TY - JOUR A1 - Agoston, Zsuzsa A1 - Li, Naixin A1 - Haslinger, Anja A1 - Wizenmann, Andrea A1 - Schulte, Dorothea T1 - Genetic and physical interaction of Meis2, Pax3 and Pax7 during dorsal midbrain development JF - BMC Developmental Biology N2 - Background: During early stages of brain development, secreted molecules, components of intracellular signaling pathways and transcriptional regulators act in positive and negative feed-back or feed-forward loops at the mid-hindbrain boundary. These genetic interactions are of central importance for the specification and subsequent development of the adjacent mid-and hindbrain. Much less, however, is known about the regulatory relationship and functional interaction of molecules that are expressed in the tectal anlage after tectal fate specification has taken place and tectal development has commenced. Results: Here, we provide experimental evidence for reciprocal regulation and subsequent cooperation of the paired-type transcription factors Pax3, Pax7 and the TALE-homeodomain protein Meis2 in the tectal anlage. Using in ovo electroporation of the mesencephalic vesicle of chick embryos we show that (i) Pax3 and Pax7 mutually regulate each other's expression in the mesencephalic vesicle, (ii) Meis2 acts downstream of Pax3/7 and requires balanced expression levels of both proteins, and (iii) Meis2 physically interacts with Pax3 and Pax7. These results extend our previous observation that Meis2 cooperates with Otx2 in tectal development to include Pax3 and Pax7 as Meis2 interacting proteins in the tectal anlage. Conclusion: The results described here suggest a model in which interdependent regulatory loops involving Pax3 and Pax7 in the dorsal mesencephalic vesicle modulate Meis2 expression. Physical interaction with Meis2 may then confer tectal specificity to a wide range of otherwise broadly expressed transcriptional regulators, including Otx2, Pax3 and Pax7. KW - dosage KW - quali-chick chimeras KW - drosophila embryo KW - neural crest KW - transcription activation KW - hindbrain boundary KW - isthmic oragnizer KW - sonic hedghog KW - expression KW - induction Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132626 VL - 12 IS - 10 ER - TY - THES A1 - Alcantarino Menescal, Luciana T1 - In vivo characterization of genetic factors involved in Xmrk driven melanoma formation in Medaka (Oryzias latipes): a closer look at braf, Stat5 and c-myc T1 - In vivo Charakterisierung genetischer Faktoren mit Einfluss auf Xmrk induzierte Melanome in Medaka (Oryzias latipes): Untersuchung von braf, Stat5 und c-myc. N2 - Melanoma arises from the malignant transformation of melanocytes and is one of the most aggressive forms of human cancer. In fish of the genus Xiphophorus, melanoma development, although very rarely, happens spontaneously in nature and can be induced by interspecific crossing. The oncogenic receptor tyrosine kinase, Xmrk, is responsible for melanoma formation in these fishes. Since Xiphophorus are live-bearing fishes and therefore not compatible with embryonic manipulation and transgenesis, the Xmrk melanoma model was brought to the medaka (Oryzias latipes) system. Xmrk expression under the control of the pigment cell specific mitf promoter leads to melanoma formation with 100% penetrance in medaka. Xmrk is an orthologue of the human epidermal growth factor receptor (EGFR) and activates several downstream signaling pathways. Examples of these pathways are the direct phosphorylation of BRAF and Stat5, as well as the enhanced transcription of C-myc. BRAF is a serine-threonine kinase which is found mutated at high frequencies in malignant melanomas. Stat5 is a transcription factor known to be constitutively activated in fish melanoma. C-myc is a transcription factor that is thought to regulate the expression of approximately 15% of all human genes and is involved in cancer progression of a large number of different tumors. To gain new in vivo information on candidate factors known to be involved in melanoma progression, I identified and analysed BRAF, Stat5 and C-myc in the laboratory fish model system medaka. BRAF protein motifs are highly conserved among vertebrates and the results of this work indicate that its function in the MAPK signaling is maintained in medaka. Transgenic medaka lines carrying a constitutive active version of BRAF (V614E) showed more pigmented skin when compared to wild type. Also, some transiently expressing BRAF V614E fishes showed a disrupted eye phenotype. In addition, I was able to identify two Stat5 copies in medaka, named Stat5ab/a and Stat5ab/b. Sequence analysis revealed a higher similarity between both Stat5 sequences when compared to either human Stat5a or Stat5b. This suggests that the two Stat5 copies in medaka arose by an independent duplication processes. I cloned these two Stat5 present in medaka, produced constitutive active and dominant negative gene versions and successfully established transgenic lines carrying each version under the control of the MITF promoter. These lines will help to elucidate questions that are still remaining in Stat5 biology and its function in melanoma progression, like the role of Stat5 phosphorylation on tumor invasiveness. In a third project during my PhD work, I analysed medaka C-myc function and indentified two copies of this gene in medaka, named c-myc17 and c-myc20, according to the chromosome where they are located. I produced conditional transgenic medaka lines carrying the c-myc17 gene coupled to the hormone binding domain of the estrogen receptor to enable specific transgene activation at a given time point. Comparable to human C-myc, medaka C-myc17 is able to induce proliferation and apoptosis in vivo after induction. Besides that, C-myc17 long-term activation led to liver hyperplasia. In summary, the medaka models generated in this work will be important to bring new in vivo information on genes involved in cancer development. Also, the generated transgenic lines can be easily crossed to the melanoma developing Xmrk medaka lines, thereby opening up the possibility to investigate their function in melanoma progression. Besides that, the generated medaka fishes make it possible to follow the whole development of melanocytes, since the embryos are transparent and can