TY - JOUR A1 - Endesfelder, Ulrike A1 - Malkusch, Sebastian A1 - Flottmann, Benjamin A1 - Mondry, Justine A1 - Liguzinski, Piotr A1 - Verveer, Peter J. A1 - Heilemann, Mike T1 - Chemically Induced Photoswitching of Fluorescent Probes - A General Concept for Super-Resolution Microscopy N2 - We review fluorescent probes that can be photoswitched or photoactivated and are suited for single-molecule localization based super-resolution microscopy. We exploit the underlying photochemical mechanisms that allow photoswitching of many synthetic organic fluorophores in the presence of reducing agents, and study the impact of these on the photoswitching properties of various photoactivatable or photoconvertible fluorescent proteins. We have identified mEos2 as a fluorescent protein that exhibits reversible photoswitching under various imaging buffer conditions and present strategies to characterize reversible photoswitching. Finally, we discuss opportunities to combine fluorescent proteins with organic fluorophores for dual-color photoswitching microscopy. KW - Super-Resolution Microscopy KW - photoswitchable organic fluorophores KW - fluorescent proteins KW - super-resolution KW - PALM KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74896 ER - TY - THES A1 - Vogel, Benjamin T1 - Organisation von Chromatin durch HMGA1 Proteine T1 - Organisation of chromatin through HMGA1 proteins N2 - HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts. N2 - HMGA1 proteins are small basic non-histone proteins characterized by three DNA binding domains, the AT-hooks, which bind to the minor groove of DNA. As differentially expressed architectural chromatin proteins, they perform important functions in the regulation of DNA dependent processes and in development. Aberrant expression leads to developmental defects and cancer. In this thesis the influence of HMGA1 proteins on chromatin organization is investigated. Initially C2C12 myogenic precursor cells were studied, which can be differentiated to myotubes. Previously it had been shown that down-regulation of HMGA1 proteins is crucial for the initiation of myogenic differentiation. Constant over-expression of HMGA1a-eGFP prevents myogenic differentiation by influencing the expression of myogenic genes and by the establishment of a stable chromatin structure. Here it was shown that the differential HMGA1 expression does not only influence the expression of myogenic specific genes but also affects total chromatin composition. This was shown by reduced and aberrant expression of chromatin proteins such as histone H1, HMGB1, HMGN1 and HP1 proteins. Recently it was demonstrated that HMGA1 together with ORC proteins function in origin definition in eukaryotic cells. ORC proteins were also identified as components of heterochromatin and direct interaction partners of HP1α. Here, it was shown by co-immunoprecipitation, pull-down assays, siRNA and displacement experiments that HMGA1 proteins can interact with ORC proteins directly and that they can cooperate with HP1α in heterochromatin. It could be shown that HP1α indeed does not directly interact with HMGA1 but together with ORC proteins is relevant for heterochromatin maintenance. Thus HMGA1 proteins turned out to be important stabilizers of heterochromatin. Until recently it was thought that HMGA1 proteins bind DNA collinearly. In principle the three independent DNA binding AT-hooks of HMGA1 also suggest a concomitant binding to neighboring DNA strands, which could lead to a three dimensional stabilization of DNA. This assumption was affirmed by the occurrence of chromatin aggregates in HMGA1a-eGFP overexpressing cells, which was analyzed by confocal and high resolution (dSTORM) microscopy. By using a newly developed DNA cross-linking assay, which allows the analysis of a DNA crosslinking capability of a protein, it was proven that HMGA1 proteins can bind two individual DNA fibers simultaneously. Furthermore a novel domain in HMGA1 proteins was discovered which is significantly involved in the DNA cross-linking. Electron microscopic analyses confirmed that HMGA1 proteins can specifically generate crossings and loops in DNA molecules. These results support the assumption that HMGA1 proteins can create a DNA scaffold that has influence on cell typical chromatin organization and possibly also affects DNA dependent processes. To what extent HMGA1 induced DNA cross-linking plays a role in vivo, for example in the organization of chromocenters of C2C12 cells or in cancer cells, where HMGA1 proteins are over-expressed, will need to be elucidated in further experiments In summary, this work shows, that HMGA1 proteins influence chromatin structure and composition by affecting the expression of chromatin proteins, by interacting with other architectural chromatin proteins or by producing a higher organization of chromatin on its own. KW - Chromatin KW - HMG-Proteine KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65295 ER - TY - JOUR A1 - Endesfelder, Ulrike A1 - Malkusch, Sebastian A1 - Flottmann, Benjamin A1 - Mondry, Justine A1 - Liguzinski, Piotr A1 - Verveer, Peter J. A1 - Heilemann, Mike T1 - Chemically Induced Photoswitching of Fluorescent Probes - A General Concept for Super-Resolution Microscopy JF - Molecules N2 - We review fluorescent probes that can be photoswitched or photoactivated and are suited for single-molecule localization based super-resolution microscopy. We exploit the underlying photochemical mechanisms that allow photoswitching of many synthetic organic fluorophores in the presence of reducing agents, and study the impact of these on the photoswitching properties of various photoactivatable or photoconvertible fluorescent proteins. We have identified mEos2 as a fluorescent protein that exhibits reversible photoswitching under various imaging buffer conditions and present strategies to characterize reversible photoswitching. Finally, we discuss opportunities to combine fluorescent proteins with organic fluorophores for dual-color photoswitching microscopy. KW - Photoactivated localization microscopy KW - Fusion proteins KW - Molecules KW - Patterns KW - Switch KW - Limit KW - Time KW - photoswitchable organic fluorophores KW - fluorescent proteins KW - super-resolution KW - PALM KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134080 VL - 16 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Göhler, Antonia T1 - Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung T1 - Studying carbohydrate binding proteins with high temporal and spatial resolution N2 - Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine. N2 - The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins. KW - Fluoreszenz KW - Glykoproteine KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Anisotropie KW - dSTORM-Mikroskopie KW - Galektine KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - anisotropy KW - glycoproteins KW - galectins KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - dSTORM Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665 ER - TY - THES A1 - Heidbreder, Meike T1 - Association and Activation of TNF-Receptor I Investigated with Single-Molecule Tracking and Super-Resolution Microscopy in Live Cells T1 - Assoziierung und Aktivierung des TNF-Rezeptor I untersucht mit Einzelmolekül-Tracking und hochauflösender Mikroskopie in lebenden Zellen N2 - Cellular responses to outer stimuli are the basis for all biological processes. Signal integration is achieved by protein cascades, recognizing and processing molecules from the environment. Factors released by pathogens or inflammation usually induce an inflammatory response, a signal often transduced by Tumour Necrosis Factor alpha (TNF). TNFα receptors TNF-R1 and TNF-R2 can in turn lead to apoptosis or proliferation via NF-B. These processes are closely regulated by membrane compartimentalization, protein interactions and trafficking. Fluorescence microscopy offers a reliable and non-invasive method to probe these cellular events. However, some processes on a native membrane are not resolvable, as they are well below the diffraction limit of microscopy. The recent development of super-resolution fluorescence microscopy methods enables the observation of these cellular players well below this limit: by localizing, tracking and counting molecules with high spatial and temporal resolution, these new fluorescence microscopy methods offer a previously unknown insight into protein interactions at the near-molecular level. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) utilizes the reversible, stochastic blinking events of small commercially available fluorescent dyes, while photoactivated localization microscopy (PALM) utilizes phototransformation of genetically encoded fluorescent proteins. By photoactivating only a small fraction of the present fluorophores in each observation interval, single emitters can be localized with high precision and a super-resolved image can be reconstructed. Quantum Dot Triexciton imaging (QDTI) utilizes the three-photon absorption (triexcitonic) properties of quantum dots (QD) and to achieve a twofold resolution increase using conventional confocal microscopes. In this thesis, experimental approaches were implemented to achieve super-resolution microscopy in fixed and live-cells to study the spatial and temporal dynamics of TNF and other cellular signaling events. We introduce QDTI to study the three-dimensional cellular distribution of biological targets, offering an easy method to achieve resolution enhancement in combination with optical sectioning, allowing the preliminary quantification of labeled proteins. As QDs are electron dense, QDTI can be used for correlative fluorescence and transmission electron microscopy, proving the versatility of QD probes. Utilizing the phototransformation properties of fluorescent proteins, single-receptor tracking on live cells was achieved, applying the concept of single particle tracking PALM (sptPALM) to track the dynamics of a TNF-R1-tdEos chimera on the membrane. Lateral receptor dynamics can be tracked with high precision and the influences of ligand addition or lipid disruption on TNF-R1 mobility was observed. The results reveal complex receptor dynamics, implying internalization processes in response to TNFα stimulation and a role for membrane domains with reduced fluidity, so-called lipid raft domains, in TNF-R1 compartimentalization prior or post ligand induction. Comparisons with previously published FCS data show a good accordance, but stressing the increased data depth available in sptPALM experiments. Additionally, the active transport of NF-κB-tdEos fusions was observed in live neurons under chemical stimulation and/or inhibition. Contrary to phototransformable proteins that need no special buffers to exhibit photoconversion or photoactivation, dSTORM has previously been unsuitable for in vivo applications, as organic dyes relied on introducing the probes via immunostaining in concert with a reductive, oxygen-free medium for proper photoswitching behaviour. ATTO655 had been previously shown to be suitable for live-cell applications, as its switching behavior can be catalyzed by the reductive environment of the cytoplasm. By introducing the cell-permeant organic dye via a chemical tag system, a high specificity and low background was achieved. Here, the labeled histone H2B complex and thus single nucleosome movements in a live cell can be observed over long time periods and with ~20 nm resolution. Implementing these new approaches for imaging biological processes with high temporal and spatial resolution provides new insights into the dynamics and spatial heterogeneities of proteins, further elucidating their function in the organism and revealing properties that are usually only detectable in vitro.   