TY  - THES
A1  - Daniels, Justin John Douglas
T1  - Interaction of Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes with the murine host
T1  - Interaktionen von Salmonella typhimurium und Listeria monocytogenes mit der Maus als Wirt
N2  - Food borne pathogens that cause systemic disease must cross the intestinal barrier. Many of these pathogens, eg Salmonella typhimurium and Shigella flexneri, use M cells, found only within the follicle associated epithelium (FAE) that overlies Peyer’s patches and other lymphoid follicles, to enter the host. This study is primarily an investigation into the interaction of S. typhimurium and Listeria monocytogenes with the intestinal epithelium, representing the early stage of an infection.
N2  - Alle in Nahrungsmitteln vorkommenden Pathogene, die eine systemische Infektion auslösen, müssen die Darmwand überwinden. Für die Invasion bevorzugtes Ziel vieler Lebensmittelpathogene, wie z.B. Salmonella typhimurium und Shigella flexneri, sind M-Zellen, die nur innerhalb des Follikel-assoziierten Epithels (FAE) über den Peyer’schen Plaques und anderen Lymphoid-Follikel vorkommen. In dieser Arbeit wurde in erster Linie die Interaktion von S. typhimurium und Listeria monocytogenes mit dem FAE untersucht, welche die frühe Phase einer Infektion repräsentiert.
KW  - Maus
KW  - M-Zelle
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - M-Zellen
KW  - Peyer'sche Plaques
KW  - BABLB/c
KW  - C57/BL6
KW  - Maus
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Listeria monocytogenes
KW  - M cells
KW  - Peyer's Patches
KW  - BABLB/c
KW  - C57/BL6
KW  - Mouse
Y1  - 1999
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1073
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pei, Geng
T1  - The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron
T1  - Die Rolle von Raf-vermittelten Signalwegen bei Entwicklung und Überleben von Motoneuronen
N2  - The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization.
N2  - Die Vermittlung von wachstumsfördernden und entwicklungsspezifischen Signalen von aktivierten Zelloberflächenrezeptoren führt zur Initiation von Transkriptionsprogrammen im Zellkern, die durch das koodinierte Zusammenwirken von intrazellulären Signalproteinen synergistisch gesteuert werden. Der Ras/Raf/MEK/MAPK-Weg steuert die Expression von Genen für die physiologische Regulation der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Innerhalb dieser Signalkaskade stellen die Serin/Threonin Kinasen der Raf Familie eine zentrale Zwischenstufe dar, die Verbindungen zu vielen anderen Signaltransduktionswegen herstellt. Um die Funktionen der verschiedenen Raf-Kinasen in Motoneuronen während der Entwicklung aufzuklären, wurden die Expression, Verteilung und subzelluläre Lokalisation der Raf-Isoformen in spinalen Motoneuronen und im Nucleus Fazialis der Maus während der Embryonalentwicklung und postnatal untersucht. Desweiteren haben wir die intrazelluläre Umverteilung der Raf-Moleküle in isolierten Motoneuronen von 13 oder 14 Tage alten Mäusembryonen untersucht. Um die Rolle der Raf-Kinasen nach Zugabe oder Entzug von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen zu untersuchen, analysierten wir die Überlebens-und Differenzierungseffekte von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen von B-raf oder c-raf-1 defizienten Mäusen. Wir zeigen in dieser Arbeit, daß alle drei Raf-Kinasen in spinalen Motoneuronen der Mäuse exprimiert sind. Ihre Expression steigt während der Zeit des natürlich auftretenden Zelltods. An Schnitten von embryonalem und postnatalem Rückenmark exprimieren Motoneurone ausschließlich B-Raf and c-Raf-1, aber nicht A-Raf. Raf-Kinasen sind offensichtlich an Mitochondrien lokalisiert. In isolierten Motoneuronen findet man B-Raf und c-Raf-1, Immunreaktivität vor allem im perinukleären Bereich, aber auch im Zellkern, vor allem nach Aktivierung durch Zugabe von CNTF und BDNF in vitro. Wir haben gefunden, daß die Translokation von c-Raf-1 vom Zytosol in den Nukleus von Motoneuronen nach Aktivierung durch neurotrophe Faktoren ein spezifischer Vorgang ist. Als zentralen Befund dieser Arbeit beobachteten wir, daß Motoneurone von B-raf-/-, aber nicht von c-raf-1-/-, Embryonen nicht lebensfähig sind, auch nicht in Gegenwart von CNTF oder anderer neurotropher Faktoren. Dies bedeutet, daß B-Raf und nicht c-Raf-1, welches noch immer in B-raf defizienten Motoneuronen präsent ist, eine entscheidende Rolle als Vermitter des Überlebenseffektes von neurotrophen Faktoren spielt. Um zu beweisen, daß B-Raf hierbei eine essentielle Komponente darstellt, haben wir in B-raf defizienten sensorischen und Motoneuronen B-Raf durch Transfektion exprimiert. Erfolgreich mit B-raf Plasmid transfizierte B-raf-/- sensorische und Motoneurone zeigten dieselbe Überlebensfähigkeit in Gegenwart von neurotrophen Faktoren wie primäre Neurone von Wildtyp-Mäusen. Diese Arbeit zeigt daher, daß Raf-Kinasen wichtige Funktionen in Motoneuronen der Maus haben. Die Aktivierung von Raf-Kinasen in vitro führt zur Änderung ihrer subzellulären Verteilung, vor allem von c-Raf-1 vom Zytoplasma in den Kern. Diese Umverteilung von c-Raf-1 ist jedoch nicht notwendig für den Überlebenseffekt von neurotrophen Faktoren, vor allem, wenn man in Betracht zieht, daß B-raf defiziente sensorische und Motoneuronen trotz der Gegenwart von c-Raf-1 nicht überleben. Wir nehmen an, daß die nukleäre Translokation von c-Raf-1 eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Regulation durch neurotrophe Faktoren spielt. Die Indentifizierung von c-Raf-1 regulierten Zielgenen und von durch diese beeinflussten zellulären Funktionen ist eine Aufgabe für die Zukunft.