be used for high throughput chemical screens. N2 - Melanome entstehen durch die krankhafte Transformation von Melanozyten und sind eine der aggressivsten Krebsarten beim Menschen. In Fischen der Gattung Xiphophorus können, wenn auch sehr selten, spontan Melanome entstehen oder durch spezielle Artenkreuzungen induziert werden. Grundlage für das Entstehen der Melanome in diesen Fischen ist die Rezeptortyrosinkinase Xmrk. Da alle Xiphophorus-Arten lebendgebärend sind und keine Manipulationen an Embryonen vorgenommen werden können, wurde ein Xmrk Melanommodel für Medaka (Oryzias latipes) etabliert. Die Expression von Xmrk in Pigmentzellen dieser Fischart resultiert mit 100%iger Penetranz in Melanomen. Das Xmrk ist ein Ortholog des menschlichen „epidermal growth factor“ (EGFR) und aktiviert verschiedene nachgeschaltete Signalwege. Beispiele für diese Aktivierungen sind die Phosphorylierung von BRAF, Stat5 und die erhöhte Expression von c-myc. BRAF ist eine Serin-Threoninkinase, welche oft in malignen Melanomen mutiert ist. Stat5 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher dauerhaft in Fischtumoren aktiviert ist. C-myc ist ein Transkriptionsfaktor, welcher etwa 15% aller menschlichen Gene sowie die Entstehung vieler menschlicher Tumore reguliert. Um neue Einsichten in die Funktion der Kanidatengene im Prozess der Melanomentstehung in vivo zu erlangen, habe ich Orthologe von BRAF, Stat5 und C-myc bei Medaka identifiziert und analysiert. Die Domänen des BRAF Proteins sind hoch konserviert in allen Vertebraten. Weiterhin deuten die Ergebnisse meiner Arbeit auf eine Beibehaltung der Funktionen im MAPK Signalweg hin. Transgene Medakalinien, welche eine dauerhaft aktive Version des BRAF Gens (V614E) exprimieren, weisen einerseits eine stärkere Hautpigmentierung auf. Weiterhin treten in diesen Fischen Veränderungen der Augen auf. In einem weiteren Projekt meiner Arbeit gelang es mir, zwei Kopien des Stat5 Gens im Medaka zu identifizieren, Stat5ab/a und Stat5ab/b. Sequenzanalysen zeigten eine höhere Übereinstimmung zwischen den beiden Genkopien, als zwischen denen von Medaka und Menschen. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die beiden Medaka Gene durch eine unabhängige Duplikation entstanden. In meiner Arbeit habe ich beide Gene des Medakas kloniert und jeweils eine konstitutiv aktive und eine dominant negative Version der Gene hergestellt. Weiterhin konnte ich erfolgreich für jede Genversion eine transgene Medakalinie etablieren, welche die verschiedenen Genvarianten unter der Kontrolle des pigmentzellspezifischen Promoters des mitf Gens exprimieren. Diese Linien werden in Zukunft helfen, den Einfluss von Stat5 Signalen auf den Prozess der Melanomverbreitung und dessen Invasivität zu erklären. In einem dritten Projekt meiner Doktorarbeit untersuchte ich das Vorkommen und die Funktion der C-myc Gene des Medakas. Ich konnte zwei Genkopien identifizieren, c-myc17 und c-myc20, welche auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind. Ich konnte induzierbare, stabil transgene Linien herstellen, welche ein Fusionsprotein aus C-myc17 und der Hormonbindungsdomäne des Östrogenrezeptors von Maus exprimiert. Diese Linie ermöglichte eine induzierbare Aktivität des Transgens. Vergleichbar zum menschlichen MYC ist C-myc17 fähig, nach Aktivierung Proliferation und Apoptose in vivo auszulösen. Dauerhafte Aktivierung über einen längeren Zeitraum führt in diesen Linien zu Hyperplasie in Leber. Die verschiedenen Fischmodelle, die während dieser Arbeit generiert wurden, werden essentiell sein, um neue Einsichten in die Rolle diese Faktoren während der Krebsentwicklung in vivo zu erlangen. Weiterhin ermöglichen diese transgenen Linien durch einfaches Auskreuzen auf Xmrk Linien, deren Einfluss auf die Verbreitung von Melanomen zu untersuchen. Letztendlich sind mit diesen Linien auch Untersuchungen der Entwicklung von Pigmentzellen über Zeit möglich, da die Embryonen transparent sind und sich für chemisches Hochdurchsatz-Screening eignen. KW - Japankärpfling KW - Melanom KW - Myc KW - Molekulargenetik KW - melanoma KW - medaka KW - BRAF KW - Stat5 KW - c-myc KW - melanoma KW - medaka KW - BRAF KW - Stat5 KW - c-myc Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70762 ER - TY - JOUR A1 - Aso, Yoshinori A1 - Herb, Andrea A1 - Ogueta, Maite A1 - Siwanowicz, Igor A1 - Templier, Thomas A1 - Friedrich, Anja B. A1 - Ito, Kei A1 - Scholz, Henrike A1 - Tanimoto, Hiromu T1 - Three Dopamine Pathways Induce Aversive Odor Memories with Different Stability JF - PLoS Genetics N2 - Animals acquire predictive values of sensory stimuli through reinforcement. In the brain of Drosophila melanogaster, activation of two types of dopamine neurons in the PAM and PPL1 clusters has been shown to induce aversive odor memory. Here, we identified the third cell type and characterized aversive memories induced by these dopamine neurons. These three dopamine pathways all project to the mushroom body but terminate in the spatially segregated subdomains. To understand the functional difference of these dopamine pathways in electric shock reinforcement, we blocked each one of them during memory acquisition. We found that all three pathways partially contribute to electric shock memory. Notably, the memories mediated by these neurons differed in temporal stability. Furthermore, combinatorial activation of two of these pathways revealed significant interaction of individual memory components rather than their simple summation. These results cast light on a cellular mechanism by which a noxious event induces different dopamine signals to a single brain structure to synthesize an aversive memory. KW - dynamics KW - serotonin KW - expression KW - melanogaster KW - neurons form KW - olfactory memory KW - long-term-memory KW - drosophila mushroom body KW - sensitization KW - localization Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130631 VL - 8 IS - 7 ER - TY - JOUR A1 - Azzami, Klara A1 - Ritter, Wolfgang A1 - Tautz, Jürgen A1 - Beier, Hildburg T1 - Infection of honey bees with acute bee paralysis virus does not trigger humoral or cellular immune responses JF - Archives of Virology N2 - We have studied the responses of honey bees at different life stages (Apis mellifera) to controlled infection with acute bee