N2 - Zelluläre Antworten auf externe Stimuli sind die Basis aller biologischer Prozesse. Die Integration dieser Signale wird dabei von Proteinkaskaden ausgeführt, welche Moleküle aus der Umgebung wahrnehmen und verarbeiten. Faktoren, welche von Pathogenen oder während einer Entzündung freigesetzt werden, induzieren für gewöhnlich eine Entzündungsantwort, eine Reaktion, die oft vom Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) vermittelt wird. Die TNFα Rezeptoren TNF-R1 und TNF-R2 vermitteln nach Ligandenbinding Apoptose oder Zellproliferation durch NF-kB. Diese Prozesse sind engmaschig durch Membrankompartimentierung, Proteininteraktionen und -transport reguliert. Fluoreszenzmikroskopie bietet eine zuverlässige, nicht-invasive Methode um diese zellulären Prozesse zu untersuchen. Allerdings sind einige Prozesse innerhalb einer nativen Membran nicht auflösbar, da sie weit unterhalb der Beugungsgrenze der Lichtmikroskopie stattfinden. Die jüngste Entwicklung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopiemethoden erlaubt die Beobachtung dieser zellulären Abläufe auf molekularer Ebene: durch das Lokalisieren, Verfolgen und Zählen von Molekülen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung bieten diese neuen Fluoreszenzmethoden bisher unbekannte Einblicke in Proteininteraktionen. Direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM) nutzt die reversiblen, stochastischen Ereignisse von kleinen blinkenden, kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen, während die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) die Phototransformation fluoreszierenden Proteinen nutzt. Durch das Photoaktivieren lediglich eines kleinen Bruchteils der Fluorophore innerhalb eines Zeitintervalls können einzelne Emitter mit hoher Genauigkeit lokalisiert und ein hochaufgelöstes Bild daraus rekonstruiert werden. Quantum Dot Triexciton Imaging (QDTI) nutzt die Drei-Photonen-Absorption von Quantenpunkten um eine zweifache Auflösungserhöhung mittels eines Konfokalmikroskopes zu erreichen. In dieser Arbeit wurden experimentelle Ansätze zur hochauflösenden Mikroskopie an fixierten und lebenden Zellen implementiert, um die räumliche und zeitliche Dynamik von TNF und anderen zellulären Signalwegen zu untersuchen. Zur Analyse der dreidimensionalen, zellulären Verteilung von biologischen Zielen stellen wir QDTI vor, welches eine einfache Methode zur Verbesserung der Auflösung an Konfokalmikroskopen in Kombination mit optischen Schnitten darstellt. Dies ermöglicht die vorläufige Quantifizierung von markierten Proteinen. Da QDs eine hohe Elektronendichte besitzen kann QDTI auch für korrelative Fluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie genutzt werden, was die Vielseitigkeit der QD-Sonden verdeutlicht. Mit Hilfe des single-particle tracking PALM (sptPALM) Konzepts konnten einzelne Rezeptormoleküle verfolgt werden, um die Dynamiken einer TNF-R1-tdEos Chimäre auf der Membran zu beobachten. Die laterale Rezeptordynamik kann hier mit hoher Präzision gemessen, und die Einflüsse auf die TNF-R1-Mobilität konnte nach Ligandenzugabe oder die Störung der Membranzusammensetzung analysiert werden. Die Ergebnisse zeigen eine komplexe Rezeptordynamik und lassen sowohl auf Internalisierungsprozesse in Reaktion auf TNFα-Stimulation, als auch auf eine wichtige Rolle von Membrandomänen mit eingeschränkter Fluidität in der TNF-R1 Kompartimentierung während der Ligandenbindung schließen. Zusätzlich wurde der aktive Transport von NF-kB-tdEos Fusionsproteinen in lebenden Neuronen unter chemischer Stimulierung bzw. Inhibierung untersucht. Im Gegensatz zu phototransformierbaren Proteinen, die keine speziellen Puffer zur Photokonversion oder Photoaktivierung benötigen, war dSTORM bisher für in vivo Anwendungen ungeeignet, da organische Farbstoffe auf die Einführung über Immunfärbung in Kombination mit einem reduktiven, Sauerstoff-freiem Medium für korrektes Photoschalten angewiesen waren. ATTO655 wurde zuvor als geeignet für die Anwendung in lebenden Zellen eingestuft, da das Schaltverhalten durch die reduktive Umgebung des Zytoplasmas katalysiert werden kann. Durch die Einführung von membranpermeablen organischen Farbstoffen über ein chemisches Markierungssystem konnte eine hohe Spezifität und ein geringer Hintergrund erreicht werden. Hier konnte durch die Markierung des Histon H2B Komplexes die Bewegung einzelner Nukleosome in lebenden Zellen über lange Zeiträume mit einer Auflösung von ~20 nm beobachtet werden. Die Umsetzung dieser neuen Ansätze für die Darstellung biologischer Prozesse mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung liefert neue Einblicke in die Dynamiken und die räumliche Heterogenität von Proteinen und enthüllt Funktionen im Organismus und beleuchtet Eigenschaften, die sonst nur in vitro nachweisbar wären. KW - Fluoreszenzmikrosopie KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Hochauflösendes Verfahren KW - sptPALM KW - dSTORM KW - PALM KW - QDTI KW - TNF-R1 KW - TNF-R2 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73191 ER - TY - THES A1 - Wolter, Steve T1 - Single-molecule localization algorithms in super-resolution microscopy T1 - Einzelmoleküllokalisierungsalgorithmen in der superauflösenden Mikroskopie N2 - Lokalisationsmikroskopie ist eine Methodenklasse der superauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, deren Methoden sich durch stochastische zeitliche Isolation der Fluoreszenzemission auszeichnen. Das Blinkverhalten von Fluorophoren wird so verändert, dass gleichzeitige Aktivierung von einander nahen Fluorophoren unwahrscheinlich ist. Bekannte okalisationsmikroskopische Methoden umfassen dSTORM, STORM, PALM, FPALM, oder GSDIM. Lokalisationsmikroskopie ist von hohem biologischem Interesse, weil sie die Auflösung des Fluoreszenzmikroskops bei minimalem technischem Aufwand um eine Größenordnung verbessert. Der verbundene Rechenaufwand ist allerdings erheblich, da Millionen von Fluoreszenzemissionen einzeln mit Nanometergenauigkeit lokalisiert werden müssen. Der Rechen- und Implementationsaufwand dieser Auswertung hat die Verbreitung der superauflösenden Mikroskopie lange verzögert. Diese Arbeit beschreibt meine algorithmische Grundstruktur für die Auswertung lokalisationsmikroskopischer Daten. Die Echtzeitfähigkeit, d.h. eine Auswertegeschwindigkeit oberhalb der Datenaufnahmegeschwindigkeit an normalen Messaufbauten, meines neuartigen und quelloffenen Programms wird demonstriert. Die Geschwindigkeit wird auf verbrauchermarktgängigen Prozessoren erreicht und dadurch spezialisierte Rechenzentren oder