TY - THES A1 - Schütz, Wolfgang T1 - Postmeiotische Expression und funktionelle Charakterisierung von Lamin B3 in der Spermatogenese der Maus T1 - Postmeiotic expression and functional characterisation of lamin B3 in mouse spermatogenesis N2 - Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3. N2 - Lamins are members of a protein family that are the main structural elements of the nuclear envelope in eukaryotic cells. Differentiated mammalian somatic cells express lamins A, C, B1 and B2. The composition and structural organisation of the nuclear lamina in spermatogenic cells differ significantly from that of somatic cells: among the somatic lamins they only express lamin B1 but, additionally, two germ line-specific isoforms could be found, namely lamins C2 and B3. This study contains a detailed investigation of the expression pattern and localisation of lamin B3 during mouse spermatogenesis. By combining RT-PCR, immunoblotting, and immunofluorescence microscopy, it turned out, that lamin B3 is selectively expressed in postmeiotic stages during spermiogenesis. In round spermatids, lamin B3 is distributed in the nuclear periphery and, notably, also in the nucleoplasm. In the course of spermiogenesis, lamin B3 becomes redistributed as it concentrates progressively to the posterior pole of spermatid nuclei. The results show that during mammalian spermiogenesis the nuclear lamina is composed of B-type isoforms only, namely lamin B1 and the germ line-specific lamin B3. Lamin B3 is the first example of a mammalian lamin that is selectively expressed during postmeiotic stages of spermatogenesis. When ectopically expressed in culture cells, lamin B3 causes severe deformation of nuclei which adopt a hook-like configuration. Transfection experiments in COS-7 cells could prove that the observed nuclear deformations are due to the shortened rod domain of lamin B3. Cell fractionation experiments revealed that lamin B3 can be solubilised more easily than lamin B2. In addition, fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) analyses of transfected COS-7 cells showed that considerable amounts of lamin B3 molecules exhibit a significantly increased mobility compared to lamin B2. The increased solubility of lamin B3 compared to lamin B2 as well as the mobility of that protein is only determined by its shortened rod domain. Taken together, these data lead to the conclusion that lamin B3 reduces the stability of the nuclear periphery, what might be an important prerequisite for some reorganisation processes during spermiogenesis to occur. Via a pull-down assay using a fusion protein containing GST and the 84 amino acid long N-terminal domain of lamin B3 a screen for interaction partners of lamin B3 was performed. With MSY2, MSY2a and MSY4 three interesting candidates were found. These proteins belong to the large family of Y-box containing proteins, which are DNA and RNA binding proteins. They are involved in storage and subsequent translation of various mRNAs, e.g. the mRNA of protamine 1 (this mechanism for regulation of gene expression is a major principle in spermatogenesis). The interaction between lamin B3 and the Y-box proteins has to be verified but it would provide an additional link between reorganisation of chromatin and the nuclear envelope as it has already been reported for other proteins of the nuclear envelope like GCL or LBR. Besides that it could be a first evidence for a specific function of the lamin B3 N-terminal domain. KW - Maus KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamin B KW - Genexpression KW - Spermatogenese KW - Kernlamina KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Lamin B3 KW - Spermiogenese KW - spermatogenesis KW - nuclear lamina KW - nuclear envelope KW - lamina KW - lamin B3 KW - spermiogenesis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17110 ER - TY - THES A1 - Schütz, Monika T1 - Dynamik und Funktion der HMG-Proteine T1 - Dynamics and Function of HMG-proteins N2 - HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielfältigen Funktionen erfüllen können, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde für die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte für die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erhöhte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivität der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen führten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabhängig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen für die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden können. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine führen zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abhängige Prozesse regulieren können. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen darüber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, übernehmen können. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erklären so, wie diese Proteine ihre vielfältigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abhängiger Prozesse erfüllen können. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschränkte zeitliche Auflösungsvermögen konfokaler Mikroskope der älteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen können, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation möglich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen können. Durch eine erhöhte Verweildauer können auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erhöhte Verweildauer aber auch zur Verdrängung anderer Proteine führen, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren ermöglicht interessante neue Erkenntnisse. Diese müssen aber stets vor dem Hintergrund eines veränderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Klärung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen können, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe häufig überexprimiert sind, von großer Bedeutung. N2 - HMG proteins are architectural chromatin proteins that regulate different DNA dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. To understand how HMG proteins manage to fulfill their multiple functions they were investigated in vivo with the help of EGFP and DsRed2 fusion proteins. Using photobleaching techniques their dynamic properties were characterized in detail. Furthermore, the expression pattern of HMGN proteins in tumor cell lines was investigated for the first time. As presented in this thesis, it was found that HMGN2 proteins exhibited an elevated expression level in some tumor cells (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) correlating with the tumor differentiation status. In contrast a reduced expression of HMGN1 found in Mammacarcinoma and Non-Hodgkin-Lymphoma correlated with tumor aggressiveness. Therefore the analyses of HMGN expression may be a suitable diagnostic marker at least in the tumors investigated. FRAP analyses with cells expressing EGFP fusion proteins revealed that HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b and HMGB1 move very rapidly through the cell nucleus and only bind transiently to chromatin. It was demonstrated that the decision where HMG proteins bind in vivo is essentially mediated by their specific DNA binding motifs. However, the individual residence times in eu- or heterochromatin and