paralysis virus and have identified the haemolymph of infected larvae and adult worker bees as the compartment where massive propagation of ABPV occurs. Insects respond with a broad spectrum of induced innate immune reactions to bacterial infections, whereas defence mechanisms based on RNA interference play a major role in antiviral immunity. In this study, we have determined that honey bee larvae and adult workers do not produce a humoral immune reaction upon artificial infection with ABPV, in contrast to control individuals challenged with Escherichia coli. ABPV-infected bees produced neither elevated levels of specific antimicrobial peptides (AMPs), such as hymenoptaecin and defensin, nor any general antimicrobial activity, as revealed by inhibition-zone assays. Additionally, adult bees did not generate melanised nodules upon ABPV infection, an important cellular immune function activated by bacteria and viruses in some insects. Challenge of bees with both ABPV and E. coli showed that innate humoral and cellular immune reactions are induced in mixed infections, albeit at a reduced level. KW - chemosensory protein KW - bee larva KW - adult bee KW - honey bee KW - larva KW - work bee KW - infected bee KW - immune response KW - young work bee KW - capsid protein KW - abdominal KW - tergite KW - haemolymph KW - sample KW - Imd pathway KW - worker bee larva KW - antimicrobial KW - peptide Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-126863 VL - 157 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Bartl, Jasmin T1 - Impairment of insulin signaling pathway in Alzheimer’s disease T1 - Beeinträchtigung des Insulinsignalweges bei Alzheimer Demenz N2 - The neurodegenerative disorder Alzheimer's disease (AD) is the cause of approximately 60% of the world's 35 million patients suffering from dementia. Current research focuses here are on association with other diseases such as diabetes type 2 (T2DM), possible genetic markers, specific signal transduction pathways within the brain and potential protein modification, because the pathogenesis and etiology of AD are still not fully understood. Specifically association of T2DM with AD came to the focus with the so-called "Rotterdam study" in 1999, indicating that T2DM doubles the risk of developing AD. In the meantime, it is known that the prevalence rate in patients with T2DM is 30%. Drugs commonly used in the treatment of T2DM such as peroxisome proliferator-activated receptors gamma (PPARγ) agonists show improvement of the cognitive abilities in patients with early stage of dementia, with potential therapeutically relevance. Therefore it is important not only to investigate a link between these diseases, but also to investigate the insulin signaling pathway in the brain of AD patients. In order to investigate this complex issue in more details and demonstrate additional links between T2DM and AD, the present study used several basic biological methods to clarify the question: "Is impaired insulin signaling pathway within the brain crucial for the development of AD?" from several points of view. The methods used in this work have been i) an analysis of single nucleotide (SNP) polymorphism of the insulin-degrading enzyme gene (IDE) in relation to risk of AD and / or of T2DM, ii) post-mortem histochemical studies of brain tissue of patients with only AD, with AD combined with T2DM and with only T2DM compared with an age-matched control group, and iii.) investigations of neurochemical pathways and gene/protein expression changes of a human cell culture as a consequences of amyloid β (Aβ) treatment. After analysis of the IDE SNP polymorphism in the selected VITA (Vienna Trans Danube Aging) cohort disease-specific effects were discovered. The upstream polymorphism (IDE2) was found to influence AD risk in a protective manner, while the downstream polymorphism (IDE7) modified the T2DM risk. Based on the SNP results, the presented study delineate the model that IDE promoter and 3‟ untranslated region/downstream variation can have different effects on IDE expression, maybe a relevant endophenotype with disorder-specific effects on AD and T2DM susceptibility. Furthermore, the human post-mortem studies could show that both AD as well as T2DM patients had a significantly lower density of the insulin receptor (IR) in the hippocampus, whereas a significantly increased density of inactive phosphorylated PPARγ has been found and this persisted even in patients with both diseases. Summarizing the histological study, it was possible to reveal common histological features of AD and T2DM, but no direct connection between the two diseases. Although AD is nowadays not only characterized by amyloid-containing plaque deposits and by the hyperphosphorylation of tau protein, the excessive Aβ42 presence in the brains of AD patients is still playing a key role. Up to date it is still not entirely clear which physical form of Aβ42 is responsible for the development of AD. The present work investigated, what impact has the state of aggregation of Aβ42 on genes and proteins of the insulin signaling pathway and the amyloid cascade. It could be shown that the oligomeric variant enhanced specifically the gene and protein expression of glycogen synthase kinase (GSK) 3β and also the enzyme activity was significantly increased, but has in turn strongly inhibited the IR gene and protein expression. Additionally, the effect of Aβ42 on monoamine oxidase B (MAO-B) was examined. An effect of both aggregated forms of Aβ42 had on enzyme activity was discovered. However, the fibrillar variants led to significantly increased activity of MAO-B while the oligomeric variants inhibited the enzyme activity. Several previous studies have demonstrated the involvement of increased MAO-B activity in AD, but the present work provides for the first time a direct link between the states of aggregation of Aβ42 to enzyme activity. Finally the results of the presented thesis can be summarized to following conclusion: Although AD and T2DM sharing some degrees of common features, still there is a lack of direct association, and therefore the diseases must be considered more independent rather than linked. But the impaired cerebral insulin signaling pathway seems to be another manifested hallmark of