TY - THES A1 - Beliu, Gerti T1 - Bioorthogonale Tetrazin-Farbstoffe für die Lebendzell-Markierung und hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie T1 - Bioorthogonal tetrazine-dyes for live-cell labeling and super-resolution fluorescence microscopy N2 - Der genetische Code beschreibt die Ver- und Entschlüsselung der Erb-information für das universelle Prinzip der Proteinbiosynthese aus einzelnen Aminosäuren. Durch Erweiterung des genetischen Codes lassen sich unna-türliche Aminosäuren (uAA) mit einzigartigen biophysikalischen Eigenschaf-ten ortsspezifisch in Proteine einführen und ermöglichen die spezifische Ma-nipulation von Proteinen. Die Click-Reaktion zwischen der unnatürlichen Aminosäure TCO*-Lysin und Tetrazin besitzt eine außergewöhnliche Reaktionskinetik (≥800 M-1s-1) und ermöglicht eine spezifische und bioorthogonale Markierung von Bio- ¬molekülen unter physiologischen Bedingungen. Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Markierung von Membran- ¬rezeptoren durch Click-Chemie in lebenden Zellen sowie die Untersuchung der Wechselwirkung 22 bekannter und neuartiger Tetrazin-Farbstoff- Konjugate. Darüber hinaus wurde die Anwendbarkeit von bioorthogonalen Click-Reaktionen für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Durch Erweiterung des genetischen Codes in Proteine aus der Klasse der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluR), TNF-Rezeptoren oder Mikrotubu-li-assoziierten Proteinen (MAP) wurde ortspezifisch die unnatürliche Amino-säure TCO*-Lysin eingeführt und dadurch die Fluoreszenzmarkierung durch Tetrazin-Farbstoffe ermöglicht. Die direkte chemische Kopplung von TCO an Liganden wie Phalloidin und Docetaxel, welche spezifisch das Aktin-Zytoskelett bzw. Mikrotubuli-Filamente binden können, ermöglichte zudem die Click-Färbungen von fixierten und lebenden Zellen ohne genetische Ver-änderungen der Zielproteine. Des Weiteren wurden die spektroskopischen Eigenschaften von 22 Tetrazin-Farbstoffen, verteilt über den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich, untersucht. Ein charakteristisches Kennzeichen der Click-Reaktion mit Tet-razin-Farbstoffen ist dabei ihre Fluorogenität. Das Tetrazin fungiert nicht nur als reaktive Gruppe während der Click-Reaktion mit Alkenen, sondern führt in vielen Tetrazin-Farbstoff-Konjugaten zur Fluoreszenzlöschung. Während bei grün-absorbierenden Farbstoffe vor allem FRET-basierte Löschprozesse dominieren, konnte photoinduzierter Elektronentransfer (PET) vom angeregten Farbstoff zum Tetrazin als Hauptlöschmechanismus bei rot-absorbierenden Oxazin- und Rhodamin-Derivaten identifiziert werden. Die effiziente und spezifische Markierung aller untersuchten Tetrazin- Farbstoffe ermöglichte die Visualisierung von Aktin-Filamenten, Mikrotubuli und Membranrezeptoren sowohl durch konventionelle Fluoreszenzmikrosko-pie als auch durch hochauflösende Verfahren, wie z.B. dSTORM, auf Ein-zelmolekülebene. Die unterschiedliche Zellpermeabilität von Tetrazin-Farbstoffen kann dabei vorteilhaft für die spezifische intra- und extrazelluläre Markierung von Proteinen in fixierten und lebenden Zellen genutzt werden. N2 - The genetic code describes the encoding and decoding of genetic infor-mation for the universal principle of protein biosynthesis from individual amino acids. By expanding the genetic code, unnatural amino acids (uAA) with unique biophysical properties can be introduced site-specifically into pro-teins and enable the selective manipulation of proteins. The click reaction of the unnatural amino acid TCO*-lysine and tetrazine has an extraordinary reaction kinetic (≥800 M-1s-1) enabling the specific and bioorthogonal labeling of biomolecules under physiological conditions. The main focus of this work was the labeling of membrane receptors by click chemistry in living cells and the investigation of the interaction of 22 known and novel tetrazine dye conjugates. In addition, the applicability of bioorthogonal click reactions for high-resolution fluorescence microscopy was investigated. For this purpose, the unnatural amino acid TCO*-lysine was introduced site-specifically via genetic code expansion into proteins from the class of iono-tropic glutamate receptors (iGluR), TNF receptors or microtubule- associated proteins (MAP), thereby enabling fluorescence labeling with tetrazine dyes. The direct chemical coupling of TCO to ligands such as phalloidin and docetaxel, which can specifically bind the actin cytoskeleton or microtubule filaments, allowed click staining of fixed and living cells without genetic modifications of the target proteins. Furthermore, the spectroscopic properties of 22 tetrazine dyes spanning the entire visible wavelength range were investigated. A