TY  - JOUR
A1  - Sebald, Walter
A1  - Arends, Hermann
A1  - McCarthy, John E. G.
T1  - Isolation and manipulation of genes coding for energy-transducing enzymes from Neurospora crassa and Escherichia coli
N2  - No abstract available.
KW  - Escherichia coli
KW  - Neurospora crassa
Y1  - 1984
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86768
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hüttinger, Christian
T1  - Untersuchungen zur Aufklärung der In-vivo-Funktion des Zytolysins ClyA von Escherichia coli
T1  - Analysis of the in vivo-function of the cytolysin ClyA from Escherichia coli
N2  - Porenbildende Zytolysine stellen wichtige Virulenzfaktoren von vielen pathogenen Bakterien dar. In Escherichia coli-Stämmen wurden bisher drei verschiedene porenbildende Zytolysine identifiziert, nämlich das alpha-Hämolysin (HlyA), das EHEC-Hämolysin (EHEC-HlyA, Ehx) und das latente Hämolysin ClyA. Alpha-Hämolysin und EHEC-Hämolysin, die beide zur Familie der RTX-Toxine gehören, werden häufig von uropathogenen bzw. enterohämorrhagischen E. coli-Stämmen gebildet. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, daß das alpha-Hämolysin maßgeblich an der Pathogenität von uropathogenen E. coli-Stämmen beteiligt ist. Das Hämolysin ClyA, ein Protein von 34 kDa das keine Homologien zu den RTX-Toxinen aufweist, wurde zuerst im Laborstamm E. coli K-12 identifiziert, wo es unter normalen in vitro-Kulturbedingungen nur in sehr geringem Ausmaß exprimiert wird. Ein funktionales clyA-Gen wurde kürzlich aber auch in verschiedenen pathogenen E. coli-Stämmen, u. a. in enteroinvasiven E. coli (EIEC)-Stämmen, gefunden. Bislang ist jedoch unbekannt, ob ClyA eine Rolle in der Virulenz von pathogenen E. coli-Stämmen spielt. Die vorliegende Arbeit sollte deshalb zur Aufklärung der in vivo-Funktion von ClyA in E. coli beitragen. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei die Frage nach der Bedeutung von ClyA für EIEC-Stämme, die zur fakultativ intrazellulären Lebensweise befähigt sind. Ausgewählte wildtypische EIEC-Stämme (EIEC 12860, EIEC 4608-58) zeigten von sich aus bzw. bei Überexpression des Transkriptionsregulators SlyA phänotypisch sichtbare hämolytische Aktivität, während in vitro konstruierte isogene clyA-"knock-out"-Mutanten dieser Stämme stets nichthämolytisch waren. Daraus konnte geschlossen werden, daß die wildtypischen EIEC-Stämme in der Lage sind, ClyA in signifikanten Mengen zu exprimieren. Vergleichende Infektionsstudien, die mit dem EIEC-Stamm 4608-58 und der entsprechenden clyA-Mutante unter Verwendung von J774-Makrophagen durchgeführt wurden, ergaben außerdem, daß ClyA wesentlich zur Zytotoxizität des wildtypischen EIEC-Stamms beiträgt. Eine spezielle Bedeutung von ClyA für die fakultativ intrazelluläre Lebensweise von EIECs konnte mit diesen Versuchen allerdings nicht nachgewiesen werden. Frühere Untersuchungen hatten gezeigt, daß im Fall des fakultativ intrazellulären Bakteriums Listeria monocytogenes ein porenbildendes Toxin, Listeriolysin O (LLO), nach der Invasion in phagozytische Zellen die Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom ermöglicht. Es stellte sich deshalb die Frage, ob ClyA bei EIECs möglicherweise eine ähnliche Rolle spielt. Um dies herauszufinden, wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, inwieweit ClyA von E. coli in der Lage ist, LLO in L. monocytogenes funktional zu ersetzen. Hierzu wurden L. monocytogenes-Mutanten, die aufgrund von chromosomalen Deletionen nicht in der Lage waren, LLO zu produzieren, mit verschiedenen Plasmiden komplementiert, welche clyA bzw. clyA-Derivate unter der Kontrolle der Promotorregion des LLO-Gens (hly) enthielten. Einige dieser komplementierten Stämme exprimierten und sezernierten tatsächlich das ClyA-Protein und zeigten dementsprechend auch einen hämolytischen Phänotyp. Dieselben Stämme waren jedoch bei Infektionen in J774-Zellen nicht in der Lage, sich intrazellulär signifikant zu vermehren, obwohl teilweise eine Befreiung der Bakterien aus dem Phagosom zu beobachten war. Diese Daten zeigten, daß das ClyA-Protein von E. coli das Listeriolysin O von L. monocytogenes nicht funktional ersetzen kann. Eine mögliche Funktion von ClyA als Phagosomenöffner in EIECs kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse jedoch nicht ausgeschlossen werden.