der Einsatz von Grafikkarten vermieden. Die Berechnung wird mit dem allgemein anerkannten Gaussschen Punktantwortmodell und einem Rauschmodell auf Basis der größten Poissonschen Wahrscheinlichkeit durchgeführt. Die algorithmische Grundstruktur wird erweitert, um robuste und optimale Zweifarbenauswertung zu realisieren und damit korrelative Mikroskopie zwischen verschiedenen Proteinen und Strukturen zu ermöglichen. Durch den Einsatz von kubischen Basissplines wird die Auswertung von dreidimensionalen Proben vereinfacht und stabilisiert, um präzisem Abbilden von mikrometerdicken Proben näher zu kommen. Das Grenzverhalten von Lokalisationsalgorithmen bei hohen Emissionsdichten wird untersucht. Abschließend werden Algorithmen für die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf verbreitete Probleme der Biologie aufgezeigt. Zelluläre Bewegung und Motilität werden anhand der in vitro Bewegung von Myosin-Aktin-Filamenten studiert. Lebendzellbildgebung mit hellen und stabilen organischen Fluorophoren wird mittels SNAP-tag-Fusionsproteinen realisiert. Die Analyse des Aufbaus von Proteinklumpen zeigt, wie Lokalisationsmikroskopie neue quantitative Ansätze jenseits reiner Bildgebung bietet. N2 - Localization microscopy is a class of super-resolution fluorescence microscopy techniques. Localization microscopy methods are characterized by stochastic temporal isolation of fluorophore emission, i.e., making the fluorophores blink so rapidly that no two are likely to be photoactive at the same time close to each other. Well-known localization microscopy methods include dSTORM}, STORM, PALM, FPALM, or GSDIM. The biological community has taken great interest in localization microscopy, since it can enhance the resolution of common fluorescence microscopy by an order of magnitude at little experimental cost. However, localization microscopy has considerable computational cost since millions of individual stochastic emissions must be located with nanometer precision. The computational cost of this evaluation, and the organizational cost of implementing the complex algorithms, has impeded adoption of super-resolution microscopy for a long time. In this work, I describe my algorithmic framework for evaluating localization microscopy data. I demonstrate how my novel open-source software achieves real-time data evaluation, i.e., can evaluate data faster than the common experimental setups can capture them. I show how this speed is attained on standard consumer-grade CPUs, removing the need for computing on expensive clusters or deploying graphics processing units. The evaluation is performed with the widely accepted Gaussian PSF model and a Poissonian maximum-likelihood noise model. I extend the computational model to show how robust, optimal two-color evaluation is realized, allowing correlative microscopy between multiple proteins or structures. By employing cubic B-splines, I show how the evaluation of three-dimensional samples can be made simple and robust, taking an important step towards precise imaging of micrometer-thick samples. I uncover the behavior and limits of localization algorithms in the face of increasing emission densities. Finally, I show up algorithms to extend localization microscopy to common biological problems. I investigate cellular movement and motility by considering the in vitro movement of myosin-actin filaments. I show how SNAP-tag fusion proteins enable imaging with bright and stable organic fluorophores in live cells. By analyzing the internal structure of protein clusters, I show how localization microscopy can provide new quantitative approaches beyond pure imaging. KW - super-resolution microscopy KW - fluorescence KW - scientific computing KW - dSTORM KW - localization microscopy KW - PALM KW - 3D microscopy KW - two-color microscopy KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Bildauflösung KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109370 ER - TY - THES A1 - Klein, Teresa T1 - Lokalisationsmikroskopie für die Visualisierung zellulärer Strukturen T1 - Localization Microscopy for the visualization of cellular structures N2 - Die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Auflösung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierfür photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz räumlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu können. Aus tausenden Einzelmolekül-Lokalisationen wird ein künstliches, hochaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die hochauflösende Mikroskopie ist grade für die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzelluläre Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu können. Als Marker können sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. Während die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der höheren Photonenausbeute eine präzisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren über sogenannte chemische Tags ermöglicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gefärbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich für die Hochauflösung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Für besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings können unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfläche mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photoschädigung möglichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die Möglichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu können, stellt einen großen Gewinn für die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der ursprünglich farbstoffgekoppelte Antikörper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgeklärt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellulär vorhandene Peptide größere Aggregate formen als die im extrazellulären Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen. N2 - The implementation of fluorescence microscopy enables specific labeling and studying of cellular structures with high contrast. Since light microscopy is limited in its resolution, structural information at the molecular level remains hidden. This barrier, known as