bestimmenden Region (3 Kopien im ps-criptY-Contig des Y-Chromosoms, 1 Kopie im Xmrk-Contig des X-Chromosoms, 15 im gesamten Genom) enthielt keine ein vorzeitiges Stop-Codon, Unterbrechung oder sonstige Störung des offenen Leserasters. Dies könnte darauf hinweisen, dass die helitron-Elemente in X. maculatus noch aktiv sind oder bis vor kurzem waren. Ein Konsensus-ORF des helitron-Elements konnte auch aus Datenbank-Sequenzen des Medaka (Oryzias latipes) erstellt werden. Zwei Genkandidaten des ps-criptY-Contigs konnten auch auf dem W-Chromosom von X. maculatus (Rio Usumacinta, weibliche Heterogametie) nachgewiesen werden. Diese Marker zeigen die enge Beziehung zwischen den Geschlechtschromosomen des Platys und ermöglichen eine detaillierte Untersuchung von männlicher und weiblicher Heterogametie im Platy. Verschiedene Genkandidaten konnten im ps-criptY-Contig identifiziert werden. Allerdings zeigte die Analyse, dass einige davon, wie msh2, cript, igd und acr Pseudogene darstellen. Interessanterweise ist eines dieser Gene, swimy, ausschließlich in Spermatogonien exprimiert. Dieses neue Gen kodiert für ein Protein mit mehreren DNA-bindenden Domänen. Diese Daten machen swimy zu einem vielversprechenden Kandidaten für SD. Ein weiteres neues Gen, fredi, kodiert für ein Helix-Loop-Helix Protein, ist ebenfalls im adulten Hoden exprimiert und wird gerade eingehender analysiert. Zweifellos wird das geschlechtsbestimmende Gen in X. maculatus durch positionelle Klonierung identifiziert werden. Weitergehende molekulare Analysen der geschlechtschromosomalen Contigs werden Licht in die molekularen Grundlagen der Geschlechtsbestimmung und die Evolution der Geschlechtschromosomen in Fischen bringen.
KW  - Platy
KW  - Geschlechtsbestimmung
KW  - Y-Chromosom
KW  - Genanalyse
KW  - Xiphophorus maculatus
KW  - Geschlechtsbestimmung
KW  - Y Chromosome
KW  - Xiphophorus maculatus
KW  - Sex determination
KW  - Y chromosome
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13827
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stojic, Jelena
T1  - Cloning and functional characterization of novel genes expressed preferentially in the human retina
N2  - The human retina is a multi-layered neuronal tissue specialized for the reception and processing of visual information. The retina is composed of a great diversity of neuronal cell types including rod and cone photoreceptors, bipolar cells, ganglion cells, amacrine cells, horizontal cells and Müller glia. In response to light, a coordinated series of molecular events, the so-called phototransduction cascade, is triggered in photoreceptor cells and the signals from the photoreceptors are further processed by the bipolar and ganglion cells to the higher centers of the brain. The retina as highly complex system may be greatly susceptible to genetic defects which can lead to a wide range of disease phenotypes. Therefore, isolation and characterisation of the genes active in the human retina will facilitate our deeper understanding of retinal physiology and mechanisms underlying retinal degeneration and provide novel candidates for the retinal disease genes. To identify novel genes that are specifically or predominantly expressed in the human retina, a cDNA library enriched for retina specific transcripts was generated using suppression subtractive hybridization (SSH) technique. In total, 1113 clones were randomly isolated from the retina SSH cDNA library and partially sequenced. On the basis of BLASTN algorithm analysis these clones were classified into four categories including those with I) significant homology to known human genes (766/1113), II) significant homology to partial transcripts and hypothetical gene predictions (162/1113), III) no homology to known mRNAs (149/1113), and IV) vector sequences and clones derived from mitochondrial genes (36/1113). After correcting for redundancy, category I represented 234 known human genes and category II a total of 92unknown transcripts. Clones