TY - THES A1 - Lu, Yunzhi T1 - Kinetics of mouse and human muscle type nicotinic receptor channels T1 - Kinetik muriner und humaner nikotinischer Rezeptorkanäle vom Muskeltyp N2 - Acetylcholine (ACh) mediates transmission at vertebrate neuromuscular junctions and many other synapses. The postsynaptic ACh receptors at neuromuscular junctions are of the nicotinic subtype (nAChRs). They are among the best studied receptor channels and often serve as models or receptor prototypes. Despite a wealth of information on muscle type nAChRs so far little is known about species specific functional differences. In this work, mouse and human adult muscle type nAChRs are investigated. Cell attached recordings in the HEK293T heterologous expression system provided evidence that the ACh affinity of recombinant mouse and human adult muscle type nAChRs are different. To clarify this, I compared these receptors in outside-out patches employing a system for fast agonist application. Thus, the individual membrane patches with receptors can be exposed to various ligand concentrations. In response to 10 and 30 µM ACh normalized peak currents (î) were significantly larger and current rise-time (tr) shorter in human than in mouse receptors. Analyzing dose-response curves of î and tr and fitting them with a two-step equivalent binding-site kinetic mechanism revealed a two-fold higher ACh association rate constant in human compared to mouse receptors. Furthermore, human nAChRs were blocked faster in outside-out patches by superfusion of 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) than mouse nAChRs. Finally, human nAChRs in outside-out patches showed higher affinity at 3 µM ACh than chimeric receptors consisting of mouse α- and human β-, γ- and ε-subunits. The higher affinity of human than mouse receptors for ACh and α-Bgtx is thus at least in part due to sequence difference in their α-subunits. N2 - Acetylcholin (ACh) vermittelt Erregungsübertragung an neuromuskulären synaptischen Kontakten (neuromuscular junction, NMJ) von Wirbeltieren und vielen anderen Synapsen. Die postsynaptischen ACh-Rezeptoren an der NMJ sind vom nikotinischen Subtyp (nAChRs). Als Teil der am besten erforschten Kanalrezeptoren dienen sie oft als Modelle oder auch Prototypen für Rezeptoren. Trotz einer Fülle an Informationen über nAChRs des Muskeltyps ist bis heute recht wenig über artenspezifischen funktionellen Unterschiede bekannt. Diese Studie befasst sich daher mit der Untersuchung von nAChRs des Muskeltyps in erwachsenen Mäusen und Menschen. Aufzeichnungen mit sogenannten Cell-attached Patches im heterologen Expressionssystem HEK293T-Zellen lieferten Beweise dafür, dass die ACh-Affinität von rekombinanten erwachsenen Maus- und menschlichen nAChRs vom Muskeltyp unterschiedlich sind. Um diesem nachzugehen, habe ich diese Rezeptoren in Outside-out Patches mit Hilfe eines schnellen Piezogetriebenen Applikationssystems verglichen. Dieses System bietet den Vorteil, dass einzelne Membran-Patches mit Rezeptoren unterschiedlichen Ligandenkonzentrationen ausgesetzt werden können. Als Reaktion auf 10 und 30 µM ACh waren die normalisierten Stromamplituden (î) und Stromanstiegszeiten (tr) der menschlichen Rezeptoren signifikant höher als die der Mausrezeptoren. Die Analyse der Dosis-Wirkungskurven von î und tr sowie die Anpassung eines quantitativen zweistufigen kinetischen Modells mit zwei äquivalenten Bindestellen an die Datensätze zeigten eine zweifach höhere Assoziationsrate für ACh bei menschlichen Rezeptoren, verglichen mit der von Mausrezeptoren. Zudem wurden menschliche nAChRs in Outside-Out-Patches schneller als Mausrezeptoren durch Superfusion mit 300 nM α-Bungarotoxin (α-Bgtx) blockiert, was für eine höhere Affinität auch für α-Bgtx spricht. Schließlich wiesen die menschlichen nAChRs in Outside-Out-Patches bei 3 µM ACh eine höhere Affinität als chimäre Rezeptoren aus Maus α- und menschlichen β-, γ- and ε-Untereinheiten auf. Die höhere Affinität der menschlichen Rezeptoren zu ACh und α-Bgtx im Vergleich zu Mausrezeptoren basiert somit zumindest in Teilen auf Sequenzdifferenzen ihrer α-Einheitenen. KW - nicotinic acetylcholine receptor KW - affinity KW - kinetic mechanism KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Muskelzelle KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192688 ER - TY - THES A1 - Costea, Paul Igor T1 - Stratification and variation of the human gut microbiota T1 - Stratifikation und Variation des menschlichen Darmmikrobioms N2 - The microbial communities that live inside the human gastrointestinal tract -the human gut microbiome- are important for host health and wellbeing. Characterizing this new “organ”, made up of as many cells as the human body itself, has recently become possible through technological advances. Metagenomics, the high-throughput sequencing of DNA directly from microbial communities, enables us to take genomic snapshots of thousands of microbes living together in this