chromosomes are regulated by protein modifications (phosphorylation, acetylation). This has been demonstrated using point mutated and truncated HMGA fusion proteins and by the application of specific drugs as well. FRAP analyses also indicated that the splice variants HMGA1a and HMGA1b exhibit different kinetic properties. This supports the view that both variants have different functions. The kinetic parameters characteristic for each HMG protein lead to a model of a dynamic chromatin network in which all HMG proteins are able to regulate DNA dependent processes via multiple interactions with other proteins as components of a cocktail of dynamic chromatin proteins. In this model, individual residence times of all HMG proteins which are regulated by secondary modifications would determine how long other chromatin modulating proteins could reside on chromatin. Therefore the dynamic parameters of the HMG proteins directly affect the capability of other proteins to modulate chromatin structure, e.g. by modifications of core histones. This explains the multiple functions of HMG proteins in chromatin packaging and function. The kinetic parameters of some rapidly moving members of the HMG protein family, such as HMGB1, are beyond the time resolution capacities of most confocal microscopes. However, novel setups of modern confocal microscopes are now capable to determine the dynamic parameters of HMGB proteins and allow investigations of drug induced effects on HMGB dynamics. Control experiments revealed that other fluorophors such as DsRed2 modulate the dynamic parameters of HMG fusion proteins. Due to an increased residence time of HMG DsRed2 fusion proteins it is possible to monitor even very transient interactions. Moreover, it could be observed that this increased residence time may interfere with binding of other proteins (i.e. proteins which occupy the same binding sites) leading to a reorganization of chromatin. Thus, fusion proteins with DsRed fluorophores may be used as helpful tools to investigate protein functions. However, results should always be considered against the background of DsRed modulated kinetics and thus they should be interpreted very carefully. Taken together the results presented in this thesis provide novel information about the dynamic behaviour of HMG proteins which is crucial to understand how chromatin is modulated during differentiation processes or development of neoplasia. Their transient interactions with DNA or other proteins and the fact that overexpression correlates with tumor progression might be relevant for the development of novel strategies for tumor treatment. KW - HMG-Proteine KW - Chromatin KW - Genexpression KW - Tumor KW - HMG KW - Dynamik KW - Chromatin KW - EGFP KW - Tumorinstabilität KW - HMG KW - Dynamics KW - Chromatin KW - EGFP KW - Tumorinstability Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Ingo T1 - Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien T1 - Artificial gene expression in human mitochondria N2 - Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen. N2 - Mitochondrial dysfunctions play an important role in a variety of neuromuscular and neurodegenerative diseases. As the proteins of the respiratory chain complexes are encoded by the mitochondrial DNA as well as the nuclear genome, mutations in both could trigger solely the diseases. Up to now, changes of the mitochondrial DNA could not be corrected, hence, therapies were designed to decrease symptoms in patients. In this context, the limiting factor to cure these disease relies on the DNA transport into the mitochondria. The aim of this work was to insert exogenous DNA into the mitochondria of human cultured cells by physical transfection methods. A variety of different vectors was constructed to express the mitochondrially adapted green fluorescent mtEGFP within mitochondria. The ability of these constructs to be expressed and processed was proved by in vitro assays using a mitochrondrial extract. In the transfection experiments using the gene gun, we succeeded for the first time to introduce exogenous plasmid DNA into human mitochondria. The mtEGFP expressed by the transfected vectors could definitely be localized to the mitochondria of the cells. Transfections using magnetic particles as mediator could not be used, because the particles exhibit an autofluorescence which prevents a detection of the mtEGFP expression. An essential prerequisite for the transfection of mitochondria by mechanical methods like microinjection is the reversible induction of megamitochondria, since they could not be penetrated as small regular organelles. Acidification of the culture medium with sodium acetate or acetic acid led to mitochondria exhibiting almost the size of the nucleus, thus giving ideal conditions for microinjection. In the applied microinjection experiments using the mitochondrial expression vectors, cells displayed mitochondria with distinct green fluorescence. In summary, human mitochondria were transfected successfully for the first time with mitochondrial expression vectors. This is a fundamental step in the development of new therapies targeting mitochondrial myopathies. However, the transfection methods have to be optimized to achieve higher transfection efficiencies. KW - Mitochondrium KW - Heterologe Genexpression KW - Mitochondrien KW - mitochondria KW - gene expression KW - Transfektion KW - Mensch KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202 ER - TY - THES A1 - Reisch, Natasa T1 - Das Cysteine-String-Protein in Drosophila melanogaster: Molekulare und funktionelle Analyse verschiedener CSP-Mutanten; Ein Modell zur räumlich und zeitlich kontrollierten CSP-Expression T1 - The cysteine string protein in Drosophila melanogaster: Molecular and functional analysis of different CSP-mutants; A model for spatial and temporal controlled CSP-expression N2 - Die Exozytose von Neurotransmittern und Peptiden während der Verarbeitung und Weiterleitung von Reizen im Nervensystem wird durch eine komplexe Maschinerie von Proteinen reguliert. Das konservierte Cysteine String Protein (CSP), das gebunden an synaptische und andere sekretorische Vesikel vorliegt, konnte in den vergangenen Jahren als Teil in diesen Prozess eingeordnet werden. Die Frage nach der genauen Funktion von CSP während der Exozytose ist allerdings weiterhin offen. CSP-Nullmutanten in Drosophila melanogaster zeigen temperatursensitive Paralyse und eine extrem verkürzte Lebenserwartung, gepaart mit verminderter Fertilität. In larvalen Nerv-Muskel Präparaten kommt es bei Temperaturen über 29°C zu einem reversiblen Block der elektrophysiologisch messbaren synaptischen Transmission. Die Primärstruktur des Cysteine String Proteins kann in folgende konservierte Sequenzabschnitte unterteilt werden: eine N-terminale Protein Kinase A Phosphorylierungsstelle, eine Region mit Homologie zu einer charakteristischen Domäne von DnaJ-Proteinen (DnaJ-Domäne), einen als Linkerregion bezeichneten Abschnitt, eine cysteinreiche Sequenz, die bei Drosophila aus dem namensgebenden Strang von 11 aufeinanderfolgenden Cysteinen flankiert von 2 Cysteinpaaren besteht, und einen schwächer konservierten C-Terminus, in dem sich auch einzelne Spleißvarianten unterscheiden. Versuche mit Vertebraten konnten zeigen, dass