TY  - THES
A1  - Thoma, Eva Christina
T1  - Directed differentiation of pluripotent stem cells induced by single genes
T1  - Gerichtete Differenzierung pluripotenter Stammzellen induziert durch einzelne Gene
N2  - Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine.
N2  - Pluripotenz bezeichnet die Fähigkeit einer Stammzelle, jede Zelle des Körpers zu bilden. Zu den pluripotenten Stammzellen gehören embryonale Stammzellen (ESZ), aber auch so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (IPS Zellen), die durch Rückprogrammierung ausdifferenzierter Körperzellen in einen pluripotenten Status gewonnen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass adulte Spermatogonien (SG) in Maus und Mensch pluripotent sind. Pluripotente Stammzellen sind von großer Wichtigkeit für Forschung und regenerative Medizin. Für letztere bieten diese Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, jede Körperzellen zu bilden, eine vielversprechende Möglichkeit, zerstörte Gewebe oder Organe zu ersetzen. In der Forschung stellen sie ein nützliches System dar, um Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse zu untersuchen, die in der physiologischen Situation z.B. der Embryonalentwicklung – schwer zugänglich sind. Eine wichtige Grundlage für diese Anwendungen sind jedoch Methoden, die die effiziente und gerichtete Differenzierung von Stammzellen in einen bestimmten Zelltyp erlauben. In dieser Arbeit wird zunächst das Differenzierungspotential von SG der Fischspezies Medaka (Oryzias latipes) untersucht, um festzustellen, ob Pluripotenz von SG, die bisher nur in Maus und Mensch gezeigt wurde, auch in anderen Wirbeltieren außerhalb der Säuger erhalten ist. Meine Ergebnisse zeigen, dass Medaka-SG fähig sind verschiedene somatische Zelltypen zu bilden. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer Differenzierungsmethode, die nur auf der Expression einzelner so genannter Masterregulatoren (MR) beruht – Gene, die als essentiell für die Entwicklung bestimmter Zelltypen bekannt sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass der Pigmentzell-spezifische Transkriptionsfaktor Mitf-M, von dem gezeigt wurde, dass er die Differenzierung von Medaka-ESZ in Pigmentzellen induzieren kann, die Bildung desselben Zelltyps in Medaka-SG induziert. Dieser Ansatz ermöglichte auch die Bildung anderer somatischer Zelltypen. So führte Überexpression der MR cbfa1 und mash1 in Medaka SG zur Differenzierung in Osteoblasten bzw. Neuronen. Interessanterweise wurde bei diesen Differenzierungsprozessen die Aktivierung von Genen beobachtet, die während der Embryonalentwicklung vor dem Differenzierung-auslösenden MR aktiviert werden. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse, dass der Ansatz einer gerichteten Differenzierung, ausgelöst durch einzelne MR, auch auf Säuger-Stammzellen übertragen werden kann. So wurde durch Überexpression des neuronalen Genes ngn2 in murinen ESZ die effiziente und schnelle Bildung von Nervenzellen induziert, wobei auch hier die Aktivierung von Genen beobachtet wurde, deren Expression in der Embryogenese der von ngn2 vorangeht. Die Herstellung einer transgenen Zelllinie, in der die Überexpression von ngn2 aktiviert werden kann, erlaubte die Entstehung einer fast reinen Kultur funktionaler Neuronen. Der durch ngn2 ausgelöste Differenzierungsprozess war unabhängig von zusätzlichen Faktoren und lief sogar unter Bedingungen ab, die normalerweise den pluripotenten Zustand unterstützen. Außerdem führte Überexpression von ngn2 auch in IPS Zellen zur Bildung von Zellen mit neuronalem Phenotyp. Weiterhin konnte auch durch Transduktion des Ngn2-Proteins in murine ESZ neuronale Differenzierung ausgelöst werden, und zwar die Bildung neuronaler Vorläuferzellen. Zuletzt wird bewiesen, dass gerichtete Differenzierung von murinen ESZ durch einzelne MR Gene neben neuronalen Zelltypen auch die Bildung anderer somatischer Zellen erlaubt: Überexpression der Gene myoD oder cebpa induzierte die Differenzierung in Muskelzellen bzw. Macrophagen-ähnliche Zellen. Unter Verwendung transgener Zelllinien, die die Aktivierung jeweils eines MRs erlauben, war es möglich, gemischte Kulturen zu erhalten, in denen zwei verschiedene Differenzierungsprozesse parallel abliefen. Diese Studie zeigt, dass die Überexpression einzelner Gene ausreichend ist, um gerichtete Differenzierungsprozesse in einen bestimmten Zelltyp auszulösen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ansatzes wird nicht nur mit verschiedenen Genen und somit verschiedenen resultierenden Zelltypen nachgewiesen, sondern auch in verschiedenen Stammzelltypen aus Fisch und Maus. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass bestimmte Gene in vitro das Schicksal von Stammzellen festlegen können und dass diese Fähigkeit eine konservierte Eigenschaft in Wirbeltieren zu sein scheint. Somit präsentiert diese Arbeit neuen Erkenntnisse über die Rolle von MR bei der Festlegung von Zellidentitäten und in Differenzierungsprozessen. Weiterhin wird eine neue Methode zur Induktion gerichteter Differenzierung in Stammzellen aufgezeigt, die mehrere Vorteile in Bezug auf Effizienz, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit hat. Auslösung von Differenzierung durch MR Gene bietet somit einen neuen vielversprechenden Ansatz mit potentieller Anwendung sowohl in Stammzellforschung, als auch in regenerativer Medizin.
