TY  - THES
A1  - Friedrich, Uwe
T1  - Elektroporation von Säugerzellen
T1  - Electroporation of mammalian cells
N2  - Ziel der Arbeit war es, die wissenschaftlichen und technischen Voraussetzungen zu schaffen, um eine effiziente Elektroporation von großen aber auch kleinen Zellzahlen zu erreichen. Ein großer Teil der Arbeit diente der Entwicklung eines neuen Elektroporationsgerätes, des Multiporators. Die synergetischen Effekte dieser Technik tragen dazu bei, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Elektrotransfektion von Zellen erzielt werden. Damit konnte zum ersten Mal der Gentransfer durch künstliche Säugerzell-Chromosomen (MACs) nachgewiesen werden. Eine weitere Anwendung der Elektroporation liegt in der Transfektion von primären Zellen. Dabei ist der entscheidende Punkt für eine hohe Transfektionseffizienz der Zellzyklus. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das als Basis für ein neues Elektroporationssystem benutzt werden kann.
N2  - The aim of this work was the establishment of the scientific and technical supposition for an efficient electroporation of a large and small number of cells. A part of this work was used for the development of a new electroporation instrument, the Multiporator. The synergy of the instrument and the components enable the electrotransfection of eukaryotic cells with high efficiency. With this technique the gene transfer by mammalian artificial chromosomes (MACs) was demonstrated for the first time. Another application is the transfection of primary cells. The main point for the high yields is the cell cycle. Further, a concept for a new electroporation system was evolved.
KW  - Säugetiere
KW  - Zelle
KW  - Elektroporation
KW  - Elektroporation
KW  - Säugerzellen
KW  - primäre Zellen
KW  - künstliche Chromosomen
KW  - Dielektrophorese
KW  - Electroporation
KW  - mammalian cells
KW  - primary cells
KW  - artificial chromosomes
KW  - dielectrophoresis
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1241
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fendert, Thomas
T1  - Charakterisierung der enzymatischen Abwehrreaktion in Schwämmen der Gattung Aplysina und Isolierung von Bromotyrosinalkaloiden aus Aplysina insularis
T1  - Characterization of the enzymatic defense mecahnism in sponges of the genus Aplysina and isolation of bromotyrosine alkaloids from Aplysina insularis
N2  - Marine Schwämme der Gattung Aplysina besitzen Bromotyrosinealkaloide als typische Sekundärmetabolite. Diese Alkaloide werden in einer enzymatischen Abwehrreaktion zu biologisch aktiven Produkten abgebaut. In der vorliegenden Arbeit ist die Isolierung von 14 Schwamminhaltstsoffen aus dem Schwamm Aplysina insularis beschrieben. 14-oxo-Aerophobin-2 konnte als neues Bromoisoxazolinalkaloid beschrieben werden. Anhand des Schwammes Aplysina cauliformis wurde die Charakterisierung der enzymatischen Abwehrreaktion in Schwämmen der Gattung Aplysina vorgenommnen, die von zwei aufeinanderfolgenden Enzymen durchgeführt wird. Hierbei konnte erstmals eine Nitrilhydratase aus dem marinen Habitat beschrieben werden, die in der beschriebenen Abwehrreaktion als zweites Enzym beteiligt ist.
N2  - Marine sponges of the genus Aplysina posses bromotyrosine alkaloids as characteristic secondary metabolites. These alkaloids serve as substrates of a chemical defense mechanism in Aplysina sponges. In this dissertation the isolation of 14 constituents of the sponge Aplysina insularis is described. The bromoisoxazoline alkaloid 14-oxo-aerophobin-2 could be described as a new compound. The sponge Aplysina cauliformis was choosen for the characterization of the enzymatic defense mechanism in sponges of the genus Aplysina. In this two step mechanism a nitrilhydratase could be described for the first time. It is also the first time a nitrilhydratase could be described from a marine organism.
KW  - Aplysina
KW  - Bromorganische Verbindungen
KW  - Sekundärmetabolit
KW  - Aplysina
KW  - Aplysina caulifromis
KW  - Aplysina insularis
KW  - Bromoisoxazolinalkaloide
KW  - Bromotyrosinalkaloide
KW  - enzymatische Abwehrreaktion
KW  - Aplysina
KW  - Aplysina caulifromis
KW  - Aplysina insularis
KW  - bromoisoxazoline alkaloids
KW  - bromotyrosine alkaloids
KW  - enzymatic defense mechanism
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1166
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ernst, Roman
T1  - Visuelle Mustererkennung und Parameterextraktion bei Drosophila melanogaster
T1  - Visual pattern recognition and parameter extraction in Drosophila melanogaster
N2  - In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht.