CSP in einem trimeren Komplex aus Hsc70/CSP/SGT vorkommt und bei der Exozytose wahrscheinlich als molekulares Co-Chaperon wirkt. Der Cysteinstrang liegt mehrfach palmityliert vor und ist für die Zielfindung des Proteins zur Vesikelmembran essentiell. In vorangegangenen Arbeiten wurde begonnen, bei Drosophila durch gezielte Mutagenese und Keimbahntransformation die Rolle des Cysteinstrangs, der Linkerregion und des C-Terminus für die Funktion des CSP zu analysieren. In der vorliegenden Dissertation wurden in transgenen Fliegen die Eigenschaften von Isoformen mit vier unterschiedlich mutierten Varianten des Cysteinstrangs (CSLP, SCSP, CLP, SSP) und je Deletionen in der Linkerregion (LΔ8) und im C-terminalen Bereich (CΔ27) charakterisiert. Die subzelluläre Verteilung und veränderte Membranbindungseigenschaften dieser Proteine wurden mithilfe von Membranfraktionierung und Glycerindichtegradienten von Homogenaten der transgenen Mutanten aufgezeigt. Die Isoformen CLP und SSP sind aufgrund der fehlenden Palmitylierung nicht an die Membran der synaptischen Vesikel gebunden, während die Isoform CSLP sowohl in der Vesikelmembranfraktion als auch als lösliches Protein nachgewiesen werden kann. Die flankierenden Cysteinpaare und die verbliebenen Cysteine in den Isoformen CSLP und SCSP erfüllen offenbar noch teilweise die Aufgabe des Cysteinstrangs bei der Zielfindung der Proteine. Eine Depalmitylierung mit Hydroxylamin löst das verkürzte SCSP Protein ebensowenig aus der Membran wie das intakte CSP. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen stehen im Einklang mit immunhistochemischen Befunden. Die Deletion bzw. Substitution der zentralen 11 Cysteine in den Isoformen CSLP, CLP und SSP äußert sich in den transgenen Fliegen in einer gleichmäßigeren Verteilung der Proteine, die nicht mehr wie im Wildtyp auf das synaptische Neuropil beschränkt ist. Keine der Isoformen mit verändertem Cysteinstrang ist in der Lage die Funktion des wildtypischen CSP zu übernehmen, da die adulten transgenen Fliegen den temperatursensitiven Phänotyp und eine kurze Lebensdauer ähnlich den Csp-Nullmutanten zeigen. Die Proteinisoformen LΔ8 und CΔ27 dagegen lassen in den biochemischen Analysen keine Abweichung vom Wildtyp erkennen und weisen auch eine wildtypische Verteilung in Kryostat-Gehirnschnitten auf. Die Deletion in der Linkerregion in der Isoform LΔ8 scheint die Funktion des CSPs allerdings einzuschränken, da die entsprechenden transgenen Fliegen bereits bei 38°C, wildtypische Tiere dagegen erst bei 40°C paralysieren. Die in der Literatur beschriebene Interaktion zwischen Drosophila CSP und Syntaxin konnte für die transgen exprimierte größte CSP Isoform CSP1 in Immunpräzipitationsexperimenten mit Drosophila-Kopfhomogenat bestätigt werden. Die Frage nach einer Interaktion zwischen Syntaxin und den anderen untersuchten mutierten CSP-Isoformen bleibt dagegen offen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Versuch, mithilfe des UAS/Gal4- und des Flippase/FRT -Systems die CSP-Expression räumlich und zeitlich zu kontrollieren. Dazu wurde aufgrund von Datenbankangaben eine minimale FRT-Sequenz aus Oligonukleotiden mit entsprechenden Linkern konstruiert. Das gesamte Csp-Gen beziehungsweise die Csp cDNA1 einschließlich der regulatorischen Sequenzen wurde zwischen zwei gleichgerichteten FRT-Sequenzen pW8 eingebracht. Die Keimbahntransformation führte zu mehreren transgenen Fliegenlinien. Nach aufwendigen Kreuzungen mit Gal4-, UAS-Flippase- und Csp-Null-Linien entstanden Fliegen im CSP-Nullhintergrund, welche eine durch die verwendete Gal4-Linie definierte Expression von Flippase zeigten und das FRT-Konstrukt trugen. Diese Fliegen sollten in Flippase positiven Bereichen keine CSP-Expression mehr zeigen. Verhaltensanalysen an solchen Tieren bei normaler und erhöhter Temperatur könnten dann Aufschluss über die Funktion der Zellen ohne CSP-Expression geben. Leider konnten die erwarteten Veränderungen in der CSP-Expression nicht beobachtet werden, obwohl alle Konstrukte sich nach einer Überprüfung als intakt erwiesen haben. Die Ursache für die fehlende Rekombination zwischen den FRT-Sequenzen ist möglicherweise in einer zu geringen Länge dieser Zielsequenz der Flippase zu suchen. Im dritten Abschnitt der Arbeit wird der Csp-Genlokus und seine benachbarten Gene vorgestellt, und die möglichen Auswirkungen der Deletionen in den zur Verfügung stehenden Mutanten CspU1, CspU1w und CspK16 diskutiert. Aufgrund der Daten aus dem Drosophila Genomprojekt lag die Spekulation nahe, dass der Phänotyp der Deletionsmutanten auch durch eine veränderte Expression der benachbarten Gene stromab- und stromaufwärts des Csp Gens beeinflusst werden könnte. Die Auswertung eines Northern Blots von PolyA+-RNA adulter Fliegen, sowie einfache Verhaltenstests an vorliegenden und neu generierten CSP-Nullmutanten konnten diesen Verdacht allerdings nicht bestätigen. N2 - Exocytosis during synaptic transmission is regulated by a complex machinery of numerous proteins. CSPs (cysteine string proteins), conserved from C.elegans to mamals, are attached to synaptic vesicle membranes and other secretory granules. They were therefore implicated to play a distinct part in this regulated process. However the exact role of the CSP protein in exocytosis is not yet known. Studies of Drosophila in null mutants for the Csp gene revealed a temperature sensitive paralytic phenotype, severely shortened lifespan and fertility. Exposure of larval nerve-muscle preparations to elevated temperatures (>29°C) lead to a reversible block of neurotransmitter release in electrophysiological measurements. The primary structure of the cysteine string protein is characterized by distinct conserved domains: a N-terminal protein kinase A (PKA) phosphorylation site, a region showing high homology to a domain found in DnaJ proteins (DnaJ-domain), a region called linker domain, a cysteine rich region, which in Drosophila comprises the characteristic string of 11 cysteines flanked by two additional pairs of cysteines, and a less conserved C-terminal region, which is absent in various splice variants. Experiments using vertebrates showed that CSP is part of a trimeric complex of Hsc70/CSP/SGT and may possibly act as co-chaperone during exocytotic processes. The cysteine string is found to be modified with multiple palmitoyl residues and appears to be essential for targeting of the protein to the vesicle membrane. In earlier studies mutagenesis and germ-line transformation were used to initiate an analysis on the role of the cysteine string, the linker domain and C-terminal region for CSP function. The present thesis extends this work by characterizing in transgenic flies four different mutated cysteine string isoforms (CSLP, SCSP, CLP, SSP) and deletions affecting the linker domain (LΔ8) and C-terminal region (CΔ27) using transgenic flies. The subcellular distribution and altered membrane binding properties of the mutated isoforms were analyzed using glycerol gradients and membrane fractionation. Due to the lack of palmitoylation CLP and SSP are exclusively found as soluble proteins in the cytosol whereas CSLP can also be found attached to vesicle membranes in membrane fractions. The flanking and remaining cysteines in the isoforms CSLP and SCSP apparently are able to partially direct