TY - THES A1 - Zdzieblo, Daniela T1 - Das Polycomb group Protein PCGF6 ist ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung und kann in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen T1 - The Polycomb group protein PCGF6 is a new and essential factor for iPS reprogramming that can replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc N2 - Embryonale Stammzellen (ESCs) sind durch zwei charakteristische Eigenschaften definiert. Neben einer kontinuierlichen Selbsterneuerungskapazität weisen ESCs die Fähigkeit auf, in alle Zelltypen der drei Keimblätter differenzieren zu können. Diese Eigenschaften werden unter anderem durch ein Netzwerk wichtiger Pluripotenzfaktoren als auch durch epigenetische Mechanismen reguliert, welche die Transkription von Pluripotenz- und Differenzierungsgenen kontrollieren. In murinen ESCs sind an der Repression von Differenzierungsgenen auch Polycomb group (PcG) Proteine beteiligt. Diese Proteine bauen zwei Chromatin-modifizierende Komplexe auf, die als Polycomb repressive complex 1 bzw. 2 (PRC1 bzw. PRC2) bezeichnet werden. Nach dem klassischen Modell der Polycombfunktion, katalysieren PRC1 und PRC2 gemeinsam zwei charakteristische Histonmodifikationen, die zur Repression PRC-spezifischer Zielgene beitragen. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegen, dass der Proteinaufbau der PRC1 Komplexe stark variieren kann, wobei die Familie der Polycomb group RING finger (Pcgf) Proteine eine wichtige Rolle spielt. In diesem Zusammenhang definieren einzelne Pcgf Paraloge (Pcgf1 – 6) verschiedene PRC1 Varianten (PRC1.1 – 1.6), die Komplex-spezifische Bindestellen im Genom aufweisen. Diese Erkenntnisse lassen auf unterschiedliche Mechanismen der PRC1 Varianten und Pcgf Paralog-spezifische Funktionen schließen, die zum jetzigen Zeitpunkt nur wenig erforscht sind. Für manche Pcgf Paraloge sind wichtige Rollen in verschiedenen Stammzelltypen und während der iPS Reprogrammierung bekannt. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) und Pcgf4 (Bmi1) zeigen eine Funktion in verschiedenen adulten Stammzellen. Pcgf4 spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle in der murinen iPS Reprogrammierung. Für Pcgf6 (Mblr) wird eine Pluripotenz-assoziierte Funktion angenommen, denn Pcgf6 ist das einzige Pcgf Paralog, das eine erhöhte Expression in murinen ESCs aufweist, die jedoch im Verlauf der ESC-Differenzierung absinkt. Außerdem zeigen murine Pcgf6 KD ESCs eine verminderte Expression der Pluripotenzgene Oct4, Sox2 und Nanog, eine De-Repression mesodermaler und Testes-spezifischer Gene als auch eine erhöhte Tendenz zur hämatopoetischen Differenzierung. Wie genau Pcgf6 an der Regulation dieser Prozesse in murinen ESCs beteiligt ist, ist nicht bekannt. In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Funktion von Pcgf6 in der murinen iPS Reprogrammierung untersucht. Da bereits für Pcgf4 eine Rolle in der Reprogrammierung somatischer Zellen gezeigt wurde und Pcgf6 eine erhöhte Expression in ESCs aufweist, wurde auch für Pcgf6 eine Funktion in der iPS Reprogrammierung angenommen. Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pcgf6 während der iPS Reprogrammierung verstärkt exprimiert wird und in iPS Zellen eine ESC-ähnliche Expression aufweist. Darüber hinaus konnte Pcgf6 in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 in der iPS Reprogrammierung ersetzen. Zudem wurden für OPKM-induzierte iPS Zellen charakteristische Eigenschaften pluripotenter Zellen nachgewiesen. Außerdem konnte eine Rolle von Pcgf6 als Enhancer-Faktor für die iPS Reprogrammierung ausgeschlossen werden, da die Überexpression von Pcgf6 zusammen mit den OSKM Faktoren keine additiven Effekte auf die Reprogrammierungseffizienz erzielte. Im Gegensatz dazu führte der Knockdown (KD) von Pcgf6 in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) zu verminderten Effizienzen nach OSKM Reprogrammierung. Darüber hinaus handelte es sich bei der Mehrheit der AP+ Kolonien, die unter Pcgf6 KD Konditionen entstanden, um partiell-reprogrammierte iPS Zellen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit, dass Pcgf6 ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung ist, der in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen kann. N2 - Embryonic stem cells (ESCs) are characterized by their ability for continuous self-renewal maintaining the undifferentiated cell state and their capacity to generate all differentiated cell types of the three germ layers. Regulators of these characteristics include a protein interaction network of pluripotency-specific factors and epigenetic mechanisms that together control the transcription of pluripotency- and differentiation-associated genes. Among the interaction partners of the pluripotency-specific protein network in murine ESCs are Polycomb group (PcG) proteins. These proteins assemble in two complexes termed Polycomb group repressive complex 1 and 2 (PRC1 and PRC2). In the classical model, PRC1 and PRC2 act hierarchically together in catalyzing two characteristic histone modifications thereby contributing to the repression of PRC-specific target genes like differentiation-associated genes in ESCs. Recently, it has been shown that there are numerous PRC1 variants that differ in their protein composition. In this context, the family of Polycomb group RING finger (Pcgf) proteins (Pcgf1 – 6) defines distinct PRC1 variants (PRC1.1 – 1.6) that exhibit complex-specific genomic binding sites. Together, this indicates diverse mechanisms of PRC1 variants and Pcgf Paralog-specific functions that are not well understood. Pcgf Paralogs are known to play essential roles in various stem cell types and during iPS reprogramming. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) and Pcgf4 (Bmi1) function in diverse adult stem cells. Further, Pcgf4 plays a role in murine iPS Reprogramming. For Pcgf6 (Mblr), a pluripotency-associated function is assumed. Pcgf6 is the only Pcgf paralog with an elevated expression in murine ESCs and when ESCs differentiate Pcgf6 expression decreases. In addition, following Pcgf6 KD in ESCs the expression of Oct4, Sox2 and Nanog declines while mesodermal and testes-specific genes become de-repressed. Furthermore, Pcgf6 KD ESCs are more prone for hematopoietic lineage differentiation. The precise mechanisms by which Pcgf6 controls these processes in murine ESCs are not known. In this work, I investigated the function of Pcgf6 in murine iPS reprogramming. I assumed a role for Pcgf6 in iPS reprogramming because it is highly expressed in ESCs and it was recently shown that Pcgf4 plays a role in the reprogramming of somatic cells. The data of my work show that Pcgf6 expression is increased in iPS reprogramming and that Pcgf6 exhibits an ESC-like gene expression pattern in iPS cells. Furthermore, Pcgf6 was able to replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. In addition, OPKM-induced iPS cells showed pluripotency-specific characteristics. The overexpression of Pcgf6 together with the OSKM factors did not result in significantly increased reprogramming efficiencies indicating that Pcgf6 does not function as an enhancer-factor. However, Pcgf6 knockdown (KD) in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) resulted in decreased efficiencies after iPS reprogramming. Additionally, the majority of AP+ colonies formed after OSKM reprogramming of Pcgf6 KD MEFs represented partially reprogrammed iPS cells, as they did not exhibit ESC-like morphologies and reduced expression levels of Oct4, Sox2 and Nanog. Together, the data of my work show that Pcgf6 is a new and essential factor in iPS reprogramming that can specifically replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. KW - Stammzelle KW - iPS Reprogrammierung KW - Differenzierung KW - Repression KW - Reprogramming Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106870 ER - TY - THES A1 - Wang, Huiqiang T1 - Enhanced Replication of Vaccinia Virus GLV-1h68 in Cancer Stem-like Cells of Human Breast Cancer Cell Preparations T1 - Verbesserte Replikation desVerbesserte Replikation des Vaccinia Virus GLV-1h68 in Präparation von Tumorstammzell-ähnlichen Zellen N2 - There is more and more evidence for the cancer stem cell hypothesis which believes that cancers are driven by a cellular subcomponent that has stem cell properties which is self-renewal, tumorigenicity and multilineage differentiation capacity. Cancer