AD. N2 - Die neurodegenerative Erkrankung Alzheimer Demenz (AD) ist für etwa 60% der weltweit 35 Millionen Demenz Patienten ursächlich. Die aktuelle Forschung konzentriert sich hierbei auf Assoziationen mit anderen Erkrankungen wie Diabetes Typ 2 (T2DM), potentielle genetische Marker, spezifische Signaltransduktionswege im Gehirn und mögliche Modifizierung von Proteinen, da weder die Pathogenese noch die Ätiologie von AD vollständig geklärt ist. Im Jahr 1999 rückte durch die so genannte "Rotterdam-Studie" eine mögliche Verbindung zwischen T2DM und AD in den besonderen Fokus der Wissenschaft, da die Studie darauf hinweist, dass T2DM das Risiko eine AD zu entwickeln verdoppeln kann. In der Zwischenzeit ist bekannt, dass die Prävalenz an einer AD zu erkranken bei Patienten mit T2DM 30% beträgt. Zusätzlich zeigten Medikamente, die häufig zur Behandlung von T2DM eingesetzt werden, wie PPARγ Peroxisom-Proliferator-aktivierte Rezeptoren gamma) Agonisten, eine Verbesserung der kognitiven Leistung bei Patienten mit einem frühen Stadium der AD.Um dieses komplexe Thema in weiteren Details zu untersuchen und zusätzliche Verbindungen zwischen T2DM und AD aufzuzeigen,verwendet die vorliegende Studie mehrere biologische Grundlagenmethoden, um die Frage zu klären: "Ist ein beeinträchtigter zerebraler Insulin-Signalweg entscheidend für die Entwicklung einer AD?" Die in dieser Arbeit verwendete Methoden waren i) eine Analyse von Einzel-Nukleotid-Poly-morphismen (SNP) des Insulin-abbauende Enzym (IDE) Gens in Bezug auf das Risiko eine AD und/oder T2DM zu entwickeln; ii) post-mortem histochemische Untersuchungen des Gehirngewebes von Patienten mit nur AD, mit AD und T2DM, und mit nur T2DM verglichen mit einer altersangepassten Kontrollgruppe; und iii) Untersuchungen neurobiologischer Signalwege und Gen-/Protein-Expressions Veränderung einer humanen Neuroblastoma Zelllinie nach Behandlung mit Amyloid β (Aβ) Peptiden. Nach der Analyse der IDE-SNPs in der ausgewählten VITA (Vienna Transdanube Aging) Kohorte wurden krankheitsspezifische Effekte entdeckt. Der Upstream-Polymorphismus (IDE2) minderte das Risiko an einer AD zu erkranken, während der downstream gelegene Polymorphismus (IDE7) das Risiko T2DM zu bekommen, erhöhte. Basierend auf den SNP Ergebnissen, beschreibt die vorliegende Studie ein Modell,das Variationen innerhalb des IDE Promotors und/oder in untranslatierten Regionen unterschiedliche Auswirkungen auf die IDE Expression haben können und somit potentiell Auswirkungen auf die Entwicklung von AD und T2DM haben können. Darüber hinaus konnte die menschliche post-mortem Studie zeigen,dass sowohl AD als auch T2DM Patienten eine signifikant geringere Dichte der Insulin-Rezeptoren (IR) im Hippo-kampus hatten, während eine signifikant erhöhte Dichte von inaktiven phosphorylierten PPARγ bei allen Patientengruppen detektiert werden konnte. Die vorliegende post-mortem Studie konnte zwar gemeinsame histologische Merkmale von AD und T2DM aufzeigen, jedoch keine direkte Verbindung der beiden Erkrankungen nachweisen. Obwohl AD heutzutage nicht mehr nur noch durch die Amyloid-haltigen Plaqueablagerungen und durch die hyperphosphorylierten Tau Proteine gekennzeichnet ist, spielt das übermäßige Vorhandensein von Aβ42 in den Gehirnregionen von AD Patienten eine entscheidende Schlüsselrolle. Bis dato ist es immer noch nicht vollständig geklärt, welche physikalische Form von Aß42 verantwortlich für eine Entwicklung von AD ist. Die vorliegende Arbeit untersuchte, welche Auswirkungen die Aggregatszustände von Aß42 auf Gene und Proteine des Insulin-Signalweges und auf die Amyloid-Kaskade haben. Es konnte gezeigt werden, dass die oligomere Variante von Aß42 speziell die Gen- und Proteinexpression von Glykogen-Synthase Kinase (GSK) 3β als auch ihre Enzymaktivität deutlich erhöht hatte, jedoch im Gegenzug die IR Gen- und Proteinexpression stark gehemmt hatte. Zusätzlich wurde die Wirkung von Aß42 auf die Monoamin Oxidase-B (MAO-B) untersucht. Es wurde ein Effekt beider untersuchten aggregierten Formen von Aß42 auf die Enzymaktivität entdeckt. Jedoch führte hier die fibrilläre Variante zu einer deutlich erhöhten Aktivität von MAO-B, während die oligomere Variante die Enzymaktivität inhibiert. Frühere Studien konnten bereits eine Beteiligung von erhöhter MAO-B-Aktivität in AD nachweisen, aber die vorliegende Arbeit zeigt erstmals eine direkte Verbindung zwischen den Aggregatzuständen von Aß42 auf die Enzymaktivität auf. Abschließend können die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zu folgenden Schluss-folgerungen zusammengefasst werden: Obwohl AD und T2DM bis zu einem gewissen Grad gemeinsame Merkmale aufzeigen, fehlt es an einer direkten Verbindung, und somit sollten die Krankheiten weiterhin eher unabhängig als miteinander verbunden betrachtet werden. Jedoch scheint die Beeinträchtigung des zerebralen Insulin Signalweges ein weiteres gefestigtes Merkmal von AD zu sein. KW - Alzheimer-Krankheit KW - Amyloid KW - Insulinrezeptor KW - Diabetes mellitus KW - Neurobiologie KW - Insulinsignalweg KW - Alzheimer Dementia KW - type 2 diabetes mellitus KW - amyloid beta KW - insulin receptor KW - insulin pathway Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74197 ER - TY - JOUR A1 - Beisser, Daniela A1 - Grohme, Markus A. A1 - Kopka, Joachim A1 - Frohme, Marcus A1 - Schill, Ralph O. A1 - Hengherr, Steffen A1 - Dandekar, Thomas A1 - Klau, Gunnar W. A1 - Dittrich, Marcus A1 - Müller, Tobias T1 - Integrated pathway modules using time-course metabolic profiles and EST data from Milnesium tardigradum N2 - Background: Tardigrades are multicellular organisms, resistant to extreme environmental changes such as heat, drought, radiation and freezing. They outlast these conditions in an inactive form (tun) to escape damage to cellular structures and cell death. Tardigrades are apparently able to prevent or repair such damage and are therefore a crucial model organism for stress tolerance. Cultures of the tardigrade Milnesium tardigradum were dehydrated by removing the surrounding water to induce tun formation. During this process and the subsequent rehydration, metabolites were measured in a time series by GC-MS. Additionally expressed sequence tags are available, especially libraries generated from the active and inactive