TY - THES A1 - Hafen, Bettina T1 - Physical contact between mesenchymal stem cells and endothelial precursors induces distinct signatures with relevance to tissue regeneration and engineering T1 - Physischer Kontakt zwischen mesenchymalen Stammzellen und endothelialen Vorläuferzellen indiziert eine bestimmte Signatur mit Relevanz für die Geweberegeneration und Tissue Engineering N2 - The goal of the project VascuBone is to develop a tool box for bone regeneration, which on one hand fulfills basic requirements (e.g. biocompatibility, properties of the surface, strength of the biomaterials) and on the other hand is freely combinable with what is needed in the respective patient's situation. The tool box will include a variation of biocompatible biomaterials and cell types, FDA-approved growth factors, material modification technologies, simulation and analytical tools like molecular imaging-based in vivo diagnostics, which can be combined for the specific medical need. This tool box will be used to develop translational approaches for regenerative therapies of different types of bone defects. This project receives funding from the European Union's Seventh Framework Program (VascuBone 2010). The present study is embedded into this EU project. The intention of this study is to assess the changes of the global gene expression patterns of endothelial progenitor cells (EPCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) after direct cell-cell contact as well as the influence of conditioned medium gained from MSCs on EPCs and vice versa. EPCs play an important role in postnatal vasculogenesis. An intact blood vessel system is crucial for all tissues, including bone. Latest findings in the field of bone fracture healing and repair by the use of tissue engineering constructs seeded with MSCs raised the idea of combining MSCs and EPCs to enhance vascularization and therefore support survival of the newly built bone tissue. RNA samples from both experimental set ups were hybridized on Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 and analyzed by microarray technology. Bioinformatic analysis was applied to the microarray data and verified by RT-PCR. This study gives detailed information on how EPCs and MSCs communicate with each other and therefore gives insights into the signaling pathways of the musculoskeletal system. These insights will be the base for further functional studies on protein level for the purpose of tissue regeneration. A better understanding of the cell communication of MSCs and EPCs and subsequently the targeting of relevant factors opens a variety of new opportunities, especially in the field of tissue engineering. The second part of the present work was to develop an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for a target protein from the lists of differentially expressed genes revealed by the microarray analysis. This project was in cooperation with Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany. The development of the ELISA aimed to have an in vitro diagnostic tool to monitor e.g. the quality of cell seeded tissue engineering constructs. The target protein chosen from the lists was klotho. Klotho seemed to be a very promising candidate since it is described in the literature as anti-aging protein. Furthermore, studies with klotho knock-out mice showed that these animals suffered from several age-related diseases e.g. osteoporosis and atherosclerosis. As a co-receptor for FGF23, klotho plays an important role in bone metabolism. The present study will be the first one to show that klotho is up-regulated in EPCs after direct cell-cell contact with MSCs. The development of an assay with a high sensitivity on one hand and the capacity to differentiate between secreted and shedded klotho on the other hand will allow further functional studies of this protein and offers a new opportunity in medical diagnostics especially in the field of metabolic bone disease. N2 - Das Ziel des durch die europäische Union geförderten Projekts VascuBone ist die Entwicklung einer tool box zur Knochenregeneration, die einerseits sämtliche Grundanforderungen erfüllt, beispielsweise an die Biokompatibilität, Oberflächenbeschaffenheit und Robustheit der Biomaterialien, und andererseits frei an den Bedarf der individuellen Patientensituation angepasst werden kann. Sie beinhaltet unterschiedlichste biokompatible Materialien und Zelltypen, FDA-zugelassene Wachstumsfaktoren, materialmodifizierende Technologien sowie Simulations- und