TY - THES A1 - Vellmer, Tim T1 - New insights into the histone variant H2A.Z incorporation pathway in \(Trypanosoma\) \(brucei\) T1 - Neue Erkenntnisse zum Einbau der Histonvariante H2A.Z in \(Trypanosoma\) \(brucei\) N2 - The histone variant H2A.Z is a key player in transcription regulation in eukaryotes. Histone acetylations by the NuA4/TIP60 complex are required to enable proper incorporation of the histone variant and to promote the recruitment of other complexes and proteins required for transcription initiation. The second key player in H2A.Z-mediated transcription is the chromatin remodelling complex SWR1, which replaces the canonical histone H2A with its variant. By the time this project started little was known about H2A.Z in the unicellular parasite Trypanosoma brucei. Like in other eukaryotes H2A.Z was exclusively found in the transcription start sites of the polycistronic transcription units where it keeps the chromatin in an open conformation to enable RNA-polymerase II-mediated transcription. Previous studies showed the variant colocalizing with an acetylation of lysine on histone H4 and a methylation of lysine 4 on histone H3. Data indicated that HAT2 is linked to H2A.Z since it is required for acetylation of lyinse 10 on histone H4. A SWR1-like complex and a complex homologous to the NuA4/TIP60 could not be identified yet. This study aimed at identifying a SWR1-like remodelling complex in T. brucei and at identifying a protein complex orthologous to NuA4/TIP60 as well as at answering the question whether HAT2 is part of this complex or not. To this end, I performed multiple mass spectrometry-coupled co-Immunoprecipitation assays with potential subunits of a SWR1 complex, HAT2 and a putative homolog of a NuA4/TIP60 subunit. In the course of these experiments, I was able to identify the TbSWR1 complex. Subsequent cell fractionation and chromatin immunoprecipitation-coupled sequencing analysis experiments confirmed, that this complex is responsible for the incorporation of the histone variant H2A.Z in T. brucei. In addition to this chromatin remodelling complex, I was also able to identify two histone acetyltransferase complexes assembled around HAT1 and HAT2. In the course of my study data were published by the research group of Nicolai Siegel that identified the histone acetyltransferase HAT2 as being responsible for histone H4 acetylation, in preparation to promote H2A.Z incorporation. The data also indicated that HAT1 is responsible for acetylation of H2A.Z. According to the literature, this acetylation is required for proper transcription initiation. Experimental data generated in this study indicated, that H2A.Z and therefore TbSWR1 is involved in the DNA double strand break response of T. brucei. The identification of the specific complex composition of all three complexes provided some hints about how they could interact with each other in the course of transcription regulation and the DNA double strand break response. A proximity labelling approach performed with one of the subunits of the TbSWR1 complex identified multiple transcription factors, PTM writers and proteins potentially involved in chromatin maintenance. Overall, this work will provide some interesting insights about the composition of the complexes involved in H2A.Z incorporation in T. brucei. Furthermore, it is providing valuable information to set up experiments that could shed some light on RNA-polymerase II-mediated transcription and chromatin remodelling in T. brucei in particular and Kinetoplastids in general. N2 - Die Histonvariante H2A.Z ist ein Schlüsselelement bei der Transkriptionsregulation in Eukaryoten. Histonacetylierungen die vom NuA4/Tip60 Komplex prozessiert werden, sind für den korrekten Einbau der Variante unerlässlich. Darüber hinaus erlauben diese posttranslationellen Modifikationen die Rekrutierung weiterer Proteine und Komplexe die für die