stem cells have been connected to the initiation of tumors and are even found to be responsible for relapses after apparently curative therapies have been undertaken. This hypothesis changes our conceptual approach of oncogenesis and shall have implications in breast cancer prevention, detection and treatment, especially in metastatic breast cancer for which no curative treatment exists. Given the specific stem cell features, novel therapeutic pathways can be targeted. Since the value of vaccinia virus as a vaccination virus against smallpox was discovered by E. Jenner at 18th century, it plays an important role in human medicine and molecular biology. After smallpox was successfully eradicated, vaccinia virus is mainly used as a viral vector in molecular biology and increasingly in cancer therapy. The outstanding capability to specifically target and destroy cancer cells makes it a perfect agent for oncolytic virotherapy. Furthermore, the virus can easily be modified by inserting genes which encode therapeutic or diagnostic proteins to be expressed when a tumor is infected. The emphasis in this study was the establishment of methods for the enrichment of human breast cancer stem-like cells from cancer cell lines and characterization of those cancer stem-like cells in vitro and in vivo. Furthermore, by using the Genelux Corporation vaccinia virus strain GLV-1h68, the isolated cancer stem-like cells can be targeted not only in vitro but also in vivo more efficiently. Side-population (SP) cells within cancers and cell lines are rare cell populations known to be enriched cancer stem-like cells. In this study, we used Hoechst 33342 staining and flow cytometry to identify SP cells from the human breast cancer cell lines MCF-7 and GI-101A as models for cancer stem-like cells. Considering the cytotoxicity of Hoechst dye and the restriction of instrument, we did not carry out further studies by this method. Utilizing in vitro and in vivo experimental systems, we showed that human breast cancer cell line GI-101A with aldehyde dehydrogenase activity (ALDH) have stemlike properties. Higher ALDH activity identifies the tumorigenic cell fraction which is capable of self-renewal and of generating tumors that could recapitulate the heterogeneity of the parental tumor. Furthermore, the cells with higher ALDH activity display significant resistance to chemotherapy and ionizing radiation, which proves their stem-like properties again. The cells which have higher ALDH activity also are more invasive compared to cells which have lower ALDH activity, which connects the cancer stem-like cells with cancer metastases. By analyzing the popular human breast cancer stem cells surface markers CD44, CD49f and CD24, it was discovered that the cells with higher ALDH activity have stronger CD44 and CD49f expression than in those cells with lower ALDH activity, which further confirms their stem-like properties. Finally, the cells with higher ALDH activity and lower ALDH activity were infected in vitro and used in virotherapy in a mouse xenograft model was performed. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 can replicate in cells with higher ALDH activity more efficiently than cells with lower ALDH activity. GLV-1h68 also can selectively target and eradicate the xenograft tumors which were derived from cells with higher ALDH activity. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a key developmental program that is often activated during cancer invasion and metastases. EMT was induced in immortalized human mammary epithelial cells (HMLEs) and in GI-101A cells, which results in the acquisition of mesenchymal traits and in the expression of stem cell markers. Furthermore, the EMT-induced GI-101A cells showed resistance to chemotherapy and invasion capacity. CD44+/CD24- cells were enriched during the EMT induction. Following flow cytometry sorting by using CD44, CD24 and ESA surface marker, the sorted cells were tested in a mouse model regarding tumorigenicity. Unexpectedly, we found that CD44+/CD24+/ESA+ cells could initiate tumors more efficiently rather than CD44+/CD24-/ESA+ and other fractions in EMTinduced GI-101A cells. We also infected the CD44+/CD24+/ESA+ and CD44+/CD24- /ESA+ cells in vitro and performed virotherapy in a mouse xenograft model. The results indicated that the vaccinia virus GLV-1h68 is able to replicate in CD44+/CD24+/ESA+ cells more efficiently than in CD44+/CD24-/ESA+ cells. GLV-1h68 was also capable to selectively target and eradicate the xenograft tumors which derived from CD44+/CD24+/ESA+ cells. Moreover, CD44- cells have much lower tumorigenicity in the mouse model and CD44- cells derived-tumors are not responsive to vaccinia virotherapy. In summary, we have successfully established an in vitro and in vivo system for the identification, characterization and isolation of cancer stem-like cells from the human breast cancer cell line GI-101A by using the ALDEFLUOR assay. The vaccinia virus GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the higher ALDH activity cells and tumors derived from those cells. Although contrary to the current assumption, CD44+/CD24+/ESA+ cells in the EMT-induced GI-101A cell line showed stem-like properties and GLV-1h68 was able to efficiently target and eradicate the CD44+/CD24+/ESA+ cells and tumors which derived from those cells. Finally, improved understanding of cancer stem cells may have tremendous relevance for how cancer should be treated. It is menacing that cancer stem cells are resistant to almost all anti-tumor approaches which have already been established for the treatment of metastatic diseases such as ionizing radiation, hormonal therapy, chemotherapy, and small molecular inhibitors. Therefore, it is promising that our results suggest that these cancer stem cells may be susceptible to treatment with oncolytic vaccinia virus. N2 - Immer mehr experimentelle Hinweise stützen die Krebsstammzell-Hypothese, wonach Krebs durch eine zelluläre Teilkomponente angetrieben wird, die Stammzell- Eigenschaften hat, das heißt die Fähigkeit sich selbst zu erneuern, Tumorigenität und die Fähigkeit sich in verschiedene Richtungen zu differenzieren. Krebsstammzellen wurden mit der Enstehung von Tumorerkrankungen in Verbindung gebracht, und werden sogar für Rückfälle verantwortlich gemacht, nachdem scheinbar erfogreiche Behandlungen durchgeführt wurden. Diese Hypothese verändert unser Verständnis der Onkogenese und wird Auswirkungen auf die Brustkrebs-Prävention, -Erkennung und -Behandlung haben, vor allem in metastasierendem Brustkrebs, für den es keine kurative Behandlung gibt. Angesichts der besonderen Merkmale von Stammzellen können neue therapeutische Wege angestrebt werden. Seit sein Nutzen als Impfvirus gegen die Pocken von E. Jenner im 18. Jahrhundert entdeckt wurde, spielt das Vaccinia-Virus in der Humanmedizin und Molekularbiologie eine wichtige Rolle. Nachdem die Pocken erfolgreich ausgerottet wurden, wird das Vaccinia-Virus hauptsächlich als viraler Vektor in der Molekularbiologie und in zunehmendem Maße in der Krebstherapie verwendet. Die außerordentliche Fähigkeit, Krebszellen gezielt zu zerstören, macht es zu einem perfekten Wirkstoff für die onkolytische Virotherapie. Des Weiteren kann das Virus durch das Inserieren von Genen modifiziert werden, die für therapeutische oder diagnostische Proteine kodieren und im infizierten Tumor exprimiert werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Etablierung von Methoden für die Anreicherung menschlicher Stammzell-ähnlicher Brustkrebszellen von Krebszelllinien und die Charakterisierung dieser Krebsstammzell-ähnlichen Zellen in vitro und in vivo. Darüber hinaus können mit Hilfe des Vaccinia-Virus-Stammes GLV- 1h68 von Genelux Corporation die isolierten Krebsstammzell-ähnlichen Zellen nicht nur in vitro, sondern auch in vivo effizienter eliminiert werden. Side-Population- (SP-) Zellen in Krebserkrankungen und Zelllinien sind seltene Zellpopulationen die dafür bekannt sind, reich an Krebsstammzell-ähnlichen Zellen zu sein. In dieser Studie verwendeten wir eine Hoechst 33342-Färbung und Durchflusszytometrie, um SP-Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie MCF- 7 zu identifizieren, als Modell für Krebsstammzell-ähnliche Zellen. In Anbetracht der Zytotoxizität des Hoechst-Farbstoffes und der Beschränkung des Instruments, wurde diese Methode nicht weiter