N2  - Pore-forming cytolysins are important virulence factors of many pathogenic bacteria. In E. coli strains, three different pore-forming cytolysins have been identified so far:alpha-hemolysin (HlyA), EHEC-hemolysin (EHEC-HlyA; Ehx) and the cryptic hemolysin (ClyA). alpha-hemolysin and EHEC-hemolysin are frequently produced by uropathogenic and enterohaemorrhagic strains. Both toxins are related cytolysins and belong to a large family referred to as RTX-toxins. Among these, alpha-hemolysin has been most extensively studied. Futher experiments have shown that alpha-hemolysin which is produced by uropathogenic E. coli strains (UPEC), contributes to the virulence of UPEC. Recently, the cryptic hemolysin ClyA, a protein of about 34 kDa showing no homology to any member of the RTX-family was identified in the laboratory strain E. coli K-12. Under standard in-vitro-laboratory conditions ClyA is not produced at detectable levels. Further studies demonstrated that clyA is not only present in E. coli K12 but also a functional clyA-gene has been detected in various pathogenic E. coli isolates (p.e. enteroinvasive E. coli strains). So far, the role of ClyA for the virulence of pathogenic E. coli strains is unknown. Therefore, in that work the in-vivo function of ClyA of pathogenic E. coli strains was investigated. Especially, in enteroinvasive E. coli (EIEC) strains, which are able to replicate intracellulary in mammalian cells and to evade into the cytoplasm of the host cell, the relevance of ClyA for EIEC strains is unknown. Carefully selected wildtyp EIEC strains (EIEC 12860, EIEC 4608-58) showed a clear hemolytic phenotyp per se and after overproduction of the positive regulatory protein SlyA, respectively, while in ClyA-knock-out-mutants of these wildtyp EIEC strains a hemolytic phenotyp has never been observed. All these findings indicate that ClyA is expressed in significant amounts in wildtyp EIEC strains under standard in-vitro-laboratory conditions. Further infection studies with J774 macrophages by using the EIEC strain 4608-58 and a isogenic ClyA deletion mutante, respectively, revealed that ClyA is a strong cytolysin in wildtyp EIEC strains, which contributes to the cytotoxicity of these wildtyp EIEC strains. But a special relevance of ClyA for the intracellulary growth of EIEC could not be seen in any of these experiments. Recent studies showed that the facultative intracellulary bacteria Listeria monocytogenes produce the poreforming toxin listeriolysin O (LLO), which allows L. monocytogenes by opening the phagosomal membrane to evade into the cytoplasma of the host cell after invasion into a phagocytic cells. However, the mechanism which allows EIEC strains to penetrate the phagosomal membran is still unknown. ClyA might play a similar role for opening the phagosomal membran after invasion of EIEC into host cells. In this work it has been investigated wether ClyA of E. coli might functionally replace LLO of L. monocytogenes. In addition, L. monocytogenes LLO mutants which have a chromosomal deletion of the LLO gene and thereby lost the ability to produce LLO, were complemented with several plasmids. These plasmids carrying clyA and clyA-derivates under the control of the listeriolysin O promotorregion, respectively, were substituted for the listeriolysin O gene in the L. monocytogenes LLO mutants. Some of the recombinant L. monocytogenes strains expressed ClyA and showed hemolytic activity and a hemolytic phenotyp. Further experiments with J774 macrophages revealed that some of these recombinant L. monocytogenes strains seemed to open the phagosomal membrane. In consequence some bacteria were able to escape from the phagosomal compartment, but were not able to grow in the cytosol of infected cells. However, when ClyA were expressed in recombinant L. monocytogenes strains, a fully virulence phenotype could not be restored in-vitro. Due to these findings, ClyA of E. coli might be involved in the opening of the phagosomal membrane and the virulence of EIEC strains.
KW  - Escherichia coli
KW  - Perforine
KW  - Zytolsin
KW  - Hämolysin
KW  - ClyA
KW  - EIEC
KW  - cytolysin
KW  - ClyA
KW  - EIEC
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6817
ER  - 
TY  - THES
A1  - Denker, Katrin
T1  - Isolation and characterization of channel-forming proteins in the outer membrane of E. coli and Borrelia species
T1  - Isolierung und Charakterisierung porenformender Proteine in der Aussenmembran von E. coli und Borrelien
N2  - In this study pore forming proteins of the gram-negative bacteria B. burgdorferi, B. duttonii and E.coli were investigated. Therefore the study is subdivided into three parts. In the first part outer membrane preparation of three relapsing fever Borrelia were investigated. In the second part the putative TolC homologue BB0124 of B. burgdorferi, the Lyme borreliosis agent, was studied. In the last part the influence of point mutants within the greasy slide of the maltose specific porin (LamB) of E. coli were shown. In the first part of this study outer membrane preparations of three Borrelia relapsing fever strains have been studied for pore-forming activity in the black lipid bilayer assay. Histograms of conductance fluctuations were obtained from single-channel experiments with outer membrane preparations of B. hermsii, B. recurentis and B. duttonii. All strains had a different conductance fluctuation pattern with a broad range of single-channel conductance values varying from 0.5 nS – 11 nS. Common for all three strains was a high pore-forming activity at around 0.5 nS. Furthermore the proteins of the outer membrane of B. duttonii were separated by chromatographic methods. Some eluate fractions contained a channel-forming protein, which was forming stable channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. Characterization of this channel showed that it is slightly anionic selective and voltage independent. The small single-channel conductance suggests that it is a specific pore. However, a substrate specificity could not be determined. In the second part, for the B. burgdorferi HB19 and p66 knock out strain HB19/K02, their outer membrane preparations were characterized in the black lipid bilayer assay. Comparing the histograms of single-channel conductions fluctuations of both strains showed no single-channel activity at 11.5 nS for the p66 knock out strain. This verifies earlier studies that P66 is a pore-forming protein in B. burgdorferi. Furthermore, one fraction obtained by anion exchange chromatography of the p66 knock out outer membrane protein preparation showed a uniform channel-forming activity with a single channel conductance of 300 pS. The electrophysically characterization of the 300 pS channel showed that it is not ionselective or voltage dependent. By mass spectrometry using peptide mass finger prints, BB0142 could be identified as the sole channel forming candidate in the active fraction. A BLAST search and a conserved domain search showed that BB0142 is a putative TolC homologue in B. burgdorferi. Furthermore the location of the bb0142 gene within the chromosome is in an operon encoding a multidrug efflux pump. In this study the expression of an outer membrane component of a putative drug efflux system of B. burgdorferi was shown for the first time. In the third part functional studies of the maltooligosaccharide-specific LamB channel were performed. The 3D-structure of LamB suggests that a number of aromatic residues (Y6, Y41, W74, F229, W358 and W420) within the channel lumen is involved in carbohydrate and ion transport. All aromatic residues were replaced by alanine (A) scanning mutagenesis. Furthermore, LamB mutants were created in which one, two, three, four and five aromatic residues were replaced to study their effects on ion and maltopentaose transport through LamB. The purified mutant proteins were reconstituted into lipid bilayer membranes and the single-channel conductance was studied. The results suggest that all aromatic residues provide some steric hindrance for ion transport through LamB. Highest impact is provided by Y6 and Y41, which are localized opposite to Y118, which forms the central constriction of the LamB channel. Stability constants for binding of maltopentaose to the mutant channels were measured using titration experiments with the carbohydrate. The mutation of one or several aromatic amino acids led to a substantial decrease of the stability constant of binding. The highest effect was observed when all aromatic amino acids were replaced by alanine because no binding of maltopentaose could be detected in this case. However, binding was again possible when Y118 was replaced by tryptophane (W). The carbohydrate-induced block of the channel function could also be used for the study of current noise through the different mutant LamB-channels. The analysis of the power density spectra of some of the mutants allowed the evaluation of the on- and off-rate constants (k1 and k-1) of carbohydrate binding to the binding-site inside the channels. The results suggest that both on- and off-rate constants were affected by the mutations. For most mutants k1 decreased and k-1 increased.