complex ecosystem, without the need for isolating and growing them. Quantifying the composition of the human gut microbiome allows us to investigate its properties and connect it to host physiology and disease. The wealth of such connections was unexpected and is probably still underestimated. Due to the fact that most of our dietary as well as medicinal intake affects the microbiome and that the microbiome itself interacts with our immune system through a multitude of pathways, many mechanisms have been proposed to explain the observed correlations, though most have yet to be understood in depth. An obvious prerequisite to characterizing the microbiome and its interactions with the host is the accurate quantification of its composition, i.e. determining which microbes are present and in what numbers they occur. Historically, standard practices have existed for sample handling, DNA extraction and data analysis for many years. However, these were generally developed for single microbe cultures and it is not always feasible to implement them in large scale metagenomic studies. Partly because of this and partly because of the excitement that new technology brings about, the first metagenomic studies each took the liberty to define their own approach and protocols. From early meta-analysis of these studies it became clear that the differences in sample handling, as well as differences in computational approaches, made comparisons across studies very difficult. This restricts our ability to cross-validate findings of individual studies and to pool samples from larger cohorts. To address the pressing need for standardization, we undertook an extensive comparison of 21 different DNA extraction methods as well as a series of other sample manipulations that affect quantification. We developed a number of criteria for determining the measurement quality in the absence of a mock community and used these to propose best practices for sampling, DNA extraction and library preparation. If these were to be accepted as standards in the field, it would greatly improve comparability across studies, which would dramatically increase the power of our inferences and our ability to draw general conclusions about the microbiome. Most metagenomics studies involve comparisons between microbial communities, for example between fecal samples from cases and controls. A multitude of approaches have been proposed to calculate community dissimilarities (beta diversity) and they are often combined with various preprocessing techniques. Direct metagenomics quantification usually counts sequencing reads mapped to specific taxonomic units, which can be species, genera, etc. Due to technology-inherent differences in sampling depth, normalizing counts is necessary, for instance by dividing each count by the sum of all counts in a sample (i.e. total sum scaling), or by subsampling. To derive a single value for community (dis-)similarity, multiple distance measures have been proposed. Although it is theoretically difficult to benchmark these approaches, we developed a biologically motivated framework in which distance measures can be evaluated. This highlights the importance of data transformations and their impact on the measured distances. Building on our experience with accurate abundance estimation and data preprocessing techniques, we can now try and understand some of the basic properties of microbial communities. In 2011, it was proposed that the space of genus level variation of the human gut microbial community is structured into three basic types, termed enterotypes. These were described in a multi-country cohort, so as to be independent of geography, age and other host properties. Operationally defined through a clustering approach, they are “densely populated areas in a multidimensional space of community composition”(source) and were proposed as a general stratifier for the human population. Later studies that applied this concept to other datasets raised concerns about the optimum number of clusters and robustness of the clustering approach. This heralded a long standing debate about the existence of structure and the best ways to determine and capture it. Here, we reconsider the concept of enterotypes, in the context of the vastly increased amounts of available data. We propose a refined framework in which the different types should be thought of as weak attractors in compositional space and we try to implement an approach to determining which attractor a sample is closest to. To this end, we train a classifier on a reference dataset to assign membership to new samples. This way, enterotypes assignment is no longer dataset dependent and effects due to biased sampling are minimized. Using a model in which we assume the existence of three enterotypes characterized by the same driver genera, as originally postulated, we show the relevance of this stratification and propose it to be used in a clinical setting as