the proteins to the membrane. The shortened cysteine string in SCSP is sufficient to induce membrane binding and is as resistant to depalmitoylation with hydroxylamine as wildtype CSP. The biochemical results correspond to the immunohistochemical findings, which show an almost homogenous distribution of the proteins CSLP, CLP and SSP, unlike the wildtype staining which is confined to neuropil regions in the adult brain. The mutant isoforms with deleted or substituted cysteine string do neither rescue the temperature sensitive phenotype nor the short life span observed in CSP-null mutants. In contrast the proteins LΔ8 and CΔ27 exhibit wildtype properties in the biochemical assays and the staining pattern of the adult brain. The deletion LΔ8 seems to interfere with regular CSP function in some way, as these transgenic flies paralyze at 38°C whereas wildtype flies paralyze at 40°C. The previously described interaction of CSP and syntaxin in Drosophila could be confirmed by precipitating syntaxin together with the largest CSP isoform CSP1 from Drosophila head homogenates using an antibody against CSP. A possible disruption of this interaction in the mutant transgenic flies could not be shown and remains to be investigated. The second part of this work describes the attempt to temporally and spatially regulate CSP expression by employing the UAS/Gal4- and flippase/FRT-system. Using database information a minimal FRT-sequence with apprropriate linkers was generated from oligonucleotides. The entire Csp gene or Csp cDNA1 with necessary regulatory sequences was ligated between two FRT sites and inserted into the transformation vector pW8. After extensive crossing of transgenic flies carrying the FRT-construct with Gal4-,UAS-flippase-, and Csp-null-lines flies were obtained which expressed the flippase in defined areas of Gal4 expression and contained the FRT construct, all in Csp-null background. Areas positiv for flippase expression should loose transgenic CSP expression. Behavioural analyis of these flies at normal and elevated temperatures should provide functional information on the cells lacking CSP. Unfortunately no differences in behaviour or staining pattern of adult brain could be detected, although all constructs were proven to be functional. The lack of recombination events might be due to the reduced length of the flippase target sequence used. The third project presents the Csp-locus and its neighbouring genes in Drosophila. The possible influence of deletions in the CSP null mutants CspU1, CspU1w and CspK16 on the expression of neighbouring genes are discussed. Based on sequence data offered by the Drosophila genome project it was speculated that these genes might influence the mutant phenotype. Northern blotting of adult head polyA+-RNA, simple tests of behaviour of already known and newly generated Csp null mutants could not confirm this speculation. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Genexpression KW - Cysteine String Protein KW - Drosophila melanogaster KW - Cysteine String Protein KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6291 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Niederführ, Alexandra T1 - Expressionskartierung des menschlichen Chromosoms 11p13 T1 - Expression mapping of human chromosome 11p13 N2 - In die Region p13 des menschlichen Chromosoms 11 kartieren mehrere krankheitsrelevante Gene wie das Wilms' Tumor Gen WT1 oder das für die Aniridie verantwortliche Gen PAX6. Beide Gene können bei Patienten mit dem WAGR-Syndrom deletiert sein, was das Auftreten von Wilms' Tumoren oder Aniridie bei diesen Patienten erklärt. Die genetische Ursache für weitere Symptome des WAGR-Syndroms, wie beispielsweise die geistige Retardierung, ist bisher nicht geklärt. Des weiteren wurden Allelverluste auf 11p13 in Verbindung mit verschiedenen Tumoren (Lunge, Blase, Brust, Ovar) beobachtet, ohne daß die ursächlichen Gene hierfür beschrieben werden konnten. Eine Kartierung und anschließende Sequenzierung dieser Region dient als Grundlage für die Identifizierung neuer Gene, die möglicherweise im Zusammenhang mit diesen Krankheiten stehen. Mit dem Ziel der Sequenzierung dieser Region wurde ausgehend von einem YAC-Contig, das 8 Mb des Chromosoms 11p13-14.1 abdeckt, eine Feinkartierung der Region 11p13 durchgeführt. Über ein Screening einer humanen PAC-Bibliothek mit 11p13-spezifischen Proben, wurden PAC-Klone erhalten, die aus dieser Region stammen. Mit einem Teil dieser Klone konnte mittels "chromosome walking" ein 4,5 Mb großes PAC-Contig erstellt werden. Zur Sequenzierung des Chromosomenabschnitts 11p13 am Sanger Centre/UK wurden die PAC-Klone des "minimal tiling path" gewählt. Auf der Grundlage des PAC-Contigs wurden auf experimentellem Weg mit Hilfe des Exontrappings neue Transkripte isoliert. Hierfür wurden sechs PAC-Klone, die etwa 700 kb des Chromosoms 11p13 abdecken, herangezogen. Zusätzlich wurden erste Sequenzabschnitte (insgesamt ca. 640 kb) der PAC-Klone über eine computergestütze Auswertung mit dem Programmpaket NIX/HGMP analysiert. Insgesamt konnten mit Hilfe des Exontrappings und der in silico Analyse fünf neue potentielle Transkripte identifiziert werden. Eine erste Untersuchung dieser Transkripte wurde mit Hilfe von Datenbankvergleichen und Expressionsstudien auf Northern Blots und in situ Hybridisierungen durchgeführt. Aussagen über eine mögliche Funktion konnten bei zwei der identifizierten Transkripte anhand von Datenbankvergleichen getroffen werden. Es handelt sich zum einen um ein Transkript mit Homologien zum Gen cca3 aus der Ratte, für das aufgrund der enthaltenen BTB-Domäne eine regulatorische Funktion auf DNA-Ebene postuliert werden kann. Zum anderen wurde ein Gen mit Ähnlichkeiten zu einem Transkript aus Achlya ambisexualis isoliert. Letzteres besitzt möglicherweise die Funktion eines Steroidrezeptors. Zusätzlich zu den hier beschriebenen Transkripten, können aus dem erstellten PAC-Contig neue Gene auf der Basis von cDNA-Selektion, Exontrapping oder, nach Fertigstellung der gesamten Sequenz, über in silico Analysen identifiziert werden. N2 - The human chromosomal region 11p13 harbours several disease related genes among them the Wilms' tumour gene WT1 and PAX6 which is responsible for aniridia. Both genes can be deleted in patients with the WAGR syndrome explaining the Wilms' tumour or aniridia of the WAGR-syndrome. Additional symptoms of the WAGR syndrome like mental retardation are not yet understood genetically. Furthermore loss of heterozygosity of 11p13 has been observed in severel cancers (breast, bladder, ovary, lung). None of these regions of allele loss have been narrowed down to a single gene yet. In order to identify genes associated with these diseases mapping and subsequent sequencing of the 11p13 region are of great interest. With the aim of sequencing this region, fine mapping of 11p13 has been performed based on a YAC-contig spanning 8 Mb of chromosome 11p13-14.1. Screening of a human PAC-library with 11p13 derived probes resulted in a set of clones located in 11p13. Using the strategy of chromosome walking a PAC contig covering 4,5 Mb of 11p13 could be established with a subset of these clones. For sequencing 11p13 by the Sanger Centre/UK a minimal tiling path of PAC clones was chosen. The PAC contig has been