Transkription notwendig sind. Ein weiteres Schlüsselelement der mittels H2A.Z regulierten Transkription ist der Komplex zur Umstrukturierung des Chromatins SWR1, welcher das kanonische Histon H2A gegen seine Variante austauscht. Zu Beginn dieses Projektes war der Wissenstand bezüglich der Histonvariante H2A.Z in dem einzelligen Parasiten Trypanosoma brucei limitiert. Wie in anderen eukaryotischen Organismen wurde die Variante ausschließlich an den Startpunkten der polyzistronischen Transkriptionseinheiten gefunden, an denen es für die Öffnung des Chromatins verantwortlich ist und so die Transkription mittels RNAPolymerase II ermöglicht. Vorangegangene Studien konnten zeigen, dass die Variante mit einer Acetylierung des Lysins 10 im Histon H4 und einer Methylierung des Lysins 4 im Histon H3 co-lokalisiert. Einige Daten lieferten den Hinwies, dass die Histon-Acetyltransferase HAT2 mit H2A.Z in Zusammenhang steht, da diese die Acetylierung des Lysins 10 im Hinston H4 prozessiert. Komplexe die in ihrer Funktion dem SWR1 oder dem NuA4/TIP60 Komplex entsprechen, konnten bisher noch nicht gefunden werden. Die vorliegende Arbeit zielt darauf ab Komplexe zu identifizieren, die in ihrer Funktion dem SWR1 sowie dem NuA4/TIP60 Komplex entsprechen. Zudem soll die Frage geklärt werden ob HAT2 Teil eines möglichen NuA4/TIP60 Komplexes ist. In diesem Zusammenhang habe ich mehrere Massenspektrometrie gekoppelte Co-Immunopräzipitationen mit potenziellen Untereinheiten eines SWR1 Komplexes sowie HAT2 und einem Protein welches otholog zu einer NuA4/TIP60 Untereinheit ist, durchgeführt. Im Verlauf dieser Experimente konnte der SWR1 Komplex in T. brucei (TbSWR1) identifiziert werden. Anschließende Zellfraktionierungen sowie Chromatin Immunopräzipitationen gekoppelte Sequenzanalysen konnten bestätigen, dass der identifizierte Komplex für den Einbau der Histonvariante H2A.Z zuständig ist. Darüber hinaus konnten neben diesem Komplex noch zwei weitere Komplexe identifiziert werden, die jeweils die Histonacetyltransferasen HAT1 und HAT2 als Kernkomponenten enthalten. Im Verlauf meiner Arbeit wurden von der Arbeitsgruppe von Nicolai Siegel Daten publiziert die zeigten, dass die Histonacetyltransferase HAT2, in Vorbereitung auf den Einbau von H2A.Z, für die Acetylierung des Histons H4 verantwortlich ist. Im Gegenzug ist HAT1 für die Acetylierung von H2A.Z notwendig, welche wiederum für die korrekte Initiation der Transkription benötigt wird. Damit entspricht die Funktion der Acetylierung von H2A.Z in T. brucei der in der Literatur beschriebenen Funktion. Experimentelle Daten die im Verlauf dieser Arbeit generiert wurden, lieferten einen Hinweis darauf, dass H2A.Z auch an der Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen beteiligt ist. Die Aufschlüsselung der spezifischen Zusammensetzung aller drei Komplexe gab einige Hinweise darauf, wie sie sowohl während der Transkriptionsregulation als auch der Reparatur von DNS Doppelstrangbrüchen miteinander interagieren. Im Zuge einer molekularen Umgebungskartierung, die mit einer der Untereinheiten des TbSWR1 Komplexes durchgeführt wurde, konnten mehrere Transkriptionsfaktoren und Enzyme zur Histonmodifizierung identifiziert werden. Dabei wurden auch einige Proteine identifiziert, welche möglicherweise mit der Umformung des Chromatins in Zusammenhang stehen. Abschließend ist festzuhalten, dass diese Arbeit einige äußerst interessante Einsichten über die Zusammensetzung der Komplexe, die am H2A.Z Einbau in T. brucei beteiligt sind, liefern konnte. Darüber hinaus stellt sie einige wertvolle Informationen zur Verfügung. Diese könnten zur gezielten Planung von Experimenten genutzt werden, um mehr über RNA-Polymerase II vermittelte Transkription und Chromatin Umstrukturierung in T. brucei im speziellen und in Kinetoplastiden im Allgemeinen zu erfahren. KW - Chromatinremodelling KW - Histone KW - Transkription KW - Chromatinremodeling