verfolgt. Mit Hilfe von Experimenten in vitro und in vivo wurde gezeigt, dass die menschliche Brustkrebs-Zelllinie GI-101A mit Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität (ALDH) Stammzell-ähnliche Eigenschaften hat. Höhere ALDH-Aktivität identifiziert die tumorigene Zellfraktion, die zur Selbsterneuerung und zur Erzeugung von Tumoren fähig ist, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors deutlich macht. Darüber hinaus weisen Zellen mit hoher ALDH-Aktivität eine beachtliche Fähigkeit zur Resistenz gegen Chemotherapie und ionisierende Strahlung auf, was wiederum ihre Stammzell-ähnlichen Eigenschaften beweist. Ferner sind Zellen mit hoher ALDHAktivität im Vergleich zu Zellen mit niedriger ALDH-Aktivität stärker invasiv, was die Krebsstammzell-ähnlichen Zellen mit Krebsmetastasierung in Verbindung bringt. Bei der Analyse der gängigen Oberflächenmarker CD44, CD24 und CD49f in menschlichen Brustkrebs-Stammzellen beobachteten wir, dass Zellen mit hoher ALDH-Aktivität CD44 und CD49f stärker exprimieren als Zellen mit niedriger ALDHAktivität, was wiederum deren Stammzell-ähnliche Eigenschaften aufzeigt. Schließlich wurden die Zellen mit hoher und niedriger ALDH-Aktivität in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in Zellen mit höherer ALDH-Aktivität effizienter replizieren kann als in Zellen mit niedrigerer ALDH-Aktivität. GLV-1h68 kann auch selektiv Xenograft-Tumore finden und zerstören, welche von Zellen mit hoher ALDHAktivität abstammten. Der epithelial-mesenchymale Übergang (EMT) ist ein essentieller Entwicklungs- Schritt, der häufig während der Invasion und Metastasierung in Krebserkrankungen aktiviert wird. Wir induzierten EMT in immortalisierten humanen Brust-Epithelzellen (HMLEs) und GI-101A-Zellen, was im Erwerb von mesenchymalen Eigenschaften und der Expression von Stammzell-Markern resultiert. Außerdem zeigten die EMTinduzierten GI-101A-Zellen Chemoresistenz und Fähigkeit zur Invasion. CD44+CD24--Zellen waren während der EMT-Induktion angereichert. Es wurden durchflusszytometrische Sortierung mit Hilfe von CD44-, CD24- und ESAOberflächenmarkern durchgeführt, und die sortierten Zellen wurden danach auf Tumorigenität in einem Mausmodell getestet. Unerwarteterweise fanden wir, dass CD44+CD24-ESA+-Zellen effizienter Tumore initiieren konnten als CD44+CD24- ESA+-Zellen und andere Fraktionen in EMT-induzierten GI-101A-Zellen. Wir haben auch die infizierten CD44+CD24+ESA+- und CD44+CD24-ESA+-Zellen in vitro infiziert und Virotherapie im Maus-Xenograft-Modell durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vaccinia-Virus GLV-1h68 in CD44+CD24+ESA+-Zellen effizienter replizieren kann als CD44+CD24-ESA+-Zellen. GLV-1h68 konnte selektiv Xenograft- Tumore finden und eliminieren, die von CD44+CD24+ESA+-Zellen abstammten. Darüber hinaus haben CD44--Zellen eine sehr niedrige Tumorigenität im Mausmodell und Tumore, die von CD44--Zellen abstammen, sprechen nicht auf Vaccinia-Virotherapie an. Zusammenfassend haben wir erfolgreich ein System zur Identifizierung, Charakterisierung und Isolierung von Krebsstammzell-ähnlichen Zellen aus der menschlichen Brustkrebs-Zelllinie GI-101A in vitro und in vivo mit Hilfe des ALDEFLUOR-Assays etabliert. Das Vaccinia-Virus GLV-1h68 konnte zielgenau Zellen mit erhöhter ALDH-Aktivität oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Obwohl, im Gegensatz zur gängigen Annahme, CD44+CD24+ESA+-Zellen in der EMT-induzierten GI-101A-Zelllinie Stammzell-ähnliche Eigenschaften zeigten, konnte GLV-1h68 zielgenau CD44+CD24+ESA+-Zellen oder daraus etablierte Tumore finden und zerstören. Schließlich kann ein verbessertes Verständnis der Krebsstammzellen eine enorme Bedeutung dafür haben, wie Krebs behandelt werden sollte. Es ist verhängnisvoll, dass Krebsstammzellen gegen fast alle Anti-Tumor-Ansätze, die bereits für die Behandlung von Metastasen etabliert wurden, resistent sind, wie ionisierende Strahlung, Hormontherapie, Chemotherapie und kleine molekulare Inhibitoren. Gerade deshalb ist es vielversprechend, dass unsere Ergebnisse darauf hin deuten, dass diese Krebsstammzellen auf Behandlung mit dem onkolytischen Vaccinia-Virus ansprechen. KW - Vaccinia Virus KW - Brustkrebs KW - Stammzelle KW - cancer stem cells KW - vaccinia virus KW - human breast cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64750 ER - TY - THES A1 - Tulke, Moritz T1 - Grundlegende Arbeiten zum bio-artifiziellen renalen Tubulus aus ko-kultivierten adipozytären mesenchymalen Stammzellen und Endothelzellen auf einer synthetischen Kapillarmembran T1 - Fundamental work on a bio-artificial renal tubule consisting of co-cultivated adipose-derived mesenchymal stem cells and endothelial cells on a synthetic capillary membrane N2 - Mit fortschreitender chronischer Niereninsuffizienz kommt es zur Akkumulation von Urämietoxinen und im Endstadium unbehandelt zum Tod im sogenannten Urämischen Syndrom. Die Blutreinigung erfolgt bei der am häufigsten verwendeten Form der Nierenersatztherapie, der Hämodialyse, nur unzureichend. Die Folge ist eine erhöhte Morbidität und Mortalität der betroffenen Patienten. Bei der Hämodialyse werden nur Urämietoxine bis zu einer Größe von 20 kDa über die im Dialysator eingesetzten Hohlfaserdialysemembranen diffusiv und konvektiv semiselektiv nach Größenausschluss entfernt. Proteingebundene Urämietoxine, deren effektive Größe durch die Bindung an Transportproteine wie beispielsweise Albumin die Trennschärfe der Dialysemembranen übersteigt, werden retiniert. In-vivo werden proteingebundene Urämietoxine im proximalen Tubulus, einem Teil des tubulären Systems des Nephrons, sekretorisch eliminiert. Im Rahmen der vorliegenden Promotionsarbeit wurden die ersten Entwicklungsschritte auf dem Weg zu einem sogenannten bio-artifiziellen Tubulus evaluiert. Der angedachte biohybride Filter sollte aus einer Ko-Kultur funktionaler humaner proximaler Tubuluszellen und humaner Endothelzellen (HUVEC) auf synthetischen Hohlfasermembranen bestehen und könnte während der Hämodialyse als zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden, um unter anderem proteingebundene Urämietoxine effektiv durch aktiven Transport aus dem Blut der Patienten zu entfernen. Die Differenzierung der proximalen Tubuluszellen erfolgte dabei aus adulten adipozytären mesenchymalen Stammzellen (ASC), deren Herkunft eine spätere autologe Behandlung ermöglicht. Die Ko-Kultur mit Endothelzellen wurde zur potentiellen Steigerung der Sekretion proteingebundener Urämietoxine verwendet. In der vorliegenden Arbeit konnten ASCs durch eine Kombination der löslichen Differenzierungsfaktoren All-Trans-Retinoinsäure (ATRA), Aktivin A und BMP-7 erfolgreich in Zytokeratin 18-exprimierende Zellen differenziert werden, wodurch die erwünschte epitheliale Differenzierung bestätigt wurde. Die Expression funktionaler Proteine, wie das für den Wassertransport relevante Aquaporin 1 oder auch der Na+-/K+-ATPase, konnte in dieser Arbeit bereits vor der Differenzierung nachgewiesen werden. Im nächsten Schritt wurde erfolgreich gezeigt, dass eine simultane, qualitativ hochwertige Ko-Kultur von ASCs und HUVECs auf der mit dem extrazellulären Matrixprotein Fibronektin modifizierten Innen- bzw. Außenseite von synthetischen Hohlfasermembranen aus Polypropylen bzw. Polyethersulfon möglich ist. Die Viabilität beider Zelltypen wurde dabei durch die Verwendung eines für die Ko-Kultur entwickelten Nährmediums erreicht, in welchem die Proliferation von ASCs bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung ihrer Stammzelleigenschaften deutlich erhöht war. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse stellen eine aussichtsreiche Basis für einen bio-artifiziellen renalen Tubulus dar. Weitere Entwicklungsschritte, wie die Differenzierung der ASCs zu proximalen Tubuluszellen im 3D-Bioreaktor einschließlich ihrer funktionalen Charakterisierung anhand Tubulusepithel-spezifischer Transporter, sind erforderlich, be-vor erste funktionale Experimente vor dem „Upscaling“ auf klinisch verwendbare Module möglich sind. N2 - Progressing chronic kidney disease results in the accumulation of uremic toxins and, if left untreated in end-stage kidney disease, death due to the developing uremic syndrome. The most common renal replacement therapy is hemodialysis. It is a life-prolonging therapy but only delivering inadequate blood purification, which is associated with excess morbidity and mortality of the patients. In hemodialysis, only uremic toxins with a molecular size of up to 20 kDa are removed by diffusion or convection. Solutes are eliminated by semi-selective size exclusion across a hollow fiber dialysis membrane in a dialyzer. Binding of certain uremic toxins to carrier proteins, such as albumin, results in an increased effective size, which excludes them from passing through dialysis membranes. In the native kidney, these protein-bound uremic toxins are eliminated from blood by secretory transport in the proximal tubule, a specific part of the tubular filtration apparatus of the nephron. The present doctoral thesis evaluated the first steps towards a so-called bio-artificial tubule. The intended biohybrid filter was supposed to consist of a co-culture of functional human proximal tubule cells and human endothelial cells on synthetic hollow fiber membranes. In its final form, it would be implemented during hemodialysis as an additional purification step to more efficiently remove protein-bound uremic toxins from the patients’ blood by active transport. The proximal tubule cells were differentiated from adipose-derived mesenchymal stem cells, which facilitates a later autologous treatment. The co-culture with endothelial cells should further promote the expression of transporters for organic anions and, thereby, potentially increase the secretion of protein-bound uremic toxins. In the present study, the differentiation from ASCs to a CK18-expression lineage, which confirmed successful epithelial differentiation, was induced by a combination of the soluble differentiation factors all-trans-retinoic acid, activin A and BMP-7. The expression of functional proteins, i.e., of aquaporin 1, which is relevant for water transport, and Na+-/K+-ATPase, was shown already before differentiation. Additionally, the present work demon-strated a high-quality co-culture of ASCs and HUVECs on the inner- and outer membrane surfaces of synthetic polypropylene- or polyethersulfone-based hollow fiber membranes, which initially were surface-modified with the extracellular matrix protein fibronectin. The viability of both cell types was thereby ensured by the application of a specific co-culture medium, which further increased the proliferation of ASCs intensely while maintaining their stem-cell character. The results of the present approach represent a promising basis for a bio-artificial renal tubule. The further development requires the differentiation of ASCs into proximal tubule cells on the 3D-bioreactor membrane and their characterization by verifying tubulusepithel-specific transporters. Finally, subsequent functional experiments have to precede an upscaling to clinically applicable modules. KW - Hohlfaserreaktor KW - Stammzelle KW - Endothelzelle KW - Adipozytäre mesenchymale Stammzelle KW - Bio-artifizieller Tubulus KW - Ko-Kultur Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216896 ER - TY - THES A1 - Thoma, Eva Christina T1 - Directed differentiation of pluripotent stem cells induced by single genes T1 - Gerichtete Differenzierung pluripotenter Stammzellen induziert durch einzelne Gene N2 - Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine. N2 - Pluripotenz bezeichnet die Fähigkeit einer Stammzelle, jede Zelle des Körpers zu bilden. Zu den pluripotenten Stammzellen gehören embryonale Stammzellen (ESZ), aber auch so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (IPS Zellen), die durch Rückprogrammierung ausdifferenzierter Körperzellen in einen pluripotenten Status gewonnen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass adulte Spermatogonien (SG) in Maus und Mensch pluripotent sind. Pluripotente Stammzellen sind von großer Wichtigkeit für Forschung und regenerative Medizin. Für letztere bieten diese Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, jede Körperzellen zu bilden, eine vielversprechende Möglichkeit, zerstörte Gewebe oder Organe zu ersetzen. In der Forschung stellen sie ein nützliches System dar, um Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse zu untersuchen, die in der physiologischen Situation z.B. der Embryonalentwicklung – schwer zugänglich sind. Eine wichtige Grundlage für diese Anwendungen sind jedoch Methoden, die die effiziente und gerichtete Differenzierung von Stammzellen in einen bestimmten Zelltyp erlauben. In dieser Arbeit wird zunächst das Differenzierungspotential von SG der Fischspezies Medaka (Oryzias latipes) untersucht, um festzustellen, ob Pluripotenz von SG, die bisher nur in Maus und Mensch gezeigt wurde, auch in anderen Wirbeltieren außerhalb der Säuger erhalten ist. Meine Ergebnisse zeigen, dass Medaka-SG fähig sind verschiedene somatische Zelltypen zu bilden. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer Differenzierungsmethode, die nur auf der Expression einzelner so genannter Masterregulatoren (MR) beruht – Gene, die als essentiell für die Entwicklung bestimmter Zelltypen bekannt sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass der Pigmentzell-spezifische Transkriptionsfaktor Mitf-M, von dem gezeigt wurde, dass er die Differenzierung von Medaka-ESZ in Pigmentzellen induzieren kann, die Bildung desselben Zelltyps in Medaka-SG induziert. Dieser Ansatz ermöglichte auch die Bildung anderer somatischer Zelltypen. So führte Überexpression der MR cbfa1 und mash1 in Medaka SG zur Differenzierung in Osteoblasten bzw. Neuronen. Interessanterweise wurde bei diesen Differenzierungsprozessen die Aktivierung von Genen beobachtet, die während der Embryonalentwicklung vor dem Differenzierung-auslösenden MR aktiviert werden. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse, dass der Ansatz einer gerichteten Differenzierung, ausgelöst durch einzelne MR, auch auf Säuger-Stammzellen übertragen werden kann. So wurde durch Überexpression des neuronalen Genes ngn2 in murinen ESZ die effiziente und schnelle Bildung von Nervenzellen induziert, wobei auch hier die Aktivierung von Genen beobachtet wurde, deren Expression in der Embryogenese der von ngn2 vorangeht. Die Herstellung einer transgenen Zelllinie, in der die Überexpression von ngn2 aktiviert werden kann, erlaubte die Entstehung einer fast reinen Kultur funktionaler Neuronen. Der durch ngn2 ausgelöste Differenzierungsprozess war unabhängig von zusätzlichen Faktoren und lief sogar unter Bedingungen ab, die normalerweise den pluripotenten Zustand unterstützen. Außerdem führte Überexpression von ngn2 auch in IPS Zellen zur Bildung von Zellen mit neuronalem Phenotyp. Weiterhin konnte auch durch Transduktion des Ngn2-Proteins in murine ESZ neuronale Differenzierung ausgelöst werden, und zwar die Bildung neuronaler Vorläuferzellen. Zuletzt wird bewiesen, dass gerichtete Differenzierung von murinen ESZ durch einzelne MR Gene neben neuronalen Zelltypen auch die Bildung anderer somatischer Zellen erlaubt: Überexpression der Gene myoD oder cebpa induzierte die Differenzierung in Muskelzellen bzw. Macrophagen-ähnliche Zellen. Unter Verwendung transgener Zelllinien, die die Aktivierung jeweils eines MRs erlauben, war es möglich, gemischte Kulturen zu erhalten, in denen zwei verschiedene Differenzierungsprozesse parallel abliefen. Diese Studie zeigt, dass die Überexpression einzelner Gene ausreichend ist, um gerichtete Differenzierungsprozesse in einen bestimmten Zelltyp auszulösen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ansatzes wird nicht nur mit verschiedenen Genen und somit verschiedenen resultierenden Zelltypen nachgewiesen, sondern auch in verschiedenen Stammzelltypen aus Fisch und Maus. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass bestimmte Gene in vitro das Schicksal von Stammzellen festlegen können und dass diese Fähigkeit eine konservierte Eigenschaft in Wirbeltieren zu sein scheint. Somit präsentiert diese Arbeit neuen Erkenntnisse über die Rolle von MR bei der Festlegung von Zellidentitäten und in Differenzierungsprozessen. Weiterhin wird eine neue Methode zur Induktion gerichteter Differenzierung in Stammzellen aufgezeigt, die mehrere Vorteile in Bezug auf Effizienz, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit hat. Auslösung von Differenzierung durch MR Gene bietet somit einen neuen vielversprechenden Ansatz mit potentieller Anwendung sowohl in Stammzellforschung, als auch in regenerativer Medizin. KW - Stammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Pluripotenz KW - Pluripotent stem cells KW - differentiation KW - transcription factors Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54706 ER - TY - THES A1 - Ramos Tirado, Mario T1 - Stammzellbasierte Behandlungsstrategien zur Stimmlippenaugmentation und laryngealen Defektrekonstruktion T1 - Stem cell-based treatment strategies for laryngoplasty and reconstruction of laryngeal defects N2 - Der Kehlkopf ist ein stimmerzeugendes knorpelhaltiges Organ und spielt eine wichtige Rolle in der Atemfunktion und beim aspirationsfreien Schluckakt. Funktionsstörungen des Kehlkopfs wie Stimmbandlähmungen werden durch Schädigungen des Kehlkopfnervs nach operativen Eingriffen und Halsverletzungen hervorgerufen. Des Weiteren führen durch Traumen, Teil- und komplette Resektionen verursachte Substanzdefekte des Kehlkopfs zu Funktionsverlusten. Die hierfür notwendigen und komplexen Rekonstruktionen werden durch das schlechte Regenerationspotential von Knorpelgewebe eingeschränkt und können nur bedingt durch synthetische Ersatzmaterialen oder körpereigenes Ersatzgewebe bewerkstelligt werden. Ist es möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares Knorpelersatzgewebe herzustellen, welches zur dauerhaften Wiederherstellung der Kehlkopffunktionen eingesetzt werden kann? Die zusätzliche Markierung von Stammzellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln (VSOP) als Zellmarker bietet die Möglichkeit der Detektion und der Verfolgung der Zellen mittels nicht-invasiver Nachweismethoden nach deren Implantation. Ist die Verwendung dieser Nanopartikel ohne negative Folgen für die Stammzellen möglich und sind diese für den Einsatz in der Laryngologie geeignet? Fettgewebsstammzellen (ASC) wurden aus humanem Liposuktionsmaterial und Kaninchen-Nackenfett isoliert und expandiert. Die Zellen wurden in Hydrogelkombinationen aus Kollagen Typ-I, Agarose, Fibrin und Hyaluronsäure eingebettet und mit den chondrogenen Wachstumsfaktoren TGF-β3, BMP-6 und IGF-I über 14 Tage differenziert. Anschließend wurden diese Zell-Hydrogelkonstrukte bezüglich Morphologie, extrazellulärer Matrixanreicherung und knorpelspezifischer Genexpression histologisch, immunhistochemisch und molekularbiologisch analysiert. In einem weiteren Schritt wurden die Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in natives Knorpelgewebe sowie die Defektdeckung in einem in vitro- und einem in vivo-Knorpeldefektmodell mit vor- und nicht-vordifferenzierten Zell-Hydrogelkonstrukten untersucht. Die Analyse möglicher zyto- und genotoxischer Effekte von VSOP sowie des Einflusses der Markierung von ASC mit VSOP auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential erfolgte nach der Markierung der Zellen mit unterschiedlichen VSOP-Konzentrationen. Außerdem wurden VSOP-markierte ASC in Kaninchenstimmlippen injiziert und die Nachweisbarkeit dieser Zellen im Injektionsareal histologisch und mittels Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht. Nach 14-tägiger chondrogener Differenzierung wurde in den Zell-Hydrogelkonstrukten eine knorpelähnliche Morphologie, die Anreicherung knorpelspezifischer Matrixproteine und die Expression chondrogener Markergene nachgewiesen. Die Kombination der chondrogenen Wachstumsfaktoren zeigte keinen verstärkenden Einfluss auf die Chondrogenese von ASC. Hydrogele aus Kollagen Typ I und Hyaluronsäure wiesen die stärkste extrazelluläre Matrixanreicherung auf. Bei den agarosefreien Hydrogelen war eine ausgeprägte Gelschrumpfung auffällig. In den beiden Knorpeldefektmodellen konnte weder eine Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in den Nativknorpel noch eine vollständige Defektdeckung nachgewiesen werden. Nach der Markierung von ASC mit VSOP zeigte sich bei der höchsten Konzentration von 1,5 mM eine genotoxische Wirkung. Zytotoxische Effekte sowie Einflüsse der Markierung auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential von ASC waren nicht nachweisbar. VSOP-markierte ASC konnten nach deren Injektion in Kaninchenstimmlippen im Injektionsareal nur vereinzelt mittels MRT und histologisch nachgewiesen werden. Es ist möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares knorpelähnliches Gewebe herzustellen. Dabei begünstigen agarosefreie Trägermaterialien die chondrogene Differenzierung von ASC. Diese könnte durch die jeweilige Erhöhung der Zelldichte und Wachstumsfaktorkonzentrationen sowie die Verlängerung der Induktionszeit verstärkt werden. Eine mögliche klinische Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe in der Laryngologie ist jedoch durch deren Schrumpfung wie auch mangelnde Integration und Defektdeckung noch weit entfernt. Aufgrund ihrer genotoxischen Wirkung kann eine Verwendung von VSOP als Zellmarker auch unterhalb von 1,5 mM ohne negative Folgen für den Organismus nicht sicher ausgeschlossen werden. Der inhomogene Gewebekontrast im Kehlkopf, die schlechte Auflösung im MRT und die geringe Größe von VSOP erschweren die Nachweisbarkeit und Verfolgung markierter Zellen mittels MRT. Daher sind andere nicht-invasive Nachweismethoden für die Verwendung von VSOP im Kehlkopf zu evaluieren. Der möglichen Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe und VSOP in der rekonstruktiven Laryngologie muss eine erfolgreiche Optimierung und ausführliche positive Validierung in klinischen Tests vorausgehen. N2 - The larynx is a voice-producing and cartilage-containing organ that plays an important role in the respiratory function and aspiration-free swallowing. Dysfunctions of the larynx, such as vocal cord paralysis, are caused by damage to the laryngeal nerve after surgery and neck injuries. Furthermore, tissue defects caused by trauma and partial or complete resection of the larynx lead to loss of functions. The required and complex reconstructions are limited by the poor regeneration potential of cartilage, and can only be partially accomplished by synthetic graft materials or autologous replacement tissue. Is it possible to generate implantable cartilage replacement tissues that can be used for permanent restoration of laryngeal functions out of autologous stem cells and biocompatible scaffolds by the means of tissue engineering? The supplementary labeling of stem cells with very small superparamagnetic iron oxide nanoparticles (VSOP) as cell markers offers the possibility to identify and trace the cells after their implantation using non-invasive detection methods. Can VSOP be used without negative consequences for the stem cells, and are these nanoparticles suitable for application in laryngology? Adipose tissue-derived stem cells (ASC) were isolated from human liposuction material and rabbit nuchal fat. After expansion, the cells were embedded in hydrogel combinations of collagen type I, agarose, fibrin and hyaluronic acid and then differentiated with the chondrogenic growth factors TGF-β3, BMP-6, and IGF-I for 14 days. Subsequently, these cell-seeded hydrogel constructs were analyzed histologically, immunohistochemically and molecular biologically regarding morphology, extracellular matrix accumulation and cartilage-specific gene expression. In a further step, the integration of pre- and non predifferentiated cell-seeded hydrogel constructs into native cartilage tissue and defect coverage were examined in cartilage defect models in vitro and in vivo. The analysis of potential cytotoxic and genotoxic effects of VSOP, as well as the influence of the nanoparticles on proliferation, migration, and multilineage potential of ASC, was performed after labeling the cells with different VSOP concentrations. In addition, VSOP-labeled ASC were injected into rabbit vocal folds and the detectability of these cells in the injection area was examined histologically and by magnetic resonance imaging (MRI). A cartilage-like morphology, the accumulation of cartilage-specific matrix proteins and the expression of chondrogenic marker genes, was observed in the cell-seeded hydrogel constructs after 14 days of chondrogenic differentiation. The combination of the chondrogenic growth factors had no reinforcing effect on the chondrogenesis of ASC. Hydrogels of collagen type I and hyaluronic acid showed the strongest extracellular matrix accumulation. A pronounced shrinkage was observed with agarose-free hydrogels. In the cartilage defect models neither an integration of the cell-seeded hydrogel constructs into the native cartilage nor a complete defect coverage were detected. The labeling