TY  - THES
A1  - Föger, Niko
T1  - Costimulatory function of CD44
T1  - Die kostimulatorische Funktion von CD44
N2  - T cell activation is supposed to require two signals via engagement of the TCR and a costimulatory molecule. However, the signaling cascade of costimulatory molecules has remained elusive. Here, I provide evidence that CD44 supports proliferation as well as apoptosis mainly, if not exclusively, by enhancing signal transduction via the TCR/CD3 complex. Blockade of CD44 interferes with mounting of an immune response. This has been demonstrated by the significantly decreased IL-2 production of a T helper line, when stimulated in the presence of a competing CD44 receptor globulin. To evaluate the underlying mechanism, CD44 was cross-linked by an immobilized antibody (IM7). Cross-linking of CD44 induces proliferation of peripheral T cells and apoptosis of thymocytes and a T helper line in the presence of subthreshold levels of anti-CD3. CD44-induced proliferation was accompanied by an upregulation of the activation markers CD25 and CD69 and an increased cytokine production. TCR-mediated apoptosis was accompanied by an upregulation of CD95 ligand and CD95 receptor, which could be greatly enhanced by costimulation via CD44. On the level of signal transduction, coligation of CD44 with CD3 resulted in a strong and sustained increase of early tyrosine phosphorylation events and upregulated downstream signal transduction pathways, such as the ras/ERK and the JNK signaling cascades. These pleiotropic effects of CD44 are due to its involvement in the most proximal events in TCR signaling, as demonstrated by a strong increase in the phosphorylation of the TCR z-chain and ZAP-70. Notably, cross-linking of CD44 was binding-site dependent and was only effective when supporting colocalization of the TCR/CD3 complex and CD44. Cross-linking of CD44 via immobilized IM7 also induced profound changes in cell morphology, characterized by strong adhesion, spreading and development of surface extensions, which were dependent on a functional tubulin and actin cytoskeleton. These cytoskeletal rearrangements were mediated by rac1, a small GTPase of the rho subfamily, and src-family kinases, two of which, fyn and lck, were found to be associated with CD44. By cross-linkage of CD44 these kinases were redistributed into so called lipid rafts. It is supposed that for T cell activation a relocation of the TCR/CD3 complex into the same membrane microdomains is required. The data are interpreted in the sense that the costimulatory function of CD44 relies on its cooperativity with the TCR. Most likely by recruitment of phosphokinases CD44 significantly lowers the threshold for the initiation of signaling via the TCR. The requirement for immobilized anti-CD44, the necessity for neighbouring anti-CD3 and the dependence on the binding site of CD44 strongly suggest that the costimulatory mechanism involves cytoskeletal rearrangements, which facilitate recruitment and redirection of src-family protein kinases in glycolipid enriched membrane microdomains.
N2  - Es ist bekannt, dass die Aktivierung von T-Zellen zwei Signale erfordert, die Bindung des T-Zell-Rezeptors (TZR) an den Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex und die Bindung sogenannter kostimulatorischer Moleküle an ihren Liganden. Über diese Rezeptor-Liganden-Interaktionen wird eine Kettenreaktion von Signalen ausgelöst, die die Aktivierung einer ganzen Reihe von Genen bewirken. Die Signale die über die Liganden Bindung des TZR in Gang gesetzt werden, sind weitgehend bekannt. Hingegen ist unser Wissen über das Funktionsprinzip kostimulatorischer Moleküle äußerst lückenhaft. In der vorliegenden Arbeit wird aufgezeigt, dass und auf welche Weise CD44, eines dieser kostimulatorischen Moleküle, maßgeblich zur Verstärkung der über den TZR transduzierten Signale beiträgt. Ausgangspunkt der vorgelegten Studie war der Befund, dass eine Blockade von CD44, z.B. mittels eines kompetitiven löslichen CD44 Moleküls, die Antigen-induzierte Aktivierung einer T-Zelllinie blockieren kann. Zur Klärung des zugrunde liegenden Mechanismus wurde CD44 mittels immobilisierter Antikörper quervernetzt. Bei gleichzeitiger, suboptimaler Stimulation des T-Zell-Rezeptors induzierte die Quervernetzung von CD44 zum einen die Proliferation reifer T-Zellen, zum anderen den apoptotischen Zelltod von Thymozyten beziehungsweise einer T-Helferzelllinie. Erwartungsgemäß war die CD44-induzierte Proliferation mit der Expression sogenannter Aktivierungsmarker wie CD25 und CD69 und einer erhöhten Zytokinproduktion verbunden. Dementsprechend wurde bei CD44-induzierter Apoptose eine deutlich gesteigerte Expression des CD95 Moleküls und seines Liganden beobachtet. Die kostimulatorische Aktivität von CD44 war mit einer gesteigerten Tyrosinphosphorylierung und einer Hochregulation der ras/ERK und JNK Signalkaskaden verbunden. Da von allen beobachteten Veränderungen bekannt ist, dass sie auch über die Besetzung des TZR mit einem geeigneten Stimulus ausgelöst werden können, war es naheliegend