state. The aim of this integrated analysis is to trace changes in tardigrade metabolism and identify pathways responsible for their extreme resistance against physical stress. Results: In this study we propose a novel integrative approach for the analysis of metabolic networks to identify modules of joint shifts on the transcriptomic and metabolic levels. We derive a tardigrade-specific metabolic network represented as an undirected graph with 3,658 nodes (metabolites) and 4,378 edges (reactions). Time course metabolite profiles are used to score the network nodes showing a significant change over time. The edges are scored according to information on enzymes from the EST data. Using this combined information, we identify a key subnetwork (functional module) of concerted changes in metabolic pathways, specific for de- and rehydration. The module is enriched in reactions showing significant changes in metabolite levels and enzyme abundance during the transition. It resembles the cessation of a measurablemetabolism (e.g. glycolysis and amino acid anabolism) during the tun formation, the production of storage metabolites and bioprotectants, such as DNA stabilizers, and the generation of amino acids and cellular components from monosaccharides as carbon and energy source during rehydration. Conclusions: The functional module identifies relationships among changed metabolites (e.g. spermidine) and reactions and provides first insights into important altered metabolic pathways. With sparse and diverse data available, the presented integrated metabolite network approach is suitable to integrate all existing data and analyse it in a combined manner. KW - Milnesium tardigradum KW - Integrated network analysis KW - Functional modules KW - Metabolic profiles KW - Metabolic pathways KW - Trend test Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75241 ER - TY - THES A1 - Boyanova, Desislava Veselinova T1 - Systems biological analysis of the platelet proteome and applications of functional module search in proteome networks T1 - Systembiologische Analyse des Blutplättchenproteoms und funktionelle Modulsuche in Proteinnetzwerken N2 - Recent development of proteomic approaches and generation of large-scale proteomic datasets calls for new methods for biological interpretation of the obtained results. Systems biological approaches such as integrated network analysis and functional module search have become an essential part of proteomic investigation. Proteomics is especially applied in anucleate cells such as platelets. The underlying molecular mechanisms of platelet activation and their pharmacological modulation are of immense importance for clinical research. Advances in platelet proteomics have provided a large amount of proteomic data, which has not yet been comprehensively investigated in a systems biological perspective. To this end, I assembled platelet specific data from proteomic and transcriptomic studies by detailed manual curation and worked on the generation of a comprehensive human platelet repository for systems biological analysis of platelets in the functional context of integrated networks (PlateletWeb) (http:/PlateletWeb.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de). I also added platelet-specific experimentally validated phosphorylation data and generated kinase predictions for 80% of the newly identified platelet phosphosites. The combination of drug, disease and pathway information with phosphorylation and interaction data makes this database the first integrative platelet platform available for platelet research. PlateletWeb contains more than 5000 platelet proteins, which can also be analyzed and visualized in a network context, allowing identification of all major signaling modules involved in platelet activation and inhibition. Using the wealth of integrated data I performed a series of platelet-specific analyses regarding the platelet proteome, pathways, drug targets and novel platelet phosphorylation events involved in crucial signaling events. I analyzed the statistical enrichment of known pathways for platelet proteins and identified endocytosis as a highly represented pathway in platelets. Further results revealed that highly connected platelet proteins are more often targeted by drugs. Using integrated network analysis offered by PlateletWeb, I analyzed the crucial activation signaling pathway of adenosine diphosphate (ADP), visualizing how the signal flow from receptors to effectors is maintained. My work on integrin inside-out signaling was also based on the integrated network approach and examined new platelet-specific phosphorylation sites and their regulation using kinase predictions. I generated hypothesis on integrin signaling, by investigating the regulation of Ser269 phosphorylation site on the docking protein 1 (DOK1). This phosphorylation site may influence the inhibiting effect of DOK1 on integrin a2bb3. Extending the integrated network approach to further cell lines, I used the assembled human interactome information for the analysis of functional modules in cellular networks. The investigation was performed with a previously developed module detection algorithm, which finds maximum-scoring subgraphs in transcriptomic datasets by using assigned values to the network nodes. We extended the algorithm to qualitative proteomic datasets and enhanced the module search by adding functional information to the network edges to concentrate the solution onto modules with high functional similarity. I performed a series of analyses to validate its performance in small-sized (virus-infected gastric cells) and medium-sized networks (human lymphocytes). In both cases the algorithm extracted characteristic modules of sample proteins with high functional similarity. The functional module search is especially useful in site-specific phosphoproteomic datasets, where kinase regulation of the detected sites is often sparse or lacking. Therefore, I used the module detection algorithm in quantitative phosphoproteomic datasets. In a platelet phosphorylation dataset, I presented a pipeline for network analysis of detected phosphorylation sites. In a second approach, the functional module detecting algorithm was used on a phosphoproteome network of human embryonic stem