TY - THES A1 - Appelt-Menzel, Antje T1 - Etablierung und Qualifizierung eines humanen Blut-Hirn-Schranken-Modells unter Verwendung von induziert pluripotenten und multipotenten Stammzellen T1 - Establishment and qualification of a human blood-brain barrier model by use of human induced pluripotent stemm cells an multipotent stem cells N2 - Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005). Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen. Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER) unter 150 · cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte von mehr als 1500 · cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann. Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren Bedingungen bereitzustellen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A) zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt. Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren, wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen. Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte von bis zu 2500 · cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für weiterführende Studien ausgewählt. Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin, Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden. Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt. Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten: Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt. Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen. Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening von Medikamenten denkbar. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro- Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt. Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden. N2 - The blood-brain barrier (BBB) presents one of the tightest and most important barriers between the blood circulation and the central nervous system (CNS). The BBB consists of specialized endothelial cells, which line the cerebral capillaries and are connected through very dense tight junctions (TJs). Together with pericytes, astrocytes, neurons, microglial cells and the extracellular matrix of the basal membrane of the brain capillaries, they form a dynamic and complex regulatory system, the so-called neurovascular unit (Hawkins and Davis 2005). The main functions of the BBB can be divided into three subgroups, the physical-, metabolic- and transport-barrier (Neuhaus and Noe 2010). The BBB mainly serves to maintain the homeostasis of the CNS and for protection against neurotoxical substances and pathogens, such as bacteria and viruses. Moreover, the BBB ensures the supply of neurons with nutrients and regulatory substances. Furthermore, it is responsible for the efflux of CNS metabolism waste products. For the development of drugs applied for the treatment of neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease and Multiple Sclerosis or even brain tumors, the tightness of the BBB models towards substances and the high metabolic activity of the endothelial cells pose a problem. Numerous drugs cannot overcome the BBB in sufficient enough concentration to reach the target location or they are metabolized before transportation and thus become less effective. Moreover, defects of the BBB play a decisive role in the manipulation of the pathogenesis of numerous CNS diseases. Due to the high demand for test systems in basic and preclinical research of drug development and infection studies, a range of different BBB models have been developed. Besides the in silico, acellular in vitro and in vivo models, numerous cell-based BBB models have been developed. However, standardized models based on immortalized cell lines show only inhomogeneous TJ expression and possess low barrier integrity which is detected through transendothelial electrical resistance (TEER) below 150 · cm2 (Deli et al. 2005). In comparison, the TEER values in animal tests reached more than 1500 · cm2 at the BBB (Butt et al. 1990; Crone and Olesen 1982). The availability of human primary BBB cells is highly limited. Moreover, using human primary BBB cells is an extremely serious matter, not only in respect of ethical aspects. Human brain cells can, for instance, be isolated from biopsy or autopsy material obtained from patients suffering epilepsy or brain cancer. However, there is the risk that the isolated cells are altered due to disease, which may significantly change the features of the BBB models. An alternative to avoid such problems and to provide standardized human BBB models by the use of reproducible conditions, is the application of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). In this context, it has been successful to differentiate hiPSCs in vitro – under established and reproducible methods – into endothelial cells of the BBB (hiPS-ECs), neural stem cells (hiPS-NSCs) as well as astrocytes (hiPS-A) (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013; Reinhardt et al. 2013) and to use them for model establishment. The endothelial cells were examined for the existence and the functionality of endothelial-specific markers as well as specific transporters by protein- and gene-based methods. Within this work, the croypreservation of hiPS-EC progenitors was established. This will allow an increase of the spatial and temporal flexibility while working with the stem cell based models as well as the establishment of standardized cell banks. Furthermore, multipotent NSCs, isolated from fetal brain biopsies (fNSCs), were used as a control population for hiPSC-NSCs and for BBB modelling. In order to imitate the in vivo BBB in the best possible way and to optimize model characteristics, a set of ten different BBB models based on primary cells, hiPSCs and fNSCs was analyzed. Model establishment was done by the use of transwell systems. By the systematically analysis of the influence of the different neurovascular unit cell types on barrier integrity and on endothelial cell gene expression, the quadruple culture with pericytes, astrocytes and hiPS-NSCs was identified demonstrating the most physiological properties. Due to the significant increase of TEER results up to 2500 · cm2 as well as the at least 1.5-fold increase in gene expression of BBB relevant transporter and TJ markers compared to the mono-cultures, this model was selected for further studies. The presence of a complex in vivo-like TJ network, based on occludin, claudin 1, 3, 4 and 5 was detected by quantitative reale time PCR, Western blot analyses as well as on ultrastructural level by freeze fracture electron microscopy and transmission electron microscopy. Beside the limitation of the paracellular permeability, proven by the low permeation of FITC dextran (4 kDa and 40 kDa), fluorescein and Lucifer yellow, the BBB represents also a barrier for transcellular transported substances. A model evaluation, to assess the models qualification to be used for drug screenings, was proven by transport studies based on BBB relevant reference substances. The classification of the test substances was made analog their permeation rates: diazepam and caffeine are classified as fast, ibuprofen, celecoxib and diclofenac as medium, and loratadine and rhodamine 123 as slow permeating substances. Within our tests, this ranking based on literature data could be confirmed by using the quadruple-culture models, only caffeine was transported with a significantly decreased permeation coefficient compared to the mono-cultures. Furthermore, the implementation of the hiPSC technology allows the generation of a large quantity of human somatic cell types form only one single stem cell line and their provision for specific applications. Within this work it was shown, that by the use of an in-house constructed stirred tank bio-reactor, providing defined culture conditions, a reproducible expansion of hiPSCs was enabled. On this basis, a high throughput drug screening might be possible. The data presented within this work demonstrate the establishment of a stem cell based in vitro quadruple-model of the human BBB with in vivo-like characteristics. All minimal requirements for human BBB modeling, including the reproducibility of the results, adequate characterization with regard on the permeability of reference components, expression of BBB transporters as well as the robust and physiological morphology are fulfilled. The established BBB model can be used in pharmaceutical drug development. In preclinical research adequate qualified models are asked for toxicity and transport studies with new developed substances in order to allow a better in vitro-in vivo correlation of the results. Moreover, the model can be used to develop mechanisms to selectively overcome the barrier. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Stammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - In vitro KW - Endothelzelle KW - induziert pluripotente Stammzelle KW - multipotente Stammzelle KW - in vitro Modell KW - Neurovaskuläre Einheit KW - Neurale Stammzellen Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134646 ER - TY - THES A1 - Beck, Katherina T1 - Einfluss von RSK auf die Aktivität von ERK, den axonalen Transport und die synaptische Funktion in Motoneuronen von \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - RSK2 alters ERK activity, axonal transport and synaptic function in motoneurons of \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - In dieser Arbeit sollte die Funktion von RSK in Motoneuronen von Drosophila untersucht werden. Mutationen im RSK2-Gen verursachen das Coffin-Lowry-Syndrom (CLS), das durch mentale Retardierung charakterisiert ist. RSK2 ist hauptsächlich in Regionen des Gehirns exprimiert, in denen Lernen und Gedächtnisbildung stattfinden. In Mäusen und Drosophila, die als Modellorganismen für CLS dienen, konnten auf makroskopischer Ebene keine Veränderungen in den Hirnstrukturen gefunden werden, dennoch wurden in verschiedenen Verhaltensstudien Defekte im Lernen und der Gedächtnisbildung beobachtet. Die synaptische Plastizität und die einhergehenden Veränderungen in den Eigenschaften der Synapse sind fundamental für adaptives Verhalten. Zur Analyse der synaptischen Plastizität eignet sich das neuromuskuläre System von Drosophila als Modell wegen des stereotypen Innervierungsmusters und der Verwendung ionotroper Glutamatrezeptoren, deren Untereinheiten homolog sind zu den Untereinheiten der Glutamatrezeptoren des AMPA-Typs aus Säugern, die wesentlich für die Bildung von LTP im Hippocampus sind. Zunächst konnte gezeigt werden, dass RSK in den Motoneuronen von Drosophila an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist, wodurch RSK eine Synapsen-spezifische Funktion ausüben könnte. Morphologische Untersuchungen der Struktur der neuromuskulären Synapsen konnten aufzeigen, dass durch den Verlust von RSK die Größe der neuromuskulären Synapse, der Boutons sowie der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder reduziert ist. Obwohl mehr Boutons gebildet werden, sind weniger Aktive Zonen und Glutamatrezeptorfelder in der neuromuskulären Synapse enthalten. RSK reguliert die synaptische Transmission, indem es die postsynaptische Sensitivität, nicht aber die Freisetzung der Neurotransmitter an der präsynaptischen Seite beeinflusst, obwohl in immunhistochemischen Analysen eine postsynaptische Lokalisierung von RSK nicht nachgewiesen werden konnte. RSK ist demnach an der Regulation der synaptischen Plastizität glutamaterger Synapsen beteiligt. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte erstmals gezeigt werden, dass aktiviertes ERK an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist und diese synaptische Lokalisierung von RSK reguliert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass durch den Verlust von RSK hyperaktiviertes ERK in den Zellkörpern der Motoneurone vorliegt. RSK wird durch den ERK/MAPK-Signalweg aktiviert und übernimmt eine Funktion sowohl als Effektorkinase als auch in der Negativregulation des Signalwegs. Demnach dient RSK in den Zellkörpern der Motoneurone als Negativregulator des ERK/MAPK-Signalwegs. Darüber hinaus könnte RSK die Verteilung von aktivem ERK in den Subkompartimenten der Motoneurone regulieren. Da in vorangegangenen Studien gezeigt werden konnte, dass ERK an der Regulation der synaptischen Plastizität beteiligt ist, indem es die Insertion der AMPA-Rezeptoren zur Bildung der LTP reguliert, sollte in dieser Arbeit aufgeklärt werden, ob der Einfluss von RSK auf die synaptische Plastizität durch seine Funktion als Negativregulator von ERK zustande kommt. Untersuchungen der genetischen Interaktion von rsk und rolled, dem Homolog von ERK in Drosophila, zeigten, dass die durch den Verlust von RSK beobachtete reduzierte Gesamtzahl der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder der neuromuskulären Synapse auf die Funktion von RSK als Negativregulator von ERK zurückzuführen ist. Die Größe der neuromuskulären Synapse sowie die Größe der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder beeinflusst RSK allerdings durch seine Funktion als Effektorkinase des ERK/MAPK-Signalwegs. Studien des axonalen Transports von Mitochondrien zeigten, dass dieser in vielen neuropathologischen Erkrankungen beeinträchtigt ist. Die durchgeführten Untersuchungen des axonalen Transports in Motoneuronen konnten eine neue Funktion von RSK in der Regulation des axonalen Transports aufdecken. In den Axonen der Motoneurone von RSK-Nullmutanten wurden BRP- und CSP-Agglomerate nachgewiesen. RSK könnte an der Regulation des axonalen Transports von präsynaptischem Material beteiligt sein. Durch den Verlust von RSK wurden weniger Mitochondrien in anterograder Richtung entlang dem Axon transportiert, dafür verweilten mehr Mitochondrien in stationären Phasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch der anterograde Transport von Mitochondrien durch den Verlust von RSK beeinträchtigt ist. N2 - In this thesis the function RSK in motoneurons of Drosophila has been analyzed. Mutations in the RSK2-gene cause the Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) which is characterized by mental retardation. RSK2 is predominantly expressed in regions of the brain where learning and formation of the memory take place. Even no obvious changes in brain structures could be observed at macroscopic level in mouse and Drosophila which serve as an animal model for CLS. However deficits in various learning tasks could be observed due to the loss of the RSK function. Synaptic plasticity and the following changes in synaptic properties are fundamental for adaptive behaviors. The neuromuscular system of Drosophila suits as a model for studies of the synaptic plasticity because of the stereotypic innervation pattern and the use of ionotropic glutamate receptors which subunits are homologous to the subunits of the mammalian AMPA-type of glutamate receptors which are essential for the formation of LTP in the hippocampus. This study shows that RSK is located at the presynaptic site of the motoneurons of Drosophila which indicates a synapse-specific function of RSK. The structural analysis of the neuromuscular junction (NMJ) show that the loss of RSK causes a reduction in size of the NMJ, boutons, active zones and glutamate receptor fields. More boutons were found at the NMJ, but less active zones and glutamate receptor fields were established. The localization of RSK at the postsynaptic side could not be detected in this study although RSK regulates the synaptic transmission by affecting the postsynaptic sensitivity but not the presynaptic neurotransmitter release. Hence RSK could take part in the regulation of synaptic plasticity. Immunohistochemical analysis could depict a novel function of RSK in the synapse-specific localization of ERK. Further this study show that due to the loss of RSK more activated ERK is located in den cell bodies of the motoneurons. RSK functions as a negative regulator of the ERK/MAPK signaling in the somata of motoneurons. Additionally, RSK could regulate the distribution of ERK in the different subcompartments of the motoneurons. Previous studies show ERK as a regulator of synaptic plasticity by influencing the insertion of AMPA receptors into the postsynaptic membrane during LTP. RSK is activated by the ERK/MAPK signaling and functions not only as an effector kinase but also as a negative regulator of this pathway. If the effect of RSK on synaptic plasticity is due to its function as a negative regulator of ERK should be clarified in this work. Analysis of the genetic interactions of rsk and rolled, the Drosophila homologue of mammalian ERK, show that the reduced number of active zones and glutamate receptor fields found at the NMJ of RSK null mutants is caused by the function of RSK as a negative regulator of ERK. In turn RSK affects the size of the NMJ, also the size of the active zones and glutamate receptor fields by its function as an effector kinase of the ERK/MAPK signaling. Several studies have shown that the axonal transport of mitochondria is affected in many neuropathological diseases. This work could uncover a novel function of RSK in the regulation of the axonal transport in motoneurons. The loss of RSK causes the formation of agglomerates of the presynaptic proteins BRP and CSP. Therefore RSK takes part in the regulation of the transport of presynaptic material. In absence of RSK less mitochondria are transported in anterograde direction and more mitochondria are pausing. This results implicate a function of RSK in regulating the anterograde transport of mitochondria. KW - Taufliege KW - RSK KW - axonaler Transport KW - synaptische Funktion KW - ERK KW - Motoneuron KW - Motoneuron KW - Genmutation KW - Drosophila Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130717 ER - TY - THES A1 - Bertho, Sylvain T1 - Biochemical and molecular characterization of an original master sex determining gene in Salmonids T1 - Biochemische und molekulare Charakterisierung des Mastergens bei der Sex-bestimmung in Salmoniden N2 - Sexual development is a fundamental and versatile process that shapes animal morphology, physiology and behavior. The underlying developmental process is composed of the sex determination and the sex differentiation. Sex determination mechanisms are extremely labile among taxa. The initial triggers of the sex determination process are often genetics called sex determining genes. These genes are expressed in the bipotential gonad and tilt the balance to a developmental program allowing the differentiation of either a testis or an ovary. Fish represent a large and fascinating vertebrate group to study both sex determination and sex differentiation mechanisms. To date, among the known sex determining genes, three gene families namely sox, dmrt and TGF-β factors govern this developmental program. As exception to this rule, sdY “sexually dimorphic on the Y” does not belong to one of these families as it comes from the duplication / evolution of an ancestor gene related to immunity, i.e., the interferon related factor 9, irf9. sdY is the master sex determining gene in salmonids, a group of fishes that include species such as rainbow trout and Atlantic salmon. The present study was aimed to firstly characterize the features of SdY protein. Results indicate that SdY is predominantly localized in the cytoplasm tested in various fish and mammalian cell lines and confirmed by different methods. Predictive in silico analysis revealed that SdY is composed of a β-sandwich core surrounded by three α-helices as well specific characteristics conferring a putative protein-protein interaction site. Secondly, the study was aimed to understand how SdY could trigger testicular differentiation. SdY is a truncated divergent version of Irf9 that has a conserved protein-protein domain but lost the DNA interaction domain of its ancestor gene. It was then hypothesized that SdY could initiate testicular differentiation by protein-protein interactions. To evaluate this we first conducted a yeast-two-hybrid screen that revealed a high proportion of transcription factors including fox proteins. Using various biochemical and cellular methods we confirm an interaction between SdY and Foxl2, a major transcription factor involved in ovarian differentiation and identity maintenance. Interestingly, the interaction of SdY with Foxl2 leads to nuclear translocation of SdY from the cytoplasm. Furthermore, this SdY translocation mechanism was found to be specific to fish Foxl2 and to a lesser extend Foxl3 and not other Fox proteins or mammalian FoxL2. In addition, we found that this interaction allows the stabilization of SdY and prevents its degradation. Finally, to better decipher SdY action we used as a model a mutated version of SdY that was identified in XY females of Chinook salmon natural population. Results show that this mutation induces a local conformation defect obviously leading to a misfolded protein and a quick degradation. Moreover, the mutated version compromised the interaction with Foxl2 defining a minimal threshold to induce testicular differentiation. Altogether results from my thesis propose that SdY would trigger testicular differentiation in salmonids by preventing Foxl2 to promote ovarian differentiation. Further research should be now carried out on how this interaction of SdY and Foxl2 acts in-vivo. N2 - Le développement du sexe est un processus fondamental et versatile qui forme la morphologie, la physiologie et le comportement des animaux. Le processus de développement sous-jacent est composé de la détermination et de la différentiation du sexe. Les mécanismes de détermination du sexe sont extrêment labile parmi les taxons. Les signaux initiaux du processus de détermination du sexe sont souvent génétiques et nommés gènes de détermination du sexe. Ces gènes sont exprimés dans la gonade bipotente et font pencher l’équilibre vers un programme de développement permettant la formation soit d’un testicule soit d’un ovaire. Les poissons représentent un large et fascinant groupe de vertébrés pour étudier les processus de détermination et de différentiation du sexe. A l’heure actuelle, parmi les gènes de détermination connus, trois familles de gènes nommément sox, dmrt and les facteurs TGF-β gouvernent ce processus de développement. Comme exception à cette règle, sdY « sexually dimorphic on the Y » n’appartient à aucune de ces familles puisqu’il provient d’une duplication/évolution d’un gène ancestral de l’immunité, c’est-à-dire d’un facteur lié à l’interféron, irf9. sdY est le gène maître de la détermination du sexe chez les salmonidés, un groupe de poissons incluant des espèces tel que la truite arc-en-ciel et le saumon Altantique. L’étude présentée avait pour but de premièrement caractériser les propriétés de la protéine SdY. Les résultats indiquent que SdY est localisée de façon prédominante dans le cytoplasme testés dans diverses cellules de poissons et de mammifères et confirmé par des différentes méthodes. Une analyse in silico prédictive a révélé que SdY est composé d’un core β-sandwich entouré par trois hélices-α ainsi que des caractéristiques lui conférant un site d’interaction protéine-protéine. Deuxièment, l’étude avait pour but de comprendre comment SdY pouvait entraîner la différentiation testiculaire. SdY est une version tronquée divergente de Irf9 qui a conservé le domaine protéine-protéine mais a perdu le domaine d’interaction à l’ADN présent dans le gène ancestral. Il a été proposé que SdY entraîne la différentiation testiculaire par interaction(s) protéine-protéine. Afin d’évaluer cette hypothèse, un crible double-hybride en système levure a révélé une forte proportion de facteurs de transcription incluant les protéines fox. En utilisant de nombreuses méthodes au niveau cellulaire et biochimique, nous avons confirmé une interaction entre SdY et Foxl2, un facteur majeur impliqué dans la différentiation ovarienne et gardien de son identité. De façon intéressante, l’interaction de SdY avec Foxl2 conduit à une translocation nucléaire de SdY à partir