N2  - In dieser Studie wurden porenformende Proteine der gram-negativen Bakterien B. burgdorferi, B. duttonii und E. coli untersucht. Daher wurde die Arbeit in drei Teile untergliedert. Im ersten Teil wurden zuerst die Außenmembranpräparationen von drei Rückfallfieber auslösenden Borrelien Stämmen untersucht. Der zweite Teil der Arbeit behandelt das TolC homologe Protein BB0142 des Erreger der Lyme Borreliose, B. burgdorferi. Im letzten Teil wurde der Einfluss von Punktmutationen innerhalb der „greasy slide“ auf die zuckerspezifische Pore (LamB) von E. coli untersucht. Die Außenmembranpräparationen der drei Rückfallfieber Borrelien wurden auf porenformende Aktivität im Black Lipid Bilayer untersucht. Leitfähigkeitshistograme wurden nach Einzelkanalmessungen der Außenmembranepräparation von B. hermsii, B. recurrentis und B. duttonii erstellt. Alle Stämme zeigten ein anderes Leitfähigkeitsfluktuationsmuster, wobei die Werte der Einzelleitfähigkeit von 0,5 nS bis 11 nS variierten. Auffällig war das alle drei Stämme eine hohe Aktivität um 0,5 nS gemeinsan hatten. Darauffolgend wurden die Proteine der Außenmembran von B. duttonii durch verschiedene chromatographische Methoden aufgetrennt. Einige Eluatfraktionen enthielten ein kanalformendes Protein, das stabile Kanäle mit einer Einzelleitfähigkeit von 80 pS in 1 M KCl formt. Die Bestimmung der Kanaleigenschaften zeigte, dass er leicht anionenselektive und spannungsunabhängig ist. Die geringe Einzelleitfähigkeit suggeriert, dass der Kanal zudem eine spezifische Pore sein könnte. Bisher konnte aber keine Substratespezifität festgestellt werden. Im zweiten Abschnitt erfolgte die Untersuchung von Außenmembranpräparationen von B. burgdorferi HB19 und dem p66 knock-out Stamm HB19/K02 mit Hilfe des Black Lipid Bilayers. Im Vergleich der beiden erhalten Einzelleitfähigkeitshistogramme konnte gezeigt werden, dass die Einzelleitfähigkeit von 11,5 nS nicht mehr im p66 knock out Stamm vorkam. Dies belegt frühere Studien, dass P66 ein poreformendes Protein von B. burgdorferi ist. Durch Anionenaustauscher-Chromatographie der Außenmembranpräparation des p66 knock out Stammes wurde zudem eine Proteinfraktion mit einer einheitlichen porenformenden Aktivität von 300 pS in 1 M KCl erhalten. Die elektrophysikalische Charakterisierung der 300 pS Pore zeigte, dass der Kanal nicht ionenselektiv oder spannungsabhängig ist. Mit Hilfe von Massenspektrometrie und Peptidemassenbestimmung, konnte BB0142 als einziger möglicher kanalformender Kandidat identifiziert werde. Eine BLAST Suche sowie eine „conserved domain“ Suche zeigten, dass BB0142 ein putatives TolC homologes Protein von B. burgdorferi ist. Darüber hinaus ist das bb0142 Gen in einem Operon lokalisiert, das eine putative Efflux Pumpe codiert. In der vorliegenden Arbeit konnte das erste Mal gezeigt weden, dass in B. burgdorferi die Außenmembrankomponente einer Efflux Pumpe expremiert wird. Im dritten Teil wurden Funktionsstudien an dem zuckerspezifischen Kanal LamB durchgeführt. Die 3D Struktur zeigte, dass einige aromatische Aminosäuren (Y6, Y41, W74, F229, W358 und W420) innerhalb des Kanallumen in den Kohlenhydrat- und Ionentransport involviert sind. Alle aromatischen Reste wurden bei Punktmutation durch Alanin ersetzt. Zudem wurden LamB Mutanten erzeugt in denen ein, zwei, drei, vier oder fünf aromatische Reste durch Alanin ersetzt. Die aufgereinigten LamB Mutanten wurden im Black Lipid Bilayer untersucht und ihre Einzelleitfähigkeit bestimmt. Die Ergebnisse zeigen, dass alle aromatischen Reste eine gewisse sterische Hinderung beim Ionentransport durch LamB bewirken. Den größten Einfluss haben die Reste Y6 und Y41, die gegenüber dem Rest Y188 liegen, der die zentrale Verengung des LamB Kanal darstellt. Stabilitätskonstanten der Zuckerbindung in den Mutanten wurde durch Titrationsexperimente mit Maltopentaose und -heptaose bestimmt. Mutation an einem oder mehreren aromatischen Resten führt zu einer deutlichen Abnahme der Bindungsstabilitätskonstanten. Den stärksten Effekt zeigte die Mutante, in der alle aromatischen Reste durch Alanin ersetzt wurden. Es konnte dort keine Zuckerbindung mehr festgestellt werden. Die Bindung wurde wieder hergestellt nachdem Y118 durch ein Tryptophan ersetzt wurde. Durch das zuckerinduzierte Öffnen und Schließen des Kanals ergiebt sich ein Stromrauschen. Die Analyse des Rausch Spektrum von einigen Mutanten erlaubte die Bestimmung der Dissoziations- (k-1) und der Assoziationskonstaten (k1) der Zuckerbindung an der Bindestelle innerhalb des Kanals. Die Ergebnisse zeigten, dass die Geschwindigkeitskonstanten durch die Mutationen beeinflusst wurden. Für die meisten Mutanten sank der k1 Wert während der k-1 Wert anstieg.