N2  - The results of operant conditioning experiments at the flight simulator suggest that Drosophila melanogaster can extract four parameters from visual patterns: pattern area, vertical position of the center of gravity, separatedness and horizontal/vertical pattern orientation. It can not be excluded that the fly can extract additional parameters. Spontaneous pattern preferences and conditioned preferences show different relationships with pattern parameters. The fly treats separated pattern elements as a compound figure. Retinal transfer is not observed even when patterns are presented at two different vertical training positions. Patterns are generalized if the positions of the centers of gravity of corresponding patterns are retained between training and test although training and test patterns do not overlap retinally. In this case there is no retinotopy of pattern memory on the pixel level but possibly on the level of the pattern parameter 'center of gravity'. Flies can not be trained to discriminate certain patterns that differ only by the vertical position of their centers of gravity. However, when tested with different patterns with corresponding centers of gravity they prefer the previously unpunished position of the center of gravity. The extraction of center of gravity and pattern area are modelled with a simple artificial neuronal filter. The architecture of this filter is based on an algorithm for the computation of the common center of gravity of multiple elements.
KW  - Taufliege
KW  - Mustererkennung
KW  - Visuelle Wahrnehmung
KW  - visuelle Mustererkennung
KW  - Musterlernen
KW  - Parameterextraktion
KW  - Generalisierung
KW  - neuronales Filter
KW  - Drosophila melanogaster
KW  - visiual pattern recognition
KW  - pattern conditioning
KW  - parameter extraction
KW  - generalization
KW  - neuronal filter
KW  - Drosophila melanogaster
Y1  - 1999
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1156
ER  - 
TY  - THES
A1  - Engelhardt, Stefan
T1  - Transgene Mausmodelle zur Charakterisierung der Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren
T1  - Characterization of cardiac beta-adrenergic receptors through the use of transgenic mouse models
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion kardialer beta-adrenerger Rezeptoren mit Hilfe einer Kombination aus transgenen Mausmodellen und physiologischen und molekularbiologischen Methoden untersucht. Durch gezielte Überexpression des humanen beta1-adrenergen Rezeptors im Herzen transgener Mäuse konnte gezeigt werden, daß die chronische Aktivierung dieses Rezeptors eine trophische Wirkung auf die Herzmuskelzellen hat. Über einen Zeitraum von mehreren Monaten führte dies zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz. In der menschlichen Herzinsuffizienz kommt es zu einem ähnlichen Phänomen: Durch deutlich erhöhte Freisetzung von endogenen Katecholaminen kommt es zu einer chronischen Dauerstimulation kardialer beta1-adrenerger Rezeptoren. Daß diese schädlich ist belegen das hier beschriebene Mausmodell und zudem einige neuere klinische Studien, die zeigen daß eine pharmakologische Blockade beta-adrenerger Rezeptoren zu einer Verminderung der Herzinsuffizienzmortalität führt. Dieses Mausmodell erlaubte es erstmals den beta1-adrenergen Rezeptor hinsichtlich seiner spontanen Rezeptoraktivität in einem physiologischen Modell zu untersuchen. Dabei zeigte sich, daß der humane beta1-adrenerge Rezeptor spontane Aktivität aufweist, jedoch in einem deutlich geringeren Ausmaß als der beta2-adrenerge Rezeptor. Dies könnte klinisch relevant sein, da klinisch verwendete beta-Rezeptor-Antagonisten die spontane Aktivität des beta1-adrenergen Rezeptors in unserem Modell unterschiedlich stark unterdrückten. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem untersucht, ob sich die beiden kardial exprimierten Beta-Rezeptor-Subtypen Beta1 und Beta2 hinsichtlich ihrer Signaltransduktion unterscheiden. Ausgehend von dem Befund, daß die chronische Aktivierung der beiden Subtypen in transgenen Mausmodellen zu deutlich unterschiedlichen Phänotypen führt, wurden verschiedene intrazelluläre Signalwege auf ihre Aktivierung hin überprüft. Abweichend von publizierten, in vitro nach kurzzeitiger Rezeptorstimulation erhobenen Daten zeigte sich, daß die chronische Aktivierung der Rezeptorsubtypen zu einer unterschiedlichen Aktivierung der kardialen MAP-kinasen (ERK) führt. Die beta1-spezifische Aktivierung dieser Kinasen könnte die beobachtete unterschiedliche Hypertrophieentwicklung in diesen beiden Mausmodellen erklären. Einen weiteren Schwerpunkt bei der Aufklärung des Mechanismus beta-adrenerg induzierter Hypertrophie bildete die Untersuchung der zellulären Calcium-homöostase. Als früheste funktionelle Veränderung in der Entwicklung einer beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie und -insuffizienz trat dabei eine Störung des intrazellulären Calciumtransienten auf. Als möglicher Mechanismus für die Störung des Calciumhaushalts konnte eine zeitgleich auftretende veränderte Expression des Calcium-regulierenden Proteins Junctin beschrieben werden. Einen neuen therapeutischen Ansatz für die Therapie der Herzinsuffizienz könnten schließlich vielleicht die Untersuchungen zum kardialen Na/H-austauscher ergeben: Es konnte erstmals gezeigt werden, daß der kardiale Na/H-Austauscher maßgeblich an der beta-adrenerg induzierten Herzhypertrophie- und Fibrose-entstehung beteiligt ist und daß die pharmakologische Inhibition dieses Proteins sowohl Hypertrophie als auch die Fibrose wirksam unterdrücken kann.