du cytoplasme. De plus, le mécanisme de translocation de SdY est spécifique à la protéine Foxl2 et dans une moindre mesure à Foxl3 parmi les protéines Fox de poissons ou bien des protéines FoxL2 de mammifères. Puis, nous avons montré que cette interaction permet la stabilisation de SdY et empêche sa dégradation. Enfin, pour mieux décrypter l’action de SdY, nous avons utilisé comme modèle une version mutée qui a été identifiée dans une population naturelle de saumon Chinook avec des individus XY femelles. Les résultats montrent que la mutation induit un défaut de conformation local menant à une protéine mal-repliée et à sa dégradation. De plus, la version mutée compromet l’interaction avec Foxl2 définissant un seuil minimal d’induction de la différentiation testiculaire. Les résultats de ma thèse pris dans leur ensemble proposent que SdY pourrait entraîner la différentiation testiculaire chez les salmonidés en empêchant Foxl2 d’induire la différentiation ovarienne. Les recherches doivent se poursuivre dans le but de comprendre comment l’interaction SdY avec Foxl2 fonctionne in vivo. N2 - Sexuelle Entwicklung ist ein grundlegender und vielfältiger Prozess, der die Morphologie, Physiologie und das Verhalten von Tieren gestaltet. Der zugrundeliegende Entwicklungsprozess besteht aus der Geschlechtsbestimmung und der Geschlechtsdifferenzierung. Die Mechanismen der Geschlechtsbestimmung sind sehr instabil zwischen verschiedenen Arten. Die Auslöser des Prozesses der Geschlechtsbestimmung sind oft genetischen Ursprungs wie geschlechtsbestimmende Gene. Diese Gene werden in den bipotentialen Gonaden exprimiert und steuern die Balance eines entwicklungsgemäßen Programms, das die Differenzierung zum Testis oder Ovar erlaubt. Fische repräsentieren eine umfangreiche und faszinierende Gruppe von Vertebraten, um die Mechanismen der Geschlechtsbestimmung und –differenzierung zu untersuchen. Bislang ist bekannt, dass –unter den bekannten geschlechtsbestimmenden Genen- die drei Gen-Familien sox, dmrt und die TGFß-Faktoren dieses Entwicklungsprogramm steuern. Als Ausnahme von dieser Regel ist sdY „sexually dimorphic on the Y“ keiner dieser Familien zugehörig da es von der Duplikation / Evolution eines Vorgänger-Gens, das mit Immunität wie z.B. interferon related factor9, irf9, in Verbindung steht, herrührt. sdY ist das Mastergen der Geschlechtsbestimmung in Salmoniden, die als Gruppe von Fischen Arten wie die Regenbogenforelle und den Atlantischen Lachs umfassen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es zunächst die Eigenschaften des SdY Proteins zu charakterisieren. Die Ergebnisse zeigen, dass SdY vor allem im Zytoplasma lokalisiert ist. Dies wurde in verschiedenen Fischen und Säugetier Zelllinien untersucht und mit Hilfe verschiedener Methoden bestätigt. Prädiktive in silico Analysen zeigten, dass SdY aus einem ß-sandwich Kern besteht, der von drei α-Helices umgeben ist sowie spezifischen Eigenschaften für eine putative Protein-Protein Interaktion Stelle. Das zweite Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu verstehen, wie SdY die testikuläre Differenzierung auslösen könnte. SdY ist eine verkürzte, divergente Version von Irf9, das eine konservierte Protein-Protein Domäne aufweist, jedoch seine DNA Interaktion Domäne a seines Vorläufer Gens verloren hat. Daher wurde angenommen, dass SdY die testikuläre Differenzierung durch Protein-Protein Interaktion initiieren könnte. Um diese Hypothese zu bestätigen führten wir zuerst einen Yeast Two-Hybrid Screen durch, der einen hohen Anteil an Transkriptionsfaktoren darunter fox Proteine zeigte. Unter Einsatz verschiedener biochemischer und zellulärer Methoden bestätigten wir eine Interaktion zwischen SdY und Foxl2, einem wesentlichen Transkriptionsfaktor, der in die Differenzierung und die Erhaltung der Identität der Ovarien involviert ist. Interessanterweise führt die Interaktion von SdY mit Foxl2 zu einer nukleären Translokation von SdY aus dem Zytoplasma. Außerdem wurde festgestellt, dass dieser SdY Translokations-Mechanismus für das Fisch Foxl2 und in einem geringerem Maße für Foxl3 spezifisch ist aber nicht für andere Fox Proteine oder Säuger FoxL2. Des Weiteren haben wir herausgefunden, dass diese Interaktion die Stabilisierung von SdY ermöglicht und sein Abbau verhindert. Zuletzt haben wir ein Modell einer mutierten Version von SdY benutzt, die in XY Weibchen der natürlichen Population der Königslachse identifiziert wurde, um die Wirkung von SdY besser zu entschlüsseln. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Mutation einen lokalen Konformationsdefekt verursacht, der zu fehlgefalteten Proteinen und einem raschen Abbau führt. Darüber hinaus beeinträchtigt die mutierte Version die Interaktion mit FoxL2 und definiert einen minimalen Grenzwert, um die testikuläre Differenzierung zu induzieren. Insgesamt deuten die Ergebnisse meiner Dissertation darauf hin, dass SdY die testikuläre Differenzierung in Salmoniden auslöst, indem es verhindert, dass Foxl2 die Differenzierung der Ovarien fördert. In Zukunft soll erforscht werden, wie sich die Interaktion von SdY und Foxl2 in-vivo auswirkt. KW - Fish Sex determination KW - gonad development KW - SdY KW - salmonids KW - Lachsartige KW - Geschlechtsdifferenzierung KW - Molekulargenetik Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139130 ER - TY - THES A1 - Blättner, Sebastian T1 - The role of the non-ribosomal peptide synthetase AusAB and its product phevalin in intracellular virulence of Staphylococcus aureus T1 - Die Rolle der nicht-ribosomalen Peptidsynthetase AusAB und ihres Produktes Phevalin in der intrazellulären Virulenz von Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus is a prevalent commensal bacterium which represents one of the leading causes in health care-associated bacterial infections worldwide and can cause a variety of different diseases ranging from simple abscesses to severe and life threatening infections including pneumonia, osteomyelitis and sepsis. In recent times multi-resistant strains have emerged, causing severe problems in nosocomial as well as community-acquired (CA) infection settings, especially in the United States (USA). Therefore S. aureus has been termed as a superbug by the WHO, underlining the severe health risk originating from it. Today, infections in the USA are dominated by S. aureus genotypes which are classified as USA300 and USA400, respectively. Strains of genotype USA300 are responsible for about 70% of the CA infections. The molecular mechanisms which render S. aureus such an effective pathogen are still not understood in its entirety. For decades S. aureus was thought to be a strictly extracellular pathogen relying on pore-forming toxins like α-hemolysin to damage human cells and tissue. Only recently it has been shown that S. aureus can enter non-professional phagocytes, using adhesins like the fibronectin-binding proteins which mediate an endocytotic uptake into the host cells. The bacteria are consequently localized to endosomes, where the degradation of enclosed bacterial cells through phagosome maturation would eventually occur. S. aureus can avoid degradation, and translocate to the cellular cytoplasm, where it can replicate. The ability to cause this so-called phagosomal escape has mainly been attributed to a family of amphiphilic peptides called phenol soluble modulins (PSMs), but as studies have shown, they are not sufficient. In this work I used a transposon mutant library in combination with automated fluorescence microscopy to screen for genes involved in the phagosomal escape process and intracellular survival of S. aureus. I thereby identified a number of genes, including a non-ribosomal peptide synthetase (NRPS). The NRPS, encoded by the genes ausA and ausB, produces two types of small peptides, phevalin and tyrvalin. Mutations in the ausAB genes lead to a drastic decrease in phagosomal escape rates in epithelial cells, which were readily restored by genetic complementation in trans as well as by supplementation of synthetic phevalin. In leukocytes, phevalin interferes with calcium fluxes and activation of neutrophils and promotes cytotoxicity of intracellular bacteria in both, macrophages and neutrophils. Further ausAB is involved in survival and virulence of the bacterium during mouse lung pneumoniae. The here presented data demonstrates the contribution of the bacterial cyclic dipeptide phevalin to S. aureus virulence and suggests, that phevalin directly acts on a host cell target to promote cytotoxicity of intracellular bacteria. N2 - Staphylococcus aureus ist ein weit verbreitetes kommensales Bakterium, welches zugleich einer der häufigsten Verursacher von Krankenhausinfektionen ist, und eine Reihe verschiedener Krankheiten, angefangen bei simplen Abszessen, bis hin zu schweren Erkrankungen wie Lungenentzündung, Osteomylitis und Sepsis verursachen kann. Das Risiko durch nosokomiale sowie epidemische S. aureus Infektionen ist in den vergangenen Jahren weiter gestiegen. Dazu beigetragen hat das Auftreten multiresistenter und hoch cytotoxischer Stämme, vor allem in den USA. Als Konsequenz hat die WHO S. aureus inzwischen als „Superbug“ tituliert und als globales Gesundheitsrisiko eingestuft. Bei CA-Infektionen dominieren die Isolate der Klassifizierung USA300 und USA400, wobei den Erstgenannten bis zu 70% aller in den USA registrierten CA-MRSA Infektionen der letzten Jahre zugesprochen werden. Lange Zeit wurde angenommen, dass S. aureus strikt extrazellulär im Infektionsbereich vorliegt und die cytotoxische Wirkung von z.B. α-Toxin für Wirtszelltod und Gewebeschädigungen verantwortlich ist. Erst vor kurzem wurde festgestellt, dass S. aureus auch durch fakultativ phagozytotische Zellen, wie Epithel- oder Endothelzellen, mittels zahlreicher Adhäsine aufgenommen wird. Die Aufnahme in die Zelle erfolgt zunächst in ein Phagoendosom, in dem die Pathogene durch antimikrobielle Mechanismen abgebaut würden. Um dies zu verhindern, verfügt S. aureus über Virulenzfaktoren, welche die endosomale Membran schädigen. Die Bakterien gelangen so in das Zellzytoplasma, wo sie sich vervielfältigen können, bevor die Wirtszelle schließlich getötet wird. Eine wichtige Funktion in diesem Vorgang konnte bereits in mehreren Studien den Phenol löslichen Modulinen (PSM) zugesprochen werden, Arbeiten unserer Gruppe deuten jedoch darauf hin, dass diese nicht alleine für den phagosomalen Ausbruch von S. aureus verantwortlich sind. In dieser Arbeit verwendete ich eine Transposon Mutantenbibliothek des S. aureus Stammes JE2 (USA300) in Verbindung mit automatisierter Fluoreszenzmikroskopie, um Gene zu identifizieren, die den phagosomalen Ausbruch von S. aureus beeinflussen. Unter den Mutanten, welche eine Minderung der Ausbruchsraten zeigten, fanden sich auch Mutanten in beiden Genen eines Operons, welches für die nicht-ribosomale Peptidsynthetase AusA/B codiert, die die beiden Dipeptide Phevalin und Tyrvalin produziert. Verminderte Ausbruchsraten konnten sowohl durch genetische Komplementation als auch mittels des Zusatzes synthetischen Phevalins wiederhergestellt werden. In Leukozyten verhindert Phevalin effizienten Calcium-Flux und die Aktivierung von Neutrophilen. Zudem fördert Phevalin die Cytotoxizität intrazellulärer Bakterien sowohl in Makrophagen, als auch Neutrophilen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die NRPS AusAB und ihre Produkte eine Rolle beim Überleben der Bakterien während einer Infektion im Tiermodell einnehmen. Die hier präsentierten Daten hinsichtlich des Einflusses von Phevalin auf Virulenz und der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen lassen den Schluss zu, dass Phevalin direkt auf einen Wirtszellfaktor wirkt, um die Cytotoxicität intrazellulärer Bakterien zu stärken. KW - Staphylococcus aureus KW - MRSA KW - Virulenz KW - Intracellular virulence KW - Non-ribosomal peptide synthetase KW - USA300 Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146662 ER - TY - THES A1 - Cicova, Zdenka T1 - Characterization of a novel putative