KW  - Maus
KW  - Motoneuron
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Signaltransduktion
KW  - Raf-Kinasen
KW  - Motoneuron
KW  - Raf-Kinase
KW  - Zentrales Nervensystem
KW  - motoneuron
KW  - Raf
KW  - CNS
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846
ER  - 
TY  - THES
A1  - Chan, Gordon
T1  - The Role of Vav-1, Vav-2 and Lsc in NK T cell development and NK cell cytotoxicity
N2  - The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation.
N2  - Vav-1 ist ein spezifisch in hämatopoetischen Zellen exprimierter Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) für Rho-GTPasen, der die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion in Lymphocyten reguliert und essentiell für der Reifung und Aktivierung von B- und T-Zellen ist. Untersuchungen an menschlichen Zellen lassen vermuten, dass Vav1 auch für Antikörper-unabhängige, natürliche Zytotoxizität und die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytoxizität (ADCC) von „Natürlichen-Killerzellen“ (NK-Zellen) wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass Vav-1 auch in murinen NK-Zellen exprimiert ist. Analysen von Vav-1-/--Mäuse zeigen eine normale Anzahl von NK-Zellen, die wiederum ein ähnliches Expressionsprofil von typischen NK-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu wildtypischen Mäusen aufweisen. Die ADCC von Vav-1-/- NK-Zellen ist unverändert, wie auch die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung von ERK, JNK und p38. Im Gegensatz dazu zeigen Vav-1-/- NK-Zellen eine reduzierte natürliche Cytotoxizität gegenüber EL4-, C4.4.25-, RMA- und RMA/S-Zielzellen. Vav-1 ist daher nicht für die Entwicklung, sondern für den Aufbau der natürlichen Cytotoxizität von NK-Zellen von Bedeutung. Für Vav-2 wurde ebenfalls eine Rolle in NK-Zellfunktionen wahrscheinlich gemacht. Dennoch zeigen Vav-2-/- Mäuse ein normales zytotoxisches Verhalten. NK-Zellen von Vav-1/Vav-2-doppeldefizienten Tieren weisen ähnliche Defekte wie NK-Zellen von Vav-1-defizienten Tieren. Somit besitzt Vav-2 keine entscheidende Funktion für die Entwicklung und Aktivierung von NK-Zellen. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist die Anzahl der NKT-Zellen in Vav-1-/- Mäusen drastisch reduziert. Außerdem sind NKT-Zellen Vav-1-defizienter Mäuse nicht in der Lage IL-4 und INFg nach CD3-Stimulierung in vivo zu produzieren. Ein ähnlicher Verlust der NKT-Zell-Population wurde in Vav-1-/-- Vav-2-/--Mäusen beobachtet, nicht aber in Vav-2-/- Mäusen. Daher scheint nur Vav-1, nicht aber Vav-2, ein essentieller Regulator sowohl der NKT-Zell-Entwicklung als auch der NK-Zell-Cytotoxizität zu sein. Ein weiterer Rho-GEF, Lsc, ist ebenfalls spezifisch im hämatopoetischen System exprimiert. Lsc besitzt auch eine negativ-regulatorische RGS-Domäne (regulator of G-protein signaling) für die Ga12- und Ga13-Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. NK- und NKT-Zellen von Lsc-defizienten Mäusen entwickeln sich normal, weisen aber eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumor-Zellen auf. Diese Daten zeigen zum ersten mal die Beteiligung eines RGS-Rho-GEF an zytotoxischen Reaktionen und deuten auf eine negative Modulation der NK-Zell-Aktivierung durch Lsc hin.