anzunehmen, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine Verstärkung der TZR-vermittelten Signale zurückführen läßt. Der Befund einer gesteigerten Phosphorylierung der TZR-z-Kette und der ZAP-70 Kinase, über die die Aktivierung von T-Zellen eingeleitet wird, unterstützt nachhaltig diese Hypothese. Hinzu kommen zwei weitere Befunde: 1. Die Quervernetzung von CD44 führt nur unter der Voraussetzung einer räumlichen Annäherung von CD44 und dem TZR zu einer Unterstützung der T-Zellaktivierung. Diese findet in sogenannten "Rafts" statt; 2. Die Quervernetzung von CD44 führt zu Adhäsion und Zellspreitzung, bedingt durch ein Rearrangement des Zytoskeletts an dem die GTPase rac1 und die src-Kinasen fyn und lck beteiligt sind. Diese beiden Kinasen sind konstitutiv mit CD44 assoziiert. Bei Quervernetzung des Moleküls und Reorganisation des Zytoskeletts wird eine deutliche Anreicherung von fyn und lck in den Rafts, also in direkter Nachbarschaft zum TZR, beobachtet. Diese Daten unterstützen nachhaltig meine Arbeitshypothese, dass sich die kostimulatorische Funktion von CD44 auf eine kooperative Aktivität mit dem TZR zurückführen läßt. Es ist wahrscheinlich, dass durch Rekrutierung der Kinasen lck und fyn der Schwellenwert für die Initiierung von Signalen über den TZR signifikant erniedrigt wird. Die Rekrutierung dieser Kinasen wird durch eine Reorganisation des Zytoskeletts, die mit der Einbringung dieser Kinasen in den Bereich der Rafts einhergeht, ermöglicht. Inwieweit die erhobenen Befunde zur kostimulatorischen Aktivität des Adhäsionsmoleküls CD44 im Sinne eines Verstärkungs-mechanismus eingeleitet durch räumliche Annäherung generelle Gültigkeit haben, kann noch nicht abschließend beantwortet werden. Die Mehrheit der in jüngster Zeit erhobenen Befunde zur Klärung des Funktionsprinzips kostimulatorischer Moleküle bestätigt jedoch das Prinzip nachbarschaftlicher Kooperation.
KW  - Antigen CD44
KW  - T-Lymphozyten-Rezeptor
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Aktivierung <Physiologie>
KW  - T-Lymphozyten
KW  - Signal Transduktion
KW  - Kostimulatorisches Molekül
KW  - T-Zell-Rezeptor
KW  - Lipid Mikrodomänen
KW  - Aktin-Zytoskelett
KW  - T lymphocytes
KW  - signal transduction
KW  - costimulatory molecule
KW  - T cell receptor
KW  - lipid microdomains
KW  - actin cytoskeleton
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1186
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seitz, Sabine
T1  - Identifikation und Charakterisierung von autoreaktiven humanen T-Zell-Rezeptor Molekülen
T1  - Identification and characterisation of autoreactive human T cell receptor molecules
N2  - Die Multiple Sklerose und die entzündlichen Muskelerkrankungen Polymyositis und Einschlusskörperchenmyositis sind Autoimmunerkrankungen, in denen T-Lymphozyten in das Gehirn bzw. den Muskel eindringen und dort körpereigenes Gewebe zerstören. Die Pathogenese dieser Krankheiten ist bis jetzt noch nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, die ins Zielgewebe eingedrungenen autoaggressiven T-Lymphozyten aus gefrorenem Biopsiegewebe zu isolieren, ihren ab-T-Zell-Rezeptor zu analysieren und diesen rekombinant zu exprimieren. Folgeversuche mit den TZR-Transfektanten sollten erste Hinweise auf ein mögliches Antigen liefern. Um autoaggressive T-Zellen von irrelevanten zu unterscheiden, konzentrierten wir uns auf Zellen, die zum einen im Zielgewebe klonal expandiert vorlagen, zum anderen einen direkten morphologischen Kontakt mit der Zielzelle aufwiesen. Wir untersuchten das T-Zell-Repertoire verschiedener Patienten auf klonal expandierte Populationen durch CDR3-Spektratyping und isolierten positiv gefärbte Kandidatenzellen durch Lasermikrodissektion aus dem Gewebe. Anschließend wurden die T-Zell-Rezeptoren mit einer speziellen, im Rahmen der Arbeit entwickelten Einzelzell-Muliplex-RT-PCR analysiert. Bisher war es nicht möglich, die a- und b-Kette desselben T-Zell-Rezeptors aus Biopsiematerial zu identifizieren. Dies lag an der geringen Anzahl verfügbarer anti-a-Ketten-Antikörper sowie an der wesentlich höheren Variabilität der a-Ketten-Gene. Aus dem Biopsiegewebe eines Patienten isolierten wir 23 ab-TZR-Pärchen, welche alle die identische expandierte TZR-b-Kette zeigten. 20 der 23 Zellen wiesen eine identische a-Kette auf. Die Dominanz des TZR ist ein Hinweis auf die pathogene Relevanz dieses T-Zell-Klons. Die anderen drei Zellen zeigten drei unterschiedliche funktionelle a-Ketten. Aus der Biopsie eines zweiten Patienten isolierten wir zwei weitere ab-TZR-Pärchen. Die vier Rezeptoren des ersten Patienten wurden in einer T-Zell Hybridom Zellinie exprimiert. Vorläufige Versuche, ein mögliches Antigen zu detektieren, zeigten, dass es sich wahrscheinlich weder um ein muskelspezifisches Antigen noch um ein ubiquitär exprimiertes Selbst-Antigen handelt. Die hier beschriebene Methode der Isolierung und Analyse von autoaggressiven T-Lymphozyten kann man nicht nur zur Untersuchung des TZR-ab-Repertoires von Myositis- oder MS-Patienten einsetzen. Sie ist ebenfalls geeignet, andere Autoimmunerkrankungen sowie Tumor- oder Infektionserkrankungen zu untersuchen.