a potential marker for disease development. Moreover, we believe that these attractors underline different rules of community assembly and we recommend they be accounted for when analyzing gut microbiome samples. While enterotypes describe structure in the community at genus level, metagenomic sequencing can in principle achieve single-nucleotide resolution, allowing us to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) and other genomic variants in the gut microbiome. Analysis methodology for this level of resolution has only recently been developed and little exploration has been done to date. Assessing SNPs in a large, multinational cohort, we discovered that the landscape of genomic variation seems highly structured even beyond species resolution, indicating that clearly distinguishable subspecies are prevalent among gut microbes. In several cases, these subspecies exhibit geo-stratification, with some subspecies only found in the Chinese population. Generally however, they present only minor dispersion limitations and are seen across most of our study populations. Within one individual, one subspecies is commonly found to dominate and only rarely are several subspecies observed to co-occur in the same ecosystem. Analysis of longitudinal data indicates that the dominant subspecies remains stable over periods of more than three years. When interrogating their functional properties we find many differences, with specific ones appearing relevant to the host. For example, we identify a subspecies of E. rectale that is lacking the flagellum operon and find its presence to be significantly associated with lower body mass index and lower insulin resistance of their hosts; it also correlates with higher microbial community diversity. These associations could not be seen at the species level (where multiple subspecies are convoluted), which illustrates the importance of this increased resolution for a more comprehensive understanding of microbial interactions within the microbiome and with the host. Taken together, our results provide a rigorous basis for performing comparative metagenomics of the human gut, encompassing recommendations for both experimental sample processing and computational analysis. We furthermore refine the concept of community stratification into enterotypes, develop a reference-based approach for enterotype assignment and provide compelling evidence for their relevance. Lastly, by harnessing the full resolution of metagenomics, we discover a highly structured genomic variation landscape below the microbial species level and identify common subspecies of the human gut microbiome. By developing these high-precision metagenomics analysis tools, we thus hope to contribute to a greatly improved understanding of the properties and dynamics of the human gut microbiome. N2 - Die mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb des menschlichen Darmtrakts – das menschliche Darm-Mikrobiom - sind wichtig für das Wohlbefinden und die Gesundheit des Wirts. Die Charakterisierung dieses neuen “Organs”, welches aus ähnlich vielen Zellen besteht wie der menschliche Körper, ist in jüngster Zeit durch technologische Fortschritte möglich geworden. Die Metagenomik, die direkte Hochdurchsatz-Sequenzierung mikrobieller DNA, ermöglicht die Aufnahme “genomischer Schnappschüsse” tausender verschiedener, in einem komplexen Ökosystem zusammenlebender Bakterien, ohne dafür auf deren Isolierung und Wachstum angewiesen zu sein. Die Quantifizierung des menschlichen Mikrobioms erlaubt es uns, seine Eigenschaften zu untersuchen und Verbindungen zu Wirtsphysiologie und -krankheiten zu knüpfen. Der Reichtum dieser Informationen ist unerwartet hoch und wahrscheinlich noch immer unterbewertet. Aufgrund der Tatsache, dass der Großteil unserer Ernährung und unseres Medikamentenkonsums unser Mikrobiom, welches wiederum selbst über verschiedene Arten mit unserem Immunsystem interagiert, beeinflusst, wurden viele Mechanismen vorgeschlagen, um die beobachteten Korrelationen zu erklären. Die meisten davon sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Eine offensichtliche Komponente zur Charakterisierung des Mikrobioms und dessen Interaktionen mit dem Wirt ist eine akkurate Quantifizierung seiner genauen Zusammensetzung, womit sowohl die Anwesenheit von bestimmten Bakterien als auch deren Anzahl gemeint ist. Obwohl etablierte Standardprozeduren zur Probenbehandlung, DNA- Extrahierung und Datenanalyse existieren, sind sie nicht immer für metagenomische Studien anwendbar, da sie für isolierte Bakterienkulturen entwickelt worden. Deswegen und auch wegen der Begeisterung, die neuartige Technologien mit sich bringen, nahmen sich die ersten metagenomischen Studien jeweils die Freiheit, ihre eigenen Protokolle und Herangehensweisen zu definieren. Die Metaanalyse dieser Studien zeigte, dass Unterschiede sowohl in der Probenbehandlung als auch in der statistischen Auswertung den Vergleich zwischen