factor involved in host adaptation in Trypanosoma brucei T1 - Charakterisierung einer neuen Komponente für die Wirtsanpassung in Trypanosoma brucei N2 - Trypanosomes are masters of adaptation to different host environments during their complex life cycle. Large-scale proteomic approaches provide information on changes at the cellular level in a systematic way. However, a detailed work on single components is necessary to understand the adaptation mechanisms on a molecular level. Here we have performed a detailed characterization of a bloodstream form (BSF) stage-specific putative flagellar host adaptation factor (Tb927.11.2400) identified previously in a SILAC-based comparative proteome study. Tb927.11.2400 shares 38% amino acid identity with TbFlabarin (Tb927.11.2410), a procyclic form (PCF) stage specific flagellar BAR domain protein. We named Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) and demonstrate that it is a result of a gene duplication event, which occurred in African trypanosomes. TbFlabarinL is not essential for growth of the parasites under cell culture conditions and it is dispensable for developmental differentiation from BSF to the PCF in vitro. We generated a TbFlabarinL-specific antibody and showed that it localizes in the flagellum. The co-immunoprecipitation experiment together with a biochemical cell fractionation indicated a dual association of TbFlabarinL with the flagellar membrane and the components of the paraflagellar rod. N2 - Trypansomen zeigen sich im Laufe ihres komplexen Lebeszyklus als Meister der Adaption an verschiedene Umweltbedingungen ihrer Wirte. Umfangreiche proteomische Analysen geben systematisch Auskunft über Änderungen auf zellulärer Ebene. Detailierte Arbeit an einzelnen Komponenten ist jedoch nötig, um die Adaptionsmechanismen auf molekularer Ebene zu verstehen. Wir haben im Rahmen dieser Arbeit eine detaillierte Charakterisierung eines stadienspezifischen mutmaßlich flagellaren Wirtsadaptionsfaktors der Blutstromform (BSF) durchgeführt (Tb927.11.2400), der zuvor in einer SILAC-basierten vergleichenden Proteomstudie idendifiziert wurde. Tb927.11.2400 teilt 38% der mit TbFlabarin (Tb927.11.2410), eines stadienspezifischen flagellaren BAR- domänen Proteins der prozyklischen Form (PCF). Wir haben Tb927.11.2400 TbFlabarin like (TbFlabarinL) genannt und zeigen, dass es das Ergebnis eines Genduplikations-Ereignisses darstellt, das in afrikanischen Trypanosomen aufgetreten ist. TbFlabarinL ist nicht essentiell für das Wachstum der Parasiten unter Zellkultur-Bedingungen und entbehrlich für den Differenzierungprozess von BSF zu PCF in vitro. Wir haben einen TbFlabarinL-spezifischen Antikörper entwickelt und zeigen, dass er in der Flagelle lokalisiert. Das Co-immunoprezipitations-Experiment deutet zusammen mit einer biochemischen Zellfraktionierung darauf hin, dass TbFlabarinL mit der flagellaren Membran und Komponenten der paraflagellaren Stab binär assoziiert ist. KW - Trypanosoma brucei KW - Wirt KW - Anpassung KW - stage specific regulation KW - Geißel KW - flagellum KW - Flabarin Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142462 ER - TY - THES A1 - Costea, Paul Igor T1 - Stratification and variation of the human gut microbiota T1 - Stratifikation und Variation des menschlichen Darmmikrobioms N2 - The microbial communities that live inside the human gastrointestinal tract -the human gut microbiome- are important for host health and wellbeing. Characterizing this new “organ”, made up of as many cells as the human body itself, has recently become possible through technological advances. Metagenomics, the high-throughput sequencing of DNA directly from microbial communities, enables us to take genomic snapshots of thousands of microbes living together in this complex ecosystem, without the need for isolating and growing them. Quantifying the composition of the human gut microbiome allows us to investigate its properties and connect it to host physiology and disease. The wealth of such connections was unexpected and is probably still underestimated. Due to the fact that most of our dietary as well as medicinal intake affects the microbiome and that the microbiome itself interacts with our immune system through a multitude of pathways, many mechanisms have been proposed to explain the observed correlations, though most have yet to be understood in depth. An obvious prerequisite to characterizing the microbiome and its interactions with the host is the accurate quantification of its composition, i.e. determining which microbes are present and in what numbers they occur. Historically, standard practices have existed for sample handling, DNA extraction and data analysis for many years. However, these were generally developed for single microbe cultures and it is not always feasible to implement them in large scale metagenomic studies. Partly because of this and partly because of the excitement that new technology brings about, the first metagenomic studies each took the liberty to define their own approach and protocols. From early meta-analysis of these studies it became clear that the differences in sample handling, as well as differences in computational approaches, made comparisons across studies very difficult. This restricts our ability to cross-validate findings of individual studies and to pool samples from larger cohorts. To address the pressing need for standardization, we undertook an extensive comparison of 21 different DNA extraction methods as well as a series of other sample manipulations that affect quantification. We developed a number of criteria for determining the measurement quality in the absence of a mock community and used these to propose best practices for sampling, DNA extraction and library preparation. If these were to be accepted as standards in the field, it would greatly improve comparability across studies, which would dramatically increase the power of our inferences and our ability to draw general conclusions about the microbiome. Most metagenomics studies involve comparisons between microbial communities, for example between fecal samples from cases and controls. A multitude of approaches have been proposed to calculate community dissimilarities (beta diversity) and they are often combined with various preprocessing techniques. Direct metagenomics quantification usually counts sequencing reads mapped to specific taxonomic units, which can be species, genera, etc. Due to technology-inherent differences in sampling depth, normalizing counts is necessary, for instance by dividing each count by the sum of all counts in a sample (i.e. total sum scaling), or by subsampling. To derive a single value for community (dis-)similarity, multiple distance measures have been proposed. Although it is theoretically difficult to benchmark these approaches, we developed a biologically motivated framework in which distance measures can be evaluated. This highlights the importance of data transformations and their impact on the measured distances. Building on our experience with accurate abundance estimation and data preprocessing techniques, we can now try and understand some of the basic properties of microbial communities. In 2011, it was proposed that the space of genus level variation of the human gut microbial community is structured into three basic types, termed enterotypes. These were described in a multi-country cohort, so as to be independent of geography, age and other host properties. Operationally defined through a clustering approach, they are “densely populated areas in a multidimensional space of community composition”(source) and were proposed as a general stratifier for the human population. Later studies that applied this concept to other datasets raised concerns about the optimum number of clusters and robustness of the clustering approach. This heralded a long standing debate about the existence of structure and the best ways to determine and capture it. Here, we reconsider the concept of enterotypes, in the context of the vastly increased amounts of available data. We propose a refined framework in which the different types should be thought of as weak attractors in compositional space and we try to implement an approach to determining which attractor a sample is closest to. To this end, we train a classifier on a reference dataset to assign membership to new samples. This way, enterotypes assignment is no longer dataset dependent and effects due to biased sampling are minimized. Using a model in which we assume the existence of three enterotypes characterized by the same driver genera, as originally postulated, we show the relevance of this stratification and propose it to be used in a clinical setting as a potential marker for disease development. Moreover, we believe that these attractors underline different rules of community assembly and we recommend they be accounted for when analyzing gut microbiome samples. While enterotypes describe structure in the community at genus level, metagenomic sequencing can in principle achieve single-nucleotide resolution, allowing us to identify single nucleotide polymorphisms (SNPs) and other genomic variants in the gut microbiome. Analysis methodology for this level of resolution has only recently been developed and little exploration has been done to date. Assessing SNPs in a large, multinational cohort, we discovered that the landscape of genomic variation seems highly structured even beyond species resolution, indicating that clearly distinguishable subspecies are prevalent among gut microbes. In several cases, these subspecies exhibit geo-stratification, with some subspecies only found in the Chinese population. Generally however, they present only minor dispersion limitations and are seen across most of our study populations. Within one individual, one subspecies is commonly found to dominate and only rarely are several subspecies observed to co-occur in the same ecosystem. Analysis of longitudinal data indicates that the dominant subspecies remains stable over periods of more than three years. When interrogating their functional properties we find many differences, with specific ones appearing relevant to the host. For example, we identify a subspecies of E. rectale that is lacking the flagellum operon and find its presence to be significantly associated with lower body mass index and lower insulin resistance of their hosts; it also correlates with higher microbial community diversity. These associations could not be seen at the species level (where multiple subspecies are convoluted), which illustrates the importance of this increased resolution for a more comprehensive understanding of microbial interactions within the microbiome and with the host. Taken together, our results provide a rigorous basis for performing comparative metagenomics of the human gut, encompassing recommendations for both experimental sample processing and computational analysis. We furthermore refine the concept of community stratification into enterotypes, develop a reference-based approach for enterotype assignment and provide compelling evidence for their relevance. Lastly, by harnessing the full resolution of metagenomics, we discover a highly structured genomic variation landscape below the microbial species level and identify common subspecies of the human gut microbiome. By developing these high-precision metagenomics analysis tools, we thus hope to contribute to a greatly improved understanding of the properties and dynamics of the human gut microbiome. N2 - Die mikrobiellen Gemeinschaften innerhalb des menschlichen Darmtrakts – das menschliche Darm-Mikrobiom - sind wichtig für das Wohlbefinden und die Gesundheit des Wirts. Die Charakterisierung dieses neuen “Organs”, welches aus ähnlich vielen Zellen besteht wie der menschliche Körper, ist in jüngster Zeit durch technologische Fortschritte möglich geworden. Die Metagenomik, die direkte Hochdurchsatz-Sequenzierung mikrobieller DNA, ermöglicht die Aufnahme “genomischer