cells, in which nodes represented the maximally changing phosphorylation sites in the experiment. Additional kinases from the human phosphoproteome in PlateletWeb were included to the network to investigate the regulation of the signal flow. Results indicated important phosphorylation sites and their upstream kinases and explained changes observed in embryonic stem cells during differentiation. This work presents novel approaches for integrated network analysis in cells and introduces for the first time a systematic biological investigation of the human platelet proteome based on the platelet-specific knowledge base PlateletWeb. The extended methods for optimized functional module detection offer an invaluable tool for exploring proteomic datasets and covering gaps in complex large-scale data analysis. By combining exact module detection approaches with functional information data between interacting proteins, characteristic functional modules with high functional resemblance can be extracted from complex datasets, thereby focusing on important changes in the observed networks. N2 - Jüngste Entwicklungen der Proteomik und die damit einhergehende Erzeugung großer Datensätze erfordern neue Methoden zur biologischen Interpretation der gewonnenen Ergebnisse. Systembiologische Ansätze wie die integrierte Netzwerkanalyse sowie die funktionelle Modulsuche sind zu einem wesentlichen Bestandteil bei der Untersuchung von Proteinen geworden. Die Proteomik wird vor allem in kernlosen Zellen wie den Blutplättchen angewandt. Die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen bei der Aktivierung von Thrombozyten und deren pharmakologische Modulation sind von immenser Bedeutung für die klinische Forschung. Aktuelle Studien in der Proteomforschung haben insbesondere bei Thrombozyten große Mengen an Daten erzeugt, die bisher noch nicht umfassend systembiologisch untersucht wurden. Zu diesem Zweck stellte ich manuell thrombozyten-spezifische Daten aus Proteom- und Transkriptomstudien zusammen und arbeitete an der Entwicklung einer umfassenden menschlichen Thrombozytendatenbank für die systembiologische Analyse der Funktion von Blutplättchen mittels integrierter Netzwerkanalyse (PlateletWeb) (http:/PlateletWeb.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de). Zusätzlich habe ich plättchen-spezifische, experimentell validierte Phosphorylierungsinformationen hinzugefügt und generierte Kinasenvorhersagen für 80% der neu identifizierten Phosphorylierungsstellen. Die Kombination aus Medikamenten, assoziierten Krankheiten und Signalweginformation zusammen mit Phosphorylierungs- und Interaktionsdaten macht diese Datenbank zu einer ersten und umfassenden Anlaufstelle für Thrombozytenforschung. PlateletWeb enthält mehr als 5000 Plättchenproteine, die in einem Netzwerk analysiert und dargestellt werden können. Dabei ist die Identifizierung aller wichtigen Signalmodule zur Plättchenaktivierung und -inhibierung möglich. Mit der Fülle an verfügbaren Daten führte ich eine Reihe thrombozyten-spezifischer Analysen am Plättchenproteom, an Signalwegen, pharmakologischen Wirkstoffzielen und Phosphorylierungsreaktionen in grundlegenden Signalprozessen durch. Ich analysierte die statistische Anreicherung bekannter Signalwege für Plättchenproteine und identifizierte Endozytose als einen sehr repräsentativen Signalweg in Thrombozyten. Weitere Ergebnisse zeigten, dass stark vernetzte Plättchenproteine häufiger Ziel von Medikamenten sind. Mittels der Netzwerkanalyse von PlateletWeb untersuchte ich den grundlegenden Signalaktivierungspfad von Adenosindiphosphat (ADP), und veranschaulichte den Signalfluss von Rezeptor zu Effektor. Meine Arbeit an der Integrin-Inside-Out-Signalisierung beinhaltete zudem die Untersuchung neuer thrombozyten-spezifischer Phosphorylierungsstellen und ihre Regulation durch Kinasenvorhersagen mit Hilfe des integrierten Netzwerkanalyseansatzes. Durch die Untersuchung der Regulation bei der Phosphorylierungsstelle Ser269 im Docking-Protein (DOK1) stellte ich eine neue Hypothese zur Integrinsignalisierung auf. Diese Phosphorylierungsstelle könnte den inhibitorischen Effekt von DOK1 auf integrin a2bb3 beeinflussen. Ich erweiterte den integrierten Netzwerkanalyseansatz für andere Zelllinien, indem ich die gesammelten Informationen aus dem menschlichen Interaktom für die Analyse von funktionellen Modulen in zellulären Netzen nutzte. Die Untersuchung wurde mit einem zuvor entwickelten Algorithmus zur Modulerkennung durchgeführt, der maximal bewertete Teilgraphen in Transkriptomdatensätzen anhand zugewiesener Werte für Netzwerkknoten findet. Wir erweiterten den Algorithmus zur Anwendung auf qualitative Proteomdatensätze und optimierten die Modulsuche durch Integration funktioneller Informationen in die Netzwerkkanten. Dies fokussierte die Optimierung auf Proteinmodule mit hoher funktioneller Ähnlichkeit. Ich führte eine Reihe von Analysen durch, um die Effizienz des Algorithmus in kleinen (durch Viren infizierte Magenzellen) und mittelgroßen Netzwerken (menschliche Lymphozyten) zu überprüfen. In beiden Fällen extrahierte der Algorithmus charakteristische Module der untersuchten Proteine mit hohen funktionellen Ähnlichkeiten. Die funktionelle Modulsuche ist besonders bei positionsspezifischen Phosphoproteomikdatensätzen nützlich, in denen die Kinasenregulation der detektierten Phosphorylierungsstellen nur spärlich oder gar nicht vorhanden ist. Daher habe ich den Algorithmus der Moduldetektion auf quantitative Phosphoproteomikdatensätze angewandt. Anhand eines Datensatzes bestehend aus phosphorylierten Plättchenproteinen habe ich eine Vorgehensweise zur Netzwerkanalyse von Phosphorylierungsstellen entwickelt. In einer zweiten Studie wurde der Algorithmus der Moduldetektion auf ein phosphoproteomisches Netzwerk menschlich embryonaler Stammzellen angewandt, in dem Phosphorylierungsstellen mit maximaler Veränderung durch Netzwerkknoten repräsentiert wurden. Um die Regulation des Signalflusses zu untersuchen wurden weitere Kinasen aus dem menschlichen Phosphoproteom beziehungsweise PlateletWeb integriert. Ergebnisse wiesen auf wichtige Phosphorylierungsstellen und ihre Upstream-Kinasen hin und verdeutlichten Vorgänge, die während der Differenzierung in den embryonalen Stammzellen stattgefunden haben. Diese