TY - THES A1 - Lee, Kyeong-Hee T1 - Cofilin T1 - Cofilin N2 - This study has identified cofilin, an actin binding protein, as a control element in the reorganization of the actin cytoskeleton which is highly relevant for T lymphocyte activation. Cofilin is regulated in its activity by reversible phosphorylation which is inducible by stimulation through accessory receptors such as CD2 and CD28. First it could be demonstrated that accessory receptor triggering induces the transient association of cofilin with the actin cytoskeleton and that only the dephosphorylated form of cofilin possesses the capacity to bind cytoskeletal actin in vivo. PI3-kinase inhibitors block both the dephosphorylation of cofilin and its association with the actin cytoskeleton. Importantly, cofilin, actin, PI3-kinase and one of its substrates, namely phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) which can bind to cofilin, co-localize within CD2-receptor caps. The cofilin/F-actin interaction has been identified as a crucial regulatory element for receptor cap formation and the strength of signal transduction. To this end, appropriately designed cell permeable non-toxic peptides that are homologous to actin binding motifs of the human cofilin sequence were introduced into untransformed human peripheral blood T lymphocytes. These peptides competitively and dose dependently inhibit the activation induced interaction of cofilin with the actin cytoskeleton in vivo. By this approach it was possible to study, for the first time, the functional consequences of this interaction in immunocompetent T cells. The present data demonstrate that inhibition of the actin/cofilin interaction in human T lymphocytes by means of these cofilin derived peptides abolishes receptor cap formation and strongly modulates functional T cell responses such as T cell proliferation, interleukin-2 production, cell surface expression of CD69, gIFN production, and CD95L expression. Importantly, receptor independent activation by PMA and calcium ionophore circumvents these peptide produced inhibitory effects on lymphocyte stimulation and places the cofilin/actin interaction to a proximal step in the cascade of signaling events following T cell activation via surface signals. The present results are novel since as yet no information existed regarding the molecular elements which link cell surface receptor stimulation directly to the resulting reorganization of the actin cytoskeleton. N2 - Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass Cofilin, ein aktin-bindendes Protein, als Kontrollelement bei der Reorganisation des Aktinzytoskeletts fungiert und damit von besonderer Bedeutung für die Aktivierung von T-Lymphozyten ist. Cofilin wird in seiner Aktivität durch reversible Phosphorylierung reguliert, die induzierbar ist über eine Stimulation durch akzessorische Rezeptoren wie CD2 und CD28. Es konnte gezeigt werden, dass eine Stimulation über akzessorische Rezeptoren zu einer transienten Assoziation von Cofilin mit dem Aktinzytoskelett führt und dass nur die dephosphorylierte Form von Cofilin die Fähigkeit besitzt, in vivo an das Aktinzytoskelett zu binden. Inhibitoren der PI3-Kinase blockieren sowohl die Dephosphorylierung von Cofilin, als auch seine Assoziation mit dem Aktinzytoskelett. Hervorzuheben ist, dass Cofilin, zusammen mit Aktin, PI3-Kinase und einem ihrer Substrate, Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphat (PtdIns(4,5)P2), welches an Cofilin binden kann, mit CD2-Rezeptor-"Caps" kolokalisiert. Die Cofilin/F-Aktin-Interaktion konnte als wesentliches regulatorisches Element für die Rezeptor-"Cap"-bildung und die Stärke der Signalübertragung identifiziert werden. Hierzu wurden maßgeschneiderte zellpermeable Peptide, welche homolog zu aktin-bindenden Motiven der humanen Cofilin-Sequenz sind, in nicht-transformierte humane periphere T-Lymphozyten eingeschleust. Diese Peptide hemmen kompetitiv und dosisabhängig die durch Aktivierung induzierte Interaktion von Cofilin mit dem Aktinzytoskelett in vivo. Dieser Ansatz ermöglichte erstmals die Untersuchung funktioneller Konsequenzen dieser Interaktion in immunkompetenten T-Zellen. Die vorgelegten Ergebnissse zeigen, dass die Blockierung der Interaktion von Cofilin mit dem Aktinzytoskelett in humanen T-Zellen mittels von Cofilin abgeleiteter Peptide die Rezeptor-"Cap"-bildung verhindert, sowie zu einer deutlichen Modulation funktioneller T-Zell-Antworten, wie T-Zellproliferation, Interleukin-2-Produktion, Zelloberflächenexpression von CD69, gIFN-Produktion und Expression von CD95L führt. Hervorzuheben ist, dass rezeptor-unabhängige Aktivierung über PMA und Calciumionophor diese durch Peptide verursachten inhibitorischen Effekte umgeht und die Cofilin/Aktin-Interaktion somit als einen proximalen Schritt in der über Oberflächenmoleküle vermittelten Signalübertragungskaskade in T-Zellen identifiziert. Die vorgestellten Ergebnisse sind neu, da bisher keine Informationen bezüglich der molekularen Elemente