Schnappschüsse” tausender verschiedener, in einem komplexen Ökosystem zusammenlebender Bakterien, ohne dafür auf deren Isolierung und Wachstum angewiesen zu sein. Die Quantifizierung des menschlichen Mikrobioms erlaubt es uns, seine Eigenschaften zu untersuchen und Verbindungen zu Wirtsphysiologie und -krankheiten zu knüpfen. Der Reichtum dieser Informationen ist unerwartet hoch und wahrscheinlich noch immer unterbewertet. Aufgrund der Tatsache, dass der Großteil unserer Ernährung und unseres Medikamentenkonsums unser Mikrobiom, welches wiederum selbst über verschiedene Arten mit unserem Immunsystem interagiert, beeinflusst, wurden viele Mechanismen vorgeschlagen, um die beobachteten Korrelationen zu erklären. Die meisten davon sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Eine offensichtliche Komponente zur Charakterisierung des Mikrobioms und dessen Interaktionen mit dem Wirt ist eine akkurate Quantifizierung seiner genauen Zusammensetzung, womit sowohl die Anwesenheit von bestimmten Bakterien als auch deren Anzahl gemeint ist. Obwohl etablierte Standardprozeduren zur Probenbehandlung, DNA- Extrahierung und Datenanalyse existieren, sind sie nicht immer für metagenomische Studien anwendbar, da sie für isolierte Bakterienkulturen entwickelt worden. Deswegen und auch wegen der Begeisterung, die neuartige Technologien mit sich bringen, nahmen sich die ersten metagenomischen Studien jeweils die Freiheit, ihre eigenen Protokolle und Herangehensweisen zu definieren. Die Metaanalyse dieser Studien zeigte, dass Unterschiede sowohl in der Probenbehandlung als auch in der statistischen Auswertung den Vergleich zwischen Studien sehr schwierig machen. Das wiederum beschneidet unsere Fähigkeit, Entdeckungen zu bestätigen und Daten über Studien hinweg zu kombinieren. Um die zwingend notwendige Standardisierung voranzutreiben haben wir einen umfassenden Vergleich von 21 verschiedenen DNA-Extraktionsmethoden sowie verschiedener weiterer Probenbehandlungen, welche Quantifizierungen beeinflussen, vorgenommen. Wir haben eine Reihe von Kriterien entwickelt, um die Messqualität in Abwesenheit von Mock-Kontrollen zu bestimmen und schlagen anhand dieser Methoden für Probenbeschaffung, DNA-Extraktion und Library- Generierung optimale Verfahren vor. Wenn diese als Standard akzeptiert werden, würde das eine stark verbesserte Vergleichbarkeit zwischen Studien ermöglichen und damit sowohl einen extremen Zuwachs an statistischer Power als auch unserer Fähigkeit, generelle Schlüsse über das Mikrobiom zu ziehen, zur Folge haben. Die meisten metagenomischen Studien teilen ihre Datensätze auf um Vergleiche anzustellen, z.B. zwischen Stuhlproben gesunder und erkrankter Menschen. Eine Vielzahl verschiedener Ansätze, welche wiederum oft mit verschiedenen Datenvorbehandlungen kombiniert werden, wurden vorgeschlagen, um Dissimilarität zwischen Gemeinschaften (Beta-Diversität) zu berechnen. Um metagenomische Daten auf Spezies-, Genus- und höheren Ebenen zu quantifizieren werden üblicherweise reads auf Referenzgenome bestimmter taxonomischer Einheiten aligniert und gezählt. Aufgrund technologieabhängiger Unterschiede in Sequenziertiefe müssen reads normalisiert werden, z.B. indem man alle counts durch die Gesamtanzahl der counts einer Sequenzierung teilt (total sum scaling), oder durch subsampling. Für die Messung der Gemeinschafts(dis)similarität wurden viele Distanzmaße vorgeschlagen. Da es schwierig ist diese Ansätze theoretisch zu vergleichen, haben wir ein biologisch motiviertes Konzept entwickelt, mit dem man Distanzmaße evaluieren kann. Dies unterstreicht die Wichtigkeit der Datentransformation und dessen Einwirkung auf Distanzmaße. Aufbauend auf unserer Erfahrung mit Häufigkeitsabschätzungen und Techniken zur Datenvorbehandlung können wir nun versuchen, grundlegende Eigenschaften mikrobieller Gemeinschaften zu verstehen. 2011 wurde vorgeschlagen, dass sich die Variation auf Genusebene im menschlichen Darm auf drei grundlegende Typen beschränkt, welche Enterotypen getauft wurden. Diese wurden in Datensätzen verschiedener Länder als unabhängig von Herkunft, Alter und anderer Wirtseigenschaften beschrieben. Die Enterotypen sind durch einen Cluster-Ansatz als „dicht besiedelte Bereiche in einem multidimensionalen Raum der Gemeinschaftszusammensetzung“ definiert und wurden als grundlegende Stratifikatoren für die menschlichen Population vorgeschlagen. Spätere Studien, welche dieses Konzept auf andere Datensätze anwandten, erhoben Zweifel bezüglich der optimalen Anzahl an Clustern und an der generellen Robustheit des Ansatzes. Dies leitete erneut eine langanhaltende Debate über die Existenz von Strukturen und die besten Wege, diese zu bestimmen und einzufangen, ein. Hier überdenken wir, in Anbetracht der stark gestiegenen Anzahl an verfügbaren Daten, das Enterotypen-Konzept. Wir schlagen ein überarbeitetes Konzept vor, in welchem die verschiedenen Enterotypen als schwache Attraktoren im multidimensionalen Raum verstanden werden und implementieren einen Ansatz zur Berechnung des Attraktors, der dem Datensatz am ähnlichsten ist. Dafür trainieren wir einen Klassifizierer auf einen Referenz- Datensatz, um neue Datensätze zuzuordnen. Damit ist Enterotypisierung nicht mehr datensatzabhängig und der Effekt von sampling bias ist minimiert. Indem wir ein Modell nutzen für das wir die Existenz dreier Enterotypen (definiert durch die selben Genera wie ursprünglich postuliert) annehmen, zeigen wir die Relevanz dieser Stratifikation und schlagen es in einem klinischen Zusammenhang als potentiellen Marker für Krankheitsfortschritt vor. Außerdem glauben wir, dass diese Attraktoren verschiedene Regeln mikrobieller Zusammensetzung widerspiegeln und schlagen vor, sie bei der Analyse von mikrobiellen Daten zu berücksichtigen. Während Enterotypen Struktur in der Gemeinschaft auf Genusebene beschreiben, kann metagenomische Sequenzierung prinzipiell Auflösung auf Nukleotidebene erreichen, womit single nucleotide polymorphisms (SNPs) und andere genomische Variationen im Darm- Mikrobiom identifiziert werden können. Analysemethoden für dieses Auflösungsniveau wurden erst kürzlich entwickelt und bis heute wurden diese erst wenig erforscht. Wir zeigen, dass die Landschaft an genomischer Variation von SNPs in einer großen, multinationalen Kohorte sogar über die Speziesebene hinaus geht und hochgradig strukturiert ist, was das Vorkommen klar abgrenzbarer Subspezies unter Darmmikroben suggeriert. In mehreren Fällen zeigen diese Subspezies geographische Stratifikation, wobei einige Subspezies nur in chinesischen Populationen vorkommen. Im Allgemein zeigen Sie jedoch nur eine geringfügige Beschränkung der Dispersion und sind in der Mehrzahl der Populationen vorhanden. Innerhalb eines Individuums dominiert häufig eine bestimmte Subspezies, nur selten dominieren verschieden gemeinsam im gleichen Ökosystem. Eine Analyse von Zeitreihenexperimenten deutet darauf hin, dass die dominante Subspezies über Zeiträume von mehr als drei Jahren stabil bleibt. Wenn man ihre funktionalen Eigenschaften untersucht findet man viele Unterschiede, von denen bestimmte relevant für den Wirt erscheinen. Zum Beispiel identifizieren wir eine Subspezies von E. rectale, welcher das Flagellum-Operon fehlt, die signifikant assoziiert ist mit geringerem BMI und geringerer Insulinresistenz ihres Wirts; sie korreliert zudem mit höherer mikrobieller Diversität. Diese Assoziationen konnten auf Speziesebene nicht gesehen werden (auf der mehrere Subspezies überlagert sind), was die Wichtigkeit dieser erhöhten Auflösung für ein umfassenderes Verständnis mikrobieller Interaktionen innerhalb des Mikrobioms und mit dem Wirt illustriert. Zusammenfassend bieten unsere Ergebnisse eine präzise Grundlage für vergleichende Metagenomik des menschlichen Darms, einschließlich Empfehlungen über experimentelles Sampling und statistische Analysen. Weiterhin verfeinern wir das Konzept der Enterotypen- Stratifikation in Gemeinschaften, entwickeln referenzbasierte Ansätze für Enterotypen- Zuordnung und bieten überzeugende Beweise für ihre Relevanz. Indem wir die volle Auflösung metagenomischer Sequenzierungen nutzen entdecken wir eine Landschaft hochgradig strukturierter genomischer Variation unterhalb der Speziesebene und identifizieren gemeinsame Subspezies des menschlichen Darm-Mikrobioms. Durch die Entwicklung dieser hochpräzisen metagenomischen Untersuchungsansätze tragen wir zu einem verbesserten KW - metagenomics KW - microbiology KW - Mensch KW - Darmflora KW - Metagenom Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-139649 ER - TY - THES A1 - Eck, Saskia T1 - The impact of thermogenetic depolarizations of specific clock neurons on Drosophila melanogaster's circadian clock T1 - Der Einfluss thermogenetischer Depolarisationen spezifischer Uhrneurone auf Drosophila melanogasters circadiane Uhr N2 - The rotation of the earth around its own axis determines periodically changing environmental conditions, like alterations in light and temperature. For the purpose of adapting all organisms’ behavior, physiology and metabolism to recurring changes, endogenous clocks have evolved, which allow the organisms to anticipate environmental changes. In chronobiology, the scientific field dealing with the investigation of the underlying mechanisms of the endogenous clock, the fruit fly Drosophila melanogaster serves as a beneficial model organism. The fruit fly’s circadian clock exhibits a rather simple anatomical organization, but nevertheless constitutes homologies to the mammalian system. Thus also in this PhD-thesis the fruit fly was used to decipher general features of the circadian clock’s interneuronal communication. Drosophila melanogaster’s circadian clock consists of about 150 clock neurons, which are located in the central nervous system of the fly. These clock neurons can be subdivided regarding to their anatomical position in the brain into the dorsal neurons (DN1s, DN2s, DN3s), as well as into the lateral neurons (LPNs, LNds, s-LNvs, l-LNvs). Functionally these clock neuron clusters can be classified as Morning- and Evening oscillators (M- and E- oscillators), driving different parts of the fly’s locomotor activity in light-dark conditions (LD). The Morning-oscillators are represented by the s-LNvs and are known to be the main pacemakers, driving the pace of the clock in constant conditions (constant darkness; DD). The group of Evening-oscillators consists of the LNds, the DN1s and the 5th s-LNv and is important for the proper timing of the evening activity in LD. All of these clock neurons are not functionally independent, but form complex neuronal connections, which are highly plastic in their response to different environmental stimuli (Zeitgebers), like light or temperature. Even though a lot is known about the function and the importance of some clock neuron clusters, the exact interplay between the neurons is not fully known yet. To investigate the mechanisms, which are involved in communication processes among different clock neurons, we depolarized specific clock cells in a temporally and cell-type restricted manner using dTrpA1, a thermosensitive cation channel, which allows the depolarization of neurons by application of temperature pulses (TP) above 29°C to the intact and freely moving fly. Using different clock specific GAL4-driver lines and applying TPs at different time points within the circadian cycle in DD enabled us with the help of phase shift experiments to draw conclusions on the properties of the endogenous clock. The obtained phase shifts in locomotor behavior elicited by specific clock neuronal activation were plotted as phase response curves (PRCs). The depolarization of all clock neurons shifted the phase of activity the strongest, especially in the delay zone of the PRC. The exclusive depolarization of the M oscillators together with the l-LNvs (PDF+ neurons: s-LNvs & l-LNvs) caused shifts in the delay and in the advance zone as well, however the advances were severely enhanced in their temporal occurrence