from category I, were selected for expression analysis by RT-PCR in a great number of human tissues. This resulted in the identification of 16 genes which were expressed exclusively in the retina, 13 which were highly expressed in the retina compared to other tissues, 12 genes which were specifically expressed in neuronal tissues and 48 ubiquitously expressed genes. Thus, our expression analysis resulted in the identification of 29 genes exclusively or abundantly transcribed in the human retina. Of those, retina specific genes L25,L33, L35, L37, L38 and L40 were selected for further analysis. To characterize the complete mRNA sequences of these transcripts a full-length human retina cDNA library was constructed. The analysis of the L25 gene revealed three splicing variants of the ABCC5 gene, consequently named ABCC5_SV1 (SV1), ABCC5_SV2 (SV2) and ABCC5_SV3 (SV3).These isoforms comprise the first five exons of ABCC5 and additional novel exons named 5a, 5b and 5c, generated by differential exon usage. The determined lengths of the three transcripts are 2039 bp, 1962 bp, and 1887 bp in size, respectively. RT-PCR, real-time PCR and Northern blot analysis of ABCC5 as well as the isoforms SV1, SV2 and SV3demonstrated high levels of expression for all transcripts in the retina compared to other tissues. Analysis of their nucleotide sequences revealed that inclusion of exon 5a in splicing variant SV1 produced a frame shift and premature termination codon (PTC). Our data show that this splice variant is the target of nonsense mediated mRNA decay (NMD). This was shown by inhibition of protein synthesis with antibiotics puromycin and anisomycin in human cell lines A-RPE 19 and Y79. Our analysis resulted in an increase of the PTC containing transcript and a decrease of the ABCC5 transcript. Conversely, the amount of both transcripts (SV1 and ABCC5) returned to pre-treatment levels after removal of the inhibitors. Together, our results suggest that alternative splicing of the ubiquitously expressed ABCC5 gene in addition to NMD is involved in retina-specific transcriptional regulation of the mRNA level of ABCC5. In contrast, additional experiments demonstrated that the levels of expression ofSV2 and SV3 isoforms do not appear to influence ABCC5 transcription. Several of the cloned genes were selected for additional genotyping of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in order to construct their SNP maps which are going to be used for future association studies of complex disease AMD. Thus, identification of novel retinal genes and their functional characterization will further our elucidation of retinal physiology in general and in the diseased state in particular, by providing candidate retinal disease genes.
N2  - Die menschliche Retina ist ein vielschichtiges neuronales Gewebe, das auf die Aufnahme und Verarbeitung visueller Informationen spezialisiert ist. Sie besteht aus einergroßen Vielfalt neuronaler Zelltypen, inklusive der Stäbchen und Zapfen (Photorezeptoren), Bipolar- und Ganglionzellen, Amakrinen Zellen sowie Horizontalzellen und Müllerglia. Als Antwort auf einen Lichteinfall wird eine koordinierte Serie von molekularen Ereignissen, die so genannte Phototransduktionskaskade, in den Photorezeptoren ausgelöst, die von den Photorezeptoren kommenden Signale von den Bipolar- und Ganglionzellen weiterverarbeitetund an höhere Hirnzentren gesandt. Als äußerst komplexes System kann die Retina hochanfällig für genetische Defektesein, die zu einem breiten Spektrum an Krankheitsphänotypen führen können. Deshalb wird die Isolation und Charakterisierung von in der Retina aktiven Genen unser tieferes Verständnis für die Physiologie der Netzhaut, sowie den einer Retinadegeneration zu Grundeliegenden Mechanismen, erleichtern. Um neue Gene, die spezifisch oder überwiegend in der Netzhaut exprimiert werden, identifizieren zu können wurde, unter Nutzung der subtractive hybridization technique (SSH) eine cDNA