existierten, welche eine Stimulation von Zelloberflächenrezeptoren direkt mit der Reorganisation des Aktinzytoskeletts verbinden. KW - T-Lymphozyt KW - Aktivierung KW - Actin KW - Cofilin KW - Lymphozytentransformation KW - Cofilin KW - Aktin-Zytoskelett KW - T-Zell-Aktivierung KW - PI3-Kinase KW - Apoptose KW - cofilin KW - actin cytoskeleton KW - T cell activation KW - PI3-kinase KW - apoptosis Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1681 ER - TY - THES A1 - Föger, Niko T1 - Costimulatory function of CD44 T1 - Die kostimulatorische Funktion von CD44 N2 - T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains. N2 - Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen zwei Signale erfordert, die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TZR) an den Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex und die Bindung sogenannter kostimulatorischer Moleküle an ihren Liganden. Über diese Rezeptor-Liganden-Interaktionen wird eine Kettenreaktion von Signalen ausgelöst, die die Aktivierung einer ganzen Reihe von Genen bewirken. Die Signale die über die Liganden Bindung des TZR in Gang gesetzt werden, sind weitgehend bekannt. Hingegen ist unser Wissen über das Funktionsprinzip kostimulatorischer Moleküle äußerst lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt, dass und auf welche Weise CD44, eines dieser kostimulatorischen Moleküle, maßgeblich zur Verstärkung der über den TZR transduzierten Signale beiträgt. Ausgangspunkt der vorgelegten Studie war der Befund, dass eine Blockade von CD44, z.B. mittels eines kompetitiven löslichen CD44 Moleküls, die Antigen-induzierte Aktivierung einer T-Zelllinie blockieren kann. Zur Klärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde CD44 mittels immobilisierter Antikörper quervernetzt. Bei gleichzeitiger, suboptimaler Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzierte die Quervernetzung von CD44 zum einen die Proliferation reifer T-Zellen, zum anderen den apoptotischen Zelltod von Thymozyten beziehungsweise einer T-Helferzelllinie. Erwartungsgemäß war die CD44-induzierte Proliferation mit der Expression sogenannter Aktivierungsmarker wie CD25 und CD69 und einer erhöhten Zytokinproduktion verbunden. Dementsprechend wurde bei CD44-induzierter Apoptose eine deutlich gesteigerte Expression des CD95 Moleküls und seines Liganden beobachtet. Die kostimulatorische Aktivität von CD44 war mit einer gesteigerten Tyrosinphosphorylierung und einer Hochregulation der ras/ERK und JNK Signalkaskaden verbunden. Da von allen beobachteten Veränderungen bekannt ist, dass sie auch über die Besetzung des TZR mit einem geeigneten Stimulus ausgelöst werden können, war es naheliegend anzunehmen, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine Verstärkung der TZR-vermittelten Signale zurückführen läßt. Der Befund einer gesteigerten Phosphorylierung der TZR-z-Kette und der ZAP-70 Kinase, über die die Aktivierung von T-Zellen eingeleitet wird, unterstützt nachhaltig diese Hypothese. Hinzu kommen zwei weitere Befunde: 1. Die Quervernetzung von CD44 führt nur unter der Voraussetzung einer räumlichen Annäherung von CD44 und dem TZR zu einer Unterstützung der T-Zellaktivierung. Diese findet in sogenannten "Rafts" statt; 2. Die Quervernetzung von CD44 führt zu Adhäsion und Zellspreitzung, bedingt durch ein Rearrangement des Zytoskeletts an dem die GTPase rac1 und die src-Kinasen fyn und lck beteiligt sind. Diese beiden Kinasen sind konstitutiv mit CD44 assoziiert. Bei Quervernetzung des Moleküls und Reorganisation des Zytoskeletts wird eine deutliche Anreicherung von fyn und lck in den Rafts, also in direkter Nachbarschaft zum TZR, beobachtet. Diese Daten unterstützen nachhaltig meine Arbeitshypothese, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine kooperative Aktivität mit dem TZR zurückführen läßt. Es ist wahrscheinlich, dass durch Rekrutierung der Kinasen lck und fyn der Schwellenwert für die Initiierung von Signalen über den TZR signifikant erniedrigt wird. Die Rekrutierung dieser Kinasen wird durch eine Reorganisation des Zytoskeletts, die mit der Einbringung dieser Kinasen in den Bereich der Rafts einhergeht, ermöglicht. Inwieweit die erhobenen Befunde zur kostimulatorischen Aktivität des Adhäsionsmoleküls CD44 im Sinne eines Verstärkungs-mechanismus eingeleitet durch räumliche Annäherung generelle Gültigkeit haben, kann noch nicht abschließend beantwortet werden. Die Mehrheit der in jüngster Zeit erhobenen Befunde zur Klärung des Funktionsprinzips kostimulatorischer Moleküle bestätigt jedoch das Prinzip nachbarschaftlicher Kooperation. KW - Antigen CD44 KW - T-Lymphozyten-Rezeptor KW - T-Lymphozyt KW - Aktivierung KW - T-Lymphozyten KW - Signal Transduktion KW - Kostimulatorisches Molekül KW - T-Zell-Rezeptor KW - Lipid Mikrodomänen KW - Aktin-Zytoskelett KW - T lymphocytes KW - signal transduction KW - costimulatory molecule KW - T cell receptor KW - lipid microdomains KW - actin cytoskeleton Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1186 ER -