ranging into the subjective day. We concluded that light might have inhibitory effects on the PDF+ cells in that particular part of the PRC, as typical light PRCs do not exhibit that kind of distinctive advances. By completely excluding light in the PRC-experiments of this PhD-thesis, this photic inhibitory input to the PDF+ neurons is missing, probably causing the broadened advance zone. These findings suggest the existence of an inhibitory light-input pathway to the PDF+ cells from the photoreceptive organs (Hofbauer-Buchner eyelet, photoreceptor cells of compound eyes, ocelli) or from other clock neurons, which might inhibit phase advances during the subjective day. To get an impression of the molecular state of the clock in the delay and advance zone, staining experiments against Period (PER), one of the most important core clock components, and against the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF) were performed. The cycling of PER levels mirrored the behavioral phase shifts in experimental flies, whereas the controls were widely unaffected. As just those neurons, which had been depolarized, exhibited immediate shifted PER oscillations, this effect has to be rapidly regulated in a cell-autonomous manner. However, the molecular link between clock neuron depolarization and shifts in the molecular clock’s cycling is still missing. This issue was addressed by CREB (cAMP responsive element binding protein) quantification in the large ventrolateral neurons (l-LNvs), as these neurons responded unexpectedly and strongest to the artificial depolarization exhibiting a huge increase in PER levels. It had been previously suggested that CREB is involved in circadian rhythms by binding to regulatory sequences of the period gene (Belvin et al., 1999), thus activating its transcription. We were able to show, that CREB levels in the l-LNvs are under circadian regulation, as they exhibit higher CREB levels at the end of the subjective night relative to the end of the subjective day. That effect was further reinforced by artificial depolarization, independently of the time point of depolarization. Furthermore the data indicate that rises in CREB levels are coinciding with the time point of increases of PER levels in the l-LNvs, suggesting CREB being the molecular link between the neuronal electrical state and the molecular clock. Taking together, the results indicate that a temporal depolarization using dTrpA1 is able to significantly phase shift the clock on the behavioral and protein level. An artificial depolarization at the beginning of the subjective night caused phase delays, whereas a depolarization at the end of the subjective night resulted in advances. The activation of all clock neurons caused a PRC that roughly resembled a light-PRC. However, the depolarization of the PDF+ neurons led to a PRC exhibiting a shape that did not resemble that of a light-mediated PRC, indicating the complex processing ability of excitatory and inhibitory input by the circadian clock. Even though this experimental approach is highly artificial, just the exclusion of light-inputs enabled us to draw novel conclusions on the network communication and its light input pathways. N2 - Die Rotation der Erde um ihre eigene Achse hat periodisch verändernde Umweltbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in den Lichtverhältnissen und der Temperatur, zur Folge. Um das Verhalten, die Physiologie und den Metabolismus eines Organismus an stets wiederkehrende Veränderungen anzupassen, haben sich endogene/circadiane Uhren entwickelt, die es dem Organismus erlauben diese Umweltbedingungen zu antizipieren. In der Chronobiologie, einem wissenschaftlichen Fachbereich, der sich mit der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Inneren Uhr befasst, dient die Taufliege Drosophila melanogaster als nützlicher Modellorganismus. Die Innere Uhr der Taufliege ist anatomisch eher einfach organisiert, weist trotz alledem jedoch Homologien zum Säugersystem auf. Auch im Rahmen dieser Doktorarbeit diente die Taufliege daher dazu grundlegende Netzwerkeigenschaften der circadianen Uhr zu untersuchen. Die Innere Uhr von Drosophila melanogaster besteht aus ungefähr 150 Uhrneuronen, die sich im zentralen Nervensystem der Fliege befinden. Diese Uhrneurone können, bezüglich ihrer anatomischen Position im Gehirn in die Gruppe der dorsalen Neurone (DN1, DN2, DN3), sowie in die der lateralen Neurone untergliedert werden (LPN, LNd, s-LNv, l-LNv). Funktionell werden diese Uhrneuronengruppen als Morgen- und Abendoszillatoren (M- und E-Oszillatoren) klassifiziert, da sie für unterschiedliche Verhaltensanteile in der Laufaktivität der Fliege unter Licht-Dunkel-Verhältnissen (LD) verantwortlich sind. Die s-LNv stellen dabei die Morgenoszillatoren (M-Oszillatoren) dar und werden als Hauptschrittmacher betrachtet, da sie die Geschwindigkeit der Uhr unter konstanten Bedingungen (Dauerdunkel; DD) bestimmen. Die Gruppe der Abendoszillatoren (EOszillatoren) besteht aus den LNd, einigen DN1 und der fünften s-LNv (5th s-LNv) und ist für die richtige Terminierung der Abendaktivität in LD zuständig. All diese Uhrneurone sind funktionell nicht unabhängig voneinander, sondern bilden komplexe neuronale Verschaltungen untereinander aus, die durch einen hohen Grad an Plastizität bezüglich ihrer Reaktion auf unterschiedliche Umweltparameter (Zeitgeber), wie Licht oder Temperatur, gekennzeichnet sind. Obwohl bereits vieles hinsichtlich der Funktion und der Bedeutung einiger Gruppen von Uhrneuronen bekannt ist, ist das genaue Zusammenspiel unter ihnen immer noch recht unklar. Um die Mechanismen, die in den Kommunikationsprozessen zwischen verschiedenen Uhrneuronen involviert sind, zu untersuchen, machten wir Gebrauch von dTrpA1, einem thermosensitiven Kationenkanal, der es durch die Applizierung von Temperaturpulsen (TP) über 29°C ermöglicht, Neuronen in der intakten und sich frei bewegenden Fliege zeitlich begrenzt und zellspezifisch zu depolarisieren. Mithilfe verschiedener Uhr-spezifischer GAL4-Treiberlinien und der Verabreichung von TP zu verschiedenen Zeitpunkten des circadianen Zyklus in DD, war es uns möglich Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Inneren Uhr anhand von Phasen-Verschiebungsexperimenten zu ziehen. Die hervorgerufenen Phasenverschiebungen im Laufverhalten, die durch die Aktivierung spezieller Uhrneuronen hervorgerufen wurden, wurden dabei als Phasen Responz Kurve (engl. phase response curve; PRC) dargestellt. Die Depolarisierung aller Uhrneurone verschob die Phase der Aktivität am stärksten, insbesondere in der Phasen-Verzögerungszone der PRC. Wurden ausschließlich die M-Oszillatoren zusammen mit den l-LNv (PDF+ Neurone: s-LNv & l-LNv) depolarisiert, wurden ebenso Phasenverschiebungen nach vorne, wie auch nach hinten hervorgerufen, jedoch reichten die Verschiebungen nach vorne deutlich in den subjektiven Tag hinein. Daraus schlussfolgerten wir, dass Licht inhibitorischen Einfluss in diesem Bereich der PRC haben muss, da typische Licht-PRCs nicht derart ausgeprägte Vorverschiebungen aufweisen. Aufgrund des vollständigen Lichtausschlusses in den PRC-Versuchen dieser Doktorarbeit fehlt jedoch dieser Licht-vermittelte inhibitorische Einfluss zu den PDF+ Neuronen und führt daher zur zeitlich stark ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone. Diese Ergebnisse lassen daher vermuten, dass ein inhibitorisch wirkender Licht-vermittelter Eingang zu den PDF+ Neuronen von den photorezeptiven Organen (Hofbauer-Buchner Äuglein, Photorezeptoren der Komplexaugen, Ocellen) oder von anderen Uhrneuronen existieren muss, der die Phasen-Vorverschiebungen während des subjektiven Tages unterdrückt. Um Kenntnis über den molekularen Status der Uhr in der Verzögerungs- und Phasen-Vorverschiebungszone zu erlangen, wurden Färbungen gegen das Protein Period (PER), eines der zentralen Bestandteile der Inneren Uhr und gegen das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF) angefertigt. Der zeitliche Verlauf im Auf- und Abbau des PER Proteins spiegelte die Phasenverschiebungen im Verhalten der Experimentalfliegen wider, wohingegen die Kontrollen weitestgehend unauffällig blieben. Zudem waren nur diejenigen Neurone von einer unmittelbaren Verschiebung der PER Protein Oszillation betroffen, die depolarisiert wurden, was auf einen schnellen Zell-autonomen Prozess schließen lässt. Die molekulare Verknüpfung, die zwischen der Depolarisation der Uhrneuronen und der Verschiebung der molekularen Uhr-Oszillation fungiert, ist immer noch unbekannt. Diesem Thema wurde nachgegangen, indem CREB (engl. cAMP responsive element binding protein) in den großen ventrolateralen Neuronen (l-LNv) quantifiziert wurde, da diese Neuronen unerwarteterweise und am wirksamsten auf die artifizielle Depolarisation mit einer starken PER-Akkumulation reagiert haben. In vorherigen Arbeiten wurde bereits angenommen, dass CREB in die circadiane Rhythmik involviert sei, indem es an Regulationssequenzen des period Gens bindet (Belvin et al., 1999) und somit dessen Transkription aktiviert. Wir konnten zeigen, dass die Menge an CREB Protein in den l-LNv circadian reguliert wird, da diese am Ende der subjektiven Nacht im Vergleich zum Ende des subjektiven Tages deutlich erhöht ist. Dieser Effekt konnte durch die artifizielle Depolarisation, aber unabhängig von deren Zeitpunkt, weiter verstärkt werden. Zudem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Akkumulation des CREB Proteins mit dem Zeitpunkt des Anstiegs des PER Proteins in den l-LNv koinzidiert. Das lässt die Vermutung zu, dass CREB als molekulare Verbindung zwischen dem elektrischen neuronalen Status und der molekularen Uhr dienen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die zeitlich begrenzte Depolarisation mithilfe von dTrpA1 signifikante Phasenverschiebungen im Verhalten wie auch auf der Proteinebene hervorrufen kann. Eine artifizielle Depolarisation zu Beginn der subjektiven Nacht verursacht Phasenverschiebungen nach hinten, wohingegen eine Depolarisation zum Ende der subjektiven Nacht Phasenverschiebungen nach vorne zur Folge hat. Die Aktivierung aller Uhrneurone brachte eine PRC hervor, die weitestgehend einer Licht-PRC gleicht. Die Depolarisierung der PDF+ Zellen hingegen ergab eine PRC, die sich insbesondere bezüglich der ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone von einer Licht-vermittelten PRC unterscheidet. Die Innere Uhr scheint somit die Fähigkeit zu besitzen, exzitatorische und inhibitorische Eingänge in komplexer Art und Weise zu verarbeiten. Obwohl der in dieser Doktorarbeit gewählte experimentelle Ansatz hochgradig artifiziell ist, war es uns gerade durch den Ausschluss von Licht möglich, neue Schlussfolgerungen bezüglich der Kommunikation innerhalb des Netzwerks und dessen Lichtinformations-Eingänge zu ziehen. KW - Chronobiologie KW - Circadian clock KW - Tagesrhythmus KW - Taufliege Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137118 ER - TY - THES A1 - Hackl, Thomas T1 - A draft genome for the Venus flytrap, Dionaea muscipula : Evaluation of assembly strategies for a complex Genome – Development of novel approaches and bioinformatics solutions T1 - Ein Genom für die Venus Fliegenfalle, Dionaea muscipula N2 - The Venus flytrap, \textit{Dionaea muscipula}, with its carnivorous life-style and its highly specialized snap-traps has fascinated biologist since the days of Charles Darwin. The goal of the \textit{D. muscipula} genome project is to gain comprehensive insights into the genomic landscape of this remarkable plant. The genome of the diploid Venus flytrap with an estimated size between 2.6 Gbp to 3.0 Gbp is comparatively large and comprises more than 70 % of repetitive regions. Sequencing and assembly of genomes of this scale are even with state-of-the-art technology and software challenging. Initial sequencing and assembly of the genome was performed by the BGI (Beijing Genomics Institute) in 2011 resulting in a 3.7 Gbp draft assembly. I started my work with thorough assessment of