used to isolate new transcripts located in this region. For this purpose exon trapping was performed with six of the PAC clones spanning 700 kb of 11p13. Additionally, genomic sequences of some of the PAC clones (ca. 640 kb) were analysed in silico by the NIX program package/HGMP. The exon trapping approach together with the in silico analyses resulted in the identification of five new transcripts which were investigated by database searches as well as expression studies via Northern blots and in situ hybridisations. For two of the identified transcripts a possible function could be suggested based on database searches. One shows similarities to a rat gene named cca3 which may be involved in transcriptional regulation due to its BTB domain. The other one is similar to a transcript of Achlya ambisexualis. For the latter a role as a steroid receptor has been postulated. In addition to the transcripts described here, new genes can be isolated by using the established PAC contig for either exon trapping, cDNA selection or in silico analysis of the sequence which will be finished in the near future. KW - Mensch KW - Chromosom 11 KW - Genexpression KW - Genkartierung KW - Chromosom 11p13 KW - PAC-Contig KW - genomische Sequenzierung KW - Expressionskartierung KW - Genidentifizierung KW - DNA-Sequenzanalyse KW - chromosome 11p13 KW - PAC contig KW - genomic sequencing KW - expression mapping KW - gene identification KW - DNA sequence analysis KW - exon trapping Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1803 ER - TY - THES A1 - Li, Naixin T1 - Dorso-ventral Differentiation and Specification of the Mesencephalon in Early Chick Embryos T1 - Die dorsoventrale Differenzierung und Spezifikation des frühen embryonalen Hühnermittelhirn N2 - The chick midbrain is subdivided into functionally distinct ventral and dorsal domains, tegmentum and optic tectum. In the mature tectum, neurons are organized in layers, while they form discrete nuclei in the tegmentum. An interesting characteristic of the embryonic brain is the development of a large optic tectum, of which the growth becomes obvious at embryonic day 3 (E3). Dorsoventral (DV) specification of the early midbrain should thus play a crucial role for the organization of the neuronal circuitry in optic tectum and tegmentum. In the first part of my thesis, I investigated regional commitment and establishment of cellular differences along the midbrain DV axis. I examined the commitment of gene expression patterns in isolated ventral and dorsal tissue in vivo and in vitro, and studied their cell mixing properties. Explant cultures, and grafting of dorsal midbrain into a ventral environment or vice versa, revealed a gradual increase in the autonomy of region-specific gene regulation between, which was accompanied by a gradual increase in differential adhesive properties from E2 to E3, once the DV axis polarity was fixed. These events happened at a time-point when the majority of midbrain cells are not yet differentiated. Long-term transplantation (6 - 9 days) using quail cells from ventral midbrain as grafts showed the same result. Hence, the results suggest that progressive specification of the midbrain DV axis is accompanied by progressively reduced cell mixing between dorsal and ventral precursors, leading to a partial regionalization of midbrain tissue into autonomous units of precursor cell populations. In the second part I investigated the genes that might be involved in regulating the growth of the tectum. In particular, I focused on the role of Pax7 transcription factor, a paired domain protein. The results suggested that Pax7 was involved in regulating the medial-lateral extension of the tectum. Over expression of Pax7 in dorsal midbrain led to an enlarged tectum accompanied by a raise in cell division, while Pax7 knockdown by shrank caused a reduction in tectum. The overall pattern of neuronal differentiation was not disturbed by an up or down regulation of Pax7. Pax7 also positively regulated Pax3, another pair-ruled gene expressed dorsally. These results suggest that Pax7 very likely together with Pax3 could facilitate or maintain neural cell proliferation in the midbrain at early stages and that a regulation of the size in that region does not influence the neuronal patterning of the developmental field. I further checked the expression and function of a GFPase Rab 23, that was suggested to be involved in the DV patterning in mouse neural tube as a negative regulator of Shh signaling. Overexpression of Rab23 indicated that it facilitated the expression of Pax7 and Pax3 in the neural tube and suppressed ventral genes like Nkx6.1 cell autonomously, however, it did not disturb neuronal patterning. Interestingly, a thorough expression study of Rab 23 during chick early development revealed that Rab23 is already expressed very early and asymmetrically during gastrulation, suggesting a possible role of Rab23 on the left-right determination of Hensen’s node. In combination with the result that Rab23 is expressed in the notochord early in development, I assume that both Rab23 and Shh exist in all neural progenitor cells initially, and when their expression patterns separate gradually the neural cells adopt a ventral or dorsal fate according to their location along the dorsoventral axis. The avian embryo is a classic system used widely to investigate questions of vertebrate development. The easy and cheap accessibility of the embryo for in ovo or ex ovo experiments all around the year make it an ideal animal model to work with. The only recently developed method of over expressing genes in specific cells or regions in the chick embryo by electroporation enabled me to study different ways of gene suppression using this way of gene transfection. Thus, I compared the effect of long-hairpin and short hairpin dsRNA in different vectors and antisense morpholino oligonucleotides. The results revealed that all hairpin dsRNA constructs did reduce gene and protein expression often accompanied by morphological changes. Most efficiently were shRNAi constructs cloned into a siRNA-specific vector – pSilencer 1.0-U6. Gene silencing was already well observed 36 hours after transfection. In comparison antisense morpholino oligonucleotides did not show such big gene reduction as the shRNA in pSilencer. Taken together, this methodical research proposes that the shRNA in the pSilencer vector was a good and effective tool to reduce gene and protein expression locally. N2 - Das Mittelhirn des Huhns wird in funktionel unterschiedliche, ventrale und dorsale Regionen eingeteilt, nämlich das Tegmentum ventral und das optisches Tectum dorsal. Im vollentwickelten Tectum bilden Nervenzellen Schichten, während das Tegmentum aus unterschiedlichen Nuclei besteht. Ein charakteristisches Merkmal des embryonalen Gehirns ist die Entwicklung eines großen optischen Techtums, die am dritten embryonalen Tag (E3) sehr deutlich zu beobachten ist. Diese unterschiedliche funktionelle und morphologische Entwicklung des Mittelhirns deutet daraufhin, das die dorsoventrale Spezifikation des frühen Mittelhirns für der Organisation neuronaler Netzwerke im optischen Tectum und Tegmentum eine kritische Rolle spielt. Im ersten Teil dieser Doktorarbeit wurde die regionale Bestimmung und Bildung