Studien sehr schwierig machen. Das wiederum beschneidet unsere Fähigkeit, Entdeckungen zu bestätigen und Daten über Studien hinweg zu kombinieren. Um die zwingend notwendige Standardisierung voranzutreiben haben wir einen umfassenden Vergleich von 21 verschiedenen DNA-Extraktionsmethoden sowie verschiedener weiterer Probenbehandlungen, welche Quantifizierungen beeinflussen, vorgenommen. Wir haben eine Reihe von Kriterien entwickelt, um die Messqualität in Abwesenheit von Mock-Kontrollen zu bestimmen und schlagen anhand dieser Methoden für Probenbeschaffung, DNA-Extraktion und Library- Generierung optimale Verfahren vor. Wenn diese als Standard akzeptiert werden, würde das eine stark verbesserte Vergleichbarkeit zwischen Studien ermöglichen und damit sowohl einen extremen Zuwachs an statistischer Power als auch unserer Fähigkeit, generelle Schlüsse über das Mikrobiom zu ziehen, zur Folge haben. Die meisten metagenomischen Studien teilen ihre Datensätze auf um Vergleiche anzustellen, z.B. zwischen Stuhlproben gesunder und erkrankter Menschen. Eine Vielzahl verschiedener Ansätze, welche wiederum oft mit verschiedenen Datenvorbehandlungen kombiniert werden, wurden vorgeschlagen, um Dissimilarität zwischen Gemeinschaften (Beta-Diversität) zu berechnen. Um metagenomische Daten auf Spezies-, Genus- und höheren Ebenen zu quantifizieren werden üblicherweise reads auf Referenzgenome bestimmter taxonomischer Einheiten aligniert und gezählt. Aufgrund technologieabhängiger Unterschiede in Sequenziertiefe müssen reads normalisiert werden, z.B. indem man alle counts durch die Gesamtanzahl der counts einer Sequenzierung teilt (total sum scaling), oder durch subsampling. Für die Messung der Gemeinschafts(dis)similarität wurden viele Distanzmaße vorgeschlagen. Da es schwierig ist diese Ansätze theoretisch zu vergleichen, haben wir ein biologisch motiviertes Konzept entwickelt, mit dem man Distanzmaße evaluieren kann. Dies unterstreicht die Wichtigkeit der Datentransformation und dessen Einwirkung auf Distanzmaße. Aufbauend auf unserer Erfahrung mit Häufigkeitsabschätzungen und Techniken zur Datenvorbehandlung können wir nun versuchen, grundlegende Eigenschaften mikrobieller Gemeinschaften zu verstehen. 2011 wurde vorgeschlagen, dass sich die Variation auf Genusebene im menschlichen Darm auf drei grundlegende Typen beschränkt, welche Enterotypen getauft wurden. Diese wurden in Datensätzen verschiedener Länder als unabhängig von Herkunft, Alter und anderer Wirtseigenschaften beschrieben. Die Enterotypen sind durch einen Cluster-Ansatz als „dicht besiedelte Bereiche in einem multidimensionalen Raum der Gemeinschaftszusammensetzung“ definiert und wurden als grundlegende Stratifikatoren für die menschlichen Population vorgeschlagen. Spätere Studien, welche dieses Konzept auf andere Datensätze anwandten, erhoben Zweifel bezüglich der optimalen Anzahl an Clustern und an der generellen Robustheit des Ansatzes. Dies leitete erneut eine langanhaltende Debate über die Existenz von Strukturen und die besten Wege, diese zu bestimmen und einzufangen, ein. Hier überdenken wir, in Anbetracht der stark gestiegenen Anzahl an verfügbaren Daten, das Enterotypen-Konzept. Wir schlagen ein überarbeitetes Konzept vor, in welchem die verschiedenen Enterotypen als schwache Attraktoren im multidimensionalen Raum verstanden werden und implementieren einen Ansatz zur Berechnung des Attraktors, der dem Datensatz am ähnlichsten ist. Dafür trainieren wir einen Klassifizierer auf einen Referenz- Datensatz, um neue Datensätze zuzuordnen. Damit ist Enterotypisierung nicht mehr datensatzabhängig und der Effekt von sampling bias ist minimiert. Indem wir ein Modell nutzen für das wir die Existenz dreier Enterotypen (definiert durch die selben Genera wie ursprünglich postuliert) annehmen, zeigen wir die Relevanz dieser Stratifikation und schlagen es in einem klinischen Zusammenhang als potentiellen Marker für Krankheitsfortschritt vor. Außerdem glauben wir, dass diese Attraktoren verschiedene Regeln mikrobieller Zusammensetzung widerspiegeln und schlagen vor, sie bei der Analyse von mikrobiellen Daten zu berücksichtigen. Während Enterotypen Struktur in der Gemeinschaft auf Genusebene beschreiben, kann metagenomische Sequenzierung prinzipiell Auflösung auf Nukleotidebene erreichen, womit single nucleotide polymorphisms (SNPs) und andere genomische Variationen im Darm- Mikrobiom identifiziert werden können. Analysemethoden für dieses Auflösungsniveau wurden erst kürzlich entwickelt und bis heute wurden diese erst wenig erforscht. Wir zeigen, dass die Landschaft an genomischer Variation von SNPs in einer großen, multinationalen Kohorte sogar über die Speziesebene hinaus geht und hochgradig strukturiert ist, was das Vorkommen klar abgrenzbarer Subspezies unter Darmmikroben suggeriert. In mehreren Fällen zeigen diese Subspezies geographische Stratifikation, wobei einige Subspezies nur in chinesischen Populationen vorkommen. Im Allgemein zeigen