KW  - Stammzelle
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Transkriptionsfaktor
KW  - Pluripotenz
KW  - Pluripotent stem cells
KW  - differentiation
KW  - transcription factors
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54706
ER  - 
TY  - THES
A1  - Subota, Ines
T1  - Switches in trypanosome differentiation: ALBA proteins acting on post-transcriptional mRNA control
T1  - Steuerungsmechanismen der Differenzierung in Trypanosomen: die Rolle von ALBA Proteinen in post-transkriptioneller mRNA Kontrolle
N2  - Trypanosoma brucei is a digenetic eukaryotic parasite that develops in different tissues of a mammalian host and a tsetse fly. It is responsible for sleeping sickness in sub-saharan Africa. The parasite cycle involves more than nine developmental stages that can be clearly distinguished by their general morphology, their metabolism and the relative positioning of their DNA-containing organelles. During their development, trypanosomes remain exclusively extracellular and encounter changing environments with different physico-chemical properties (nutritional availability, viscosity, temperature, etc.). It has been proposed that trypanosomes use their flagellum as a sensing organelle, in agreement with the established role of structurally-related cilia in metazoa and ciliates. Recognition of environmental triggers is presumed to be at the initiation of differentiation events, leading to the parasite stage that is the best suited to the new environment. These changes are achieved by the modification of gene expression programmes, mostly underlying post-transcriptional control of mRNA transcripts. We first demonstrate that the RNA-binding proteins ALBA3/4 are involved in specific differentiation processes during the parasite development in the fly. They are cytosolic and expressed throughout the parasite cycle with the exception of the stages found in the tsetse fly proventriculus, as shown by both immunofluorescence and live cell analysis upon endogenous tagging with YFP. Knock-down of both proteins in the developmental stage preceding these forms leads to striking modifications: cell elongation, cell cycle arrest and relocalization of the nucleus in a posterior position, all typical of processes acting in parasites found in the proventriculus region. When ALBA3 is over-expressed from an exogenous copy during infection, it interferes with the relocalization of the nucleus in proventricular parasites. This is not observed for ALBA4 over-expression that does not visibly impede differentiation. Both ALBA3/4 proteins react to starvation conditions by accumulating in cytoplasmic stress granules together with DHH1, a recognized RNA-binding protein. ALBA3/4 proteins also partially colocalize with granules formed by polyA+ RNA in these conditions. We propose that ALBA are involved in trypanosome differentiation processes where they control a subset of developmentally regulated transcripts. These processes involving ALBA3/4 are likely to result from the specific activation of sensing pathways. In the second part of the thesis, we identify novel flagellar proteins that could act in sensing mechanisms. Several protein candidates were selected from a proteomic analysis of intact flagella performed in the host laboratory. This work validates their flagellar localization with high success (85% of the proteins examined) and defines multiple different patterns of protein distribution in the flagellum. Two proteins are analyzed during development, one of them showing down-regulation in proventricular stages. The functional analysis of one novel flagellar membrane protein reveals its rapid dynamics within the flagellum but does not yield a visible phenotype in culture. This is coherent with sensory function that might not be needed in stable culture conditions, but could be required in natural conditions during development. In conclusion, this work adds new pieces to the puzzle of identifying molecular switches involved in developmental mRNA control and environmental sensing in trypanosome stages in the tsetse fly.