KW  - Maus
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Cytotoxizität
KW  - Vav
KW  - Lsc/p115 Rho GEF
KW  - NK cells
KW  - cytotoxicity
KW  - T cells
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3645
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gogishvili, Tea
T1  - Immunotherapy of allergic disorders in a mouse model of allergic airway inflammation
T1  - Immuntherapie allergischer Erkrankungen in einem Mausmodell für allergische Atemwegsentzündungen
N2  - Allergische Erkrankungen sind Störungen, bei denen es zu Immunfehlregulationen kommt und die bei empfänglichen Individuen zur Entstehung von Allergen spezifischen T-Helfer 2 (TH2) Immunantworten führen. Neuere Untersuchungen deuten darauf hin, dass die für Soforttypallergien charakteristischen TH2 Immunantworten sowohl durch natürlich vorkommende CD4+CD25+ regulatorische T Zellen (Treg) als auch durch Antigen induzierte IL-10-secreting CD4+ regulatorische T Zellen kontrolliert werden können. Weiterhin gibt es Hinweise, dass eine erfolgreiche Allergen spezifische Immuntherapie über die Induktion von IL-10 sezernierenden T reg Zellen vermittelt wird. In ersten Teil der Arbeit wird die Effizienz einer Allergen spezifischen Immuntherapie (SIT) in einem Mausmodel für allergische Atemwegsentzündung demonstriert. Als Allergieparameter wurden Allergen spezifisches IgE im Serum, verschiedene TH1 und TH2 Cytokine in der brochoalveolären Lavage Flüssigkeit und nach in vitro Restimulation in Milzzellen untersucht. Weiterhin wurden Histologien von Lungengewebe angefertigt, um das eosinophile Entzündungsinfiltrat und die Asthma typische Becherzellmetaplasie darzustellen. Weiterhin wurden durch FACS Untersuchungen regulatorische T Zellen nachgewiesen. Es konnte gezeigt werden, dass im Mausmodell die intranasale Applikationsform der SIT die allergischen Symptome effizienter bekämpfen konnte, als die beim Menschen etablierte subcutane Applikationsform. Um Mechanismen zu definieren die eine SIT effizienter machen könnten wurde ein IL-4/IL13 Inhibitor (QY) als Adjuvans für die SIT benutzt. Für den Zytokininhibitor konnte gezeigt werden, dass bei einer Applikation während der allergischen Sensibilisierung die Entstehung einer TH2 Immunantwort und die Ausbildung allergischer Symptome verhindert wird. Die Applikation des Inhibitors zusammen mit einer SIT zeigte jedoch keine zusätzlichen signifikanten antiallergischen Effekte im Vergleich zur Durchführung der SIT als Monotherapie. Diese Ergebnisse deuten möglicherweise daraufhin , dass der bekannte Wechsel einer TH2 Immunantwort zu einer TH1 Antwort während der SIT nicht der Schlüsselmechanismus zu einer erfolgreichen Behandlung ist. Insbesondere weil unter der SIT auch in unserem Mausmodell die Induktion von IL-10 sezernierenden CD4+ T regulatorischen Zellen mit der Suppression der allergischen Atemwegsentzüdnung vergesellschaftet waren, so dass möglicherwiese diese Zellen für den Therapieerfolg relevant sind . Um die Rolle regulatorischer T Zellen im Allergiemodell näher zu beleuchten wurde im 2. Teil der Arbeit ein monoklonaler superagonistischer anti-CD28 Antikörper benutzt, von dem bekannt ist dass T regulatorische Zellen in vivo induziert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Applikation des Antikörpers während der allergischen Sensibilisierung die Etablierung einer TH2 Immunantwort verstärkte. Im Gegensatz dazu wurden durch die therapeutische Applikation des anti CD28 Antikörpers in einer etablierten Allergie, IL-10 sezernierende CD4+CD25+ T Zellen induziert, welches mit einer Abschwächung der gemessenen Allergieparameter einherging.
N2  - Allergic disease are inflammatory disorders in which aberrant immune regulation occurs, and susceptible individuals mount allergen specific T helper 2 (Th2) responses, which drives disease pathology. Recent studies indicate that Th2 responses that are characteristic of allergic manifestations can be regulated by both naturally occurring CD4+CD25+ regulatory (Treg) cells and antigen-driven IL-10-secreting CD4+ regulatory T cells. Evidence is also emerging that successful Allergen specific immunotherapy (SIT) might work through the induction of IL-10-secreting regulatory T cells. In the first part of this work, I demonstrated the efficiency of allergen specific immunotherapy in the mouse model for allergic airway inflammation. Here I could show that intranasal administration of SIT abrogates allergic symptoms more efficiently, than the subcutaneous treatment. Furthermore, an IL-4/IL-13 (QY) inhibitor was used as an adjuvant for SIT, which has been demonstrated to have an anti-allergic potential, when administered prophylactically during allergic sensitization. However, the combination therapy with SIT and the inhibitory molecule QY did not show any significant enhancement in regards to all measured allergic parameters, when compared to monotherapy with SIT. These results provide the evidence, that shift from Th2 to Th1 cytokine profile might not be a key event in successful SIT. Subsequently, the investigation of immune mechanisms under successful SIT demonstrate that the increase of IL-10 secreting CD4+ T regulatory cells is associated with the suppression of airway inflammation in our mouse system, suggesting that these T cell subsets might be involved in the regulatory mechanisms of allergic disorders. In agreement with these findings is the second part of this work, where superagonistic a-CD28 mAb´s were used for the expansion of T regulatory cell subsets in our murine model for allergic airway inflammation. Here I could show, that the application of a-CD28 mAb during allergic sensitization, resulted in the establishment of a Th2 state, rather than a stimulation of a Treg cell population, supporting the Th2 promoting role of a-CD28 mAb together with TCR engagement. However, interesting findings were obtained by application of the superagonistic a-CD28 mAb in the challenge phase in established allergy. Conversely to the previous experiment, therapeutic administration of a-CD28 mAb lead to the generation of IL-10 secreting CD4+CD25+ T cell population in line with the induction of anti-allergic effects. Taking together the results of this study argue for the anti-inflammatory properties of T regulatory cells in allergic disease and highlights importance of these T cell subsets in the suppression of Th2 cell-driven response to allergen. Moreover, these observations suggest that the induction of IL-10 in vivo by T regulatory cells may represent a novel treatment strategy for allergic disorders.