KW  - Escherichia coli
KW  - Kanalbildner
KW  - Zellwand
KW  - Borrelia
KW  - Borrelia burgdorferi
KW  - BB0142
KW  - porenformende Proteine
KW  - Maltoporin
KW  - black lipid bilayer
KW  - Borrelia burgdorferi
KW  - BB0142
KW  - channel forming proteins
KW  - Maltoporin
KW  - black lipid bilayer
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16955
ER  - 
TY  - THES
A1  - Stegmeier, Johannes Friedrich
T1  - Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli
T1  - Charakterisierung von YaeT und YtfM sowie Multidrugefflux Systemen in Escherichia coli
N2  - In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component
N2  - In dieser Arbeit wurden die Omp85 Familienproteine YaeT und YtfM aus E. coli biochemisch und elektrophysiologisch charakterisiert, sowie bioinformatisch und strukturell analysiert. Des Weiteren wurden Bakterienstämme mit chromosomalen Deletionen der beiden zugehörigen Gene hergestellt, um die Relevanz der beiden Proteine in vivo zu untersuchen. Für Omp85 aus N. meningitdis wurde vorhergesagt, dass das Protein aus zwei strukturellen Untereinheiten besteht, einer periplasmatischen amino-terminalen Domäne, der POTRA – („polypeptide-transport-associated“ -) Domäne und einer carboxy-terminalen Domäne, die das Protein in der Außenmembran verankert. Diese Vorhersagen wurden für die Omp85 Homologen YaeT und YtfM mit Hilfe von geeigneten Mutanten bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass der carboxy-terminale Teil beider Proteine, YaeT und YtfM, auch bei Fehlen der amino-terminalen Domäne noch in der äußeren Membran zu finden ist. Bestätigt wurde dieses Ergebnis durch „Black Lipid Bilayer“ Experimente. Für beide nativen Proteine, sowie deren carboxy-terminale Mutanten, konnte der Einbau in eine künstliche Membran und Porenbildung gezeigt werden. Anders als bei herkömmlichen Porinen, die normalerweise eine sehr gut definierte Leitfähigkeit haben, musste man den beiden untersuchten Proteinen eher eine Leitfähigkeitsspanne zuordnen. Bei Messungen in 1M KCl wurden für YaeT beispielsweise Poren mit einer Leitfähigkeit von 100 bis 600 pS aufgezeichnet, wobei 400 pS der am häufigsten vorkommende Wert ist. Diese Variabilität ist bei YaeT zumindest dadurch begründbar, dass für den Einbau anderer Proteine in die äußere Membran ein flexibler Kanal mit einer möglichen lateralen Öffnung notwendig ist. Die YaeT Poren sind kationenselektiv, für YtfM wurde ein anionenselektiver Kanal nachgewiesen, welcher zusätzlich im Vergleich zu YaeT weniger pH anfällig ist. Weiterhin haben die elektrophysiologischen Experimente gezeigt, dass die Ionenselektivität und Leitfähigkeit von YaeT durch Detergenzmoleküle beeinflussbar ist. Dies lässt hydrophobe Bereiche im Kanalinnern vermuten, an denen sich die Moleküle mit ihrem unpolaren Teil anlagern und dann durch ihre polaren Köpfe die Nettoladungen im Kanalinnern verändern. Mittels Gelelektrophorese konnte für YaeT das typische Laufverhalten von Außenmembranproteinen gezeigt werden. Wenn YaeT ungekocht auf ein SDS-Gel aufgetragen wurde, wanderte es schneller, als wenn man es vorher auf 100°C erhitzte, was für eine kompakte Struktur spricht. Für YtfM wurde dieses Verhalten nicht festgestellt. Die Erklärung für diesen Unterschied lieferten ein Sequenzvergleich beider Proteine, sowie die strukturelle Untersuchung mittels CD- und FTIR-Spektroskopie, welche im Vergleich zu YtfM einen deutlich höheren β-Faltblatt-Anteil für den carboxy-terminalen Teil von YaeT ergaben. Da der carboxy-terminale Teil der Proteine in der Außenmembran zu finden ist und porenformende Aktivität besitzt, wurde versucht, YaeT durch seine carboxy-terminale Mutante in einem Knock-out Stamm zu ersetzen. Dies schlug jedoch fehl, was auf eine bestimmte Funktion der amino-terminalen Hälfte in vivo hindeutet. Im Vergleich zu YaeT ist YtfM kein essentielles Protein und sein Fehlen beeinflusst die Zusammensetzung und die Funktion der äußeren Membran nicht. Die chromosomale Deletion von ytfM führte jedoch zu einer deutlichen Reduktion der Wachstumsrate. Bei den Multidrug Efflux Pumpen AcrAB/TolC und MexAB/OprM sind mittlerweile Strukturen aller drei Pumpenkomponenten bekannt, ihre Interaktionsstellen sind allerdings noch nicht bekannt. Mit einem chemischen „Cross-linker“ konnte der Zusammenbau eines hybriden Exportsystems bestehend aus der Außenmembrankomponente OprM aus Pseudomonas aeruginosa, dem Adapterprotein AcrA aus E. coli, sowie dessen zugehörigem Innenmembrantransporter AcrB, nachgewiesen werden. Der Zusammenbau ist insofern erstaunlich, da diese hybride Effluxpumpe nicht funktionell ist. Die Funktionalität dieser Effluxpumpe, nachgewiesen durch Antibiotikasensitivitätstests, konnte jedoch durch den Austausch der „Hairpin“-Domäne von AcrA durch den „Hairpin“ von MexA wieder hergestellt werden. Dieses Ergebnis zeigt deutlich die Wichtigkeit dieser Haarnadelstruktur für die funktionelle Interaktion mit der Außenmembrankomponente OprM. Interessanterweise konnte das hybride Adapterprotein eine funktionelle Effluxpumpe mit TolC als Außenmembrankomponente bilden, was für eine höhere Flexibilität von TolC im Gegensatz zu OprM bezüglich der Interaktionspartner spricht. Aufgrund der oben genannten Ergebnisse wurde ein Interaktionsmodell der „Hairpin“-Domäne von AcrA bzw. MexA mit den Außenmembranproteinen TolC und OprM auf molekularer Ebene erstellt. Dieses Modell kann nun als Vorlage für zielgerichtete Mutationen dienen, um die Interaktionsstellen des Adapterproteins mit der zugehörigen Außenmembrankomponente genau zu beschreiben.