analytische Werkzeuge, wie die auf molekularer Bildgebung basierende in-vivo-Diagnostik (MRI und PET/CT), die für den spezifischen medizinischen Bedarf kombiniert werden können. Die tool box wird für die Entwicklung translationaler Ansätze in der regenerativen Medizin für unterschiedliche Arten von Knochendefekten verwendet (VascuBone 2010). Eingebettet in dieses EU-Projekt sollten in der vorliegenden Arbeit die molekularen Grundlagen und Änderungen der globalen Genexpressionsmuster von endothelialen Vorläuferzellen (EPCs) und mesenchymalen Stammzellen (MSCs) nach direktem Zell-Zell-Kontakt sowie nach Gabe von konditioniertem Medium untersucht werden. EPCs spielen eine wichtige Rolle in der postnatalen Vaskulogenese. Ein intaktes Blutgefäßsystem ist überlebensnotwendig für alle Gewebe, einschließlich Knochen. Neueste Erkenntnisse in der Knochenheilung und -regeneration durch die Nutzung von Tissue-Engineering-Konstrukten, die mit MSCs besiedelt wurden, förderten die Idee, MSCs und EPCs zu kombinieren, um die Vaskularisierung – und somit das Überleben – des neu gebildeten Knochengewebes zu begünstigen. Die RNA-Proben aus beiden Versuchsansätzen wurden für die Microarray-Analysen auf Affymetrix GeneChips® HG-U133 Plus 2.0 hybridisiert. Die Array-Daten wurden bioinformatisch ausgewertet und mittels RT-PCR verifiziert. Die vorliegende Arbeit gibt detailliert Aufschluss darüber, wie MSCs und EPCs miteinander kommunizieren, und erlaubt somit wichtige Einblicke in Signalwege des muskuloskelettalen Systems. Dies wiederum ermöglicht weitere funktionelle Studien auf Proteinebene zum Zwecke der Geweberegeneration. Das bessere Verständnis der Zellkommunikation zwischen MSCs und EPCs und somit die gezielte Adressierung von relevanten Faktoren eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Anwendung, insbesondere im Bereich Tissue Engineering. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte in Kooperation mit der Firma Immundiagnostik AG, Bensheim, ein ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) aufgebaut werden. Ziel war es, für ein geeignetes Protein aus den zu erwartenden Listen regulierter Gene ein in-vitro-diagnostisches Nachweisverfahren zu entwickeln, das ggf. später als Qualitätsnachweis für erfolgreich besiedelte Tissue-Engineering-Konstrukte herangezogen werden könnte. Als geeigneter Kandidat wurde Klotho ausgewählt. Klotho gilt als anti-aging-Protein, da Klotho-knock-out-Mäuse alle alterstypischen Erkrankungen wie Osteoporose oder Arteriosklerose zeigen. Als Co-Rezeptor für FGF23 spielt Klotho außerdem eine wichtige Rolle im Knochenstoffwechsel. Diese Studie ist die erste, die zeigt, dass in EPCs nach direktem Zell-Zell-Kontakt mit MSCs Klotho hochreguliert wird. Die Entwicklung eines sensitiven und differenzierten Nachweises von sezerniertem Klotho sowie der von der Membran proteolytisch abgespaltenen Form von Klotho, eröffnet völlig neue Möglichkeiten in der klinischen Diagnostik, insbesondere im Bereich der Knochenstoffwechselerkrankungen KW - MSC KW - EPC KW - bone regeneration KW - microarray KW - Vorläuferzelle KW - Endothel KW - Mesenchymzelle KW - Knochenregeneration Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119417 ER - TY - THES A1 - Reinboth, Jennifer T1 - Cellular Factors Contributing to Host Cell Permissiveness in Support of Oncolytic Vaccinia Virus Replication T1 - Beteiligung zellulärer Faktoren an der Permissivität von Wirtszellen in Unterstützung der onkolytischen Vaccinia Virus Replikation N2 - In initial experiments, the well characterized VACV strain GLV-1h68 and three wild-type LIVP isolates were utilized to analyze gene expression in a pair of autologous human melanoma cell lines (888-MEL and 1936 MEL) after infection. Microarray analyses, followed by sequential statistical approaches, characterized human genes whose transcription is affected specifically by VACV infection. In accordance with the literature, those genes were involved in broad cellular functions, such as cell death, protein synthesis and folding, as well as DNA replication, recombination, and repair. In parallel to host gene expression, viral gene expression was evaluated with help of customized VACV array platforms to get better insight over the interplay between VACV and its host. Our main focus was to compare host and viral early events, since virus genome replication occurs early after infection. We observed that viral transcripts segregated in a characteristic time-specific pattern, consistent with the three temporal