zellulärer Unterschiede entlang der DV Achse des Mittelhirns untersucht. Dafür bestimmte ich den Zeitpunkt, an dem spezifische ventrale und dorsale Genexpressionsmuster festgelegt werden in isoliertem ventralen und dorsalen Gewebe in vivo and in vitro. Desweiteren untersuchte ich die Entwicklung unterschiedlicher adhäsiver Eigenschaften von ventralen und dorsalen Zellen in vitro. Explantatkulturen und Transplantationen von dorsalem Mittelhirn in eine ventrale Umgebung oder vice versa liessen eine schrittweise Zunahme der Autonomie der region-spezifischen Genregulation erkennen. Dies wurde von einer schrittweisen Zunahme des differentialen Adhäsionsverhaltens von ventralen und dorsalen Mittelhirnzellen von E2 zu E3 begleitet, der Zeitspanne, in der die Polarität der DV Achse festgelegt wurde. Diese Entwicklungsprozesse fanden u einem Zeitpunkt statt, an dem die meisten Zellen des Mittelhirns noch nicht differenziert hatten. Transplantationen,. von ventralen Mittelhirnzellen der Wachtel ins dorsale Hühnertecctum, die erst nach mehreren Tagen (6 - 9 Tage) untersucht wurden, zeigten das gleiche Ergebnis. Diese Ergebnisse lassen schliessen, dass eine partielle Regionalisierung des Mittelhirns in autonome Einheiten von Vorläuferzellen der dorsoventralen Achse stattfindet. Dies erlaubt den Zellen eine Positionsidentität zu bewahren – unhabhängig von der wachsenden Distanz zu Signalzentren. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich Gene, die das Wachstum und die spezifische Entwicklung des Tectums regulieren könnten. Die Arbeit konzentrierte sich speziell auf die Rolle von Pax7, ein Mitglied der sogenannten ‚pair-ruled’ Familie von Transkriptionsfaktoren, und auf die Rolle von Rab23, einer GTPase, die den Shh-Signalweg im dorsalen Neuralrohr inhibiert. Dieser Versuch zeigte, dass Pax7 an der Regulation der medio-lateral Ausdehnung des Tectums beteiligt ist. Überexpression von Pax7 im dorsalen Mittelhirn führte zu einer Vergrößerung des Tectums, die von einer Zunahme der Zellteilung begleitet wurde, während Knockdown von Pax7 eine Größereduktion des Tectums verursachte. Das neuronale Differenzierungsmuster im generellen wurde nicht von der Überexpression oder Repression von Pax7 gestört. Pax7 induzierte ausserdem Pax3, ein Mitglied derselben Familie, das ebenfalls dorsal exprimiert wird und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Pax7, sehr wahrscheinlich zusammen mit Pax3, die neural Zellproliferation im Mittelhirn in frühen Entwicklungsstadien fördert oder auf einem konstanten Level hält und dass die Muster der neuronalen Entwicklung nicht durch der Regulation der Größe dieser Region beeinflusst wird. Außerdem förderte Rab 23, das sehr wahrscheinlich ein negativer Regulator von Shh ist, die Expression von Pax7 und Pax3 im ventralen Mittelhirn und unterdrückte ventrale Gene wie Nkx6.1. Die Überexpression von Rab 23 beeinflusste auch nicht das neuronale Differenzierungsmusterung. Interessanterweise zeigte eine genaue Analyse der Expression von Rab 23 während der frühen Entwicklungsstadien des Huhns, dass Rab 23 bereits sehr früh und asymmetrisch während der Gastrulation exprimiert wurde. Dies deutet auf eine mögliche Rolle von Rab 23 für die links-rechts Determination des Hensen´s node an. Betrachtet man diese Ergebnisse zusammen, dann könnte man zu fogender Schlussfolgerung kommen, nämlich, dass sowohl Rab 23 als auch Shh früh in allen neural Progenitorzellen existieren, und dass die neuralen Zellen jeweils nach ihrer Lage entlang der dorsoventral Achse ein ventrales oder dorsales Schicksal annehmen, wenn das sich die Expressionsmuster von Rab 23 und Shh allmänlich trennen. Der Vogelembryo ist ein klassisches und häufig benutztes System, um die Entwicklung der Vertebraten zu untersuchen. Die einfache und preiswerte Zugänglichkeit des Embryos für in ovo oder ex ovo Experiment das ganze Jahr über machen ihn zu einem idealen Tiermodell. Die in den letzten Jahren entwickelte Methode der Elektroporation eines Embryos zum Gentransfer in die Zellen, ermöglichte es mir unterschiedliche Weisen der Genunterdrückung in embryonalem Gewebe zu testen und zu vergleichen.Ich verglich in dieser Untersuchung die Wirkung von langen und kurzen Haarnadel-RNAs (hairpin RNA) in verschieden Vektoren mit der Wirkung von Antisense-morpholino-Oligonucleotiden verglichen. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Haarnadel-dsRNA-Konstruktionen die Gen- und Proteinexpression reduzierten, wobei es häufig zu einer morphologischen Veränderung kam. Die kurze shRNAi-Konstruktionen, die in einen siRNA-spezifischen Vektor – pSilencer 1.0-U6 - geklont wurden war, zeigte sich dabei am effizientesten.. Die Herunterregulierung der Gene wurde bereits 36 Stunden nach der Transfektion beobachtet. Im Gegensatz dazu, zeigten die Antisense-Morpholino-Oligonucleotiden keine solche starke Reduktion wie das shRNA in pSilencer. Zusammenfassend zeigt diese methodische Untersuchung, dass die shRNA im pSilencer-Vektor ein gutes und effektives Werkzeug ist, um Gen- und Proteinexpression örtlich zu reduzieren. KW - Differenzierung KW - Embryo KW - Genexpression KW - Mittelhirn KW - Spezifikation KW - Dorso-ventral Patterning KW - Mesencephalon KW - Morpholino KW - Neuronal Proliferation KW - Pax3 KW - Pax7 KW - Rab23 KW - Shh KW - siRNA KW - Transplantation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32950 ER - TY - THES A1 - Lang, Carmen T1 - Molekulare Charakterisierung, Expressionsmuster und Interaktionen der Lamina-assoziierten Polypeptide 2 (LAP2) in Xenopus laevis T1 - Molecular characterization, expression pattern and interactions of lamina-associated polypeptides 2 (LAP2) in Xenopus laevis N2 - Lamina-assoziierte Polypeptide 2 (LAP2) in Vertebraten sind bis auf zwei Ausnahmen integrale Membranproteine der inneren Kernmembran, die durch unterschiedliches Spleißen eines einzigen Gens entstehen. Während die aminoterminale Domäne, die allen LAP2 Isoformen gemeinsam ist, in Interphasezellen mit Chromatin und dem DNA-Bindungsprotein BAF interagiert, beinhaltet der carboxyterminale Bereich die Lamin Bindungsdomäne und eine Transmembrandomäne. Diese beiden carboxyterminalen Domänen bewirken die Lokalisation der Proteine an die Kernhülle. In dieser Arbeit konnten drei LAP2 Isoformen von Xenopus laevis molekular charakterisiert werden, die alle integrale Membranproteine sind. In somatischen Zellen werden vorwiegend die beiden Isoformen LAP2γ und LAP2ß exprimiert, in frühen Entwicklungsstadien dagegen die größte Isoform, das LAP2ω. In allen bekannten funktionellen Domänen weisen die LAP2 Proteine von Xenopus eine hohe Sequenzübereinstimmung mit den LAP2 Proteinen in Säugern auf. Allerdings finden sich in Xenopus zusätzliche Isoform-spezifische Proteindomänen, die zwischen der amino-terminalen Domäne und der Lamin Bindungsdomäne eingeschoben sind. Eine dem Xenopus LAP2ω im Aufbau und in der Expression vergleichbare Isoform wurde bisher nur beim Zebrafisch nachgewiesen. Auch die somatisch exprimierten LAP2 Isoformen des Zebrafisch (ZLAP2b und ZLAP2g) entsprechen den beiden somatischen Xenopus Isoformen. Um Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den drei LAP2 Isoformen feststellen zu können, wurden die Proteine des Zebrafischs als GFP Fusionsproteine in Xenopus A6 Zellen exprimiert. ZLAP2ω und LAP2ß wurden vorwiegend an mitotische Chromosomen gebunden, dagegen war der größte Teil des ZLAP2g im Cytoplasma verteilt. Mutanten der drei Proteine, denen jeweils die Lamin Bindungsdomäne einschließlich der Transmembrandomäne fehlte, zeigten dasselbe Verhalten. Somit scheinen diese b- und w-spezifischen Domänen Chromatin-Bindungseigenschaften zu besitzen. In Amphibien liegt das XLAP2ß in der Interphase in einem Proteinkomplex mit A- und B-Typ Laminen vor. Diese Proteinkomplexe konnten durch Immunpräzipitationen von GFP-XLAP2ß Fusionsproteinen mit GFP Antikörpern nachgewiesen werden. Die Extrakte für die Immunpräzipitationen wurden aus stabil transfizierten Xenopus A6 Zelllinien gewonnen. Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit in vitro Bindungsstudien mit GST- XLAP2ß Fusionsproteinen. Für die Bildung des Lamin-LAP2ß Proteinkomplexes und auch für die korrekte Lokalisation des Proteins an die Kernhülle reicht ein in Vertebraten hochkonservierter Bereich von 36 Aminosäuren in Kombination mit der Transmembrandomäne aus. Zudem scheint diese kurze carboxyterminale LAP2ß Sequenz in Xenopus, Zebrafisch und Ratte mit dem endogenen LAP2ß um Bindungsstellen in der Kernlamina zu konkurrieren. Sowohl in Amphibien- wie auch in Säugerzellen konnte in transient transfizierten Zellen eine beträchtliche Verminderung des endogenen LAP2ß beobachtet werden, ohne dass dabei die Kernmorphologie und die Verteilung anderer Kernmembranproteine beeinträchtigt wurde. Somit scheint die Lamin-Bindungsdomäne des LAP2ß in Vertebraten stark konserviert zu sein. N2 - Lamina-associated polypeptides 2 (LAP2) in vertebrates are, except for two mammalian isoforms, integral membrane proteins of the inner nuclear membrane which are generated by alternative splicing from a single gene. Whereas the aminoterminal domain, which is common for all LAP2 isoforms, interacts with chromatin and the DNA-binding protein BAF in interphase cells, the carboxyterminal region contains the lamin binding domain and a transmembrane domain. Both carboxyterminal domains are responsible for the localisation of the proteins in the nuclear envelope. In this work three LAP2 isoforms of Xenopus laevis were molecularly characterised, all of them being integral membrane proteins. In somatic cells the two predominant isoforms are LAP2γ and LAP2ß, whereas in early developmental stages only the largest isoform LAP2ω can be found. In all known functional domains, the LAP2 proteins of Xenopus show a high sequence homology to the LAP2 proteins of mammals. But in Xenopus, additional isoform-specific domains can be found which are inserted between the aminoterminal domain and the lamin binding domain. Only in zebrafish, an isoform comparable in structure and expression pattern to the Xenopus LAP2ω can be found. Also the LAP2 isoforms characteristic for somatic cells of zebrafish (LAP2ß and LAP2γ) correspond to the two somatic Xenopus isoforms. To enable the investigation of differences and similarities between the three LAP2 isoforms, the zebrafish proteins were expressed as GFP fusion proteins in Xenopus A6 cells. ZLAP2ω and ZLAP2ß were mainly bound to mitotic chromosomes, whereas ZLAP2γ was mostly distributed in the cytoplasm. Mutants of the three proteins which were lacking the lamin binding region and the transmembrane domain, showed the same behaviour. It seems therefore that the ω- and ß-specific domains mediate chromatin binding. In interphase cells of amphibian XLAP2ß is part of a protein complex also containing A- and B-type lamins. The existence of these protein complexes could be demonstrated by immunoprecipitations of GFP-LAP2ß fusion proteins with GFP antibodies. The extracts used for these immunoprecipitations were prepared from stably transfected Xenopus A6 cell lines. These results correspond to the results obtained by in vitro binding studies with GST-XLAP2ß fusion proteins. In vertebrates a short, highly conserved region of 36 amino acids in combination with the transmembrane domain, is sufficient for the formation of the lamin-LAP2ß protein complex as well as for the correct localisation of the proteins to the nuclear envelope. Moreover, it seems that this short carboxyterminal sequence of LAP2ß in Xenopus, zebrafish and rat competes with endogenous LAP2ß for the same binding sites in the nuclear lamina. In amphibian as well as in mammalian cells a significant reduction of the endogenous LAP2ß can be seen in transiently transfected cells. The nuclear morphology and the distribution of other nuclear components seems to be unchanged. Therefore it can be concluded that the lamin binding domain of LAP2ß is highly conserved in vertebrates. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Kernhülle KW - Polypeptide KW - Genexpression KW - Lamina-assoziierte Polypeptide KW - Expressionsmuster KW - Interaktionen KW - molekulare Charakterisierung KW - Lamina-associated polypeptides KW - expression pattern KW - interactions KW - molecular characterization Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3844 ER - TY - THES A1 - Körner, Ulrich T1 - Funktionelle Rolle von HMGN-Proteinen während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis T1 - The functional role of the HMGN proteins during embryogenesis of Xenopus laevis N2 - HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären. N2 - HMGN proteins are architectural chromatin proteins that reduce the compaction of the chromatin fiber, facilitate access to nucleosomes and modulate DNA-dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. In this work the functional role of the HMGN proteins during embryogenesis was analyzed using the African clawed frog Xenopus laevis as a model system. The expression and cellular location of the HMGN proteins was found to be developmentally regulated. Experimental manipulations of the HMGN protein amounts led to gross developmental defects in postblastula embryos. HMGN transcripts and proteins were present throughout oogenesis. Interestingly, the HMGN proteins were stored in the cytoplasm of later oocyte stages and excluded from the oocytes nuclei and lampbrush chromosomes. Upon maturation of oocytes into eggs, HMGN proteins were no longer detectable. During embryogenesis, HMGN proteins were first detected in blastula stage embryos, coinciding with the transcriptional activation of the embryonic genome. At least at the mRNA level the expression pattern showed a tissue specific pattern, with relatively high levels of mRNAs in the mesodermal and neuroectodermal regions of early tailbud embryos as shown by whole mount in-situ hybridization and RT-PCR-analyses. After microinjection of recombinant HMGN proteins (overexpression) or morpholino-antisense oligonucleotides (knock-down) the embryos displayed typical phenotypes with imperfect closure of the blastopore, distorted body axis and abnormal head structures. Histological analyses and magnetic resonance imaging indicated that mesoderm differentiation was particularly affected by aberrant HMGN protein levels. The results demonstrate that proper embryonic development of Xenopus laevis requires precisely regulated levels of HMGN proteins. “Animal cap assays” and RT-PCR-analyses of the expression of mesodermal genes indicated that HMGN proteins are involved in the regulation of mesoderm