TY - THES A1 - Osterloh, Lisa T1 - Identifizierung und Charakterisierung LIN-9 regulierter Gene im humanen System - Die Rolle von LIN-9 in der Regulation des Zellzyklus T1 - Identification and characterization of LIN-9 regulated genes in the human system - The role of LIN-9 in the regulation of the cell cycle N2 - Das humane LIN-9 wurde zuerst als pRB-interagierendes Protein beschrieben und spielt eine Rolle als Tumorsuppressor im Kontext des pRB-Signalweges. Über die molekulare Funktion von LIN-9 ist jedoch wenig bekannt. Die Homologe von LIN-9 in D. melanogaster und in C. elegans, sind an der transkriptionellen Regulation verschiedener Genen beteiligt. Dies und die Tatsache, dass LIN-9 mit pRB in der Aktivierung differenzierungspezifischer Gene kooperiert, ließ vermuten, dass humanes LIN-9 einen bedeutenden Einfluss auf die transkriptionelle Regulation von Genen haben könnte. Primäres Ziel dieser Arbeit war daher die Identifizierung LIN-9 regulierter Gene. Dazu sollte mit Hilfe von cDNA-Microarray Analysen, das Genexpressionsprofil LIN-9 depletierter primärer humaner Fibroblasten (BJ ET Zellen) im Vergleich zu Kontrollzellen untersucht werden. Hierfür wurde zunächst ein RNAi-basierendes System etabliert, um die posttranskriptionelle Expression von LIN-9 in BJ-ET Zellen effizient zu reprimieren. Auf dem Ergebnis der cDNA-Microarray Analysen aufbauende Untersuchungen sollten Aufschluss über die molekularbiologische Funktion von LIN-9 geben. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass der Verlust von LIN-9 zu einer verminderten Expression einer Gruppe G2/M-spezifischer Gene führt, deren Produkte für den Eintritt in die Mitose benötigt werden. Bekannt war, dass ein Teil dieser Gene durch den Transkriptionsfaktor B-MYB koreguliert wird. Zudem konnten Untersuchungen in unserem Labor eine Interaktion von LIN-9 und B-MYB auf Proteinebene, sowie die Bindung beider Proteine an die Promotoren der LIN-9 regulierten G2/M-Gene nachweisen. Dies lässt vermuten, dass LIN-9 und B-MYB gemeinsam die Expression der G2/M-Gene kontrollieren. Die verminderte Expression von G2/M-Genen in LIN-9 bzw. B-MYB depletierten Zellen geht mit einer Reihe phänotypischer Veränderungen einher, wie einer deutlich verlangsamten Proliferation und einer Akkumulation der Zellen in der G2/M-Phase. Mit Hilfe eines Durchflusszytometers erstellte Zellzykluskinetiken ergaben, dass die Progression LIN-9 bzw. B-MYB depletierter Fibroblasten von der S-Phase durch die G2/M-Phase und in die nächste G1-Phase deutlich verzögert ist. Es konnte weder ein Arrest dieser Zellen in der Mitose noch eine veränderte Länge der S-Phase nach LIN-9 oder B-MYB Depletion festgestellt werden. Daher ist die verlangsamte Zellzyklusprogression nach LIN-9 bzw. B-MYB Verlust höchstwahrscheinlich auf einen Defekt in der späten G2-Phase zurückzuführen, welcher in einem verzögerten Eintritt in die Mitose resultiert. In D. melanogaster und in C. elegans sind die Homologe von LIN-9 und B-MYB zusammen, als Bestandteile hoch konservierter RB/E2F-Komplexe, an der Regulation von Genen entscheidend beteiligt. Daher liegt es nahe, dass im humanen System LIN-9 und B MYB ebenfalls Bestandteile eines ähnlichen Komplexes sind und dadurch die Aktivierung der LIN 9 abhängigen G2/M-Gene vermitteln. Die Tatsache, dass LIN-9 sowohl als Tumorsuppressor, als auch als positiver Regulator des Zellzyklus fungiert, lässt vermuten, dass LIN-9 zu einer stetig größer werdenden Gruppe von Proteinen gehört, welche in Abhängigkeit vom zellulären und genetischen Kontext sowohl tumorsuppressive als auch onkogene Funktionen besitzen. N2 - The human LIN-9 Protein was first identified as a novel pRB-interacting Protein which acts as a