of ASC with the highest VSOP concentration of 1.5 mM induced genotoxic effects. Cytotoxic effects and influences of labeling with VSOP on proliferation, migration and multilineage potential of ASC could not be observed. After their injection into rabbit vocal folds VSOP-labeled ASC were only sporadically detected histologically and by MRI in the injection area. It is possible to generate implantable cartilage-like tissues out of autologous stem cells and biocompatible scaffolds by the means of tissue engineering. Here, agarose-free scaffolds promote the chondrogenic differentiation of ASC. This may be enhanced by increasing the cell density and growth factor concentrations as well as extending the induction time. Because of their shrinkage and the lack of integration and defect coverage, a possible clinical application of these cartilage-like tissues in laryngology is still far away. Due to the genotoxic effects of 1.5 mM VSOP, the use of these nanoparticles as cell markers without negative consequences for the organism cannot be ruled out with certainty at lower concentrations. The inhomogeneous tissue contrast in the larynx, a poor resolution in MRI and the small size of VSOP make labeled cells difficult to detect and trace in the larynx by MRI. Therefore, other non-invasive detection methods for the use of VSOP in the larynx have to be evaluated. The potential application of these cartilage-like tissues and VSOP in reconstructive laryngology must be preceded by successful optimization and extensive positive validation in clinical trials. KW - Tissue Engineering KW - Hydrogele KW - Hydrogel KW - Fettgewebsstammzellen KW - Eisenoxidnanopartikel KW - Stammzelle KW - Kehlkopf Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117528 ER - TY - THES A1 - Mekala, SubbaRao T1 - Generation of cardiomyocytes from vessel wall-resident stem cells T1 - Erzeugung von Kardiomyozyten aus Gefäßwand-residenten Stammzellen N2 - Myocardial infarction (MI) is a major cause of health problems and is among the leading deadly ending diseases. Accordingly, regenerating functional myocardial tissue and/or cardiac repair by stem cells is one of the most desired aims worldwide. Indeed, the human heart serves as an ideal target for regenerative intervention, because the capacity of the adult myocardium to restore itself after injury or infarct is limited. Thus, identifying new sources of tissue resident adult stem or progenitor cells with cardiovascular potential would help to establish more sophisticated therapies in order to either prevent cardiac failure or to achieve a functional repair. Ongoing research worldwide in this field is focusing on a) induced pluripotent stem (iPS) cells, b) embryonic stem (ES) cells and c) adult stem cells (e. g. mesenchymal stem cells) as well as cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, thus far, these efforts did not result in therapeutic strategies that were transferable into the clinical management of MI and heart failure. Hence, identifying endogenous and more cardiac-related sources of stem cells capable of differentiating into mature cardiomyocytes would open promising new therapeutic opportunities. The working hypothesis of this thesis is that the vascular wall serves as a niche for cardiogenic stem cells. In recent years, various groups have identified different types of progenitors or mesenchymal stem cell-like cells in the adventitia and sub-endothelial zone of the adult vessel wall, the so called vessel wall-resident stem cells (VW-SCs). Considering the fact that heart muscle tissue contains blood vessels in very high density, the physiological relevance of VW-SCs for the myocardium can as yet only be assumed. The aim of the present work is to study whether a subset of VW-SCs might have the capacity to differentiate into cardiomyocyte-like cells. This assumption was challenged using adult mouse aorta-derived cells cultivated in different media and treated with selected factors. The presented results reveal the generation of spontaneously beating cardiomyocyte-like cells using specific media conditions without any genetic manipulation. The cells reproducibly started beating at culture days 8-10. Further analyses revealed that in contrast to several publications reporting the Sca-1+ cells as cardiac progenitors the Sca-1- fraction of aortic wall-derived VW-SCs reproducibly delivered beating cells in culture. Similar to mature cardiomyocytes the beating cells developed sarcomeric structures indicated by the typical cross striated staining pattern upon immunofluorescence analysis detecting α-sarcomeric actinin (α-SRA) and electron microscopic analysis. These analyses also showed the formation of sarcoplasmic reticulum which serves as calcium store. Correspondingly, the aortic wall-derived beating cardiomyocyte-like cells (Ao-bCMs) exhibited calcium oscillations. This differentiation seems to be dependent on an inflammatory microenvironment since depletion of VW-SC-derived macrophages by treatment with clodronate liposomes in vitro stopped the generation of Ao bCMs. These locally generated F4/80+ macrophages exhibit high levels of VEGF (vascular endothelial growth factor). To a great majority, VW-SCs were found to be positive for VEGFR-2 and blocking this receptor also stopped the generation VW-SC-derived beating cells in vitro. Furthermore, the treatment of aortic wall-derived cells with the ß-receptor agonist isoproterenol or the antagonist propranolol resulted in a significant increase or decrease of beating frequency. Finally, fluorescently labeled aortic wall-derived cells were implanted into the developing chick embryo heart field where they became positive for α-SRA two days after implantation. The current data strongly suggest that VW-SCs resident in the vascular adventitia deliver both progenitors for an inflammatory microenvironment and beating cells. The present study identifies that the Sca-1- rather than Sca-1+ fraction of mouse aortic wall-derived cells harbors VW-SCs differentiating into cardiomyocyte-like cells and reveals an essential role of VW-SCs-derived inflammatory macrophages and VEGF-signaling in this process. Furthermore, this study demonstrates the cardiogenic capacity of aortic VW-SCs in vivo using a chimeric chick embryonic model. N2 - Der Myokardinfarkt (MI) ist einer der Hauptgründe für gesundheitliche Probleme und zählt zu einer der am häufigsten tödlich verlaufenden Krankheiten weltweit. Daher ist es nicht verwunderlich, dass die Regeneration von funktionellem Myokardgewebe und/oder die kardiale Reparatur durch Stammzellen eines der weltweit am meisten angestrebten Ziele darstellt. Das adulte menschliche Herz stellt aufgrund seiner äußerst eingeschränkten endogenen Regenerationskapazität, die bei weitem nicht ausreicht, das geschädigte Gewebe zu erneuern, ein ideales Zielorgan für regenerative Therapieverfahren dar. Folglich könnte die Identifizierung neuer Quellen adulter Stamm- oder Vorläuferzellen mit kardiovaskulärem Differenzierungspotential dabei helfen, verfeinerte Therapien zu entwickeln, um entweder kardiale Fehlfunktionen zu verhindern oder eine deutlich verbesserte myokardiale Reparatur zu erreichen. Die aktuelle weltweite Forschung auf diesem Gebiet fokussiert sich auf: a) induzierte pluripotente Stammzellen (iPS), b) embryonale Stammzellen (ES) und c) adulte Stammzellen, wie z. B. mesenchymale Stammzellen, kardiale Fibroblasten und Mesangioblasten sowie Myofibroblasten. Bisher haben jedoch alle Bemühungen noch zu keinem Durchbruch geführt, so dass die teilweise vielversprechenden experimentellen Ergebnisse nicht in die klinische Therapie des MI und der kardialen Defekte mittels Stammzellen transferiert werden können. Abgesehen davon, ob und wie stark so ein endogenes herzeigenes Potential wäre, würde die Identifizierung neuer endogener Stammzellen mit kardiogenem Potential, die genaue Charakterisierung ihrer Nischen und der Mechanismen ihrer Differenzierung einen Meilenstein in der kardioregenerativen Stammzelltherapie darstellen. Die Arbeitshypothese der hier vorgelegten Dissertation besagt, dass die Gefäßwand als Nische solcher Zellen dienen könnte. Innerhalb der letzten Jahre konnte die Adventitia und die subendotheliale Zone der adulten Gefäßwand als Nische für unterschiedliche Typen von Vorläuferzellen und multipotenten Stammzellen, die sogenannten Gefäßwand-residenten Stammzellen (VW-SCs) identifiziert werden. In Anbetracht der Tatsache, dass die Blutgefäße aufgrund ihrer hohen Dichte im Herzen eine essentielle stromale Komponente des Herzgewebes darstellen, kann die mögliche klinische Relevanz von VW-SCs für das Myokardium im Moment nur erahnt werden. Ausgehend von der Annahme, dass eine Subpopulation dieser VW-SCs die Fähigkeit besitzt, sich in Kardiomyozyten-ähnliche Zellen zu differenzieren, sollte im Rahmen dieser Dissertationsarbeit das myokardiale Potential der Gefäßwand-residenten Stammzellen aus der Aorta adulter Mäuse studiert werden, indem die Zellen unter unterschiedlichen definierten Bedingungen kultiviert und dann sowohl morphologisch als auch funktionell charakterisiert werden. Erstaunlicherweise zeigten die ersten Ergebnisse die Generierung spontan schlagender Kardiomyozyten-ähnlicher Zellen, nur durch Verwendung eines speziellen Nährmediums und ohne jegliche genetische Manipulation. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Analysen belegen zudem, dass die Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen reproduzierbar nach ca. 9-11 Tagen in der Kultur anfangen, spontan zu schlagen. In immunzytochemischen Analysen zeigten die schlagenden Zellen ein quergestreiftes Färbemuster für α sarkomeres Actinin. Passend dazu wiesen diese spontan schlagenden Zellen, wie reife Kardiomyozyten, Sarkomerstrukturen mit Komponenten des sarkoplasmatischen Retikulums in elektronenmikroskopischen Analysen auf. Sie zeigten dementsprechend eine mit dem spontanen Schlag assoziierte Kalzium-Oszillation. Erstaunlicherweise zeigten die hier vorgelegten Befunde erstmalig, dass es nicht die Sca-1+ (stem cell antigen-1) Zellen waren, denen seit Jahren eine kardiomyozytäre Kapazität zugeschrieben wird, sondern es waren die Sca-1- Zellen der Mausaorta, die sich zu den spontan schlagenden Zellen differenzierten. Des Weiteren scheint diese Differenzierung von einer endogen generierten inflammatorischen Mikroumgebung abhängig zu sein. Die hier vorgelegten Ergebnisse legen daher den Schluss nahe, dass die VW-SCs in der vaskulären Adventitia sowohl die inflammatorische Mikroumgebung als auch die spontan schlagenden Kardiomyozyten-ähnlichen Zellen bereitstellten. So entstanden in der Kultur aortaler Zellen unter anderem auch Makrophagen, die hohe Mengen des Gefäßwachstumsfaktors VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) aufweisen. Wurden die Makrophagen in der Zellkultur durch Zugabe von Clodtronat-Liposomen depletiert, so wurde damit auch die Generierung spontan schlagender Zellen aus den aortalen VW-SCs unterbunden. Um zu testen, ob und inwieweit dieser Einfluss der Makrophagen auf die Entstehung spontan schlagender Zellen aus den VW-SCs auf den VEGF zurückzuführen ist, wurden kultivierte Zellen der Mausaorta mit dem VEGF-Rezeptor-2-Blocker (E7080) behandelt. Auch diese Behandlung resultierte wie bei der Depletion von Makrophagen darin, dass keine spontan schlagenden Zellen entstanden. Um die von VW-SCs generierten spontan schlagenden Zellen funktionell zu charakterisieren, wurden die kultivierten Zellen der Mausaorta mit Isoproterenol (ß-Sympathomimetikum) und Propranolol (ß-Blocker) behandelt. Eine signifikante Steigerung der Schlagfrequenz unter Isoproterenol und eine Reduzierung bei Zugabe von Propranolol unterstreichen ebenfalls die Kardiomyozyten-ähnliche Eigenschaft der spontan schlagenden Zellen. Schließlich wurden die aus der Mausaorta isolierten Zellen Fluoreszenz-markiert und dann in das kardiale Feld des sich entwickelnden Hühnerembryos (am fünften Tag der Entwicklung) implantiert. Zwei Tage später wurden die Herzen entnommen. Immunfärbungen zeigten, dass ein Teil der implantierten Zellen auch unter diesen in vivo-Bedingungen für α-sarkomeres Actinin positiv wurde und somit einen kardiomyozytären Phänotyp aufwies. KW - vessel wall resident stem cells KW - cardiomyocytes KW - Herzmuskelzelle KW - Stammzelle Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146046 N1 - My PhD research work has been published in Circ Res. 2018 Aug 31;123(6):686-699. ER - TY - THES A1 - Esterlechner, Jasmina T1 - Role of the DREAM complex in mouse embryonic stem cells and identification of ZO-2 as a new LIN9 interacting protein T1 - Die Rolle des DREAM-Komplexes in embryonalen Stammzellen der Maus und Identifikation von ZO-2 als neues LIN9- interagierendes Protein N2 - The DREAM complex plays an important role in regulation of gene expression during the cell cycle. It was previously shown that the DREAM subunits LIN9 and B-MYB are required for early embryonic development and for the maintenance of the inner cell mass in vitro. In this work the effect of LIN9 or B-MYB depletion on embryonic stem cells (ESC) was examined. It demonstrates that LIN9 and B-MYB knock down changes the cell cycle distribution of ESCs and results in an accumulation of cells in G2 and M and in an increase of polyploid cells. By using genome-wide expression studies it was revealed that the depletion of LIN9 leads to downregulation of mitotic genes and to upregulation of differentiation-specific genes. ChIP-on chip experiments determined that mitotic genes are direct targets of LIN9 while lineage specific markers are regulated indirectly. Importantly, depletion of LIN9 does not alter the expression of the pluripotency markers Sox2 and Oct4 and LIN9 depleted ESCs retain alkaline phosphatase activity. I conclude that LIN9 is essential for proliferation and genome stability of ESCs by activating genes with important functions in mitosis and cytokinesis. The exact molecular mechanisms behind this gene activation are still unclear as no DREAM subunit features a catalytically active domain. It is assumed that DREAM interacts with other proteins or co-factors for transcriptional activation. This study discovered potential binding proteins by combining in vivo isotope labeling of proteins with mass spectrometry (MS) and further analysed the identified interaction of the tight junction protein ZO-2 with DREAM which is cell cycle dependent and strongest in S-phase. ZO-2 depletion results in reduced cell proliferation and decreased G1 gene expression. As no G2/M genes, typical DREAM targets, are affected upon ZO-2 knock down, it is unlikely that ZO-2 binding is needed for a functional DREAM complex. However, this work demonstrates that with (MS)-based quantitative proteomics, DREAM interacting proteins can be identified which might help to elucidate the mechanisms underlying DREAM mediated gene activation. N2 - Der DREAM Komplex spielt eine bedeutende Rolle in der Genregulation im Verlauf des Zellzyklus. Es wurde gezeigt, dass die DREAM Untereinheiten LIN9 und B-MYB für die frühe Embryogenese und den in vitro Erhalt der inneren Zellmasse erforderlich sind. In der vorligenden Arbeit wurde die Auswirkung von LIN9 und B-MYB Depletierung auf embryonale Stammzellen untersucht. Es zeigt sich, dass Depletion von LIN9 und B-MYB die Zellzyklus-Verteilung von embryonalen Stammzellen beeinflusst, zur Akkumulation der Zellen in G2 und M Phase und zu erhöhter Polyploidie führt. Genomweite Expressionsstudien ergaben, dass die Verringerung von LIN9 in der Runterregulierung von mitotischen und in der Hochregulierung von differenzierungsspezifischen Genen resultiert. ChIP-on-chip Experimente ermittelten, dass LIN9 Mitosegene als direkte Ziele hat, wohingegen entwicklungslinienspezifische Marker indirekt reguliert werden. Wesentlich ist, dass LIN9 Depletion nicht die Expression der Pluripotenzgene Oct4 oder Sox2 beeinflusst und embryonale Stammzellen ihre Alkaline Phosphatase Aktivität behalten. Daraus lässt schließen, dass LIN9 essentiell für die Proliferation und genomische Stabilität von embryonalen Stammzellen ist, in dem es Gene aktiviert, die wichtige Funktionen in Mitose und Zytokinese ausüben. Der exakte Mechanismus hinter der Genaktivierung ist noch nicht geklärt, da keine DREAM Untereinheit eine katalytisch aktive Domäne aufweist. Vermutlich ist die Interaktion mit weiteren Proteinen oder Co-Faktoren für die Genaktivierung vonnöten. Diese Studie entdeckte mit in vivo Isotop-Markierung von Proteinen und Massenspektrometrie (MS) potentielle Bindungspartner und untersuchte die identifizierte Bindung mit dem Tight Junction Protein ZO-2 genauer. Diese Bindung ist zellzyklus-abhängig und ist am stärksten während der S-Phase. ZO-2 Depletion führt zu reduzierter Zellproliferation und verringerter