expression classes of VACV genes, including a group of genes which could be classified as early-stage genes. In this work, comparison of VACV early replication and respective early gene transcription led to the identification of seven viral genes whose expression correlated strictly with replication. We considered the early expression of those seven genes to be representative for VACV replication and we therefore referred to them as viral replication indicators (VRIs). To explore the relationship between host cell transcription and viral replication, we correlated viral (VRI) and human early gene expression. Correlation analysis revealed a subset of 114 human transcripts whose early expression tightly correlated with early VRI expression and thus early viral replication. These 114 human molecules represented an involvement in broad cellular functions. We found at least six out of 114 correlates to be involved in protein ubiquitination or proteasomal function. Another molecule of interest was the serine-threonine protein kinase WNK lysine-deficient protein kinase 1 (WNK1). We discovered that WNK1 features differences on several molecular biological levels associated with permissiveness to VACV infection. In addition to that, a set of human genes was identified with possible predictive value for viral replication in an independent dataset. A further objective of this work was to explore baseline molecular biological variances associated with permissiveness which could help identifying cellular components that contribute to the formation of a permissive phenotype. Therefore, in a subsequent approach, we screened a set of 15 melanoma cell lines (15-MEL) regarding their permissiveness to GLV-1h68, evaluated by GFP expression levels, and classified the top four and lowest four cell lines into high and low permissive group, respectively. Baseline gene transcriptional data, comparing low and highly permissive group, suggest that differences between the two groups are at least in part due to variances in global cellular functions, such as cell cycle, cell growth and proliferation, as well as cell death and survival. We also observed differences in the ubiquitination pathway, which is consistent with our previous results and underlines the importance of this pathway in VACV replication and permissiveness. Moreover, baseline microRNA (miRNA) expression between low and highly permissive group was considered to provide valuable information regarding virus-host co-existence. In our data set, we identified six miRNAs that featured varying baseline expression between low and highly permissive group. Finally, copy number variations (CNVs) between low and highly permissive group were evaluated. In this study, when investigating differences in the chromosomal aberration patterns between low and highly permissive group, we observed frequent segmental amplifications within the low permissive group, whereas the same regions were mostly unchanged in the high group. Taken together, our results highlight a probable correlation between viral replication, early gene expression, and the respective host response and thus a possible involvement of human host factors in viral early replication. Furthermore, we revealed the importance of cellular baseline composition for permissiveness to VACV infection on different molecular biological levels, including mRNA expression, miRNA expression, as well as copy number variations. The characterization of human target genes that influence viral replication could help answering the question of host cell response to oncolytic virotherapy and provide important information for the development of novel recombinant vaccinia viruses with improved features to enhance replication rate and hence trigger therapeutic outcome. N2 - Die Replikationseffizienz von VACVs spielt eine maßgebliche Rolle für deren antitumorale Wirkung und onkolytische Effizienz. Ferner hängt die Permissivität einer Wirtszelle gegenüber der Behandlung mit onkolytischen VACVs maßgeblich von einer erfolgreichen viralen Replikation und Vermehrung ab. Darauf basierend, war der Fokus der vorliegenden Arbeit, zelluläre Eigenschaften zu erforschen, welche die VACV-Replikation beeinflussen und die Wirtszell-Permissivität gegenüber einer Behandlung mit VACV prognostizieren können. Für initiale Genexpressionsanalysen wurden zwei autologe, humane Melanom-Zelllinien (888-MEL und 1936 MEL), sowie der ausgiebig charakterisierte VACV-Stamm GLV-1h68 und drei wildtypische LIVP Isolate