tumorsuppressor in context of the pRB-pathway. But the molecular function of LIN-9 is poorly unterstood. The homologs of LIN-9 in D. melanogaster and C. elegans are required for the transcriptional regulation of different genes. This and the fact, that LIN 9 cooperates with pRB in the activation of differentiation specific genes let to the hypothesis, that human LIN-9 could play an important role in the transcriptional regulation of genes. Thus, the primary goal of this thesis was to identify genes which are regulated by LIN-9. For that purpose, the genexpression profiles of LIN-9 depelted primary human fibroblasts (BJ ET cells) in comparison to control cells should be analyzed by a cDNA-microarray approach. Therefor an RNAi-based system was established, that efficiently represses the posttranscriptional expression of LIN-9 in BJ-ET cells. Based on the outcome of the cDNA microarray analysis, further studies should provide more informations about the molecular function of LIN-9. It was possible to show, that the loss of LIN-9 leads to a reduced expression of a cluster of G2/M-specific genes, whose products are required for timely entry into mitosis. It was known, that some of these genes are coregulated by the transcriptionfactor B-MYB. Moreover, studies in our lab account for the interaction of LIN-9 and B-MYB on protein level and the binding of both proteins to the promotors of LIN-9 regulated G2/M-genes. The reduced expression of these genes is accompanied by phenotypically changes, such as strongly impaired proliferation and an accumulation of these cells in the G2/M-Phase. Cell cycle kinetics generated by flowcytometry revealed that the progression of LIN-9 or B MYB depleted cells from S-phase to G2/M-phase and into the next G1-Phase is significantly delayed. Depletion of LIN-9 or B-MYB results neither in an arrest in mitosis nor in a significantly changed S-phase length of these cells. This indicates that the slowed progression is most likely due to a defect in the late G2-phase, which results in a delayed entry into mitosis. The homologs of LIN-9 and B-MYB in D. melanogaster and C. elegans act together as subunits of highly conserved RB/E2F-complexes in the regulation of genes. This let to the suggestion, that LIN-9 and B-MYB are also components of a similar complex in humans and thereby mediate the activation of LIN-9 regulated G2/M-genes. Because LIN-9 acts as a tumorsuppressor in the pRB-pathway as well as an positive regulator of the cell cycle, it seems that LIN-9 belongs to an increasing group of proteins, which function as context dependent tumorsuppressors and oncogenes. KW - Zellzyklus KW - Mitose KW - Genregulation KW - Microarray KW - G2/M-Übergang KW - LIN-9 KW - B-MYB KW - E2F KW - Transkription KW - G2/M-transition KW - LIN-9 KW - B-MYB KW - E2F KW - transcription Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24360 ER - TY - THES A1 - Mannefeld, Mirijam T1 - Role of the human LIN complex in DNA damage induced regulation of gene expression T1 - Die Rolle des humanen LIN Komplex in der Genregulation nach DNA Schädigung N2 - In jeder menschlichen Zelle entstehen täglich ca. 10.000 – 150.000 endogene DNA Schäden. Eine Anhäufung dieser Läsionen kann zu genetischer Instabilität führen und dadurch zur Krebsentwicklung beitragen. Daher ist eine schnelle DNA Schadensantwort nötig, um schwerwiegende Folgen für die Zelle zu vermeiden. Da bekannt ist, dass der Multiproteinkomplex LINC (auch humaner dREAM-Komplex genannt) an der transkriptionellen Regulation mitotischer und G2-spezifischer Gene beteiligt ist, sollte in dieser Arbeit seine Beteiligung an der DNA Schadensantwort genauer untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass in normal wachsenden Zellen B-MYB an den LINC-Kernkomplex bindet, welcher sich aus 5 Proteinen zusammensetzt: LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 und RbAp48. Treten DNA Schäden auf, dissoziiert B-MYB vom LINC Kernkomplex wobei gleichzeitig die Bindung von p130 und E2F4 an LINC induziert wird. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass der Signalweg, der die LINC Umlagerung vermittelt, sowohl p53- als auch p21-abhängig ist. p53 negative Zellen können nach Schädigung der DNA weder einen G1 Block induzieren noch einen G2 Block langfristig aufrechterhalten. Eine Erklärung für diese Schwächung des G2 Arrests liefern Daten dieser Arbeit: Da in DNA geschädigten p53 -/- Zellen keine LINC Umlagerung beobachtet werden kann und zusätzlich B-MYB verstärkt an LINC und die Zielpromotoren bindet, kommt es zu einer erhöhten G2/M Genexpression. Dies resultiert häufig in einem verfrühten Wiedereintritt in den Zellzyklus („checkpoint adaptation“). Eine Daten-Analyse primärer Brustkrebstumore zeigte außerdem, dass erhöhte B-MYB Genexpressionslevel mit einer erhöhte Rückfallgefahr und einer schlechten Prognose korrelieren, was möglicherweise auf die Funktion von B-MYB während der „checkpoint adaptation“ zurückzuführen ist. Schlussendlich lassen die Ergebnisse dieser Arbeit vermuten, dass die Hemmung der B-MYB Funktion in solchen Tumoren, die p53 Mutationen tragen, die Wahrscheinlichkeit eines Behandlungserfolges vergrößern und die Wahrscheinlichkeit eines Rückfalls senken könnte. N2 - Around 10.000 – 150.000 endogenous DNA damage-induced lesions occur in a human body per day and cell. Accumulation of unrepaired lesions can lead to aneuploidy and the loss of genomic integrity which in turn contributes to tumor formation. Therefore, an efficient DNA damage response has to be initiated, in the end leading to cell cycle inhibition and induction of repair. Since it is known that a recently characterized human multiprotein complex named LINC (or human dREAM) together with B-MYB is involved in the regulation of G2/M gene expression (Plk1, cyclin B1, cdc2 etc.), its function in the DNA damage response was analyzed in this study. In growing cells B-MYB is associated to the LIN core complex which consists of 5 different proteins named LIN-9, LIN-54, LIN-52, LIN-37 and RbAp48. After induction of DNA damage B-MYB leaves the complex and binding of E2F4 and p130 to LINC is induced. Importantly, the upstream pathway leading to LINC rearrangement is dependent on the activation of p53 and p21. Interestingly, p53 -/- cells solely have the potential to block in the G2 phase of the cell cycle, thereby making them vulnerable for errors during G2 arrest induction or maintenance. Here I demonstrate that LINC rearrangement is absent in p53 -/- cells and that B-MYB/LINC binding to target gene promoters is increased. This in turn leads to an increased G2/M gene expression after DNA damage induction and triggers premature cell cycle re-entry (checkpoint adaptation). Significantly, B-MYB expression is increased in p53 mutated primary breast cancer tumors and correlates with poor prognosis and reoccurrence probably due to its function in checkpoint adaptation. This study gives evidence that inhibition of B-MYB gene expression or B-MYB function in p53 mutant tumors could be a good choice for adjuvant therapy. KW - Zellzyklus KW - DNS-Schädigung KW - Myb KW - Mitose KW - Genregulation KW - LIN-9 KW - LINC KW - DNA-Schadensantwort KW - Checkpoint recovery KW - Checkpoint adaptation KW - LIN-9 KW - LINC KW - DNA damage response KW - Checkpoint recovery KW - Checkpoint adaptation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39261 ER -