Sie jedoch nur eine geringfügige Beschränkung der Dispersion und sind in der Mehrzahl der Populationen vorhanden. Innerhalb eines Individuums dominiert häufig eine bestimmte Subspezies, nur selten dominieren verschieden gemeinsam im gleichen Ökosystem. Eine Analyse von Zeitreihenexperimenten deutet darauf hin, dass die dominante Subspezies über Zeiträume von mehr als drei Jahren stabil bleibt. Wenn man ihre funktionalen Eigenschaften untersucht findet man viele Unterschiede, von denen bestimmte relevant für den Wirt erscheinen. Zum Beispiel identifizieren wir eine Subspezies von E. rectale, welcher das Flagellum-Operon fehlt, die signifikant assoziiert ist mit geringerem BMI und geringerer Insulinresistenz ihres Wirts; sie korreliert zudem mit höherer mikrobieller Diversität. Diese Assoziationen konnten auf Speziesebene nicht gesehen werden (auf der mehrere Subspezies überlagert sind), was die Wichtigkeit dieser erhöhten Auflösung für ein umfassenderes Verständnis mikrobieller Interaktionen innerhalb des Mikrobioms und mit dem Wirt illustriert. Zusammenfassend bieten unsere Ergebnisse eine präzise Grundlage für vergleichende Metagenomik des menschlichen Darms, einschließlich Empfehlungen über experimentelles Sampling und statistische Analysen. Weiterhin verfeinern wir das Konzept der Enterotypen- Stratifikation in Gemeinschaften, entwickeln referenzbasierte Ansätze für Enterotypen- Zuordnung und bieten überzeugende Beweise für ihre Relevanz. Indem wir die volle Auflösung metagenomischer Sequenzierungen nutzen entdecken wir eine Landschaft hochgradig strukturierter genomischer Variation unterhalb der Speziesebene und identifizieren gemeinsame Subspezies des menschlichen Darm-Mikrobioms. Durch die Entwicklung dieser hochpräzisen metagenomischen Untersuchungsansätze tragen wir zu einem verbesserten KW - metagenomics KW - microbiology KW - Mensch KW - Darmflora KW - Metagenom Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139649 ER - TY - THES A1 - Ott, Christine Kornelia T1 - Diverse Aspects of the Sorting and Assembly Machinery in Human Mitochondria T1 - Diverse Aspekte der Sortierungs- und Assemblierungsmaschinerie in humanen Mitochondrien N2 - Mitochondria are organelles of endosymbiotic origin, which play many important roles in eukaryotic cells. Mitochondria are surrounded by two membranes and, considering that most of the mitochondrial proteins are produced in the cytosol, possess import machineries, which transport mitochondria-targeted proteins to their designated location. A special class of outer mitochondrial membrane (OMM) proteins, the β-barrel proteins, require the sorting and assembly machinery (SAM) for their OMM integration. Both mitochondrial β-barrel proteins and the central component of the SAM complex, Sam50, have homologs in gram-negative bacteria. In yeast mitochondria, bacterial β-barrel proteins can be imported and assembled into the OMM. Our group demonstrated that this, however, is not the case for human mitochondria, which import only neisserial β barrel proteins, but not those of Escherichia coli and Salmonella enterica. As a part of this study, I could demonstrate that β-barrel proteins such as Omp85 and PorB of different Neisseria species are targeted to human mitochondria. Interestingly, only proteins belonging to the neisserial Omp85 family were integrated into the OMM, whereas PorB was imported into mitochondria but not assembled. By exchanging parts of homologous neisserial Omp85 and E. coli BamA and, similarly, of neisserial PorB and E. coli OmpC, it could be demonstrated in this work that the mitochondrial import signal of bacterial β barrel proteins cannot be limited to one short linear sequence, but rather secondary structure and protein charge seem to play an important role, as well as specific residues in the last β-strand of Omp85. Omp85 possesses five conserved POTRA domains in its amino-terminal part. This work additionally demonstrated that in human mitochondria, at least two POTRA domains of Omp85 are necessary for membrane integration and functionality of Omp85. In the second part of this work, the influence of Sam50 on the mitochondrial cristae structure was investigated. This work contributed to a study performed by our group in which it was confirmed that Sam50 is present in a high molecular weight complex together with mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, metaxin 1 and metaxin 2. This connection between the inner and outer mitochondrial membrane was shown to be crucial for the maintenance of the mitochondrial cristae structure. In addition, a role of Sam50 in respiratory complex assembly, suggested by a SILAC experiment conducted in our group, could be confirmed by in vitro import studies. An influence of Sam50 not only on respiratory complexes but also on the recently described respiratory complex assembly factor TTC19 was demonstrated. It was shown that TTC19 not only plays a role in complex III assembly as