verwendet. Mit Hilfe von Microarray Analysen und einem sequenziellen statistischen Ansatz konnten humane Gene charakterisiert werden, deren Transkription eigens durch VACV-Infektion beeinflusst wird. Erwartungsgemäß zeigten diese Gene eine Anreicherung in globalen zellulären Signalwegen und Funktionen. Die frühe virale Gentranskription kann als repräsentative Bestimmungsgröße für virale Replikation betrachtet werden. Darauf basierend resultierte der Vergleich von früher VACV Replikation und entsprechender früher Gentranskription in der Identifikation von sieben viralen Genen, deren Expression und Replikation stark korrelierten. Aus diesem Grund wurde die frühe Expression der sieben VACV-Gene als kennzeichnend für virale Replikation angesehen und diese Gene als virale Replikations-Indikatoren (VRIs) definiert. Zur Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Wirts-Transkription und viraler Replikation wurde die frühe virale VRI-Expression mit der frühen humanen Genexpression in Beziehung gesetzt. Mit Hilfe von Vergleichsanalysen wurden 114 humane Transkripte identifiziert, deren frühes Expressionsmuster eng mit demjenigen der VRIs korrelierte und dementsprechend ebenso mit der viralen Replikation. Von den 114 Korrelaten spielen mindestens sechs eine Rolle in der Protein-Ubiquitinierung oder in der proteasomalen Signalgebung. Ein weiteres Molekül, welches besonderes Interesse weckte, war die Serin-Threonin Proteinkinase WNK Lysin-defizientes Protein 1 (WNK1). Für WNK1 wurden Unterschiede, die mit der VACV-Infektions-Permissivität zusammenhängen, auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen nachgewiesen. Desweiten wurde in dieser Arbeit eine Anzahl humaner Gene identifiziert, welche virale Replikation in einem unabhängigen Datensatz prognostizieren konnten. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, molekularbiologische Unterschiede, welche mit Infektions-Permissivität von Zellen assoziiert sind, auf Basisebene zu ergründen. Diese könnten dabei helfen, zelluläre Komponenten zu identifizieren, welche einen so genannten permissiven Phänotyp kennzeichnen. Aus diesem Grund wurden in einem weiteren Versuchsansatz 15 Melanom-Zelllinien (15-MEL) bezüglich ihrer Permissivität gegenüber GLV-1h68 anhand von GFP Expression untersucht. Die vier Zelllinien mit der höchsten und diejenigen vier mit der niedrigsten Permissivität wurden je einer Gruppe zugeordnet (hochpermissive und niedrigpermissive Gruppe). Die Gruppen hoher und niedriger Permissivität wurden bezüglich ihrer Basislevel-Transkription verglichen. Unterschiedlich exprimierte Gene waren, zumindest zum Teil, in globale zelluläre Prozesse involviert. Darüber hinaus wurde microRNA (miRNA) Basislevel-Expression von hoch- und niedrigpermissiver Gruppe untersucht. In dieser Arbeit wurden sechs miRNAs identifiziert, deren Basislevel-Expression zwischen niedrig und hochpermissiver Gruppe differiert. Abschließend wurden Veränderungen der Kopienzahl von Genen (copy number variations, CNVs) im Vergleich zwischen niedrig- und hochpermissiver Gruppe untersucht. Betrachtung chromosomaler Veränderungen zeigte eine Anreicherung von Segment-Amplifikationen in der niedrigpermissiven Gruppe, während gleiche Abschnitte der hochpermissiven Gruppe größtenteils keine Veränderungen aufwiesen. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine mutmaßliche Korrelation zwischen viraler Replikation, früher Genexpression und der entsprechenden Wirtsantwort gezeigt werden und somit eine mögliche Beteiligung humaner Wirtsfaktoren an der viralen Replikation. Zusätzlich wurden wichtige Aspekte der Basiskomposition von Zellen für die Permissivität gegenüber VACV-Infektion auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen aufgedeckt, einschließlich mRNA-Expression, miRNA-Expression sowie Kopienzahl-Variationen. Die Charakterisierung humaner Zielgene, welche die virale Replikation beeinflussen, könnte dabei helfen, die Wirtszellantwort auf onkolytische Virotherapie aufzuklären und wichtige Informationen zu liefern für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Vaccinia-Viren mit verbesserten Eigenschaften und verbesserter Replikationseffizienz und somit einem gesteigerten Therapieerfolg. KW - Vaccinia-Virus KW - Microarray KW - Melanom KW - onkolytische Virotherapie KW - Vaccinia Virus Replikation KW - vaccinia virus KW - microarray KW - malignant melanoma KW - oncolytic virotherapy KW - vaccinia virus replication KW - Onkolyse Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85392 ER -