KW - Histones KW - Variants KW - Complexes Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-257960 ER - TY - THES A1 - Hofstetter, Christine T1 - Inhibition of H3K27me-Specific Demethylase Activity During Murine ES cell Differentiation Induces DNA Damage Response T1 - Inhibierung der H3K27me-Spezifischen Demethylase Aktivität in Murin Differenzierenden ES Zellen Induziert die DNA Schadensantwort N2 - Stem cells are defined by their capacity to self-renew and their potential to differentiate into multiple cell lineages. Pluripotent embryonic stem (ES) cells can renew indefinitely while keeping the potential to differentiate into any of the three germ layers (ectoderm, endoderm or mesoderm). For decades, ES cells are in the focus of research because of these unique features. When ES cells differentiate they form spheroid aggregates termed “embryoid bodies” (EBs). These EBs mimic post- implantation embryonic development and therefore facilitate the understanding of developmented mechanisms. During ES cell differentiation, de-repression or repression of genes accompanies the changes in chromatin structure. In ES cells, several mechanisms are involved in the regulation of the chromatin architecture, including post-translational modifications of histones. Post-translational histone methylation marks became one of the best- investigated epigenetic modifications, and they are essential for maintaining pluripotency. Until the first histone demethylase KDM1A was discovered in 2004 histone modifications were considered to be irreversible. Since then, a great number of histone demethylases have been identified. Their activity is linked to gene regulation as well as to stem cell self-renewal and differentiation. KDM6A and KDM6B are H3K27me3/2-specific histone demethylases, which are known to play a central role in the regulation of posterior development by regulating HOX gene expression. So far less is known about the molecular function of KDM6A or KDM6B in undifferentiated and differentiating ES cells. In order to completely abrogate KDM6A and KDM6B demethylase activity in undifferentiated and differentiating ES cells, a specific inhibitor (GSK-J4) was employed. Treatment with GSK-J4 had no effect on the viability or proliferation on ES cells. However, in the presence of GSK-J4 ES cell differentiation was completely abrogated with cells arrested in G1-phase and an increased rate of apoptosis. Global transcriptome analyses in early-differentiating ES cells revealed that only a limited set of genes were differentially regulated in response to GSK-J4 treatment with more genes up- regulated than down-regulated. Many of the up-regulated genes are linked to DNA damage response (DDR). In agreement with this, DNA damage was found in EBs incubated with GSK-J4. A co-localization of H3K27me3 or KDM6B with γH2AX foci, marking DNA breaks, could be excluded. However, differentiating Eed knockout (KO) ES cells, which are devoid of the H3K27me3 mark, showed an attenuated GSK-J4- induced DDR. Finally, hematopoietic differentiation in the presence of GSK-J4 resulted in a reduced colony-forming potential. This leads to the conclusion that differentiation in the presence of GSK-J4 is also restricted to hematopoietic differentiation. In conclusion, my results show that the enzymatic activity of KDM6A and KDM6B is not essential for maintaining the pluripotent state of ES cells. In contrast, the enzymatic activity of both proteins is indispensable for ES cell and hematopoietic differentiation. Additionally KDM6A and KDM6B enzymatic inhibition in differentiating ES cells leads to increased DNA damage with an activated DDR. Therefore, KDM6A and KDM6B are associated with DNA damage and in DDR in differentiating ES cells. N2 - Stammzellen sind definiert durch ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung und dem Potential in multiple Zellinien zu differenzieren. Pluripotente