Arbeit bietet neue Vorgehensweisen der integrierten Netzwerkanalyse in Zellen und präsentiert zum ersten Mal eine systembiologische Untersuchung des menschlichen Proteoms mit Hilfe der Trombozytendatenbank PlateletWeb. Die erweiterten Methoden zur verbesserten Erkennung funktioneller Module bieten ein wertvolles Werkzeug für die Erforschung proteomischer Datensätze und vervollständigen die komplexe und umfangreiche Datenanalyse. Charakteristische Module, die große Ähnlichkeit auf funktioneller Ebene aufweisen, können durch die Kombination von exakten Modulerkennungsansätzen mit funktionellen Daten extrahiert werden. Dabei werden wichtige Änderungen besonders bei der Analyse komplexer Netzwerke hervorgehoben. KW - Netzwerkanalyse KW - Thrombozyt KW - Proteomanalyse KW - Systembiologie KW - Funktionelle Modulsuche KW - Plättchenphosphoproteom KW - Netzwerkalgorithmen KW - Systems Biology KW - Integrated network analysis KW - Plättchennetzwerk KW - Proteome KW - Phosphoproteomic analysis KW - Functional module search KW - Functional interaction Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72165 ER - TY - THES A1 - Bruder, Jessica T1 - Antigenerkennung bei autoaggressiven Lymphozyten T1 - Antigen recognition of autoaggressive lymphocytes N2 - Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten. N2 - Millions of people worldwide suffer from various autoimmune diseases. These disorders occur if the immune system reacts to and destroys healthy body tissue. Pathogenesis is mediated by components of the innate immune system as well as by constituents of the adaptive immune system, like lymphocytes and antibodies. However, the origin and molecular mechanisms of these diseases remain still largely unknown. Therefore we investigated the role of autoaggressive lymphocytes in the human autoimmune diseases polymyositis and multiple sclerosis. Polymyositis is a chronically inflammatory disease of the skeletal muscles. Cytotoxic CD8+ gd-T lymphocytes invade, attack and finally destroy muscle fibers. However, in a rare variant of polymyositis, muscle fibers are similarly attacked by CD8- gd-T lymphocytes. These gd-T lymphocytes were monoclonally expanded and their receptor, termed M88, was identified as Vg1.3+Vd2+. Previous investigations of the antigen specificity of these cells revealed that M88 recognizes several structurally and functionally different proteins from various species. This recognition is specifically mediated by the antigen recognition sites of both receptor chains of M88. In this work we have identified different bacterial and human proteins of the translation apparatus as antigens of M88. Further detailed investigations of one paradigmatic bacterial antigen, the translation initiation factor EcIF1, have shown that M88 binds to surface-exposed conformational protein epitopes. Interestingly, M88 recognizes several human aminoacyl-tRNA-synthetases. These antigens have been described to be also targeted by autoantibodies in other forms of myositis. This observation reveals a remarkable link between T cell and antibody-mediated B cell responses in autoimmune myositis. In multiple sclerosis the central nervous system is affected. Autoaggressive lymphocytes attack and destroy the myelin sheet of nerve cells of the brain and spinal cord. In the cerebrospinal fluid of these patients clonally expanded and affinity-maturated B cells as well as „oligoclonal band“ (OCB) antibodies can be detected. Although these features indicate an antigen-induced immune response, the underlying antigens and the role of the OCB antibodies in the pathogenesis are still unknown. In this work we describe the antigen specificity of five IgG OCB antibodies from three patients. Through various biochemical methods we have identified intracellular candidate antigens. Interestingly, these include several nuclear proteins involved in transcription regulation and RNA processing. Reactivity against intracellular antigens also occurs in other autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus. These findings suggest a general mechanism for the generation and function of autoantibodies in these human autoimmune diseases. KW - Multiple Sklerose KW - gamma-delta T-Lymphozyten KW - Polymyositis KW - B-Lymphozyten KW - Antikörper KW - Multiple Sklerose KW - gamma-delta T-lymphocytes KW - polymyositis KW - B-lymphocytes KW - antibodies KW - Multiple Sclerosis KW - Polymyositis KW - Lymphozyt KW - Antikörper Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73342 ER - TY - THES A1 - Buckel, Lisa T1 - Evaluating the combination of oncolytic vaccinia virus and ionizing radiation in therapy of preclinical glioma models T1 - Evaluierung der Kombination von onkolytischem Vaccinia Virus und ionisierender Strahlung in vorklinischen Gliomamodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) verkörpert die aggressivste Form von bösartigen Gehirntumoren und seine Therapie gestaltet sich schwierig. Weitläufige Forschung hat dazu geführt, dass onkolytische Viren zur Verbesserung der Tumorbehandlung untersucht wurden. Gegenwärtig wird eine Vielzahl an verschiedenen onkolytischen Viren untersucht und einige wenige befinden sich bereits in klinischen Studien. Eines der Viren die untersucht werden, ist das Vaccinia-Virus. GLV-1h68, ein onkolytisches Vaccinia- Virus, wurde durch die Einfügung von drei Genkasseten, RUC-GFP Fusion, β- Galaktosidase und β- Glucuronidase in das Genom des LIVP Stammes hergestellt. Da fokale Bestrahlungstherapie aus der Behandlung von Krebs, nicht nur im Falle von Glioblastomen, nicht wegzudenken ist, ist es klinisch relevant, zu untersuchen, wie ein systemisch verabreichtes Vaccinia-Virus mit gezielter ionisierender Strahlung (IR) kombiniert werden könnte, um Therapiechancen zu verbesseren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, wie gezielte IR mit verschiedenen sytemisch injizierten Vaccinia-Virus Stämmen in einem Mausmodell für humane U-87-Glioma kombiniert wurde. Nachdem einleitende Versuche bestätigten, dass IR die virale Erbinformation nicht beschädigt und auch nicht den viralen Tropismus verändert, wurden Tierstudien durchgeführt, die die Interaktion des Vaccinia-Virus mit Bestrahlungtherapie in vivo untersuchten. Wir konnten zeigen, dass eine vorherige Bestrahlung des