KW  - Bronchialasthma
KW  - Allergie
KW  - Maus
KW  - Immuntherapie
KW  - Allergy
KW  - asthma
KW  - IL-4/IL-13 inhibitor
KW  - Mouse model of allergic airway inflammation
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19304
ER  - 
TY  - THES
A1  - Düchs, Matthias
T1  - Effects of Toll-like receptor agonists on the pathogenesis of atopic asthma in mice
T1  - Effekte von Toll-like Rezeptor Agonisten auf den Krankheitsverlauf von atopischen Asthma im Mausmodell
N2  - In the last decades, both the incidence and the severity of asthma have steadily increased. Furthermore, available therapies only treat the symptoms but do not cure the disease. Immune modulation induced by TLR agonists may be a promising novel approach to effectively treat asthma as it targets the underlying immunopathology directly rather than one mediator alone. The aim of this thesis was to investigate if the immunostimulatory properties of Toll-like receptor (TLR) agonists can be utilized to develop novel therapeutic intervention strategies for the treatment of asthma using murine models of allergic inflammation. For this purpose five different TLR agonists were tested in preclinical mouse models of acute and chronic asthma, both in preventive and therapeutic settings. Firstly, TLR-2, 3, 4, 7/8 and 9 agonists were delivered intratracheally at different doses before pulmonary allergen exposure in the asthma model of acute inflammation. TLR9 agonist CpG-containing oligodeoxynucleotides (CpG) > TLR7 agonist Resiquimod (R848) > TLR3 agonists poly(I:C) strongly reduced allergen induced airway eosinophilia and IL-4 levels in a dose-dependent manner. All TLR agonists increased neutrophil numbers, TLR4 agonist lipopolysaccharide (LPS) > TLR2 agonist lipoteichonic acid (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848 and, with the exception of R848, the amount of pro-inflammatory cytokines in the airways. Suppressive effects were not dependent upon IFN-γ and IL-10 or associated with increased numbers of regulatory T cells in the airways. All TLR agonists, except LTA, similarly reduced airway eosinophilia and IL-4 levels when applied therapeutically after allergen challenge. These results show that the TLR agonists have different suppressive effects on TH2 responses in the airways which further depend on the dose and the experimental setup in which they were tested. Interestingly, all agonists induced airway neutrophilia, albeit to different degrees, raising the question if TLR ligands are safe for human use when applied directly into the lung. Different TLR agonists are also being developed for human use as adjuvants combined with allergen in specific immunotherapy. Recent clinical data suggest that this may be achieved by induction of allergen-specific TH1 responses. For this reason, the ability of different TLR agonists to induce allergen-specific TH1 and suppress allergen-specific TH2 responses in a preclinical setting was investigated in this thesis. Different doses of the TLR agonists were applied together with allergen, then mice were exposed to allergen aerosol. CpG > LPS >LTA dose-dependently strongly suppressed the development of airway eosinophilia with poly(I:C) and R848 having no effect. The decrease in eosinophilic numbers was associated withincreased neutrophils present in the airways. IL-4 and IL-5 levels in the bronchoalveolar lavage fluid were also decreased when poly(I:C), LPS, and CpG were used. All TLR agonists increased allergen-specific IgG2a, and with the exception of poly(I:C), reduced allergen-specific IgE levels in the serum. Cutaneous anaphylaxis to allergen was completely prevented when LPS or CpG were given as adjuvant. The strongest TH1 responses were induced by CpG and poly(I:C), characterized by the presence of IFN-γ in the bronchoalveolar lavage and the highest allergen-specific IgG2a levels in the serum. This data supports approaches to use TLR9 or TLR4 agonists for human therapy as adjuvant in combination with allergen in novel specific immunotherapy formulations. In the last part of the thesis, it was investigated if TLR activation can also affect the pathology of severe chronic asthma. Therapeutic administration of R848 or CpG reduced features of inflammation and remodeling. Both agonists showed superior effects to dexamethasone, with CpG being more efficient than R848. This result again supports a TLR9-based therapy as a viable option for the treatment of severe chronic asthma which may present a potential alternative for anti-inflammatory therapy with steroids. Taken together, the results of this thesis support the use of TLR agonists to treat asthma. The most favorable efficacy/safety ratio is to be expected from TLR-based therapies combining TLR4 or TLR9 agonists with allergen in specific immunotherapy. In regard to TLR agonist monotherapy, R848 and CpG showed the most promising profiles, CpG particularly in a model of severe chronic asthma. However, since all TLR agonists used in this study also showed pro-inflammatory potential, the safety aspect of such an approach needs to be taken into account.