N2  - Trypanosoma brucei ist ein digenetischer, eukaryotischer Parasit, der zwischen Säugetier und Tsetsefliege alterniert, in welchen er unterschiedliche Gewebe besiedelt. Er ist die Ursache für die Schlafkrankheit in Afrika südlich der Sahara. Der Lebenszyklus der Trypanosomen besteht aus mehr als neun Parasitenstadien, die eindeutig anhand ihrer Morphologie, ihres Metabolismus und der Positionierung ihrer DNA Organellen unterschieden werden können. Trypanosomen bleiben ausschließlich extrazellulär und kommen im Laufe ihres Infektionszyklus mit sich verändernden Umwelteinflüssen in Berührung, z. B. Temperaturschwankungen, Variation in vorhandenen Energiequellen, erhöhte Viskosität usw. In Übereinstimmung mit der anerkannten sensorischen Funktion die Cilien in Vielzellern ausüben, wurde für diese Rolle das strukturverwandte Flagellum in Trypanosomen vorgeschlagen. Die Erkennung wechselnder Umweltparameter ist der vermutliche Auslöser für Differenzierungsprozesse, die ein Entwicklungsstadium hervorbringen, welches am besten an die neue Umgebung angepasst ist. Dies wird durch eine Modifizierung der Genexpression erreicht, die in Trypanosomen fast ausschließlich auf posttranskriptioneller Ebene erfolgt. Diese Arbeit zeigt, dass die RNA bindenden Proteine ALBA3 und ALBA4 an der Differenzierung von Trypanosomen in der Tsetsefliege beteiligt sind. Immunfluoreszenzanalyse und Lebendvideomikroskopie von Zellen, die eine an YFP gekoppelte Variante der Proteine enthalten, haben gezeigt, dass sich ALBA3/4 im Zytosol befinden und dass sie in jedem Parasitenstadium exprimiert sind, mit Ausnahme derer, die im Proventrikel der Tsetsefliege zu finden sind. Das Herunterregulieren der Proteine in vorangehenden Stadien, führt zu markanten Veränderungen, die mit denjenigen, die in Parasiten im Proventrikel zu finden sind, vergleichbar sind: z. B. Verlängerung der Zelle, Zellzyklusarrest und Lokalisierung des Zellkerns in eine posteriore Position. Im Gegenteil dazu findet die Umpositionierung des Zellkerns nicht statt, wenn ALBA3 während der Entwicklung des Parasiten in der Tsetsefliege überexprimiert wird. Ein vergleichbarer Effekt wird mit ALBA4 Überexpression nicht erreicht, welches die Entwicklung nicht negativ zu beeinflussen scheint. Wenn Trypanosomen Hungerstress ausgesetzt sind, reichern sich beide ALBA Proteine zusammen mit DHH1, einem anerkannten RNA bindenden Protein, in zytoplasmatischen Aggregaten an, die nur teilweise mit denjenigen kolokalisieren, die durch polyA+ RNA in diesen Bedingungen verursacht werden. Diese Arbeit zeigt, dass ALBA Proteine eine wichtige Rolle in der Entwicklung von Trypanosomen spielen und legt nahe, dass sie an der entwicklungsbedingten Kontrolle eines Teils der mRNA Expression beteiligt sind. Der zweite Teil dieser Arbeit handelt von der Identifizierung neuer flagellarer Proteine, die eine sensorische Funktion haben könnten. Hierfür wurden mehrere Proteinkandidaten aus einer durchgeführten Proteomanalyse intakter Flagellen gewählt. Die vorliegende Arbeit bestätigt die flagellare Lokalisierung der Proteine mit großem Erfolg (85% der untersuchten Proteine) und zeigt, dass sie unterschiedliche Verteilungsmuster vorweisen. Zwei der Proteine werden während der Infektion des Parasiten in der Tsetsefliege untersucht, was aufdeckt, dass eines davon in den Stadien im Proventrikel herunterreguliert ist. Die Funktionsstudie eines neu identifizierten flagellaren Membranproteins weist seine schnelle Dynamik im Flagellum auf, führt jedoch zu keinem sichtbaren Phänotyp in Laborbedingungen. Diese Beobachtung passt zu der Annahme, dass Proteine mit sensorischer Funktion in stabilen Laborverhältnissen nicht essentiell sind aber eine wichtige Rolle während der Entwicklung des Parasiten in natürlichen Bedingungen spielen. Zusammenfassend fügt diese Arbeit Teile zum Puzzle der Identifizierung molekularer Schalter, die in Trypanosomenstadien in der Tsetsefliege an der mRNA Kontrolle und der Erkennung der Umwelt beteiligt sind.
KW  - Trypanosoma brucei
KW  - Parasit
KW  - Entwicklung
KW  - Tsetsefliege
KW  - Trypanosomen
KW  - parasitärer Entwicklungszyklus
KW  - Differenzierung
KW  - Tsetse Fliege
KW  - ALBA Proteine
KW  - Kontrolle der Genexpression
KW  - trypanosomes
KW  - parasite cycle
KW  - differentiation
KW  - tsetse fly
KW  - ALBA proteins
KW  - gene expression control
KW  - flagellar sensing proteins
KW  - FLAMM
KW  - Genexpression
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85707
N1  - Durchführung der Experimente am Institut Pasteur, Arbeitsgruppe Trypanosome Cell Biology Unit, Paris, Frankreich
ER  -