diffraction limit, can be circumvented by modern imaging techniques. For this purpose localization microscopy employs photoswitchable fluorophores. The fluorescence of these fluorophores is spatially and temporally separated in order to localize single fluorophores with nanometer precision. From thousands of single-molecule localizations an artificial highresolution image is reconstructed. Super-resolution microscopy is a valuable tool for live-cell observations in order to investigate sub-cellular structures and protein dynamics beyond the diffraction limit under physiological conditions. Both photoactivatable fluorescent proteins and photoswitchable organic fluorophores can be used as labels. Whereas labeling with fluorescent proteins is straightforward to implement, organic fluorophores, however, have the Advantage of a more precise localization due to a higher photon yield. In living cells, labeling of structures with synthetic fluorophores is facilitated by so-called chemical tags. Those are polypeptide sequences that are genetically fused to the target protein and subsequently labeled with dye coupled substrates. In this work, on the basis of the model structure H2B—a histone protein—dyes are identified in combination with chemical tags, that can be successfully used for super-resolution imaging with direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in living cells. The dyes tetramethylrhodamine, 505 and Atto 655 proved to be particularly suitable, whereby the whole spectral range is represented. However, unspecific binding and dye aggregation can pose a problem for the efficient labeling of living cells. It is shown, that coating the glass surface with glycine successfully minimizes unspecific adsorption of fluorophores. Furthermore the impact of the excitation light on living cells is discussed. Methods are presented to keep photodamage at a minimum, e. g., by choosing a dye within the red excitation range. The feasibility to label living cells with photoswitchable organic fluorophores represents a big asset for localization microscopy, which originally employed dye labeled antibodies. This alternative labeling technique is used in a collaboration to study the aggregation behavior of � -Amyloid peptides, which cause Alzheimer’s disease. By means of HeLa cells, different diffraction limited morphologies of aggregates are revealed. It is thereby shown, that intracellular peptides generate larger aggregates than the ones in the extracellular region. In another collaboration the structural organization of two flotillin proteins in the membrane of bacteria is examined by means of the photoactivatable Protein mEos2 and photoactivated localization microscopy (PALM). These proteins form two clusters with different diameters, which could be determined with nanometer precision. It was also asserted that both proteins exist in unequal numbers within the bacterium. KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Zellmarker KW - dSTORM KW - PALM KW - live-cell KW - Hochauflösung KW - Zellmarkierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99260 ER - TY - THES A1 - Löschberger, Anna T1 - Biologische Referenzstrukturen und Protokolloptimierung in der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie mit dSTORM T1 - Biological model structures and optimization of protocols in super-resolution fluorescence microscopy with dSTORM N2 - Die Lokalisationsmikroskopie ist eine neue, vielversprechende Methode der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie. Sie ermöglicht detaillierte Einblicke in die Organisation und den strukturellen Aufbau von Zellen. Da die Vorbereitung der Proben und das Aufnehmen der Bilder im Vergleich zu herkömmlichen Methoden höhere Anforderungen stellt, mussten ihr Potential und ihre Zuverlässigkeit erst noch überzeugend gezeigt werden. Bis vor kurzem wurde das Auflösungsvermögen vor allem an Mikrotubuli gezeigt, deren filamentöse Struktur allerdings schon in konfokalen Bildern zu erkennen ist. Deswegen wurde in dieser Dissertation der Kernporenkomplex (NPC), dessen Struktur in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht auflösbar ist, als Modellstruktur für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie eingeführt. Dazu wurden Kernporenkomplexe aus Kernhüllen von Xenopus laevis Oocyten mit dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy), einer Methode der Lokalisationsmikroskopie, hochaufgelöst. Damit konnte nun erstmals die Achtfachsymmetrie dieses Proteinkomplexes lichtmikroskopisch dargestellt werden. Desweiteren konnte der Zentralkanal mit einem Durchmesser von ca. 40 nm aufgelöst werden. Die Daten eigneten sich außerdem für eine automatisierte Bildanalyse nach dem sogenannten "particle averaging" - einer aus der Elektronenmikroskopie bekannten Methode, um eine Durchschnittsstruktur zu ermitteln. Darüber hinaus wurden Zweifach-Färbungen von NPCs benutzt, um verschiedene Ansätze für Zweifarben-Aufnahmen mit dSTORM zu testen. Neben dem mittlerweile standardmäßig benutzten, sequentiellen Ansatz mit zwei spektral getrennten Farbstoffen, wurde auch ein simultaner Ansatz mit zwei spektral überlappenden Farbstoffen erfolgreich angewandt. Auch für 3D-Messungen mit den Ansätzen Biplane und Astigmatismus eignete sich die Markierung der Kernhülle. Hier wurden jedoch A6-Zellen benutzt und die Krümmung des Zellkerns über die gefärbten Kernporen dargestellt. dSTORM-Messungen können nicht nur an fixierten, sondern auch in lebenden Zellen durchgeführt werden. Hierzu eignen sich vor allem sehr immobile Proteine, wie H2B oder Lamin C. Anhand von SNAP-Tag- und Halo-Tag-Konstrukten konnte gezeigt werden, dass sich kommerziell erhältliche, organische Farbstoffe auch in endogener zellulärer Umgebung schalten lassen, wodurch Lebendzell-Aufnahmen mit dSTORM möglich sind. Ein weiterer Teil dieser Arbeit befasst sich mit korrelativen Aufnahmen aus dSTORM und Rasterelektronenmikroskopie (SEM). Hierzu wurden Xenopus laevis Kernhüllen zuerst mit dSTORM hochaufgelöst und danach für die EM präpariert. Anschließend wurden zugehörige Bereiche am Rasterelektronenmikroskop aufgenommen. Mit