Bibliothek, angereichert mit retinaspezifischen Genen, generiert. Insgesamt wurden 1113 Klone zufällig aus der Retina SSH cDNA Bibliothek ausgewählt und teilweise sequenziert. Auf der Basis einer BLASTN Algorithmus Analyse wurden diese Klone in 4 Kategorien eingeteilt, wobei I) Klone mit signifikanten Homologien zu bekannten menschlichen Genen (766/1113) beinhaltet, II) Klone mitsignifikanten Homologien zu partiellen Transkripten und hypothetischen Genvorhersagen (162/1113), III) Klone ohne Homologie zu bekannten mRNAs (149/1113) und IV)Vektorsequenzen und Klone, erhalten von mitochondrialen Genen (36/1113). Nach Redundanzkorrektur repräsentierte Kategorie I 234 bekannte menschliche Gene undKategorie II insgesamt 92 unbekannte Transkripte. Klone der Kategorie I wurden für eine Expressionsanalyse mittels RT-PCR in einer Vielzahl menschlicher Gewebe ausgewählt. Dies führte zur Identifikation von 16 exklusiv inder Retina exprimierten Genen, weiteren 13 mit, im Vergleich zu anderen Geweben, hoher Expression in der Netzhaut, 12 Genen, die spezifisch in neuronalen Geweben exprimiertwerden, sowie 48 ubiquitär exprimierten Genen. Somit resultierte unsere Expressionsanalysen der Identifikation von 29 exklusiv oder reichlich in der menschlichen Retina transkribierten Genen. Aus diesen wurden die retinaspezifischen Gene L25, L33, L35, L38 und L40 für weitere Analysen ausgewählt. Um die kompletten mRNA Sequenzen dieser Transkripte zucharakterisieren wurde eine full-length human retina cDNA Bibliothek konstruiert. Die Analyse des L25 Genes erbrachte 3 Splicevarianten des ABCC5 Genes, die konsequent mit ABCC5_SV1 (SV1), ABCC5_SV2 (SV2) und ABCC5_SV3 (SV3) benannt wurden. Diese Isoformen bestehen aus den ersten 5 Exonen von ABCC5 und zusätzlichenneuen 5a, 5b und 5c genannten Exonen, die durch unterschiedliche Exonnutzung entstehen. Die ermittelten Längen der drei Transkripte sind 2039 bp, 1962 bp, und 1887 bp. RT-PCR, real time PCR und Northern Blot Analyse des ABCC5 Genes sowie der Isoformen SV1, SV2und SV3, konnten hohe Expressionslevel all dieser Transkripte in der Retina im Vergleich zu anderen Geweben zeigen. Die Analyse ihrer Nukleotidsequenzen enthüllte, dass der Einschluss von Exon 5a in Splicevariante SV1 eine Leserahmenverschiebung sowie die Entstehung eines premature termination Kodons (PTC) bewirkt. Unsere Daten zeigen, dass diese Splicevariante Ziel eines nonsense mediated mRNA decay (NMD) ist. Dies wurde durch Hemmung der Proteinsynthese mittels Gabe der Antibiotika Puromycin und Anisomycin in den humanen Zelllinien ARPE-19 und Y79 gezeigt. Es kam bei diesem Versuch zu einem Anstieg des PTC enthaltenden Transkripts und einem Abfall des ABCC5Transkripts. Umgekehrt ging die Menge beider Transkripte (SV1 und ABCC5) nach Wegnahme der Inhibitoren auf die Ausgangswerte vor Antibiotikagabe zurück. Zusammengefasst weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass alternatives Splicing des ubiqitärexprimierten ABCC5 Genes zusätzlich zu NMD in der retinaspezifischen Transkriptionsregulation der mRNA Level des ABCC5 Genes involviert ist. Im Gegensatzdazu zeigten zusätzliche Experimente, dass die Expressionslevel der SV2 und SV3 Isoformendie ABCC5 Transkription scheinbar nicht beeinflussen. Einige dieser klonierten Gene wurden zur zusätzliche Genotypisierungen ihrer single nucleotide Polymorphismen (SNPs) ausgewählt, mit dem Ziel SNP Karten zu erstellen, die für spätere Assoziationsstudien komplexer AMD Erkrankungen verwendet werden sollen.Auf diese Weise wird die Identifizierung neuer retinaler Gene sowie deren Funktionscharakterisierung die Aufklärung der Netzhautphysiologie im Allgemeinen und deren krankhafter Veränderungen im besonderen fördern, indem sie Kandidatengene für Retinaerkrankungen zu Verfügung stellt.
KW  - Netzhaut
KW  - cDNS
KW  - Senile Makuladegeneration
KW  - Genanalyse
KW  - retina
KW  - AMD
KW  - cDNA library
KW  - NMD
KW  - ncRNA genes
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13746
ER  -