N2  - In den letzten Jahrzehnten wurde für Asthma ein Anstieg der Neuerkrankungen und der schweren Krankheitsverläufe verzeichnet. Des Weitern kontrollieren angewandte Therapien zwar Symptome, bieten aber keine Heilung. Ein vielversprechender Ansatz, mit dem Ziel den ursächlichen Krankheitsmechanismus zu inhibieren, ist die TLR Agonisten induzierte Immunmodulation. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Eignung von immunstimulatorischen Toll-like Rezeptor (TLR) Agonisten für neue Therapieansätze in allergischen Entzündungsmodellen zu untersuchen. Hierfür wurden fünf verschiedene TLR Agonisten in murinen Modellen von akutem oder chronischem Asthma, sowohl prophylaktisch als auch therapeutisch verabreicht. Als erstes wurden in einem Modell mit akuter Entzündungsreaktion verschiedene Konzentrationen der Agonisten für TLR 2, 3, 4, 7 und 9, vor der pulmonalen Allergenexposition intratracheal appliziert. Hier verminderten TLR9 Agonist CpG-Oligodesoxynukleotide (CpG) > TLR7 Agonist Resiquimod (R848) > TLR3 Agonist poly(I:C) konzentrationsabhängig die allergen-induzierte Eosinophilie in den Atemwegen. Alle TLR Agonisten erhöhten die Anzahl an Neutrophilen, am stärksten TLR4 Agonist Lipopolysaccharid (LPS) > TLR2 Agonist Lipoteichon Säure (LTA) > poly(I:C) > CpG > R848. Weiterhin erhöhten, bis auf R848, alle TLR Agonisten die Menge an pro-inflammatorischen Zytokinen in den Atemwegen. Die hierbei beobachteten suppressiven Effekte waren weder IFN-γ noch IL-10 abhängig und korrelierten auch nicht mit einer Erhöhung der pulmonalen regulatorischen T Zellen. Die therapeutische Gabe von TLR Agonisten nach Allergenexposition reduzierte ebenfalls die Eosinophilie sowie IL-4 in den Atemwegen. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die TLR Agonisten in ihrer suppressiven Wirkung stark unterscheiden, und dass ihre Wirkung zum einen von der verabreichten Konzentration und zum anderen von dem experimentellen Aufbau abhängig ist. Auffällig war, dass alle Agonisten, wenngleich in unterschiedlicher Ausprägung, eine Neutrophilie in den Atemwegen induzierten. Dies wirft die Frage auf, ob eine wiederholte pulmonale Gabe für den Menschen verträglich wäre. Ein anderer Ansatz verwendet TLR Agonisten als Adjuvanzien für die Kombination mit Allergenen in der spezifischen Immuntherapie. Aktuelle klinische Ergebnisse deuten darauf hin, dass die TLR vermittelte Erhöhung der allergen-spezifischen TH1Antwort die Effektivität der Therapie steigern kann. Deswegen wurden in der vorliegenden Arbeit die verschieden TLR Agonisten auf ihre Fähigkeit hin untersucht allergen-spezifische TH1 Antworten auszulösen und allergen-spezifische TH2 Antworten zu unterdrücken. Hierfür wurde Allergen zusammen mit verschiedenen Konzentrationen der TLR Agonisten appliziert und anschließend die Mäuse Allergen-Aerosol ausgesetzt. Hier konnte eine starke, konzentrationsabhängige Unterdrückung der Atemwegseosinophilie, begleitet von einer Neutrophilie, bei CpG > LPS >LTA beobachten werden. Poly(I:C) und R848 zeigten keine Effekte. Auch wurde die Menge von IL-4 und IL-5 in der bronchoalveolaren Lavage durch poly(I:C), LPS, und CpG erniedrigt. Weiterhin reduzierten alle TLR Agonisten, mit der Ausnahme von poly(I:C), die Menge an allergen-spezifischem IgE im Serum. Die kutane anaphylaktische Reaktion gegen das Allergen wurde durch CpG- oder LPS-Adjuvans komplett verhindert. Die stärkste TH1 Antwort, charakterisiert durch erhöhtes IFN-γ in der Lavage und die größte Menge an allergen-spezifischem IgG2a, wurde durch CpG und poly(I:C) ausgelöst. Diese Resultate unterstützen den klinischen Ansatz CpG als erfolgsversprechenden Adjuvants-Kandidaten für die Kombinationstherapie mit Allergen in der spezifischen Immuntherapie einzusetzen. Im letzten Teil der vorliegenden Arbeit wurde untersucht ob die Aktivierung von TLRs auch den Krankheitsverlauf von schwerem chronischem Asthma beeinflussen kann. Die beiden TLR Agonisten CpG und R848 reduzierten Faktoren des Atemwegumbaus und der Entzündung effektiver als das Steroid Dexamethasone, wobei CpG die höchste Effektivität aufwies. Dieses Ergebnis unterstützt ebenfalls eine auf TLR9 Agonisten basierende Therapie als einen vielverspechenden Ansatz für die Behandlung von schwerem chronischem Asthma auch als eine potentielle Alternative zur antiinflammatorischen Therapie mit Steroiden. Zusammenfassend unterstützen die Resultate die Verwendung von TLR Agonisten für die Behandlung von Asthma. Die höchste Effektivität und Verträglichkeit ist für eine TLR Allergen Kombinationstherapie mit TLR4 oder TLR9 Agonisten in der spezifischen Immuntherapie zu erwarten. Für eine mögliche TLR Monotherapie zeigten R848 und CpG die besten Wirkungsprofile, für schwereres chronisches Asthma bevorzugt CpG. Hierbei muss jedoch stets berücksichtigt werden, dass TLR Agonisten auch selbst entzündliche Reaktionen hervorrufen können.
KW  - Toll-like Rezeptor
KW  - Ligand <Biochemie>
KW  - Bronchialasthma
KW  - Hypersensibilität
KW  - Toll-like receptor
KW  - Asthma
KW  - allergy
KW  - mouse model
KW  - Maus
KW  - Allergie
KW  - Maus Modell
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66369
ER  - 
TY  - THES
A1  - Englberger, Eva
T1  - Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution
T1  - Genregulation in Herzen Hey-mutierter Mausembryonen und Darstellung der sub-zellulären Verteilung von Hey1
N2  - Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus.