the delivered assembly and data. My analysis showed that the BGI assembly is highly fragmented and at the same time artificially inflated due to overassembly of repetitive sequences. Furthermore, it only comprises about on third of the expected genes in full-length, rendering it inadequate for downstream analysis. In the following I sought to optimize the sequencing and assembly strategy to obtain an assembly of higher completeness and contiguity by improving data quality and assembly procedure and by developing tailored bioinformatics tools. Issues with technical biases and high levels of heterogeneity in the original data set were solved by sequencing additional short read libraries from high quality non-polymorphic DNA samples. To address contiguity and heterozygosity I examined numerous alternative assembly software packages and strategies and eventually identified ALLPATHS-LG as the most suited program for assembling the data at hand. Moreover, by utilizing digital normalization to reduce repetitive reads, I was able to substantially reduce computational demands while at the same time significantly increasing contiguity of the assembly. To improve repeat resolution and scaffolding, I started to explore the novel PacBio long read sequencing technology. Raw PacBio reads exhibit high error rates of 15 % impeding their use for assembly. To overcome this issue, I developed the PacBio hybrid correction pipeline proovread (Hackl et al., 2014). proovread uses high coverage Illumina read data in an iterative mapping-based consensus procedure to identify and remove errors present in raw PacBio reads. In terms of sensitivity and accuracy, proovread outperforms existing software. In contrast to other correction programs, which are incapable of handling data sets of the size of D. muscipula project, proovread’s flexible design allows for the efficient distribution of work load on high-performance computing clusters, thus enabling the correction of the Venus flytrap PacBio data set. Next to the assembly process itself, also the assessment of the large de novo draft assemblies, particularly with respect to coverage by available sequencing data, is difficult. While typical evaluation procedures rely on computationally extensive mapping approaches, I developed and implemented a set of tools that utilize k-mer coverage and derived values to efficiently compute coverage landscapes of large-scale assemblies and in addition allow for automated visualization of the of the obtained information in comprehensive plots. Using the developed tools to analyze preliminary assemblies and by combining my findings regarding optimizations of the assembly process, I was ultimately able to generate a high quality draft assembly for D. muscipula. I further refined the assembly by removal of redundant contigs resulting from separate assembly of heterozygous regions and additional scaffolding and gapclosing using corrected PacBio data. The final draft assembly comprises 86 × 10 3 scaffolds and has a total size of 1.45 Gbp. The difference to the estimated genomes size is well explained by collapsed repeats. At the same time, the assembly exhibits high fractions full-length gene models, corroborating the interpretation that the obtained draft assembly provides a complete and comprehensive reference for further exploration of the fascinating biology of the Venus flytrap. N2 - Die Venus Fliegenfalle, D. muscipula fasziniert aufgrund ihres karnivoren Lebensstil und ihrer hochspezialisierten Fallen Biologen schon seit der Zeit von Charles Darwins. Das Ziel des D. muscipula Genomprojekts ist es, neue Einblicke in den genomischen Grundlagen dieser besonderen Pflanze zu gewinnen. Die diploide Venus Fliegenfalle verfügt mit eine geschätzten Größe von 2.6 bp bis 3Gbp über ein vergleichsweise großes Genom, das zudem zu über 70% aus repetitiven Regionen besteht. Sequenzierung und Assembly von Genomen dieser Größenordnung stellen selbst mit neusten technischen und informatischen Methoden eine große Herausforderung dar. Zum ersten mal sequenziert und assembliert wurde das Genom 2011 durch das BGI (Beijing Genomics Institute). Meine Arbeit am Genom der Fliegenfalle begann mit der Analyse des 3.7Gbp großen Assemblies, welches wir vom BGI erhalten haben. Mit meinen Untersuchungen könnte ich zeigen, dass das Assembly stark fragmentiert und gleichzeitig durch überrepräsentierte repetitive Sequenzen stark aufgebläht ist. Darüberhinaus beinhaltet es gerade ein mal eine drittel der erwarteten Gene in Volllänge, wodurch es für die weiter Analyse ungeeignet ist. In meiner weiteren Arbeit habe ich mich daher darauf konzentriert, unsere Sequenzierungsund Assemblierungsstrategie zu verfeinern um ein stärker zusammenhängendes und vollständigeres Assembly zu erhalten. Dafür war es notwendig die Qualität der Sequenzierdaten so wie den Assemblierungsprozess selbst zu optimieren, und Programme zu entwickeln, die eine Verbesserung der Daten und eine Analyse der Zwischenergebnisse ermöglichen. So wurden etwa zur neue Bibliotheken von nicht-polymorphen DNA-Proben sequenziert um die Heterogenität im Datensatz zu verringern. Um die Kontinuität der Assemblies zu verbessern und Probleme mit der Heterozygosität der Daten zu lösen habe ich eine Reihe verschiedener Assemblierungsprogramme getestet. Dabei zeigte sich, dass das Programm ALLPATHS-LG am besten geeignet ist für die Assemblierung von D. muscipula Daten. Durch den Einsatz von digitaler Normalisierung konnte ich den Bedarf an Computerressourcen für einzelne Assemblierungen deutlich reduzieren und gleichzeitig die Kontinuität der Assemblies deutlich erhöhen. Zur besseren Auflösung repetitiver Strukturen im Genom, habe ich auf eine neu entwickelte Sequenziertechnologie von PacBio zurückgegriffen, die deutlich länger Sequenzen erzeugt. Um die neuen Daten trotz ihrer hohen Fehlerrate von 15% für Assemblierungen nutzen zu können, entwickelte ich das Korrekturprogramm proovread (Hackl et al., 2014). proovread nutzt kurze Illumina Sequenzen mit hoher Sequenziertiefe um innerhalb eines iterativen Prozess Fehler in PacBio Daten ausfindig zu machen und zu korrigieren. Das Programm erreicht dabei eine bessere Genauigkeit und eine höhere Sensitivität als vergleichbare Software. Darüber hinaus erlaubt sein flexibles Design auch Datensätze in der Größenordung des Fliegenfallengenoms effizient auf großen Rechenclustern zu bearbeiten. Neben dem Assemblierungsprozess an sich, stellt auch die Analyse von Assemblies großer Genome eine Herausforderung dar. Klassische Methoden basieren oft auf der rechenintensiven Berechnung von Alignments zwischen Sequenzierdaten und Assembly. Um vergleichbare Analysen deutlich schneller generieren zu können, habe ich Programme entwickelt die auf der Auswertung von k-mer Häufigkeiten beruhen, und die gewonnenen Ergebnisse in übersichtlichen Graphiken darstellen. Durch Kombination der so gewonnenen Einblicke und der verschiedenen Erkenntnisse bezüglich der Optimierung es Assemblierungsprozesses, war es mir am Ende möglich, ein Assembly von hoher Qualität für das Genom der Venus Fliegenfalle zu rekonstruieren. Dieses habe ich weiter verfeinert, unter anderem durch das Entfernen heterozygoter Sequenzen und durch das Flicken von Lücken mit Hilfe von PacBio Daten. Das so erstelle Assembly besteht aus 86 × 103 Sequenzen und hat eine Gesamtgröße von 1.45Gbp. Der Unterschied zur erwarteten Genomgröße lässt sich dabei gut durch kollabierte repetitive Regionen erklären. Gleichzeitig untermauert ein hoher Anteil an Volllängengenen im Assembly die Interpretation, dass das vorliegende Assembly eine vollständiges und umfassendes Abbild der D. muscipula Genom zeigt, und dass es sich damit als gute Grundlage für weitere Untersuchungen zur Biologie dieser faszinierenden Pflanze eignet. KW - Venusfliegenfalle KW - genome assembly KW - repeats KW - heterozygosity KW - pacbio correction KW - Genom Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-133149 ER - TY - THES A1 - Imes, Dennis T1 - Aufklärung der molekularen Struktur und Funktion des R-Typ Anionenkanals QUAC1 in Schließzellen T1 - Molecular structure and function analyses of the R-type anion channel QUAC1 in guard cells N2 - Zum Gasaustausch mit Ihrer Umgebung besitzen höhere Pflanzen stomatäre Komplexe. Die Turgor-getrieben Atmungsöffnungen in der Epidermis der Blätter werden von zwei Schließzellen umsäumt. Um bei Trockenheit einen exzessiven Verlust von Wasser zu verhindern, synthetisieren/importieren Schließzellen das Stresshormon ABA (Abszisinsäure), das über eine schnelle ABA-Signalkaskade plasmamembrangebundene Ionenkanäle steuert. Dabei wird der Stomaschluss durch die Aktivität von R-(rapid) und S-(slow)Typ Anionenkanälen initiiert. Obwohl die R- und S-Typ Anionenströme in Schließzellen seit Jahrzehnten bekannt waren, konnte erst kürzlich das Gen identifiziert werden, das für den S-Typ Anionenkanal (SLAC1, Slow activating Anion Channel 1) kodiert. Daraufhin wurde schnell der Zusammenhang zwischen dem Stresshormon ABA, der ABA-Signalkette und der Aktivität des SLAC1 Anionenkanals im heterologen Expressionssystem der X. laevis Oozyten als auch in Schließzellprotoplasten aufgeklärt. Es konnte gezeigt werden, dass ABA durch einen zytosolischen Rezeptor/Phosphatasekomplex (RCAR1/ABI1) erkannt wird und die Aktivität von kalziumabhängigen Kinasen (CPK-Familie) sowie kalziumunabhängigen Kinasen der SnRK2-Familie (OST1) steuert. In Anwesenheit von ABA phosphorylieren diese Kinasen SLAC1 und sorgen so für die Aktivierung von Anionenströmen und damit für die Initiierung des Stomaschlusses. Die genetische Herkunft der ABA-induzierten R-Typ Ströme in Schließzellen war zu Beginn der vorliegenden Arbeit noch nicht bekannt. R-Typ Ströme zeichnen sich durch eine strikte Spannungsabhängigkeit und sehr schnellen Aktivierungs- sowie Deaktivierungskinetiken aus. Die Charakterisierung von Verlustmutanten des Schließzell-exprimierten Gens ALMT12 (Aluminium-aktivierter Malattransporter 12) konnte in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Martinoia (Zürich) erste Hinweise auf die Beteiligung dieses Gens an der Stomabewegung demonstrieren. Anschließende Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten aus Wildtyppflanzen und ALMT12-Verlustmutanten zeigten, dass ALMT12 für die Malat-aktivierte R-Typ Anionenstromkomponente verantwortlich ist. Deshalb wurde der Anionenkanal QUAC1 (Quickly activating Anion Channel 1) benannt - in Anlehnung an die Benennung des Anionenkanals SLAC1. Mit der Identifizierung von QUAC1 in planta war es nun meine Aufgabe, die elektrischen Eigenschaften von ALMT12/QUAC1 und dessen Aktivitätskontrolle durch die ABA-Signalkaskade im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten zu untersuchen. Protein-Protein Interaktionsstudien mit der Hilfe der Bimolekularen Fluoreszenz-Technik, sowie die Beobachtung von markant erhöhten QUAC1 Anionenströmen in Anwesenheit der SnRK2 Kinase OST1 und den Calcium-abhängigen Kinasen CPK2 und CPK20, ließen den Schluss zu, dass QUAC1, ebenso wie SLAC1, unter der Kontrolle des schnellen ABA-Signalwegs steht. Eine zusätzliche Expression des negativen Regulators ABI1 unterdrückte die aktivierenden Eigenschaften der QUAC1-aktivierenden Kinasen, was die Hypothese der Koregulation von S- und R-Typ Anionenkanälen durch die gleiche ABA-Signalkaskade weiter unterstützt. Zur weiteren Aufklärung der elektrischen Eigenschaften von QUAC1 wurden tiefgreifende elektrophysiologische Untersuchungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemmen Technik durchgeführt. Durch die Wahl von geschickten Spannungsprotokollen konnte sowohl die schnelle Aktivierungskinetik als auch die schnelle Deaktivierungskinetik von QUAC1 bestimmt und quantifiziert werden. Diese Stromantworten waren sehr ähnlich zu den R-Typ Strömen, die man von Patch-Clamp Untersuchungen an Schließzellprotoplasten kannte, was ein weiteres Indiz dafür war, dass es sich bei QUAC1 tatsächlich um eine Komponente des R-Typ Kanals aus Schließzellen handelt. Weiterführende Untersuchungen