embryonale Stammzellen (ES Zellen) können sich fortlaufend erneuern und besitzen zudem das Potential, in alle drei Keimblätter (Ektoderm, Endoderm oder Mesoderm) zu differenzieren. Auf Grund dieser einzigartigen Eigenschaften sind ES Zellen seit Jahrzehnten im Focus der Wissenschaft. Wenn ES Zellen differenzieren, sind sie in der Lage, sphäroid-förmige Aggregate zu bilden, welche als embryoide Körperchen (EBs) bezeichnet werden. In EBs finden sich Zellen aller 3 Keimblätter und daher dienen sie als in vitro Modell für frühe embryonale Entwicklung. Während der ES Zell Differenzierung verändert die De-repression oder Repression von Genen die Struktur des Chromatins. ES Zellen besitzen eine Vielzahl von Mechanismen, die mit der Regulation des Chromatins assoziiert sind, einschließlich post-translationale Modifikationen an Histonen. Post-translationale Histon- methylierung gehören zu den am häufigsten untersuchten epigenetischen Modifikationen und spielen z.B. ein wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Pluripotenz. Bis zur Entdeckung der ersten Histon-Demethylase KDM1A im Jahre 2004 glaubte man, dass Modifikationen an Histonen irreversible sind. Bislang wurden jedoch eine Vielzahl an Histon-Demethylasen identifiziert, welche mit der Genregulation, sowie der Selbsterneuerung und Differenzierung von Stammzelle in Verbindung gebracht werden konnten. KDM6A und KDM6B sind H3K27me3/2-spezifische Histon-Demethylasen, welche bei der posterioren Entwicklung durch Regulation der Hox Gene eine wichtige Rolle spielen. Bislang ist über die molekulare Funktion von KDM6A und KDM6B in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen wenig bekannt. Um die KDM6A und KDM6B Demethylase Aktivität in nicht differenzierten und differenzierenden ES Zellen außer Kraft zu setzten kam ein spezifischer Inhibitor (GSK-J4) zum Einsatz. Die Behandlung mit GSK-J4 zeigte keine Auswirkungen auf die Viabilität oder Proliferation von nicht differenzierten ES Zellen. Jedoch war die Differenzierung von ES Zellen in Gegenwart von GSK-J4 inhibiert und zeigte einen erhöhten G1-Phase Arrest sowie eine erhöhte Rate an apoptotischen Zellen. Eine globale Transkriptionsanalyse in frühen differenzierenden ES Zellen, in Gegenwart von GSK- J4 zeigte, dass lediglich eine relativ geringe Zahl von Genen differenziell reguliert war. Dabei waren mehr Gene hochreguliert als herunterreguliert. Viele der hochregulierten Gene konnten mit der DNA Schadensantwort in Verbindung gebracht werden. In Übereinstimmung damit konnte in Gegenwart von GSK-J4 in differenzierenden ES Zellen DNA Schaden nachgewiesen werden. Eine Kolokalisation von H3K27me3 oder KDM6B mit γH2AX markierten Foci, welche DNA Schaden markieren, konnte nicht nachgewiesen werden. Nichts desto trotz zeigten GSK-J4 behandelte, differenzierende Eed KO ES Zellen, welche keine H3K27me3 Modifikation besitzen, eine abgemilderte DNA Schadensantwort. In Anwesenheit von GSK-J4 konnte während der hämatopoetischen Differenzierung eine reduzierte Kolonie-Bildung beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass in Anwesenheit von GSK-J4 ebenfalls auch die hämatopoetische Differenzierung inhibiert wird. Zusammenfassend zeigen meine Ergebnisse, dass die enzymatische Aktivität von KDM6A und KDM6B für die Aufrechterhaltung des pluripotenten Zustands nicht essenziell ist. Im Gegensatz dazu ist die enzymatische Aktivität von beiden Proteinen unabdingbar für die ES Zell sowie die hämatopoetische Differenzierung. Die enzymatische Inhibierung von KDM6A und KDM6B führt während der Differenzierung zu einem erhöhten DNA Schaden, wodurch die DNA Schadensantwort aktiviert wird. Somit sind KDM6A und KDM6B mit DNA Schaden und der DNA Schadensantwort assoziiert. KW - Embryonale Stammzelle KW - Epigenetic KW - Maus KW - Histone KW - Demethylierung KW - DNS-Schädigung KW - Epigenetik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107023 ER -