N2  - Multiple sclerosis and the inflammatory muscle diseases polymyositis and inclusion body myositis are autoimmune diseases. T cells invade and destroy brain tissue or muscle fibers, respectively. The pathogenesis of these diseases is still unknown. The aim of this thesis was to isolate tissue invading autoaggressive T-lymphocytes from frozen biopsy specimens, to analyse their T cell receptor a-and b-chains and to express the receptors in a recombinant expression system. This may provide a tool to search for possible antigens. To distinguish pathogenic from irrelevant bystander cells we used two criteria: the clonal expansion in the target tissue triggered by antigen induced proliferation and the direct morphological contact with a target cell. We analysed the T cell repertoire of different patients by CDR3-spectratyping to find clonal expanded populations and isolated immunohistochemically stained candidate cells by laser microdissection. Then we identified coexpressed pairs of a- and b-chains by a newly developed multiplex PCR protocol. The detection of matching a- and b-chains in histological sections has not been achieved until now. The a-chain analysis has been a great problem because of the paucity of available a-chain antibodies and the great variability of the a-chain genes. From the tissue of one patient we isolated 23 ab-T cell receptor pairs which expressed the same expanded T cell receptor b-chain. 20 of these 23 a-chains were identical, suggesting a pathogenic relevance of this T cell clone. The a-chains of the three other T cells were different. We characterized two further clones from another patient. The receptors from the first patient were expressed in a T hybridoma cell line. Initial studies to identify possible antigens revealed that the T cell receptors did not recognize a muscle specific antigen nor a widely expressed self-antigen. This method for the analysis and reconstruction of tissue-infiltrating ab-T cells can be applied to many other autoimmune diseases as well as tumors or infectious diseases.
KW  - Autoaggressionskrankheit
KW  - T-Lymphozyten-Rezeptor
KW  - Autoimmunerkrankungen
KW  - T-Zell-Rezeptor
KW  - Laser-Mikrodissektion
KW  - Einzelzell-PCR
KW  - Antigensuche
KW  - autoimmune diseases
KW  - T cell receptor
KW  - laser microdissection
KW  - single cell PCR
KW  - antigensearch
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22511
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - De Lira, Maria Nathalia
A1  - Raman, Sudha Janaki
A1  - Schulze, Almut
A1  - Schneider-Schaulies, Sibylle
A1  - Avota, Elita
T1  - Neutral Sphingomyelinase-2 (NSM 2) Controls T Cell Metabolic Homeostasis and Reprogramming During Activation
JF  - Frontiers in Molecular Biosciences
N2  - Neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) is a member of a superfamily of enzymes responsible for conversion of sphingomyelin into phosphocholine and ceramide at the cytosolic leaflet of the plasma membrane. Upon specific ablation of NSM2, T cells proved to be hyper-responsive to CD3/CD28 co-stimulation, indicating that the enzyme acts to dampen early overshooting activation of these cells. It remained unclear whether hyper-reactivity of NSM2-deficient T cells is supported by a deregulated metabolic activity in these cells. Here, we demonstrate that ablation of NSM2 activity affects metabolism of the quiescent CD4\(^+\) T cells which accumulate ATP in mitochondria and increase basal glycolytic activity. This supports enhanced production of total ATP and metabolic switch early after TCR/CD28 stimulation. Most interestingly, increased metabolic activity in resting NSM2-deficient T cells does not support sustained response upon stimulation. While elevated under steady-state conditions in NSM2-deficient CD4\(^+\) T cells, the mTORC1 pathway regulating mitochondria size, oxidative phosphorylation, and ATP production is impaired after 24 h of stimulation. Taken together, the absence of NSM2 promotes a hyperactive metabolic state in unstimulated CD4\(^+\) T cells yet fails to support sustained T cell responses upon antigenic stimulation.
KW  - neutral sphingomyelinase-2
KW  - T cell receptor
KW  - Seahorse XF
KW  - oxidative phosphorylation
KW  - ATP-adenosine triphosphate
KW  - Mitochondria
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211311
SN  - 2296-889X
VL  - 7
ER  -