N2  - Am Embryonaltag 14,5 zeigten Herzproben von Hey2-KO-Mäusen eine deutliche Hochregulation mehrerer Gene, die auf das Fehlen von Hey2 zurückzuführen ist, da Kontroll-Tiere gezeigt haben, dass die morphologischen Veränderungen in der Herzstruktur keinen Einfluss auf die Genregulation haben. Vereinzelt wurden die regulierten Gene noch mittels in situ Hybridisierung weiter verdeutlicht. In Immunfloureszenzexperimenten wurde Hey1 im Zellkern lokalisiert. Auf Proteinebene zeigte sich allerdings auch ein Vorhandensein von Hey1 im Cytoplasma der Zellen. Die Kernlokalisaiton von Hey1 veränderte sich während des gesamten Zellzykluses nicht und wurde auch nicht durch die Co-Expression von CaMKII beeinflusst oder die Inhibition oder Stimulation anderer Signalwege in der Zelle. Hey1 scheint nicht mit den Kerntransportproteinen Importin-alpha und -beta zu interagieren, so dass weiterhin nach einem Kernimport-System für Hey1 gesucht werden muss.
KW  - Maus
KW  - Herz
KW  - Embryonalentwicklung
KW  - Genregulation
KW  - Herzentwicklung
KW  - Kerntransport
KW  - Hey
KW  - heart development
KW  - nuclear transport
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395
ER  - 
TY  - THES
A1  - Groh, Janos Michael
T1  - Pathogenic impact of immune cells in mouse models of neuronal ceroid lipofuscinosis
T1  - Pathogener Einfluss von Immunzellen in Mausmodellen der Neuronalen Ceroid Lipofuszinose
N2  - The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are fatal neurodegenerative disorders in which the visual system is affected in early stages of disease. A typical accompanying feature is neuroinflammation, the pathogenic impact of which is presently unknown. In this study, the role of inflammatory cells in the pathogenesis was investigated in Palmitoyl-protein thioesterase 1-deficient (Ppt1-/-) and Ceroidlipofuscinosis, neuronal 3-deficient (Cln3-/-) mice, models of the infantile and juvenile forms of NCL, respectively. Focusing predominantly on the visual system, an infiltration of CD8+ cytotoxic Tlymphocytes and an activation of microglia/macrophage-like cells was observed early in disease. To analyze the pathogenic impact of lymphocytes, Ppt1-/- mice were crossbred with mice lacking lymphocytes (Rag1-/-) and axonal transport, perturbation and neuronal survival were scored. Lack of lymphocytes led to a significant amelioration of neuronal disease and reconstitution experiments revealed a crucial role of CD8+ cytotoxic T-lymphocytes. Lack of lymphocytes also caused an improved clinical phenotype and extended longevity. To investigate the impact of microglia/macrophage-like cells, Ppt1-/- and Cln3-/- mice were crossbred with mice lacking sialoadhesin (Sn-/-), a monocyte lineage-restricted cell adhesion molecule important for interactions between macrophage-like cells and lymphocytes. Similar to the lack of lymphocytes, absence of sialoadhesin significantly ameliorated the disease in Ppt1-/- and Cln3-/- mice. Taken together, both T-lymphocytes and microglia/macrophage-like cells were identified as pathogenic mediators in two distinct forms of fatal inherited neurodegenerative storage disorders. These studies expand the concept of secondary inflammation as a common pathomechanistic feature in some neurological diseases and provide novel insights that may be crucial for developing treatment strategies for different forms of NCL.
N2  - Die Neuronalen Ceroid Lipofuszinosen (NCL) sind tödlich verlaufende neurodegenerative Erkrankungen, bei denen das visuelle System frühzeitig im Krankheitsverlauf betroffen ist. Eine typische Begleiterscheinung sind Entzündungsreaktionen, deren pathogenetischer Einfluss bisher ungeklärt ist. In dieser Studie wurde die Rolle von Entzündungszellen bei der Pathogenese in Palmitoyl-protein thioestease 1-defizienten (Ppt1-/-) und Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 3-defizienten (Cln3-/-) Mäusen untersucht, den jeweiligen Modellen der Infantilen und Juvenilen Formen der NCL. Mit besonderem Augenmerk auf das visuelle System wurde früh in der Krankheit ein Aufkommen von CD8+ zytotoxischen T-Lymphozyten und eine Aktivierung von Mikroglia/Makrophagen-ähnlichen Zellen beobachtet. Um den pathogenetischen Einfluss der Lymphozyten zu klären, wurden Ppt1-/- Mäuse mit Mäusen verkreuzt, welche keine Lymphozyten besitzen (Rag1-/-). An den generierten Doppelmutanten wurden axonaler Transport, axonale Schädigung und neuronales Überleben bestimmt. Die Abwesenheit von Lymphozyten führte zu einer signifikanten Abmilderung der neuronalen Schädigung und Rekonstitutions-Experimente zeigten, dass CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten eine entscheidende Rolle spielen. Die Abwesenheit dieser Lymphozyten führte außerdem zu einem abgemilderten klinischen Phänotyp und einem verlängerten Überleben. Um den Einfluss von Mikroglia/Makrophagen zu untersuchen wurden Ppt1-/- und Cln3-/- Mäuse mit Sialoadhesin-defizienten Mäusen (Sn-/-) verkreuzt. Sn ist ein Monozyten-spezifisches Zelladhäsionsmolekül, das wichtig für Interaktionen zwischen Makrophagen-ähnlichen Zellen und Lymphozyten ist. Ähnlich wie die Abwesenheit von Lymphozyten führte die Abwesenheit von Sialoadhesin zu einer signifikanten Abmilderung der Krankheit in Ppt1-/- und Cln3-/- Mäusen. Zusammengefasst wurden sowohl T-Lymphozyten als auch Mikroglia/Makrophagenähnliche Zellen als pathogenetische Mediatoren in zwei verschiedenen Formen von tödlich verlaufenden erblichen neurodegenerativen Speicherkrankheiten identifiziert. Diese Untersuchungen erweitern das Konzept der sekundären Entzündungsreaktion als verbreitete pathomechanistische Erscheinung in einigen neurologischen Erkrankungen und liefern neue Perspektiven für die Entwicklung von Behandlungsstrategien für verschiedene Formen der NCL.