specific genes. These experiments also indicated that the HMGN expression itself is regulated during mesoderm differentiation. Moreover, by studying the expression pattern of developmentally relevant genes during midblastula transition it became evident that altered HMGN protein levels influence the onset of the expression of specific genes such as Xbra and chordin. The results show, for the first time, that these ubiquitous chromatin proteins modulate the expression of specific genes. The HMGN-induced misexpression of Xbra and chordin as key regulatory genes during mesoderm differentiation may explain the observed malformations of mesodermal structures. KW - Glatter Krallenfrosch KW - HMG-Proteine KW - Genexpression KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN Proteine KW - Xenopus laevis KW - Genexpression KW - Chromatin KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN proteins KW - Xenopus laevis KW - chromatin KW - gene expression KW - early development Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9166 ER - TY - THES A1 - Kirchmaier, Bettina Carmen T1 - Characterization of the Popeye domain containing gene family in zebrafish T1 - Charakterisierung der Popeye domain containing Genfamilie im Zebrafisch N2 - The Popeye domain containing (Popdc) gene family of membrane proteins is predominantly expressed in striated and smooth muscle tissues and has been shown to act as novel cAMP-binding proteins. In mice, loss of Popdc1 and Popdc2, respectively, affects sinus node function in the postnatal heart in an age and stress-dependent manner. In this thesis, I examined gene expression pattern and function of the Popdc gene family during zebrafish development with an emphasis on popdc2. Expression of the zebrafish popdc2 was exclusively present in cardiac and skeletal muscle during cardiac development, whereas popdc3 was expressed in striated muscle tissue and in distinct regions of the brain. In order to study the function of these genes, an antisense morpholino-based knockdown approach was used. Knockdown of popdc2 resulted in aberrant development of facial and tail musculature. In the heart, popdc2 morphants displayed irregular ventricular contractions with 2:1 and 3:1 ventricular pauses. Recordings of calcium transients using a transgenic indicator line Tg(cmlc2:gCaMP)s878 and selective plane illumination microscopy (SPIM) revealed the presence of an atrioventricular (AV) block in popdc2 morphants as well as a complete heart block. Interestingly, preliminary data revealed that popdc3 morphants developed a similar phenotype. In order to find a morphological correlate for the observed AV conduction defect, I studied the structure of the AV canal in popdc2 morphants using confocal analysis of hearts of the transgenic line Tg(cmlc2:eGFP-ras)s883, which outlines individual cardiac myocytes with the help of membrane-localized GFP. However, no evidence for morphological alterations was obtained. To ensure that the observed arrhythmia phenotype in the popdc2 morphant was based on a myocardial defect and not caused by defective valve development, live imaging was performed revealing properly formed valves. Thus, in agreement with the data obtained in knockout mice, popdc2 and popdc3 genes in zebrafish are involved in the regulation of cardiac electrical activity. However, both genes are not required for cardiac pacemaking, but they play essential roles in AV conduction. In order to elucidate the biological importance of cAMP-binding, wild type Popdc1 as well as mutants with a significant reduction in binding affinity for cAMP in vitro were overexpressed in zebrafish embryos. Expression of wild type Popdc1 led to a cardiac insufficiency phenotype characterized by pericardial edema and venous blood retention. Strikingly, the ability of the Popdc1 mutants to induce a cardiac phenotype correlated with the binding affinity for cAMP. These data suggest that cAMP-binding represents an important biological property of the Popdc protein family. N2 - Die Popeye domain containing (Popdc) Gene kodieren für eine Familie von Membranproteinen, die vorwiegend in der gestreiften und glatten Muskulatur exprimiert werden und in der Lage sind cAMP zu binden. In Mäusen resultiert der Verlust von Popdc1 oder Popdc2 in einer stressinduzierten Sinusknotendysfunktion, die sich altersabhängig entwickelt. In meiner Dissertation habe ich das Expressionsmuster und die Funktion der Popdc Genfamilie mit Schwerpunkt auf dem popdc2-Gen im Zebrafisch untersucht. Das popdc2-Gen im Zebrafisch wurde ausschließlich in der Herz- und Skelettmuskulatur exprimiert, während popdc3 sowohl in der quergestreiften Muskulatur, als auch im Gehirn exprimiert wurde. Um die Funktion dieser Gene zu untersuchen, wurde die Prozessierung der prä-mRNA mit Hilfe von Morpholinos unterdrückt, die gegen die Spleißdonor bzw. -akzeptorsequenzen von popdc2 und popdc3 gerichtet waren. Das Fehlen von popdc2 im Zebrafisch resultierte in einer Fehlentwicklung der Gesichts- und Schwanzmuskulatur. Im Herzen der popdc2-Morphanten waren ventrikuläre Überleitungsstörungen mit einem 2:1 oder 3:1 Rhythmus zu beobachten. Analysen der Calciumfreisetzung mittels SPIM (selective plane illumination microscopy) in der transgenen Zebrafischlinie Tg(cmlc2:gCaMP)s878, die einen fluoreszierenden Calciumindikator exprimiert, zeigten in den popdc2-Morphanten einen AV-Block bis hin zum kompletten Herzblock. Interessanterweise ergaben vorläufige Analysen in popdc3-Morphanten einen ähnlichen Phänotyp. Um eine mögliche morphologische Ursache der beobachteten AV-Überleitungsstörung zu finden, habe ich die Struktur des AV-Kanals von popdc2-Morphanten mit Hilfe der transgenen Zebrafischlinie Tg(cmlc2:eGFP-rass883) und konfokaler Mikroskopie untersucht. Allerdings konnte ich kein Anzeichen für morphologische Veränderungen erkennen. Um sicherzugehen, dass der beobachtete Rhythmusphänotyp der popdc2-Morphanten nicht auf einer myokardialen Störung beruht oder auf einem Defekt bei der Klappenentwicklung, wurden zusätzlich Lebendaufnahmen angefertigt, die zeigten, dass die Klappen normal entwickelt waren. In Übereinstimmung mit den Daten aus den Knockout-Mäusen haben die popdc2- und popdc3-Gene auch im Zebrafisch eine wichtige Funktion bei der elektrischen Reizleitung im Herzen. Allerdings sind die beiden Gene für die Erregungsbildung im Sinusknoten nicht essentiell, sondern werden für die Signalübertragung im AV-Kanal benötigt. Um die biologische Signifikanz der cAMP-Bindung zu untersuchen, wurden Wildtyp-Popdc1 und Punktmutanten, die eine Reduktion in der cAMP-Bindung aufweisen, nach RNA-Injektion in Zebrafischembryonen überexprimiert. Die Injektion von Wildtyp-Popdc1 induzierte eine embryonale Herzinsuffizienz, die durch perikardiales Ödem und venösen Blutstau charakterisiert war. Die Fähigkeit der Popdc1-Punktmutanten, einen Herzphänotyp nach Überexpression zu induzieren, war direkt korreliert mit der Bindungsaffinität für cAMP. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass die Fähigkeit der cAMP-Bindung eine wichtige biologische Eigenschaft der Popdc-Proteinfamilie darstellt. KW - Zebrabärbling KW - Genexpression KW - Herzmuskel KW - Herz KW - Popdc Genfamilie KW - heart KW - popdc gene family Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49413 ER -