KW  - Escherichia coli
KW  - Porin
KW  - Omp85
KW  - YaeT
KW  - YtfM
KW  - Multidrug Efflux
KW  - Omp85
KW  - YaeT
KW  - YtfM
KW  - Multidrug Efflux
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18171
ER  - 
TY  - THES
A1  - Götz, Andreas
T1  - Replikation von enteroinvasiven Escherichia coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium Stämmen in Epithelzellen unter besonderer Betrachtung des Kohlenstoffmetabolismus
T1  - Replication of enteroinvasive Escherichia coli and Salmonella enterica Serovar Typhimurium strains in epithelial cells with particular examination of the carbon metabolism
N2  - Schlagwörter: Salmonella , Salmonella enterica , Salmonella typhimurium , Salmonellose , Escherichia coli , Shigella , Infektion , Bakterielle Infektion , Zellkultur , HeLa-Zelle , Apoptosis , Metabolismus , Stoffwechsel , Glucose , Glucosetransport , Glucosestoffwechsel , Katabolismus , Kohlenstoff , Kohlenstoffbedarf , Kohlenstoffhaushalt , Kohlenstoffstoffwechsel , Kohlenstoff-13 , Kohlenstoffisotop Salmonella Typhimurium und enteroinvasive E. coli (EIEC) sind fakultativ intrazelluläre Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Während erstere sich nach der Internalisierung durch eukaryotische Zellen normalerweise in einem spezialisierten Phagosom, der Salmonella-enthaltenden Vakuole (SCV), vermehren, replizieren EIEC im Zytoplasma der Wirtszellen. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst durch Mikroinjektion die Fähigkeit von S. Typhimurium 14028s untersucht, ebenfalls im Zytoplasma von Caco-2-Zellen replizieren zu können. Dabei wurde festgestellt, daß ein früher als S. Typhimurium 14028s WT bezeichneter Stamm eine Insertion eines Desoxythymidins an Position 76 des offenen Leserasters von rfbP trägt, einem Gen, dessen Protein an der LPS-Synthese beteiligt ist. Weiterhin synthetisierte dieser Stamm ein rauhes LPS. Aufgrund von Agglutination konnte der Rauh-Stamm nur mit geringem Erfolg mikroinjiziert werden. Hingegen lag 5 h nach der Mikroinjektion einer nicht invasiven Mutante von Salmonella mit vollständigem LPS der Anteil an Caco-2-Zellen, die mehr als 32 Bakterien enthielten, bei etwa 30 %. Der Anteil war 2-3 mal höher als bei früheren Mikroinjektionen in HeLa-Zellen. Daher wurde das Verhalten von HeLa-Zellen nach einer Infektion durch S. Typhimurium ΔsifA - einer Mutante, die aus der SCV ins Zytoplasma entkommt - untersucht. Dabei wurde festgestellt, daß die sifA-Mutante 10 h nach der Infektion die Aktivität der Caspasen 9 und 3 in HeLa-Zellen, aber nicht in Caco-2-Zellen induziert. In weiteren Versuchen wurde die Bedeutung von Glukose, Glukose-6-phosphat und Mannose als Kohlenstoffquellen für die extra- und intrazelluläre Replikation zweier Isolate enteroinvasiver E. coli und eines S. Typhimurium Stammes analysiert. Zu diesem Zweck wurden zunächst definierte Mutanten in den beiden wichtigsten Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferasesystemen (PTS) für die Aufnahme von Glukose und Mannose, ptsG und manXYZ, sowie im Antiporter für die Aufnahme von Glukose-6-phosphat, uhpT, konstruiert. Bei Wachstum im Minimalmedium mit Glukose als einziger C-Quelle waren die Generationszeiten aller ΔptsG- und ΔptsG, manXYZ-Mutanten im Vergleich zu den Wildstämmen deutlich verlängert. Ebenso wuchsen ΔmanXYZ-Mutanten bzw. ΔuhpT-Mutanten deutlich langsamer auf Mannose bzw. Glukose-6-phosphat. Jedoch ergaben sich hierbei Stamm-spezifische Unterschiede. So erreichte EIEC 4608-58 ΔuhpT in der stationären Phase eine ähnliche Zelldichte wie der Wildstamm in Gegenwart von Glukose-6-phosphat und eine ΔptsG, manXYZ-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnte immer noch effizient mit Glukose wachsen. Infektionsversuche mit Caco-2-Zellen zeigten weiterhin, daß die Deletion von ptsG zu einer signifikanten Erhöhung der Adhärenz und Invasivität von EIEC 4608-58 führt, während sich die intrazellulären Generationszeiten aller hier untersuchten Mutanten kaum veränderten. Selbst die ΔptsG, manXYZ, uhpT-Dreifachmutanten der drei hier verwendeten Enterobakterien und die ΔptsG, manXYZ, glk-Mutante von S. Typhimurium 14028s konnten immer noch in Caco-2-Zellen replizieren, wenn auch mit Stamm-spezifisch verringerten Geschwindigkeiten. 