KW  - Nervendegeneration
KW  - Maus
KW  - Entzündung
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Neuronale Ceroid Lipofuszinose
KW  - Neuroinflammation
KW  - Neurodegeneration
KW  - axonaler Schaden
KW  - T-Lymphozyten
KW  - neuronal ceroid lipofuscinosis
KW  - neuroinflammation
KW  - neurodegeneration
KW  - axonal damage
KW  - T-lymphocytes
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77684
ER  - 
TY  - THES
A1  - Esterlechner, Jasmina
T1  - Role of the DREAM complex in mouse embryonic stem cells and identification of ZO-2 as a new LIN9 interacting protein
T1  - Die Rolle des DREAM-Komplexes in embryonalen Stammzellen der Maus und Identifikation von ZO-2 als neues LIN9- interagierendes Protein
N2  - The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry
(MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation.
N2  - Der DREAM Komplex spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation im Verlauf des Zellzyklus. Es wurde gezeigt, dass die DREAM Untereinheiten LIN9 und B-MYB für die frühe Embryogenese und den in vitro Erhalt der inneren Zellmasse erforderlich sind. In der vorligenden Arbeit wurde die Auswirkung von LIN9 und B-MYB Depletierung auf embryonale Stammzellen untersucht. Es zeigt sich, dass Depletion von LIN9 und B-MYB die Zellzyklus-Verteilung von embryonalen Stammzellen beeinflusst, zur Akkumulation der Zellen in G2 und M Phase und zu erhöhter Polyploidie führt. Genomweite Expressionsstudien ergaben, dass die Verringerung von LIN9 in der Runterregulierung von mitotischen und in der Hochregulierung von differenzierungsspezifischen Genen resultiert. ChIP-on-chip Experimente ermittelten, dass LIN9 Mitosegene als direkte Ziele hat, wohingegen entwicklungslinienspezifische Marker indirekt reguliert werden. Wesentlich ist, dass LIN9 Depletion nicht die Expression der Pluripotenzgene Oct4 oder Sox2 beeinflusst und embryonale Stammzellen ihre Alkaline Phosphatase Aktivität behalten. Daraus lässt schließen, dass LIN9
essentiell für die Proliferation und genomische Stabilität von embryonalen Stammzellen ist, in dem es Gene aktiviert, die wichtige Funktionen in Mitose und Zytokinese ausüben. Der exakte Mechanismus hinter der Genaktivierung ist noch nicht geklärt, da keine DREAM
Untereinheit eine katalytisch aktive Domäne aufweist. Vermutlich ist die Interaktion mit weiteren Proteinen oder Co-Faktoren für die Genaktivierung vonnöten. Diese Studie entdeckte mit in vivo Isotop-Markierung von Proteinen und Massenspektrometrie (MS) potentielle
Bindungspartner und untersuchte die identifizierte Bindung mit dem Tight Junction Protein ZO-2 genauer. Diese Bindung ist zellzyklus-abhängig und ist am stärksten
während der S-Phase. ZO-2 Depletion führt zu reduzierter Zellproliferation und verringerter G1-Genexpression. Da keine G2/M Gene, typische DREAM Ziele, von einer ZO-2 Depletion beeinflusst werden, ist es unwahrscheinlich, dass die ZO-2 Bindung für einen funktionellen DREAM Komplex benötigt wird. Jedoch demonstriert diese Studie, dass mit (MS)-basierender, quantitativer Proteomik DREAM interagierende Proteine identifiziert werden können. Dies ist hilfreich um die Mechanismen hinter der DREAM vermittelten Genaktivierung aufzuklären.
KW  - Zellzyklus
KW  - cellcycle
KW  - Stammzelle
KW  - Maus
KW  - stem cells
KW  - DREAM
KW  - Genregulation
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90440
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hofstetter, Christine
T1  - Inhibition of H3K27me-Specific Demethylase Activity During Murine ES cell Differentiation Induces DNA Damage Response
T1  - Inhibierung der H3K27me-Spezifischen Demethylase Aktivität in Murin Differenzierenden ES Zellen Induziert die DNA Schadensantwort
N2  - Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms.
During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation.
KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation.
In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells.
N2  - Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung.
Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten.
KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von
ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird.
Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert.
KW  - Embryonale Stammzelle
KW  - Epigenetic
KW  - Maus
KW  - Histone
KW  - Demethylierung
KW  - DNS-Schädigung
KW  - Epigenetik
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107023
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fraune, Johanna
T1  - The evolutionary history of the mammalian synaptonemal complex
T1  - Die Evolutionsgeschichte des Synaptonemalkomplexes der Maus
N2  - Der Synaptonemalkomplex (SC) ist eine hochkonservierte Proteinstruktur. Er weist eine dreiteili-ge, leiterähnliche Organisation auf und ist für die stabile Paarung der homologen Chromosomen während der Prophase der ersten meiotischen Teilung verantwortlich, die auch als Synpase be-zeichnet wird. Fehler während der Synpase führen zu Aneuploidie oder Apoptose der sich entwi-ckelnden Keimzellen.