hallmark of the click reaction using tetrazine dyes is their fluorogenicity. Thus, the tetrazine not only functions as a reactive group during the click reaction with alkenes, but also leads to fluorescence quenching in many tetrazine-dye conjugates. While FRET-based quenching processes dominate in green-absorbing dyes, photoinduced electron transfer (PET) from excited dye to tetrazine has been identified as the main quenching mechanism in red-absorbing oxazine and rhodamine derivatives. The efficient and specific labeling of all investigated tetrazine dyes facilitates the visualization of actin filaments, microtubules and membrane receptors by conventional fluorescence microscopy as well as by super-resolution microscopy techniques, e.g. dSTORM, also at single molecule level. The different cell permeability of tetrazine dyes can be used advantageously for the specific intra- and extracellular labeling of proteins in fixed and living cells. KW - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie KW - Tetrazin Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189628 ER - TY - THES A1 - Eiring, Patrick T1 - Super-resolution microscopy of plasma membrane receptors T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Plasmamembran Rezeptoren N2 - Plasma membrane receptors are the most crucial and most commonly studied components of cells, since they not only ensure communication between the extracellular space and cells, but are also responsible for the regulation of cell cycle and cell division. The composition of the surface receptors, the so-called "Receptome", differs and is characteristic for certain cell types. Due to their significance, receptors have been important target structures for diagnostic and therapy in cancer medicine and often show aberrant expression patterns in various cancers compared to healthy cells. However, these aberrations can also be exploited and targeted by different medical approaches, as in the case of personalized immunotherapy. In addition, advances in modern fluorescence microscopy by so-called single molecule techniques allow for unprecedented sensitive visualization and quantification of molecules with an attainable spatial resolution of 10-20 nm, allowing for the detection of both stoichiometric and expression density differences. In this work, the single molecule sensitive method dSTORM was applied to quantify the receptor composition of various cell lines as well as in primary samples obtained from patients with hematologic malignancies. The focus of this work lies on artefact free quantification, stoichiometric analyses of oligomerization states and co localization analyses of membrane receptors. Basic requirements for the quantification of receptors are dyes with good photoswitching properties and labels that specifically mark the target structure without generating background through non-specific binding. To ensure this, antibodies with a predefined DOL (degree of labeling) were used, which are also standard in flow cytometry. First background reduction protocols were established on cell lines prior analyses in primary patient samples. Quantitative analyses showed clear expression differences between the cell lines and the patient cells, but also between individual patients. An important component of this work is the ability to detect the oligomerization states of receptors, which enables a more accurate quantification of membrane receptor densities compared to standard flow cytometry. It also provides information about the activation of a certain receptor, for example of FLT3, a tyrosine kinase, dimerizing upon activation. For this purpose, different well-known monomers and dimers were compared to distinguish the typical localization statistics of single bound antibodies from two or more antibodies that are in proximity. Further experiments as well as co localization analyses proved that antibodies can bind to closely adjacent epitopes despite their size. These analytical methods were subsequently applied for quantification and visualization of receptors in two clinically relevant examples. Firstly, various therapeutically relevant receptors such as CD38, BCMA and SLAMF7 for multiple myeloma, a malignant disease of plasma cells, were analyzed and quantified on patient cells. Furthermore, the influence of TP53 and KRAS mutations on receptor expression levels was investigated using the multiple myeloma cell lines OPM2 and AMO1, showing clear differences in certain receptor quantities. Secondly, FLT3 which is a therapeutic target receptor for acute myeloid leukemia, was quantified and stoichiometrically analyzed on both cell lines and patient cells. In addition, cells that have developed