13C-Markierungsexperimente mit [U-13C6]-Glukose als Substrat ergaben jedoch, daß in der Tat alle hier untersuchten enterobakteriellen Wildstämme Glukose während der Replikation in Caco-2-Zellen unter Zellkulturbedingungen verwerten. Glukose-6-phosphat, Glukonat oder Fettsäuren konnten dagegen als wichtigste Kohlenstoffquellen für das intrazelluläre Wachstum ausgeschlossen werden. EIEC 4608-58 metabolisierte Glukose jedoch weniger effizient als EIEC HN280 und schien zudem noch zusätzlich C3-Substrate aus der Wirtszelle aufzunehmen. Das Markierungsmuster zeigte einen Stamm-spezifischen Kohlenstofffluß durch Glykolyse und/oder Entner-Doudoroff-Weg, Pentosephosphatzyklus, Citratzyklus und den anaplerotischen Reaktionen zwischen PEP und Oxalacetat. Mutanten mit Deletionen in ptsG und manXYZ konnten auf alternative C3-Substrate wechseln und glichen dies durch eine erhöhte Aufnahme von Aminosäuren aus den Wirtszellen aus.
N2  - Salmonella Typhimurium and enteroinvasive E. coli (EIEC) are facultative intracellular bacteria belonging to the family of Enterobacteriaceae. After internalisation by eukaryotic cells Salmonella normally resides inside a specialised phagosome called Salmonella-containing vacuole (SCV) whereas EIEC replicates inside the cytosol of host cells. In this study the ability of S. Typhimurium 14028s to replicate inside the cytosol of Caco-2 host cells was investigated by microinjection. It was thereby observed that a formerly used strain also called S. Typhimurium 14028s WT harboured an insertion of one deoxythymidin at position 76 of the rfbP open reading frame, a gene whose protein is involved in the LPS biosynthesis. Furthermore this strain expressed a rough LPS. Due to agglutination the microinjection procedure of the rough strain had only little success. But the percentage of Caco-2 cells that harboured more than 32 bacteria was about 30 % 5 h after injection of a non invasive mutant of Salmonella expressing full-length LPS chains. This was 2-3 times higher than the results observed before using HeLa cells. Therefore, the behaviour of HeLa cells infected by S. Typhimurium ΔsifA - a mutant that escapes from the SCV into the cytosol - was studied. The results showed that the sifA mutant strain induced the activity of caspases 9 and 3 in HeLa cells 10 h after infection but not in Caco-2 cells. In further experiments the contribution of glucose, glucose 6-phosphate and mannose as carbon sources for extra- and intracellular growth of two enteroinvasive E. coli isolates and one S. Typhimurium strain was analysed. Therefore, defined mutants of the most important phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase systems (PTS) taking up glucose or mannose, i.e. ptsG and manXYZ, were constructed as well as mutants carrying a deletion of uhpT the antiporter for uptake of glucose 6-phosphate. During growth of the resulting ΔptsG and ΔptsG, manXYZ mutants in minimal medium with glucose as sole carbon source considerably longer generation times were observed. Likewise, ΔmanXYZ mutants and ΔuhpT mutants grew significantly slower on mannose or glucose 6-phosphate, respectively. But there were also strain specific differences. EIEC 4608-58 ΔuhpT reached a similar cell density as the wild-type strain during stationary phase when grown in the presence of glucose 6-phosphate and S. Typhimurium ΔptsG, manXYZ could still grow efficiently on glucose. Infections of Caco-2 cells showed that the deletion of ptsG increased the ability of EIEC 4608-58 significantly to adhere and invade these cells. But the intracellular generation times of all mutants under study were hardly changed. Even the triple mutants ΔptsG, manXYZ, uhpT of all three enterobacterial strains and the ΔptsG, manXYZ, glk mutant of S. Typhimurium 14028s were still able to replicate in Caco-2 cells, albeit at strain specific lower rates. 13C-Isotopologue profiling using [U-13C6]glucose as precursor revealed that in deed all analysed enterobacterial wild-type strains utilised glucose for their replication in Caco-2 cells under the applied conditions. Glucose 6-phosphate, gluconate and fatty acids could be ruled out as main carbon sources for intracellular growth. EIEC 4608-58 metabolised the applied glucose less efficiently than EIEC HN280 and seemed to take up C3-compounds from the host cells in addition to glucose. The labelling patterns reflected strain specific carbon fluxes via glycolysis and/or Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, citric acid cycle and the anaplerotic reactions between PEP and oxaloacetate. Mutants carrying deletions in ptsG and manXYZ switched to alternative C3-substrates and counterbalanced this by an increased uptake of amino acids from the host cells.