G1-Genexpression. Da keine G2/M Gene, typische DREAM Ziele, von einer ZO-2 Depletion beeinflusst werden, ist es unwahrscheinlich, dass die ZO-2 Bindung für einen funktionellen DREAM Komplex benötigt wird. Jedoch demonstriert diese Studie, dass mit (MS)-basierender, quantitativer Proteomik DREAM interagierende Proteine identifiziert werden können. Dies ist hilfreich um die Mechanismen hinter der DREAM vermittelten Genaktivierung aufzuklären. KW - Zellzyklus KW - cellcycle KW - Stammzelle KW - Maus KW - stem cells KW - DREAM KW - Genregulation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90440 ER - TY - THES A1 - Appelt-Menzel, Antje T1 - Etablierung und Qualifizierung eines humanen Blut-Hirn-Schranken-Modells unter Verwendung von induziert pluripotenten und multipotenten Stammzellen T1 - Establishment and qualification of a human blood-brain barrier model by use of human induced pluripotent stemm cells an multipotent stem cells N2 - Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für weiterführende Studien ausgewählt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden. N2 - The blood-brain barrier (BBB) presents one of the tightest and most important barriers between the blood circulation and the central nervous system (CNS). The BBB consists of specialized endothelial cells, which line the cerebral capillaries and are connected through very dense tight junctions (TJs). Together with pericytes, astrocytes, neurons, microglial cells and the extracellular matrix of the basal membrane of the brain capillaries, they form a dynamic and complex regulatory system, the so-called neurovascular unit (Hawkins and Davis 2005). The main functions of the BBB can be divided into three subgroups, the physical-, metabolic- and transport-barrier (Neuhaus and Noe 2010). The BBB mainly serves to maintain the homeostasis of the CNS and for protection against neurotoxical substances and pathogens, such as bacteria and viruses. Moreover, the BBB ensures the supply of neurons with nutrients and regulatory substances. Furthermore, it is responsible for the efflux of CNS metabolism waste products. For the development of drugs applied for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Multiple Sclerosis or even brain tumors, the tightness of the BBB models towards substances and the high metabolic activity of the endothelial cells pose a problem. Numerous drugs cannot overcome the BBB in sufficient enough concentration to reach the target location or they are metabolized before transportation and thus become less effective. Moreover, defects of the BBB play a decisive role in the manipulation of the pathogenesis of numerous CNS diseases. Due to the high demand for test systems in basic and preclinical research of drug development and infection studies, a range of different BBB models have been developed. Besides the in silico, acellular in vitro and in vivo models, numerous cell-based BBB models have been developed. However, standardized models based on immortalized cell lines show only inhomogeneous TJ expression and possess low barrier integrity which is detected through transendothelial electrical resistance (TEER) below 150 · cm2 (Deli et al. 2005). In comparison, the TEER values in animal tests reached more than 1500 · cm2 at the BBB (Butt et al. 1990; Crone and Olesen 1982). The availability of human primary BBB cells is highly limited. Moreover, using human primary BBB cells is an extremely serious matter, not only in respect of ethical aspects. Human brain cells can, for instance, be isolated from biopsy or autopsy material obtained from patients suffering epilepsy or brain cancer. However, there is the risk that the isolated cells are altered due to disease, which may significantly change the features of the BBB models. An alternative to avoid such problems and to provide standardized human BBB models by the use of reproducible conditions, is the application of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). In this context, it has been successful to differentiate hiPSCs in vitro – under established and reproducible methods – into endothelial cells of the BBB (hiPS-ECs), neural stem cells (hiPS-NSCs) as well as astrocytes (hiPS-A) (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013; Reinhardt et al. 2013) and to use them for model establishment. The endothelial cells were examined for the existence and the functionality of endothelial-specific markers as well as specific transporters by protein- and gene-based methods. Within this work, the croypreservation of hiPS-EC progenitors was established. This will allow an increase of the spatial and temporal flexibility while working with the stem cell based models as well as the establishment of standardized cell banks. Furthermore, multipotent NSCs, isolated from fetal brain biopsies (fNSCs), were used as a control population for hiPSC-NSCs and for BBB modelling. In order to imitate the in vivo BBB in the best possible way and to optimize model characteristics, a set of ten different BBB models based on primary cells, hiPSCs and fNSCs was analyzed. Model establishment was done by the use of transwell systems. By the systematically analysis of the influence of the different neurovascular unit cell types on barrier integrity and on endothelial cell gene expression, the quadruple culture with pericytes, astrocytes and hiPS-NSCs was identified demonstrating the most physiological properties. Due to the significant increase of TEER results up to 2500 · cm2 as well as the at least 1.5-fold increase in gene expression of BBB relevant transporter and TJ markers compared to the mono-cultures, this model was selected for further studies. The presence of a complex in vivo-like TJ network, based on occludin, claudin 1, 3, 4 and 5 was detected by quantitative reale time PCR, Western blot analyses as well as on ultrastructural level by freeze fracture electron microscopy and transmission electron microscopy. Beside the limitation of the paracellular permeability, proven by the low permeation of FITC dextran (4 kDa and 40 kDa), fluorescein and Lucifer yellow, the BBB represents also a barrier for transcellular transported substances. A model evaluation, to assess the models qualification to be used for drug screenings, was proven by transport studies based on BBB relevant reference substances. The classification of the test substances was made analog their permeation rates: diazepam and caffeine are classified as fast, ibuprofen, celecoxib and diclofenac as medium, and loratadine and rhodamine 123 as slow permeating substances. Within our tests, this ranking based on literature data could be confirmed by using the quadruple-culture models, only caffeine was transported with a significantly decreased permeation coefficient compared to the mono-cultures. Furthermore, the implementation of the hiPSC technology allows the generation of a large quantity of human somatic cell types form only one single stem cell line and their provision for specific applications. Within this work it was shown, that by the use of an in-house constructed stirred tank bio-reactor, providing defined culture conditions, a reproducible expansion of hiPSCs was enabled. On this basis, a high throughput drug screening might be possible. The data presented within this work demonstrate the establishment of a stem cell based in vitro quadruple-model of the human BBB with in vivo-like characteristics. All minimal requirements for human BBB modeling, including the reproducibility of the results, adequate characterization with regard on the permeability of reference components, expression of BBB transporters as well as the robust and physiological morphology are fulfilled. The established BBB model can be used in pharmaceutical drug development. In preclinical research adequate qualified models are asked for toxicity and transport studies with new developed substances in order to allow a better in vitro-in vivo correlation of the results. Moreover, the model can be used to develop mechanisms to selectively overcome the barrier. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Stammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - In vitro KW - Endothelzelle KW - induziert pluripotente Stammzelle KW - multipotente Stammzelle KW - in vitro Modell KW - Neurovaskuläre Einheit KW - Neurale Stammzellen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134646 ER -