den erhaltenen korrelativen Bildern konnte gezeigt werden, dass sich dSTORM und SEM bei geeigneten Proben durchaus kombinieren lassen. Proteine können somit spezifisch markiert und im Rahmen ihrer strukturellen Umgebung mit nahezu molekularer Auflösung dargestellt werden. Da hochwertige Aufnahmen eine ausgereifte Probenpräparation voraussetzen, darf deren Etablierung nicht zu kurz kommen. Unter dieser Prämisse wurde ein optimiertes Markierungsprotokoll mit dem Namen ClickOx entwickelt. Mit ClickOx bleibt bei der kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition die Feinstruktur von Aktinfilamenten, sowie die Fluoreszenz fluoreszierender Proteine, deutlich sichtbar erhalten. Während bei den klassischen Click-Protokollen auf Grund der Entstehung von reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) feine zelluläre Strukturen, wie Aktinfilamente, angegriffen oder zerstört werden, schützt das neue Protokoll mit enzymatischem Sauerstoffentzug Proteine und somit Strukturen vor Reaktionen mit ROS. Das unterstreicht, wie wichtig es ist auch sogenannte "etablierte" Protokolle weiterzuentwickeln, denn bestimmte Nebeneffekte in Präparationen werden unter Umständen erstmals in der Hochauflösung sichtbar. Ein weiterer Aspekt war die Untersuchung des Einflusses von D1 auf die Chromatinorganisation. Mit verschiedenen mikroskopischen Methoden konnten Hinweise auf eine mögliche DNA-Cross-Linking-Fähigkeit dieses Proteins gesammelt werden. Hier wurde die Einzelmolekülinformation der dSTORM-Filme genutzt, um unterschiedliche Grade von DNA- bzw. Chromatin-Akkumulation zu vergleichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass wildtypisches D1 DNA vernetzen kann. Dies erfolgt über die sogenannten AT-Haken-Motive. Sobald diese alle durch Mutation funktionsunfähig gemacht werden - wie bei der verwendeten R10xG-Mutante - lässt sich keine Akkumulation der DNA mehr beobachten. Neben der Chromatinaggregation durch D1-Expression konnte in FRAP-Experimenten gezeigt werden, dass nur die "echten" AT-Haken eine hohe Affinität zum Chromatin aufweisen, die sogenannten "potentiellen" hingegen nicht. N2 - Localization microscopy is a new and promising imaging technique, which provides detailed insights into cellular organization and structural composition of cells with high spatial resolution. Due to the challenging preparation of samples and demanding imaging procedure, its potential and reliability had to be proven. Until recently the resolution has been shown mainly on microtubules, whose structure is already visible in confocal images. This thesis introduced the nuclear pore complex (NPC) as a more demanding model structure for super-resolution fluorescence microscopy as the structure of NPCs can not be resolved with conventional fluorescence microscopy. For this purpose nuclear envelopes of Xenopus laevis oocytes were highly resolved with dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy). With this localization microscopy method it was further possible to resolve the eightfold symmetry of nuclear pore complexes with light microscopy for the first time. In addition the central channel could be resolved with a diameter of about 40 nm. Furthermore, the localizations were used for single particle averaging, a well known image analysis method from electron microscopy, to calculate an average structure. Double staining of NPCs was used to check the potential of two-color imaging with dSTORM. Beside the common way of sequential imaging with two clearly spectrally separated dyes, a spectral demixing approach with spectrally overlapping dyes was applied. Labeling the nuclear envelope was also suitable for 3D measurements using two different approaches, i.e. biplane and astigmatism. In this case, labeled NPCs of Xenopus laevis A6-cells were used to illustrate the bending of the nucleus. dSTORM can be applied not only in fixed but also in living cells. Immobile proteins such as H2B or lamin C are especially suitable for this approach. Using fusion proteins with SNAP-Tag or Halo-Tag, it was shown that photoswitching of commercially available organic dyes is possible in an endogenous cellular environment and thus enabeling dSTORM in living cells. Another aspect of this work covers correlative microscopy using dSTORM and scanning electron microscopy (SEM). Therefor nuclear envelopes of Xenopus laevis were first imaged with dSTORM and then prepared for SEM. After that, corresponding areas were imaged with SEM. The resulting correlative images showed clearly that - assuming one has appropriate samples - dSTORM and SEM can be fairly combined. This way specifically labeled proteins can be imaged with nearly molecular resolution in the context of their structural environment. Since the quality of localization microscopy strongly depends on sample preparation, ongoing developments of labeling protocols are required. On this premise an optimized labeling protocol called ClickOx was developed. ClickOx clearly preserves the fine structure of actin filaments and the fluorescence of fluorescent proteins when using copper-catalyzed azide-alkine-cycloaddition. Whereas fine cellular structures such as actin filaments are affected by reactive oxygen species (ROS) under standard clicking procedures, the new protocol, which contains an enzymatic oxygen scavenger, protects proteins and thus cellular structures from reactions with ROS. This demonstrates the importance of further developing even so called "well established" protocols, because some side effects may appear only in super-resolution. Another aspect adressed the influence of D1 on chromatin organization. Hints for a possible DNA cross-linking ability of D1 were collected using different microscopic approaches. The single-molecule information of dSTORM measurements was used to analyse chromatin aggregation induced by D1 expression. The results indicate that wildtype D1 can cross-link DNA with its AT-hooks. Consequently the loss-of-function mutant R10xG is unable to aggregate chromatin. Furthermore FRAP experiments were performed to demonstrate that only "true" AT-hooks in D1 have a strong affinity to chromatin, but not the so called "potential" AT-hooks. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Chromatin KW - Kernporen-Komplex KW - Click-Chemie KW - Korrelative Mikroskopie KW - Lokalisationsmikroskopie KW - dSTORM KW - super-resolution KW - Hochauflösung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-102630 ER - TY - JOUR A1 - Paul, Mila M. A1 - Pauli, Martin A1 - Ehmann, Nadine A1 - Hallermann, Stefan A1 - Sauer, Markus A1 - Kittel, Robert J. A1 - Heckmann, Manfred T1 - Bruchpilot and Synaptotagmin collaborate to drive rapid glutamate release and active zone differentiation JF - Frontiers in Cellular Neuroscience N2 - The active zone (AZ) protein Bruchpilot (Brp) is essential for rapid glutamate release at Drosophila melanogaster neuromuscular junctions (NMJs). Quantal time course and measurements of action potential-waveform suggest that presynaptic fusion mechanisms are altered in brp null mutants (brp\(^{69}\)). This could account for their increased evoked excitatory postsynaptic current (EPSC) delay and rise time (by about 1 ms). To test the mechanism of release protraction at brp\(^{69}\) AZs, we performed knock-down of Synaptotagmin-1 (Syt) via RNAi (syt\(^{KD}\)) in wildtype (wt), brp\(^{69}\) and rab3 null mutants (rab3\(^{rup}\)), where Brp is concentrated at a small number of AZs. At wt and rab3\(^{rup}\) synapses, syt\(^{KD}\) lowered EPSC amplitude while increasing rise time and delay, consistent with the role of Syt as a release sensor. In contrast, syt\(^{KD}\) did not alter EPSC amplitude at brp\(^{69}\) synapses, but shortened delay and rise time. In fact, following syt\(^{KD}\), these kinetic properties were strikingly similar in wt and brp\(^{69}\), which supports the notion that Syt protracts release at brp\(^{69}\) synapses. To gain insight into this surprising role of Syt at brp\(^{69}\) AZs, we analyzed the structural and functional differentiation of synaptic boutons at the NMJ. At tonic type Ib motor neurons, distal boutons contain more AZs, more Brp proteins per AZ and show elevated and accelerated glutamate release compared to proximal boutons. The functional differentiation between proximal and distal boutons is Brp-dependent and reduced after syt\(^{KD}\). Notably, syt\(^{KD}\) boutons are smaller, contain fewer Brp positive AZs and these are of similar number in proximal and distal boutons. In addition, super-resolution imaging via dSTORM revealed that syt\(^{KD}\) increases the number and alters the spatial distribution of Brp molecules at AZs, while the gradient of Brp proteins per AZ is diminished. In summary, these data demonstrate that normal structural and functional differentiation of Drosophila AZs requires concerted action of Brp and Syt. KW - neuromuscular junction KW - Bruchpilot KW - synaptic delay KW - dSTORM KW - synaptotagmin KW - presynaptic differentiation KW - neurotransmitter release KW - active zone KW - synaptic transmission KW - fluorescent probes Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-148988 VL - 9 IS - 29 ER - TY - THES A1 - Aufmkolk, Sarah T1 - Super-Resolution Microscopy of Synaptic Proteins T1 - Hochauflösende Mikroskopie von Synaptischen Proteinen N2 - The interaction of synaptic proteins orchestrate the function of one of the most complex organs, the brain. The multitude of molecular elements influencing neurological correlations makes imaging processes complicated since conventional fluorescence microscopy methods are unable to resolve structures beyond the diffraction-limit. The implementation of super-resolution fluorescence microscopy into the field of neuroscience allows the visualisation of the fine details of neural connectivity. The key element of my thesis is the super-resolution technique dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) and its optimisation as a multi-colour approach. Capturing more than one target, I aim to unravel the distribution of synaptic proteins with nanometer precision and set them into a structural and quantitative context with one another. Therefore dSTORM specific protocols are optimized to serve the peculiarities of particular neural samples. In one project the brain derived neurotrophic factor (BDNF) is investigated in primary, hippocampal neurons. With a precision beyond 15 nm, preand post-synaptic sites can be identified by staining the active zone proteins bassoon and homer. As a result, hallmarks of mature synapses can be exhibited. The single molecule sensitivity of dSTORM enables the measurement of endogenous BDNF and locates BDNF granules aligned with glutamatergic pre-synapses. This data proofs that hippocampal neurons are capable of enriching BDNF within the mature glutamatergic pre-synapse, possibly influencing synaptic plasticity. The distribution of the metabotropic glutamate receptor mGlu4 is investigated in physiological brain slices enabling the analysis of the receptor in its natural environment. With dual-colour dSTORM, the spatial arrangement of the mGlu4 receptor in the pre-synaptic sites of parallel fibres in the molecular layer of the mouse cerebellum is visualized, as well as a four to six-fold increase in the density of the receptor in the active zone compared to the nearby environment. Prior functional measurements show that metabotropic glutamate receptors influence voltage-gated calcium channels and proteins that are involved in synaptic vesicle priming. Corresponding dSTORM data indeed suggests that a subset of the mGlu4 receptor is correlated with the voltage-gated calcium channel Cav2.1 on distances around 60 nm. These results are based on the improvement of the direct analysis of localisation data. Tools like coordinated based correlation analysis and nearest neighbour analysis of clusters centroids are used complementary to map protein connections of the synapse. Limits and possible improvements of these tools are discussed to foster the quantitative analysis of single molecule localisation microscopy data. Performing super-resolution microscopy on complex samples like brain slices benefits from a maximised field of view in combination with the visualisation of more