KW  - Escherichia coli
KW  - Intrazellulärraum
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Vermehrung
KW  - Kohlenstoffstoffwechsel
KW  - Salmonella
KW  - Salmonella enterica
KW  - Salmonella typhimurium
KW  - Salmonellose
KW  - Escherichia coli
KW  - Shigella
KW  - Infektion
KW  - Bakterielle Infektion
KW  - sifA
KW  - enteroinvasive
KW  - CaCo-2 cell
KW  - 13C-isotopologue profiling
KW  - microinjection
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57292
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brandes, Nicolas
T1  - Oxidative Thiol Modifications in Pro- and Eukaryotic Organisms
T1  - Oxidative Thiol Modifikationen in Pro- und Eukaryotischen Organismen
N2  - Cystein spielt eine wichtige Rolle in der Biochemie vieler Proteine. Aufgrund der Redox-Eigenschaften und der hohen Reaktivität der freien Thiol-Gruppe sowie dessen Fähigkeit Metallionen zu koordinieren, ist Cystein oft Bestandteil von katalytischen Zentren vieler Enzyme. Zudem lassen sich Cysteine durch reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies leicht reversibel oxidativ modifizieren. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Proteine redox-bedingte Thiol-Modifikationen nutzen, um Veränderungen ihrer Aktivität zu steuern. Diese redox-regulierten Proteine spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Das erste Ziel meiner Arbeit war die Identifizierung von Stickstoffmonoxid (NO)-sensitiven Proteinen in E. coli. Die redox-bedingten Funktionsänderungen solcher Proteine erklären möglicherweise die veränderte Physiologie von E. coli Zellen, die unter NO-Stress leiden. Um E. coli Proteine zu identifizieren, die unter Einwirkung von NO-Stress reversibel Thiol-modifiziert werden, wandte ich eine Kombination aus differentiellem Thiol-Trapping und 2D Gel-Elektrophorese an. Es wurden zehn Proteinen identifiziert, welche NO-sensitive Thiol-Gruppen enthalten. Genetische Studien ergaben, dass Modifikationen an AceF & IlvC mitverantwortlich sind für die NO-induzierte Wachstumshemmung. Bemerkenswert ist es, dass die Mehrheit der identifizierten Proteine speziell nur gegen reaktive Stickstoffspezies empfindlich ist, welches an einem der identifizierten Stickstoffmonoxid-sensitiven Proteinen, der kleinen Untereinheit von Glutamate synthase, getestet wurde. In vivo und in vitro Aktivitätsstudien zeigten, dass es zu einer schnellen Inaktivierung von Glutamate synthase nach NO-Behandlung kommt, das Protein aber resistent gegenüber anderen Oxidationsmittel ist. Diese Resultate implizieren, dass reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies unterschiedliche physiologische Vorgänge in Bakterien beeinflussen. Das zweite Ziel meiner Arbeit war es, redox-sensitive Proteine in S. cerevisiae zu identifizieren und deren Redox-Zustand als in vivo Read-Out zu verwenden, um die Rolle von oxidativen Stress während des Alterungsprozess eukaryotischer Zellen zu analysieren. Zunächst bestimmte ich in Hefezellen mit Hilfe von OxICAT, einer hochsensiblen quantitativen Methode, die Thiol-Trapping mit Massenspektrometrie verbindet, den exakten in vivo Thiol-Status von fast 300 Proteinen. Diese Proteine lassen sich in vier Gruppen einteilen: 1) Proteine, deren Cysteinreste resistent gegen Oxidation sind; 2) Proteine, in denen Cysteinmodifikationen strukturelle Aufgaben übernehmen; 3) Proteine mit oxidationsempfindlichen Cysteinen, die bereits eine gewisse Oxidation in exponentiell wachsenden Hefezellen aufweisen; 4) Proteine, die reduziert sind, aber redox-sensitive Cysteinreste enthalten, die die Funktion der Proteine bei Vorhandensein von oxidativen Stress beeinflussen. Die Sensitivität dieser Proteine gegenüber oxidativen Stress wurde durch Exposition subletaler Konzentrationen von H2O2 oder Superoxid auf Hefezellen nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die wichtigsten zellulären Angriffspunkte von H2O2- und Superoxid-bedingtem Stress Proteine sind, die an Vorgängen der Translation, Glykolyse, des Citratzyklus und der Aminosäure-Biosynthese beteiligt sind. Diese Zielproteine zeigen, dass Zellen für die Bekämpfung von oxidativen Stress Metabolite schnell in Richtung des Pentosephosphatweges umleiten, um die Produktion des Reduktionsmittels NADPH sicherzustellen. Die hier präsentierten Ergebnisse belegen, dass die quantitative Bestimmung des Oxidationsstatus von Proteinen eine wertvolle Methode ist, um redox-sensitive Cysteinreste zu identifizieren. Die OxICAT Technologie wurde dann verwendet, um das genaue Ausmaß und die Entstehung von oxidativen Stress in chronologisch alternden S. cerevisiae Zellen zu bestimmen. Für diese Bestimmung wurde der Oxidationsstatus von Proteinen in alternden Hefezellen als physiologischer Read-Out verwendet. Ich zeigte, dass die zelluläre Redox-Homöostase in chronologisch alternden Hefezellen global zusammenbricht, wobei es sich dabei um einen Prozess handelt, der dem Zelltod vorausgeht. Der Beginn dieses Zusammenbruchs scheint mit der Lebensdauer der Hefezellen zu korrelieren, da Kalorienrestriktion die Lebensdauer der Hefezellen erhöht und den Zusammenbruch des Redox-Gleichgewichts verzögert. Die Oxidation einer kleinen Anzahl an Proteinen (z.B. Thioredoxin reductase) geht dem Redox-Zusammenbruch deutlich voraus, was maßgeblich zum Verlust der Redox-Homöostase beitragen könnte. Diese Studien an alternden Hefezellen erweitern unser Verständnis, wie sich Veränderungen in der Redox-Homöostase auf die Lebensdauer von Hefezellen auswirken. Zudem bestätigen die hier präsentierten Ergebnisse die Bedeutung von oxidativen Thiol-Modifikationen als eine der wichtigsten posttranslationalen Proteinmodifikationen in pro-und eukaryotischen Organismen