published, but also influences the assembly of respiratory complex IV. Thus, in this part of the work a connection between the OMM protein Sam50 and maintenance of cristae structure, respiratory complex assembly and an assembly factor could be established. N2 - Mitochondrien sind Zellorganellen endosymbiotischen Ursprungs, die viele wichtige Funktionen in eukaryotischen Zellen haben. Mitochondrien sind von zwei Membranen umgeben, und da die meisten Mitochondrienproteine im Cytosol hergestellt werden, besitzen sie Importmaschinerien, die die für die Mitochondrien bestimmten Proteine zu ihrem jeweiligen Zielort transportieren. Eine besondere Klasse von Proteinen der äußeren Mitochondrienmembran (ÄMM), die β-Fassproteine, benötigen die Sortierungs- und Assemblierungsmaschinerie (SAM) für ihre Integration in die ÄMM. Sowohl mitochondriale β-Fassproteine als auch die zentrale Komponente des SAM-Komplexes, Sam50, haben Homologe in gramnegativen Bakterien. In Hefemitochondrien können bakterielle β Fassproteine importiert und in der ÄMM assembliert werden. Unsere Gruppe hat gezeigt, dass dies jedoch nicht auf humane Mitochondrien zutrifft, die nur neisserielle β-Fassproteine importieren, nicht aber diejenigen von Escherichia coli und Salmonella enterica. Im Rahmen dieser Studie konnte ich zeigen, dass β Fassproteine verschiedener Neisserienarten, wie Omp85 und PorB, in humane Mitochondrien aufgenommen werden. Interessanterweise wurden nur Proteine der neisseriellen Omp85-Familie in die ÄMM eingebaut, während PorB zwar importiert, jedoch nicht assembliert wurde. Durch das Austauschen von Teilen von homologem neisseriellen Omp85 und E.coli BamA und ebenso von neisseriellem PorB und E. coli OmpC konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass das mitochondriale Importsignal bakterieller β-Fassproteine nicht auf eine kurze lineare Sequenz eingegrenzt werden kann, sondern dass die Sekundärstruktur und die Ladung des Proteins eine wichtige Rolle zu spielen scheinen, sowie im Fall von Omp85 einige bestimmte Aminosäurereste des letzten β-Stranges. Omp85 besitzt fünf konservierte POTRA-Domänen in seiner aminoterminalen Hälfte. In dieser Arbeit wurde zudem demonstriert, dass in humanen Mitochondrien mindestens zwei POTRA-Domänen von Omp85 für die Membranintegration und Funktionalität von Omp85 vorhanden sein müssen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von Sam50 auf die mitochondriale Cristaestruktur untersucht. Diese Arbeit hat zu einer von unserer Gruppe durchgeführten Studie beigetragen, in der bestätigt werden konnte, dass Sam50 in einem hochmolekularen Komplex mit Mitofilin, CHCHD3, CHCHD6, DnaJC11, Metaxin 1 und Metaxin 2 vorliegt. Es wurde gezeigt, dass diese Verbindung zwischen der inneren und äußeren Mitochondrienmembran unverzichtbar für die Aufrechterhaltung der mitochondrialen Cristaestruktur ist. Zudem konnte eine Rolle von Sam50 bei der Assemblierung von Atmungskettenkomplexen, die durch ein in unserem Labor durchgeführtes SILAC-Experiment nahegelegt worden war, durch in-vitro-Importstudien bestätigt werden. Weiterhin wurde ein Einfluss von Sam50 nicht nur auf Atmungskettenkomplexe, sondern auch auf einen vor kurzem beschriebenen Assemblierungsfaktor der Atmungskette, TTC19, demonstriert. Es wurde gezeigt, dass TTC19 nicht nur, wie veröffentlicht, eine Rolle bei der Assemblierung des Atmungskettenkomplexes III spielt, sondern auch die Assemblierung des Atmungskettenkomplexes IV beeinflusst. In diesem Teil der Arbeit konnte folglich eine Verbindung zwischen dem ÄMM-Protein Sam50 und der Organisation der Cristaestruktur, der Atmungskettenassemblierung und einem Assemblierungsfaktor nachgewiesen werden. KW - Mitochondrien KW - Mensch KW - Molekularbiologie KW - mitochondria KW - Import KW - Omp85 KW - beta-barrel-proteins KW - cristae KW - beta-Fassproteine KW - Cristaestruktur Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85462 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Kathrin T1 - Identification and Characterization of GAS2L3 as a Novel Mitotic Regulator in Human Cells T1 - Die Identifizierung und Charakterisierung von GAS2L3 als neuer Regulator der Mitose in humanen Zellen N2 - Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis. N2 - Der korrekte Verlauf durch die Mitose des Zellzyklus trägt entscheidend zur Aufrechterhaltung der genomischen Integrität bei. Da ein Verlust der genomischen Integrität die Tumorentstehung begünstigt, ist die Identifizierung neuer G2/M regulatorischer Gene ein Forschungsbereich, der großes Interesse weckt. Der humane Multiproteinkomplex LINC ist für die transkriptionelle Aktivierung einer Vielzahl G2/M spezifischer Gene verantwortlich. Durch die Depletion von LIN9 in MEFs, einer Kernkomponente von LINC, wurde Gas2l3 als ein neues Zielgen von LINC identifiziert. Das bisher uncharakterisierte Gas2l3 Gen codiert für ein der GAS2 (growth arrest specific 2) Familie zugehöriges Protein, deren Mitglieder sich durch eine