resistance against midostaurin were compared with cells that still respond to this type I tyrosine-kinase-inhibitor for their FLT3 receptor expression and oligomerization state. N2 - Plasmamembranrezeptoren sind die wohl wichtigsten und meist untersuchten Komponenten einer Zelle, da sie nicht nur die Kommunikation zwischen dem extrazellulären Bereich und den Zellen gewährleisten, sondern auch für die Regulierung des Zellzyklus und der Zellteilung zuständig sind. Dabei unterscheidet sich die Zusammensetzung der Oberflächenrezeptoren, das sogenannte „Rezeptom“, und ist charakteristisch für bestimme Zelltypen. Aufgrund ihrer Bedeutsamkeit sind Rezeptoren wichtige Zielstrukturen für Diagnose und Therapie in der Krebsmedizin, welche häufig bei verschiedensten Krebserkrankungen im Vergleich zu gesunden Zellen aberrante Expressionsmuster aufweisen. Diese Abweichungen können sich allerdings auch zu Nutze gemacht werden und zum Ziel verschiedener medizinischer Behandlungsmethoden, wie es bei der personalisierten Immuntherapie der Fall ist, werden. Zusätzlich hat der Fortschritt in der modernen Fluoreszenzmikroskopie durch sogenannte Einzelmolekültechniken, es auch erlaubt, eine noch nie dagewesene empfindliche Visualisierung und Quantifizierung von Molekülen mit einer räumlichen Auflösung von 10-20 nm zu erreichen, wodurch sowohl stöchiometrische Unterschiede, als auch Unterschiede in der Expressionsdichte detektiert werden können. In dieser Arbeit wurde die einzelmolekülsensitive Methode dSTORM genutzt, um die Rezeptorkomposition von verschiedenen Zelllinien aber auch von primären Patientenzellen mit zugrundeliegenden hämatologischen Erkrankungen zu quantifizieren. Schwerpunkte dieser Arbeit sind dabei die artefaktfreie Quantifizierung, stöchiometrische Analysen von Oligomerisierungszuständen, sowie die Kolokalisationsanalyse von Membranrezeptoren. Grundvoraussetzung für die Quantifizierung von Rezeptoren sind dabei gut schaltbare Farbstoffe, sowie Label, welche die Zielstruktur spezifisch markieren ohne dabei Hintergrund durch unspezifische Bindung zu generieren. Um dies zu gewährleisten, kamen Antikörper mit einem vordefinierten DOL (degree of labeling; engl. für: Markierungsgrad) zum Einsatz, welche auch in der Durchflusszytometrie standardmäßig eingesetzt werden. Protokolle zur Hintergrundreduktion wurden dabei an Zelllinien etabliert, bevor Primärzellen von Krebspatienten analysiert wurden. Durch quantitative Analysen konnten dabei deutliche Expressionsunterschiede zwischen den Zelllinien und den Patientenzellen, aber auch zwischen den verschiedenen Patienten gezeigt werden. Ein wichtiger Bestandteil dieser Arbeit ist die Fähigkeit, den Oligomerisierungszustand von Rezeptoren zu erkennen, was eine genauere Quantifizierung der Membran-rezeptordichten im Vergleich zur Durchflusszytometrie ermöglicht. Allerdings können diese Oligomerisierungszustände auch Informationen über die Aktivierung eines Rezeptors beinhalten, wie zum Beispiel von FLT3, einer Tyrosinkinase, welche zur Aktivierung dimerisieren muss. Hierfür wurden verschiedene bekannte Monomere und Dimere verglichen, um die typische Lokalisationsstatistik von vereinzelten gebundenen Antikörpern mit der von zwei oder mehr Antikörpern, welche nah beieinanderliegen, zu vergleichen. Durch weitere Etablierungsexperimente sowie Kolokalisationsanalysen konnte außerdem bewiesen werden, dass Antikörper trotz ihrer Größe auch an nah benachbarte Epitope binden können. Diese Analyseverfahren wurden im weiteren Verlauf zur Quantifizierung und Visualisierung von Rezeptoren an zwei klinisch relevanten Beispielen angewendet. Zum einen wurden verschiedene therapeutisch relevante Rezeptoren wie z.B. CD38, BCMA und SLAMF7 für das Multiple Myelom, einer malignen Erkrankung von Plasmazellen, auf Patientenzellen analysiert und quantifiziert. Zusätzlich wurde der Einfluss von TP53 und KRAS Mutationen auf die Rezeptorexpressionen anhand der Multiplen Myelom Zelllinien OPM2 und AMO1 untersucht, bei denen eindeutige Unterschiede in der Rezeptorexpression detektiert wurden. Zum anderen wurde FLT3, welches ein therapeutischer Zielrezeptor für die akute myeloische Leukämie ist, sowohl auf Zelllinien als auch auf Patientenzellen quantifiziert und stöchiometrisch analysiert. Hierbei wurden auch Zellen welche eine Midostaurinresistenz entwickelt haben mit Zellen, welche auf diesen Typ I Tyrosinkinase Inhibitor ansprechen, auf ihre FLT3 Rezeptorexpression und ihren Oligomerisierungszustand verglichen. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Membranrezeptor KW - Hochaufgelöste Fluoreszenzmikroskopie KW - Super-resolution microscopy KW - Membrane receptor Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250048 ER -