N2  - Cysteines play important roles in the biochemistry of many proteins. The high reactivity, redox properties, and ability of the free thiol group to coordinate metal ions designate cysteines as the amino acids of choice to form key catalytic components of many enzymes. Also, cysteines readily react with reactive oxygen and nitrogen species to form reversible oxidative thiol modifications. Over the last few years, an increasing number of proteins have been identified that use redox-mediated thiol modifications to modulate their function, activity, or localization. These redox-regulated proteins are central players in numerous important cellular processes. First aim of this study was to discover nitric oxide (NO) sensitive proteins in E. coli, whose redox-mediated functional changes might explain the physiological alterations observed in E. coli cells suffering from NO-stress. To identify E. coli proteins that undergo reversible thiol modifications upon NO-treatment in vivo, I applied a differential thiol trapping technique combined with two-dimensional gel analysis. 10 proteins were found to contain thiol groups sensitive to NO-treatment. Subsequent genetic studies revealed that the oxidative modifications of AceF & IlvC are, in part, responsible for the observed NO-induced growth inhibition. Noteworthy, the majority of identified protein targets turned out to be specifically sensitive towards reactive nitrogen species. This oxidant specificity was tested on one NO-sensitive protein, the small subunit of glutamate synthase. In vivo and in vitro activity studies demonstrated that glutamate synthase rapidly inactivates upon nitric oxide treatment but is resistant towards other oxidative stressors. These results imply that reactive oxygen and nitrogen species affect distinct physiological processes in bacteria. The second aim of my study was to identify redox-sensitive proteins in S. cerevisiae and to use their redox state as in vivo read-out to assess the role of oxidative stress during the eukaryotic aging process. I first determined the precise in vivo thiol status of almost 300 yeast proteins located in the cytosol and sub-cellular compartments of yeast cells using a highly quantitative mass spectrometry based thiol trapping technique, called OxICAT. The identified proteins can be clustered in four groups: 1) proteins, whose cysteine residues are oxidation resistant; 2) proteins with structurally or functionally important cysteine modifications 3) proteins with highly oxidation-sensitive active site cysteines, which are partially oxidized in exponentially growing yeast cells due to their exquisite sensitivity towards low amounts of ROS; 4) proteins that are reduced in exponentially growing cells but harbor redox-sensitive cysteine(s) that affect the catalytic function of the protein during oxidative stress. These oxidative stress sensitive proteins were identified by exposure of yeast cells to sublethal concentrations of H2O2 or superoxide. It was shown that the major targets of peroxide- and superoxide-mediated stress in the cell are proteins involved in translation, glycolysis, TCA cycle and amino acid biosynthesis. These targets indicate that cells rapidly redirect the metabolic flux and energy towards the pentose phosphate pathway in an attempt to ensure the production of the reducing equivalent NADPH to counterattack oxidative stress. These results reveal that the quantitative assessment of a protein’s oxidation state is a valuable tool to identify catalytically active and redox-sensitive cysteine residues. The OxICAT technology was then used to precisely determine extent and onset of oxidative stress in chronologically aging S. cerevisiae cells by utilizing the redox status of proteins as physiological read-out. I found that chronological aging yeast cells undergo a global collapse of the cellular redox homeostasis, which precedes cell death. The onset of this collapse appears to correlate with the yeast life span, as caloric restriction increases the life span and delays the redox collapse. These results suggest that maintenance of the redox balance might contribute to the life expanding benefits of regulating the caloric intake of yeast. Clustering analysis of all oxidatively modified proteins in chronological aging yeast revealed a subset of proteins whose oxidative thiol modifications significantly precede the general redox collapse. Oxidation of these early target proteins, which most likely results in a loss of their activity, might contribute to or even cause the observed loss of redox homeostasis (i.e., thioredoxin reductase) in chronologically aging yeast. These studies in aging yeast expand our understanding how changes in redox homeostasis affect the life span of yeast cells and confirm the importance of oxidative thiol modifications as key posttranslational modifications in pro- and eukaryotic organisms.
KW  - Oxidativer Stress
KW  - Cystein
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - Escherichia coli
KW  - Wasserstoffperoxid
KW  - Hyperoxide
KW  - Sauerstoffradikal
KW  - Thiolgruppe
KW  - Altern
KW  - Oxidation
KW  - Biologische Oxidation
KW  - Oxidative Thiol Modifikationen
KW  - Reaktive Sauerstoffspezies
KW  - Chronologisches Altern
KW  - Reversibel
KW  - Posttranslational
KW  - oxidative thiol modification
KW  - chronological aging
KW  - reactive oxygen species
KW  - Saccharomyces cerevisiae
KW  - thioredoxin reductase
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46542
ER  -