hoch konservierte putative Aktin-bindende Domäne (CH) und eine putative Mikrotubuli-bindende Domäne (GAS2) auszeichnen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass GAS2L3 auch in humanen Zellen ein Zielgen von LINC ist. Die Transkription von GAS2L3 wies, im Gegensatz zu allen anderen GAS2 Familienmitgliedern, eine starke Regulation während des Zellzyklus auf, wobei die höchste Genexpression in der G2/M Phase vorlag. Das GAS2L3 Protein zeigte eine spezifische Lokalisation während der M Phase: In der Metaphase findet sich GAS2L3 an der mitotischen Spindel, wandert von dort an die Mikrotubuli der zentralen Spindel der Anaphase und konzentriert sich in der Telophase am Midbody, wo es bis zum Ende der Zytokinese verweilt. Der Einsatz unterschiedlicher Deletionsmutanten demonstrierte, dass die Lokalisation an die mitotischen Mikrotubuli vom C-Terminus abhängig ist, wohingegen die Lokalisation am Midbody von der gesamten Proteinsequenz abhängt. Die Ausbildung von Aktin-Streß-Filamenten nach alleiniger Überexpression der CH Domäne deutete darauf hin, dass die CH Domäne eine Aktin-bindende Domäne ist. Die GAS2 Domäne hingegen wurde weder für die Interaktion mit Mikrotubuli gebraucht, noch war sie alleine für diese ausreichend. Alle Daten weisen darauf hin, dass GAS2L3 eine bisher unbekannte Mikrotubuli-bindende Domäne im C-Terminus trägt. Interessanterweise ist der C-Terminus auch für die hohe Instabilität des GAS2L3 Proteins, die teilweise durch den Abbau im Proteasom verursacht wird, verantwortlich. Entsprechend der spezifischen Lokalisation zeigte die Depletion von GAS2L3 durch siRNA Transfektion dessen Wichtigkeit für den korrekten Verlauf der M Phase. GAS2L3 depletierte HeLa Zellen zeigten eine Anreicherung von multinukleären Zellen, welche ein Indikator für die fehlerhafte Verteilung der Chromosomen in der Mitose sind. Ein Hinweis auf Probleme im Beenden der Zytokinese stellte die erhöhte Anzahl von Zellen dar, die sich in der Zytokinese befanden. Eines der auffallendsten Merkmale war ein geschwächter mitotischer Spindelkontrollpunkt, den GAS2L3 depletierte Zellen nach der Behandlung mit den Kontrollpunkt aktivierenden Mikrotubuli-Giften aufwiesen. Auch wenn der exakte molekulare Mechanismus hierbei noch unbekannt ist, deuten erste Experimente darauf hin, dass GAS2L3 die Aktivität von BUBR1, einer essentiellen Kinase des mitotischen Spindelkontrollpunkts, beeinflusst. Alle Daten dieser Arbeit verdeutlichen die Wichtigkeit von GAS2L3 als einen neuen Regulator der Mitose und Zytokinese. Somit ist anzunehmen, dass die korrekte Funktion von GAS2L3 entscheidend zum Schutz vor Tumorentstehung beiträgt. KW - Mensch KW - Zelle KW - Mitose KW - Kernspindel KW - Kontrolle KW - Genregulation KW - Spindelkontrollpunkt KW - Zytokinese KW - Midbody KW - GAS2L3 KW - LIN9 KW - Zellzyklus KW - LIN9 KW - GAS2L3 KW - mitosis KW - cytokinesis KW - spindle assembly checkpoint Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52704 ER - TY - THES A1 - Christensen, Morten Overby T1 - Dynamics of human DNA Topoisomerases I and II T1 - Dynamic von Human DNA Topoisomerases I and II N2 - The first goal of this study was to develop cell lines with a stable expression of bio-fluorescent topo II and topo I. This was successfully achieved using a bicistronic vector system. Control experiments showed that proteins of expected size were expressed, and that GFP-tagged topos I, IIa, and IIb were active in the cells and fully integrated in the endogenous pools of the enzymes. These cell-lines provided a novel tool for investigating the cell biology of human DNA topoisomerases. Our most important finding was, that both types of mammalian topoisomerases are entirely mobile proteins that are in continuous and rapid flux between all compartments of the nucleus and between the cytososl and the chromosomes of mitotic cells. This was particularly surprising with regard to topo II, which is considered to be a structural component of the nuclear matrix and the chromosome scaffold. We must conclude that if this was the case, then these architectural structures appear to be much more dynamic than believed until now. In this context it should also be mentioned, that the alignment of topo II with the central axes of the chromosome arms, which has until now been considered a hall-mark of the enzyme’s association with the chromosomal scaffold, is not seen in vivo and can be demonstrated to be to some extent an artefact of immunohistochemistry. Furthermore, we show that the two isoforms of topo II (a and b) have a different localisation during mitotic cell division, supporting the general concept that topo II functions at mitosis are exclusively assigned to the a-form, whereas at interphase the two isoenzymes work in concert. Despite unrestricted mobility within the entire nuclear space, topoisomerases I and II impose as mostly nucleolar proteins. We show that this is due to the fact that in the nucleoli they are moving slower