Tumors, bevor das GLV-1h68-Virus systemisch injiziert wurde, eine erhöhte viraler Replikation im Tumor zur Folge hatte, wie wir durch gesteigerte virale Titer und Markergenexpression belegen konnten. Von wesentlicher Bedeutung ist, dass eine Verabreichung von ausschliesslich GLV-1h68 einen minimalen Einfluss auf das U-87 Tumorwachstum hatte, während die durch die Bestrahlung ausgelöste erhöhte Vermehrung von Virus im Tumor eine Verzögerung des Tumorwachstums sowie ein verlängertes Überleben von Mäusen mit U-87-Xenografts zur Folge hatte. Die Fähigkeit von IR virale Vermehrung zu erhöhen, wurde auch für das weniger attenuierte LIVP 1.1.1-Virus gezeigt. Wenn die Bestrahlung in einem klinisch relevanten fraktionierten Bestrahlungsschema verabreicht wurde, war virale Replikation ebenfalls erhöht. Dies verdeutlicht, dass das Vaccinia-Virus klinisch entweder in eine Bestrahlung mit einer einzelnen Dosis oder in eine konventionelle fraktionierte Bestrahlung integriert werden kann. Die Fähigkeit von fokaler IR, eine selektive Vermehrung von systemisch injizierten onkolytischen Vaccinia-Viren zu ermöglichen, wurde in einem bilateralen Gliomamausmodell bestätigt. In Mausen mit Tumoren an beiden Hinterbeinen, vermehrte sich das systemisch gespritzte Vaccinia-Virus bevorzugt im bestrahlten Tumor. Wir konnten zeigen, wie die Tumorkontrolle darüber hinaus weiter verbessert werden kann, wenn fraktionierte fokale Bestrahlung mit einem Vaccinia-Virus kombiniert wird, das eine anti-angiogenetische Ladung, die den vaskulaeren endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) inhibiert, exprimiert. Unsere Studien konnten zeigen, dass durch die Bestrahlung von U-87 Gliomazellen eine Hochregulation von VEGF-Expression ausgelöst wurde, die Radioresistenz von Endothelzellen konzentrationsabhängig induzierte. Wir konnten zeigen, dass die durch VEGF verursache Radioresistenz umkehrbar ist, wenn zusätzlich aufgereinigtes GLAF-1, einen Vaccinia Virus exprimierten Antikörper, zu den Zellen gegeben wurde. In einem Mausmodell zeigte die Kombination aus fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164, ein Vaccinia-Virus, das ebenfalls einen VEGF Antikörper mit Ähnlichkeit zu GLAF-1 exprimiert, resultierte in der stärksten volumetrischen Tumorantwort. Es wurde ebenfalls eine drastische Abnahme an VEGF im Tumor bereits 3 Tagen nach Virus- Injektion nachgewiesen. Histologische Analyse bestätigte, dass die Blockade von VEGF eine Erniedrigung der Anzahl von Tumorblutgefäßen, zu 30% von Kontrolltumoren, zur Folge hatte. Dieser Wert war niedriger als in allen anderen Behandlungsgruppen. Unsere Versuche mit fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164 konnten zeigen, dass zusätzlich zu der durch Virus und Bestrahlung ausgelösten Tumorzellzerstörung, eine effiziente Degeneration der Tumorblutgefäße möglich war. Dies wurde durch eine erhöhte Virus-Vermehrung als Folge der Bestrahlung, sowie durch Sensitiveren der tumoralen Endothelzellen durch Blockierung von VEGF-A erreicht. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit zeigen, wie fokale Bestrahlungstherapie mit systemisch verabreichten onkolytische Vaccinia-Viren für aggressive, fortgeschrittene Tumore kombiniert werden kann. Es ist denkbar, dass die Tumortherapie weiter verbessert werden kann, wenn ein Vaccinia-Virus benutzt wird, das sich zusätzlich gegen VEGF richtet, so werden zu den Krebszellen zusätzlich Tumorblutgefäße in die Therapie miteinbezogen, um die Sensitivität von Endothelzellen gegen Bestrahlung weiter zu erhöhen. KW - Gliom KW - Vaccinia-Virus KW - Strahlentherapie KW - Kombinationstherapie KW - onkolytische Virotherapie KW - Glioma KW - vaccinia virus KW - ionizing radiation KW - combination therapy KW - oncolytic virotherapy Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85309 ER - TY - JOUR A1 - Buga, Ana-Maria A1 - Scholz, Claus Jürgen A1 - Kumar, Senthil A1 - Herndon, James G. A1 - Alexandru, Dragos A1 - Cojocaru, Gabriel Radu A1 - Dandekar, Thomas A1 - Popa-Wagner, Aurel T1 - Identification of New Therapeutic Targets by Genome-Wide Analysis of Gene Expression in the Ipsilateral Cortex of Aged Rats after Stroke JF - PLoS One N2 - Background: Because most human stroke victims are elderly, studies of experimental stroke in the aged rather than the young rat model may be optimal for identifying clinically relevant cellular responses, as well for pinpointing beneficial interventions. Methodology/Principal Findings: We employed the Affymetrix platform to analyze the whole-gene transcriptome following temporary ligation of the middle cerebral artery in aged and young rats. The correspondence, heat map, and dendrogram analyses independently suggest a differential, age-group-specific behaviour of major gene clusters after stroke. Overall, the pattern of gene expression strongly suggests that the response of the aged rat brain is qualitatively rather than quantitatively different from the young, i.e. the total number of regulated genes is comparable in the two age groups, but the aged rats had great difficulty in mounting a timely response to stroke. Our study indicates that four genes related to neuropathic syndrome, stress, anxiety disorders and depression (Acvr1c, Cort, Htr2b and Pnoc) may have impaired response to stroke in aged rats. New therapeutic options in aged rats may also include Calcrl, Cyp11b1, Prcp, Cebpa, Cfd, Gpnmb, Fcgr2b, Fcgr3a, Tnfrsf26, Adam 17 and Mmp14. An unexpected target is the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 1 in aged rats, a key enzyme in the cholesterol synthesis pathway. Post-stroke axonal growth was compromised in both age groups. Conclusion/Significance: We suggest that a multi-stage, multimodal treatment in aged animals may be more likely to produce positive results. Such a therapeutic approach should be focused on tissue restoration but should also address other aspects of patient post-stroke therapy such as neuropathic syndrome, stress, anxiety disorders, depression, neurotransmission and blood pressure. KW - gamma KW - corticotropin-releasing hormone KW - colony-stimulating factor KW - cerebral ischemia KW - receptor KW - brain KW - protein KW - inhibitor KW - mouse KW - differentiation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130657 VL - 7 IS - 12 ER -