than two targets to set the protein of interest in a cellular context. This challenge served as a motivation to establish a workflow for correlated structured illumination microscopy (SIM) and dSTORM. The development of the visualisation software coSIdSTORM promotes the combination of these powerful super-resolution techniques even on separated setups. As an example, synapses in the cerebellum that are affiliated to the parallel fibres and the dendrites of the Purkinje cells are identified by SIM and the protein bassoon of those pre-synapses is visualised threedimensionally with nanoscopic precision by dSTORM. In this work I placed emphasis on the improvement of multi-colour super-resolution imaging and its analysing tools to enable the investigation of synaptic proteins. The unravelling of the structural arrangement of investigated proteins supports the building of a synapse model and therefore helps to understand the relation between structure and function in neural transmission processes. N2 - Das Zusammenspiel von synaptischen Proteinen organisiert präzise die Funktion eines der komplexesten Organe, dem Gehirn. Die Vielfalt der molekularen Bestandteile, die diese neurologischen Beziehungen beeinflussen, verkomplizieren den Bildgebungsprozess, da die konventionellen Fluoreszenzmikroskopiemethoden Strukturen, die kleiner sind als das Beugungslimit, nicht auflösen können. Die Implementierung der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in das Gebiet der Neurowissenschaften ermöglicht die Visualisierung feiner Details neurologischer Verbindungen. Die hochauflösende Mikroskopietechnik dSTORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) und dessen Optimierung als Mehrfarbenanwendung sind Schlüsselelemente meiner Doktorarbeit. Mit der Möglichkeit mehr als ein Protein zu messen, ist es mein Ziel die Verteilung synaptischer Proteine mit nanometer Genauigkeit zu entschlüsseln und diese in ein strukturelles und quantitativ Verhältnis zueinander zu setzen. Aus diesem Grund wurden dSTORM spezifische Protokolle den Besonderheiten der jeweiligen neuronalen Proben angepasst und optimiert. In einem Projekt wird der neurotrophe Faktor BDNF (brain derived neurotrophic factor) in primären hippocampalen Neuronen untersucht. Mit einer Auflösungspräzision von unter 15 nm kann durch eine Färbung der Proteine Bassoon und Homer in der aktiven Zone die prä- und postsynaptische Seite identifiziert werden. Daraus resultierend können Kennzeichen für vollentwickelte Synapsen erfasst werden. Die Einzelmolekülsensitivität von dSTORM ermöglicht erstmalig die Messung von endogenem BDNF und zeigt, dass die BDNF Gruppierungen entlang von glutamatergen Präsynapsen verteilt sind. Diese Daten beweisen, dass hippocampale Neuronen die Möglichkeit haben, BDNF in der vollausgebildeten glutamatergen Präsynapse anzureichern und somit möglicherweise synaptische Plastizität beeinflussen. Die Verteilung des metabotropen Glutamatrezeptors mGlu4 wird in physiologischen Gehirnschnitten untersucht. Das ermöglicht den Rezeptor in seiner natürlichen Umgebung zu analysieren. Mit Zweifarben-dSTORM Messungen wird das räumliche Arrangement der mGlu4 Rezeptoren in der Präsynapse der parallelen Fasern der molekularen Schicht des Mauskleinhirns visualisiert und eine vier- bis sechsfache erhöhte Dichte des Rezeptors in der aktiven Zone, verglichen mit dem näheren Umfeld, aufgezeigt. Vorausgegangende funktionale Messungen zeigen, dass metabotrope Glutamatrezeptoren spannungsgesteuerte Calciumkanäle und Proteine, die in synaptische Vesikelgrundierung involviert sind, beeinflussen. Entsprechende dSTORM Daten deuten darauf hin, dass ein Teil der mGlu4 Rezeptoren mit dem spannungsgesteuerten Calciumkanal Cav2.1 auf einer Distanz von circa 60 nm korreliert ist. Diese Ergebnisse basieren auf der Verbesserung der direkten Analyse der Lokalisationsdatensätze. Werkzeuge, wie die Koordinaten basierte Korrelationsanalyse und die Nächste Nachbaranalyse von Clusterschwerpunkten werden sich ergänzend benutzt, um ein umfassendes Bild von Proteinverbindungen in der Synapse zu erzeugen. Die Grenzen und die Verbesserungsmöglichkeiten dieser Werkzeuge werden diskutiert, um die quantitative Analyse von Einzelmoleküldatensätzen voranzubringen. Die Durchführung von hochauflösender Mikroskopie an komplexen Proben, wie Gehirnschnitten, wird begünstigt durch die Maximierung der Aufnahmefläche in Kombination mit der Möglichkeit mehr als zwei Zielstrukturen zu visualisieren, um somit das Protein von primären Interesse in einen zellulären Zusammenhang zu setzen. Diese Herausforderung hat als Motivation gedient, ein Messprotokoll für korrelierte Strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) und dSTORM zu etablieren. Die Entwicklung der Visualisierungssoftware coSIdSTORM erleichtert die Kombination dieser beiden leistungsstarken, hochauflösenden Techniken, sogar wenn diese auf getrennten Mikroskopieaufbauten umgesetzt werden. Als ein Beispiel werden Synapsen, die zwischen den parallelen Fasern in der molekularen Schicht des Cerebellums und den Purkinje-Zellen ausgebildet werden, mit SIM identifiziert und das Protein Bassoon in diesen Präsynapsen wird mit einer nanometergenauen Präzision drei-dimensional mit dSTORM Messungen visualisiert. In meiner Arbeit habe ich den Fokus auf die Weiterentwickelung von hochauflösender Mehrfarbenmikroskopie und die damit verbundenen analytischen Werkzeuge gelegt, sodass die Untersuchung von synaptischen Proteinen ermöglicht wird. Die Herausarbeitung des strukturellen Arrangements der untersuchten synaptischen Proteine unterstützt den Aufbau eines Models der Synapse und erweitert somit das Verständnis des Zusammenhangs von Struktur und Funktion in neuronalen Übertragungsvorgängen. KW - Hochauflösende Mikroskopie KW - correlative methods KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synaptische Proteine KW - Korrelative Mikroskopie KW - dSTORM KW - SIM KW - fluorescence KW - super-resolution microscopy KW - localization microscopy KW - two-color microscopy KW - synapse KW - synaptic proteins Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-151976 ER -