than in the nucleoplasm. The decreased nucleolar mobility cannot be due to DNA-interactions, because compounds that fix topoisomerases to the DNA deplete them from the nucleoli. Interestingly, the subnucleolar distribution of topoisomerases I and II was complementary. The type II enzyme filled the entire nucleolar space, but excluded the fibrial centers, whereas topo I accumulated at the fibrial centers, an allocation directed by the enzyme’s N-terminus. During mitosis, it also mediates association with the nucleolar organising regions of the acrocentric chromosomes. Thus, topo I stays associated with the rDNA during the entire cell-cycle and consistently colocalizes there with RNA-polymerase I. Finally, we show that certain cancer drugs believed to act by stabilising covalent catalytic DNA-intermediates of topoisomerases, do indeed immobilize the enzymes in living cells. Interestingly, these drugs do not target topoisomerases in the nucleoli but only in the nucleoplasm. N2 - Diese Arbeit hatte zunächst zum Ziel, humane Zelllinien zu etablieren, in denen GFP-Chimären der humanen DNS-Topoiosmerasen I, IIa und IIb stabil und constitutiv exprimiert werden. Dies wurde mit Hilfe eines bicistronischen Expressionsvektors erreicht, der eine quasi physiologische Expression der GFP-Chimären in humanen Zellen ermöglichte. Wir zeigen, dass die chimärischen Proteine die erwartete Größe haben, aktiv sind, und vollständig in die jeweiligen endogenen Enzympopulationen integriert werden. Damit halten wir ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie der Topoisomerasen in Händen. Sowohl Topoisomerase I, als auch die beiden Typ II-Enzyme innerhalb des Zellkerns vollständig mobil sind und zwischen Nukleoplasma und Nukleolen, sowie zwischen Zytosol und Chromosmen mitotischer Zellen ständig austauschen. Dieser Befund ist insbesondere hinsichtlich der Topoisomerase II erstaunlich, da man bisher davon ausgeht, dass dieses Enzym eine zentrale Rolle bei der Konstituierung der Kernmatrix bzw. des Chromosomengerüstes spielt, was mit einem vollständig und rasch beweglichen Protein unvereinbar scheint. Falls Topoisomerase II tatsächlich eine solche Rolle spielen sollte, müssen die Kernmatrix und das Chromosomengerüst sehr viel dynamischere Strukturen sein, als bisher angenommen. Es sei in diesem Zusammenhang auch darauf hingewiesen, dass wir in der lebenden Zelle keine Konzentrierung der Topoisomerase entlang der zentralen Längsachsen der Chromosmenarme gesehen haben, was bisher als Markenzeichen von deren Gerüstfunktion galt. Vielmehr konnten wir zeigen, dass eine solche axiale Anordnung überwiegend ein Artefakt immunhistologischer Methoden darstellt. Wir zeigen weiterhin, dass die beiden Isoformen der Topoisomerase II (a und b) während der Zellteilung unterschiedlich lokalisiert sind, was mit dem generellen Konzept zusammenpasst, dass nur die a-Form mitotische Funktionen wahrnimmt, während die beiden Isoenzyme in der Interphase konzertiert arbeiten. Ungeachtet ihrer unbegrenzten Mobilität innerhalb des gesamten Zellkerns, imponieren Topoiosmerase I und II in der lebende Zelle als überwiegend nukleoläre Proteine, was damit zusammenhängt, dass sie sich hier etwas langsamer bewegen, als im Nukleoplasma. Diese relative Abbremsung kann nicht auf DNS-Interaktionen beruhen, weil chemische Susbtanzen, die Topoisomerasen an der DNS fixieren, eine Entleerung der Nukleolen bewirken. Interessanterweise ist die subnukleoläre Verteilung von Topoisomerase I und II komplementär. Die Typ II- Enzyme füllen den gesamten nukleolären Raum aus, sparen aber die fibrillären Zentren aus, während das Typ I- Enzym fast ausschließlich an den fibrillären Zentren zu finden ist. Diese Assoziation wird durch den N-Terminus des Enzyms vermittelt, der darüber hinaus während der Mitose auch die Bindung an die nukelolären Organisationszentren der akrozentrischen Chromosomen bewirkt. So bleibt Topoisomerase I über den gesamten Zellzyklus hinweg mit der rDNS physisch verbunden und kolokalisiert hier mit der RNS-Polymerase I. Schließlich konnten wir zeigen, das bestimmte Tumnortherapeutika, von denen man annimt, dass sie über eine Stabilisierung der kovalenten katalytischen DNS-Intermediate der Topoiosmerasen wirken, diese Enzyme in der lebenden Zelle tatsächlich immobil machen. Interssanterweise treffen diese Substanzen überwiegend im Nukleolplasma und nicht in den Nukleolen. KW - Mensch KW - DNS-Topoisomerasen KW - Molekulargenetik KW - Topoisomerase I KW - Topoisomerase II KW - Mobilitet KW - Drogen KW - Krebs KW - Topoisomerases I KW - Topoisomerase II KW - Mobility KW - Drugs KW - Cancer Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4927 ER - TY - THES A1 - Wietek, Irina T1 - Human Interleukin-4 binding protein epitope involved in high-affinity binding of interleukin-4 N2 - No abstract available KW - Mensch KW - Interleukin 4 KW - Bindeproteine KW - Molekularbiologie Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3190 ER -