Seit 1956 ist der SC Gegenstand intensiver Forschung. Seine Existenz wurde in zahlreichen Orga-nismen von der Hefe bis zum Menschen beschrieben. Seine Struktur aus zwei parallel verlaufen-den Lateralelementen (LE), die durch eine Vielzahl von sogenannten Transversalfilamenten (TF) verbunden werden und dem Zentralen Element (CE) in der Mitte des SC ist dabei offensichtlich über die Millionen von Jahren der Evolution erhalten geblieben. Einzelne Proteinkomponenten des SC wurden jedoch nur in wenigen Modelorganismen charakterisiert, darunter Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans und Mus mus-culus. Unerwarteter Weise gelang es bei dieser Charakterisierung nicht, eine evolutionäre Ver-wandtschaft, d.h. eine Homologie zwischen den Proteinsequenzen der verschiedenen SCs nach-zuweisen. Diese Tatsache sprach gegen die grundsätzliche Annahme, dass der SC in der Evolution nur einmal entstanden sei.
Diese Arbeit hat sich nun der Aufgabe gewidmet, die Diskrepanz zwischen der hochkonservierten Struktur des SC und seiner augenscheinlich nicht-homologen Proteinzusammensetzung zu lösen. Dabei beschränkt sie sich auf die Analyse des Tierreichs. Es ist die erste Studie zur Evolution des SC in Metazoa und demonstriert die Monophylie der Säuger SC Proteinkomponenten im Tierreich. Die Arbeit zeigt, dass mindestens vier von sieben SC Proteinen der Maus spätestens im letzten gemeinsamen Vorfahren der Gewebetiere (Eumetazoa) enstanden sind und auch damals Teil ei-nes ursprünglichen SC waren, wie er heute in dem Nesseltier Hydra zu finden ist. Dieser SC weist die typische Struktur auf und besitzt bereits alle notwendigen Komponenten, um die drei Domä-nen – LE, TF und CE – zu assemblieren. Darüber hinaus ergaben die einzelnen Phylogenien der verschiedenen SC Proteine der Maus, dass der SC eine sehr dynamische Evolutionsgeschichte durchlaufen hat. Zusätzliche Proteine wurden während der Entstehung der Bilateria und der Wir-beltiere in den SC integriert, während andere ursprüngliche Komponenten möglicherweise Gen-Duplikationen erfuhren bzw. besonders in der Linie der Häutungstiere verloren gingen oder sich stark veränderten. Es wird die These aufgestellt, dass die auf den ersten Blick nicht-homologen SC Proteine der Fruchtfliege und des Fadenwurms tatsächlich doch von den ursprünglichen Prote-inenkomponenten abstammen, sich aber aufgrund der rasanten Evolution der Arthropoden und der Nematoden bis zu deren Unkenntlichkeit diversifizierten.
Zusätzlich stellt die Arbeit Hydra als alternatives wirbelloses Modellsystem für die Meiose- und SC-Forschung zu den üblichen Modellen D. melanogaster und C. elegans vor. Die kürzlich gewon-nenen Erkenntnisse über den Hydra SC sowie der Einsatz der Standard-Methoden in diesem Orga-nismus werden in dem abschließenden Kapitel zusammengefasst und diskutiert.
N2  - The synaptonemal complex (SC) is a highly conserved structure in sexually reproducing organism. It has a tripartite, ladder-like organization and mediates the stable pairing, called synapsis, of the homologous chromosomes during prophase of meiosis I. Failure in homolog synapsis result in aneuploidy and/or apoptosis of the developing germ cells.
Since 1956, the SC is subject of intense research and its presence was described in various species from yeast to human. Its structure was maintained during millions of years of evolution consist-ing of two parallel lateral elements (LEs), joined by numerous transverse filaments (TFs) which run perpendicular to the LEs and an electron dense central element (CE) in the middle of the SC. Individual protein components, however, were characterized only in few available model organ-isms, as for example Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster, Ceanorhabditis elegans and Mus musculus. Rather unexpectedly, these characterizations failed to detect an evolutionary homology between the protein components of the different SCs. This fact challenged the general idea of a single origin of the SC in the evolution of meiosis and sexual reproduction.
This thesis now addressed itself to the task to unravel the discrepancy between the high conser-vation of the SC structure and its diverse and apparently non-homologous protein composition, focusing on the animal kingdom. It is the first study dealing with the evolution of the SC in Meta-zoa and demonstrates the monophyly of the mammalian SC components in metazoan species. The thesis demonstrates that at least four out of seven murine SC proteins emerged in Eumeta-zoa at the latest and have been likewise part of an ancient SC as it can be found in the present-day cnidarian species Hydra. This SC displays the common organization and already possesses the minimal protein kit corresponding to the three different structural domains: LEs, TFs and the CE. Additionally, the individual phylogenies of the murine SC proteins revealed the dynamic evolu-tionary history of the ancient SC. Further components were added during the diversification of Bilateria and vertebrates while ancestral proteins likely duplicated in the vertebrate lineage and diversified or got lost in the branch leading to ecdysozoan species. It is hypothesized that the apparently non-homologous SC proteins in D. melanogaster and C. elegans actually do derive from the ancient SC proteins but diversified beyond recognition during the fast evolution of Ar-thropoda and Nematoda.
The study proposes Hydra as an alternative invertebrate model system for meiosis and SC re-search to the standard organisms D. melanogaster and C. elegans. Recent results about the cni-darian SC as well as the possible application of standard methods is discussed and summarized in the concluding section.
KW  - Synaptinemal-Komplex
KW  - Maus
KW  - Hydra <Polyp>
KW  - Evolution
KW  - Meiose
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-100043
ER  -