bezüglich der Spannungsabhängigkeit und der Selektivität von QUAC1 charakterisierten das Protein als einen Depolarisations-aktivierten Anionenkanal mit einer starken Präferenz für Dicarbonsäuren wie Malat und Fumarat. Zudem konnte auch eine Leitfähigkeit für Sulfat und Chlorid nachgewiesen werden. Interessanterweise erwies sich Malat nicht nur als ein permeierendes Ion, sondern auch als ein regulierendes Ion, welches das spannungsabhängige Schalten von QUAC1 maßgeblich beeinflusst. Extrazelluläres Malat verschob die Offenwahrscheinlichkeit von QUAC1 sehr stark zu negativeren Membranspannungen, so dass der Anionenkanal bereits bei typischen Ruhespannungen von Schließzellen (ca. -150 mV) aktiviert werden konnte. Eine Beladung von QUAC1-exprimierender Oozyten mit Malat bewirkte zum einen höhere Anioneneffluxströme, aber auch eine Verschiebung der spannungsabhängigen Offenwahrscheinlichkeit zu negativeren Membranpotentialen. Struktur-Funktionsanalysen sollten die umstrittene Topologie von ALMT-ähnlichen Proteinen beleuchten und die molekulare Herkunft der Phosphorylierungsaktivierung aufzeigen, sowie die Malatabhängigkeit und die starke Spannungsabhängigkeit von QUAC1 aufklären. Es zeigte sich jedoch schnell, dass Punktmutationen und Deletionen im C-Terminus von QUAC1 sehr häufig zu nicht-funktionellen Mutanten führten. Diese Tatsache weist darauf hin, dass es sich um einen hoch-strukturierten und funktionell sehr wichtigen Bereich des Anionenkanals handelt. Auch die Topologie des Anionenkanalproteins wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Sowohl die Lage des N- und C-Terminus (extrazellulär oder intrazellulär), als auch die Anzahl der membrandurchspannenden Domänen war nicht abschließend geklärt. Deshalb wurde in einem Fluoreszenz-basiertem Ansatz die Lage der Termini bestimmt. Im Rahmen meiner Arbeit konnte somit eindeutig gezeigt werden, dass sich beide Termini im Zytosol der Zelle befinden. Auf Grundlage von Modellen aus der Literatur und meiner Topologiebestimmungen konnte schließlich ein erweitertes Modell zur Struktur von QUAC1 entwickelt werden. Dieses Modell kann in Zukunft als Ausgangspunkt für weiterführende Struktur-Funktionsanalysen dienen. Diese Arbeit hat somit gezeigt, dass das Gen QUAC1 tatsächlich eine Komponente der R-Typ Ströme in Schließzellen kodiert. Ebenso wie SLAC1 steht der Malat-induzierte Anionenkanal QUAC1 unter der Kontrolle der schnellen ABA-Signalkaskade. In Zukunft bleibt zu klären, welche weiteren Gene für die R-Typ Kanalproteine in Schließzellen kodieren und welche strukturelle Grundlage für die besonderen Eigenschaften von QUAC1 hinsichtlich seiner schnellen Kinetiken, seiner Selektivität und Aktivierbarkeit durch Malat. N2 - Higher plants are able to exchange gases with their environment. This gas exchange is accomplished by the stomatal complex, which consist of two tugor-driven guard cells (GC) that surround a pore in the epidermis. Under drought conditions, guard cells produce and import the plant stress hormone abscisic acid (ABA). ABA is able to activate plasma membrane localized ion channels via the fast ABA-signal cascade, which leads to a closure of the stoma and thus minimizes the loss of water. The stomatal closure is initialized by the R-(rapid) and S-(slow) type anion channels. Although R- and S-type anion channels in guard cells have been known for over a decade, the gene which decodes the S-type anion channel SLAC1 (Slow activating Anion Channel 1) has only recently been identified. Consequently, the relationship between the plant hormone ABA, the ABA-signal-transduction-chain, and the activity of SLAC1 could be clarified in rapid succession in the heterologous expression system of X. laevis oocytes as well as in GC-protoplasts. It could be shown that ABA is recognized by a cytosolic receptor/phosphatase complex (RCAR/ABI1). This complex in turn regulates the activity of calcium dependent kinases of the CPK-family as well as the calcium independent kinases of the SnRK2-family (OST1). In the presence of ABA, these kinases activate SLAC1 by phosphorylation, and by this activate anion currents across the plasma membrane, ultimately leading to closure of the stomates. The genetic origin of the ABA induced R-type currents in guard cells was unknown at the beginning of this thesis. R-type currents are characterized by strong voltage-dependent behavior and fast activation- and deactivation-kinetics. In cooperation with the workgroup of Martinoia (Zürich), knock-out plants missing the guard cell gen ALMT12 (Aluminum activated Malate Transporter 12) were characterized. This work delivered the first hints that ALMT12 is involved in the stomatal movement. Subsequent patch-clamp studies on GC-protoplasts from WT and ALMT12 knock-out mutants revealed that ALMT12 is responsible for the malate-activated component of the R-type anion currents. Therefore, the anion-channel was named QUAC1 (Quick activating Anion Channel) in dependence on the naming of SLAC1. With the identification of QUAC1 in planta it was my duty to research the electrical properties of ALMT12/QUAC1 as well as the activation by the ABA-signal-transduction-chain in the heterologous expression system of X. laevis oocytes. Protein-protein interaction studies via bimolecular fluorescence complementation (BIFC) as well as significantly higher QUAC1 anion currents in the presence of the SnRK2 kinase OST1 and the calcium-dependent-kinases CPK2 and CPK20 led to the conclusion that QUAC1 is under the control of the fast ABA signaling pathway, as it was shown before for SLAC1. Furthermore expression of the negative regulator ABI1 inhibited the activating properties of the QUAC1-activating kinases. These findings support further the hypotheses of the simultaneous regulation of S- and R-type anion channels by the ABA-signaling pathway. To further elucidate the electrical properties of QUAC1, electrophysiological investigations were performed with the two-electrode-voltage-clamp technique (TEVC). In this way, the fast activation and deactivation of QUAC1 could be identified and quantified by carefully chosen voltage-clamp protocols. These current responses of QUAC1 closely resembled the R-type currents known from former patch-clamp studies from GC-protoplasts. This further supported the conclusion that QUAC1 is indeed a component of the R-type channels of guard cells. Additional investigations of the voltage-dependence and selectivity of QUAC1 characterized the protein as a depolarization-activated anion channel with strong preference for bicarbonate acids like malate and fumarate. Furthermore, a conductance for sulfate and chloride could also be shown. Interestingly, malate was not only able to permeate the channel, it was also able to alter the voltage-dependence of QUAC1. External malate strongly shifted the open probability of QUAC1 to negative membrane voltages. By this shift the anion channel could be activated at typical guard cell membrane potentials (approx. 150 mV). Loading of QUAC1 expressing oocytes with malate produced enhanced anion efflux currents and shift the voltage-dependent open probability to negative membrane potentials. Structure function analysis were performed to clarify the controversial topology of ALMT like proteins and the molecular origin of the phosphorylation activation. Furthermore, this should elucidate the origin of the malate dependence and the strong voltage dependence of QUAC1. It soon became evident that point mutations and deletions in the C-terminus of QUAC1 very often lead to nonfunctional mutants. This points toward a highly structured and functionally important region of the anion channel. In addition, the topology of the anion-channel-protein is controversially debated in literature. Neither the position of the C- and N-terminus (intra- or extracellular) nor the number of transmembrane domains has been conclusively established. Due to this, the position of the C- and N-termini were localized by a fluorescence based experiment. As part of this work, it could be shown explicitly that both termini reside in the cytosol of the cell. Based on models from the literature and my own topology studies, an enhanced structure model for QUAC1 could be generated. This model will serve as a starting point for future structure function analysis. This work has thus shown that the gene QUAC1 indeed encodes a component of the R-type currents in guard cells. Like SLAC1, the malate-induced anion channel QUAC1 is under the control of the fast ABA-signal-cascade. Future works must establish which further genes encode R-type channel proteins and which structural attributes are responsible for the special traits of QUAC1: its fast kinetics, its selectivity and its activation by malate. KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Anionentranslokator KW - Abscisinsäure KW - Struktur KW - Funktion KW - R-Typ KW - Anionenkanal KW - QUAC1 KW - TEVC Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136860 ER - TY - THES A1 - Jung, Lisa Anna T1 - Targeting MYC Function as a Strategy for Tumor Therapy T1 - Hemmung der MYC-Funktion als Strategie für die zielgerichtete Tumortherapie N2 - A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues. In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC. The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1. In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy. N2 - Eine Vielzahl humaner Tumore entsteht durch die aberrante Expression des Onkoproteins MYC. Da MYC als Transkriptionsfaktor viele zelluläre Prozesse reguliert, ist er auch maßgeblich an der Entwicklung von normalem Gewebe beteiligt. Die direkte Hemmung von MYC stellt eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Studien mit dem dominant-negativen MYC-Allel namens OmoMYC belegten, dass MYC ein potenzieller Angriffspunkt für die zielgerichtete Tumortherapie ist. Die systemische Expression dieser MYC-Mutante löste eine dauerhafte Tumorregression aus und zeigte milde sowie vollständig reversible Nebenwirkungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus von OmoMYC untersucht, wobei sowohl Methoden der Strukturbiologie als auch der funktionalen Genomik angewendet wurden. Die Kristallstruktur des OmoMYC Proteins wurde im freien und E-Box-gebundenen Zustand bestimmt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass OmoMYC ein stabiles Homodimer bildet. Als solches erkennt es DNA mittels derselben basenspezifischen Interaktionen wie der MYC/MAX-Komplex. Dabei bindet OmoMYC DNA mit einer ähnlichen Affinität wie das MYC/MAX-Heterodimer. Die genomweite Expressionsanalyse mittels RNA-Sequenzierung identifiziert eine Reduktion sowohl der MYC-abhängigen Transkriptionsaktiverung als auch der Transkriptionsrepression durch OmoMYC. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung wird gezeigt, dass OmoMYC mit MYC/MAXKomplexen auf Chromatin konkurriert und so deren Besetzung global an Konsensus-Bindestellen verringert. Die stärkste Reduktion zeigt sich an Promoterregionen mit schwacher Affinität für die MYC-Bindung, welche durch onkogene MYC-Proteinmengen aufgefüllt werden. Gene set enrichment-Analysen unter Berücksichtigung von OmoMYC-regulierten Genen erlaubten die Identifizierung von Tumor-Subgruppen mit hohen MYC-Proteinmengen in zahlreichen Tumorentitäten. Zusammen mit einem fokussierten shRNA-Screen können so neue Zielproteine für die Bekämpfung von MYC-getriebenen Tumoren, wie zum Beispiel ATAD3A, BOP1 und ADRM1, identifiziert werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass OmoMYC spezifisch das Tumorzellwachstum inhibiert, indem es die Expression von zentralen Proteinen limitiert, welche durch erhöhte MYC-Proteinmengen reguliert werden. Somit können neue Strategien zur Tumortherapie identifiziert werden, die auf onkogene Funktionen von MYC zielen. KW - Myc KW - Kristallstruktur KW - Transkription KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - DNS-Bindung KW - OmoMYC KW - promoter invasion Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146993 ER -