KW  - Beta-Rezeptor
KW  - Maus
KW  - Transgene Tiere
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Transgene Mäuse
KW  - beta-adrenerge Rezeptoren
KW  - Hypertrophie
KW  - Fibrose
KW  - Na/H-Austauscher
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - transgenic mice
KW  - cardiac hypertrophy
KW  - fibrosis
KW  - Na/H-exchanger
KW  - heart failure
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181950
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ebert-Dümig, Regina
T1  - Expression und Regulation 1,25(OH) 2 -Vitamin D 3-responsiver Gene in monozytären Zellen
T1  - Expression and regulation of 1,25 dihydroxyvitamin D3 responsive genes in monocytic cells
N2  - Das Secosterid Vitamin D3 wird durch die Nahrung aufgenommen oder im Organismus synthetisiert, wobei eine Reaktion in der Haut durch einen photochemischen Prozess katalysiert wird.Durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere wird Vitamin D3 über 25(OH) Vitamin D3 zum aktiven 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon. 1,25(OH)2 Vitamin D3 hat eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel, es reguliert die Ca2+-Resorption im Dünndarm. Die 1,25(OH)2 Vitamin D3-Synthese in der Niere wird durch Parathormon (PTH) kontrolliert. Ist die Serum Ca2+-Konzentration niedrig, wird PTH ausgeschüttet und die 1a-Hydroxylase, das 25(OH) Vitamin D3-aktivierende Enzym, stimuliert. Das Prinzip der (Seco)steroid-Aktivierung und -Inaktivierung in glandulären Organen, wie Leber und Niere mit anschließender Freisetzung der aktiven Hormone und Transport zu den jeweiligen Zielgeweben gilt heute nicht mehr uneingeschränkt. Auch Einzelzellen sind in der Lage Steroid-modifizierende Enzyme, die Hydroxylasen und Dehydrogenasen, zu exprimieren. Monozytäre Zellen exprimieren das 1,25(OH)2 Vitamin D3-aktivierende und das -inaktivierende Enzym, die 1a-Hydroxylase und die 24-Hydroxylase. Sie sind somit in der Lage, 1,25(OH)2 Vitamin D3 zu sezernieren, welches parakrin auf Nachbarzellen wirken kann. In diesem Zusammenhang wurde die Expression und Regulation der 1a-Hydroxylase in peripheren Blutmonozyten (PBM) und monozytären THP1-Zellen untersucht. Durch Supplementation der Zellen mit dem Substrat 25(OH) Vitamin D3 konnte die Produktion an aktivem 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon in PBM signifikant gesteigert werden. In PBM konnte im Gegensatz zum systemischen Ca2+-Stoffwechsel nur ein geringer Einfluss auf die 1a-Hydroxylase-Aktivität beobachtet werden. Durch RT-PCR-Amplifikation konnte eine Expression des PTH Rezeptors Typ 1 (PTHR1) in PBM und Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Ein weiterer Ligand des PTHR1 ist PTH related Protein (PTHrP), ein Faktor der die Tumorhyperkalzämie propagiert. Durch Markierungsexperimente mit fluoreszenz-markiertem PTHrP konnte gezeigt werden, dass PTHrP an die Zellmembran von PBM und Dendritischen Zellen bindet und in den Zellkern von Dendritischen Zellen transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsive Gene in Monozyten/Makrophagen untersucht. Die Expression der 24-Hydroxylase wird innerhalb der Differenzierung von myeloischen THP1-Zellen zu Makrophagen- bzw. Osteoklasten-ähnlichen Zellen transient induziert. Als weiteres 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsives Gen wurde die Expression von Osteopontin (OPN) untersucht. OPN ist ein vor allem in Knochen vorkommendes Matrixprotein, das wesentlich an der Zelladhäsion beteiligt ist. OPN wird in THP1-Zellen im Zuge der Differenzierung zunehmend exprimiert. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte OPN in Granulomen von Morbus Crohn- und Leberschnitten detektiert werden. Es spielt hier eine wesentliche Rolle bei der Granulomentstehung. Die Thioredoxin Reduktase 1 (TR1) ist ein Selenoenzym, welches maßgeblich an der Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen beteiligt ist. Es moduliert Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen wie die Bindung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB an DNA-responsive Elemente. Die Expression der TR1 wird in THP1-Zellen im Rahmen der Differenzierung induziert und ist in differenzierten Zellen maximal. Aktivitätsmessungen deckten sich mit dieser Beobachtung. In peripheren Blutmonozyten steigt die TR-Aktivität alleine durch Adhäsion der Zellen an das Kulturgefäß und nach Behandlung mit 1,25(OH)2 Vitamin D3. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine Abhängigkeit der TR-Aktivität vom Differenzierungsgrad der Zellen und der Supplementation des Mediums mit dem Spurenelement Selen. Die Expression weiterer Selenoproteine in monozytären Zellen wurde nachgewiesen. So konnten durch 75Selenit-Markierungsexperimente neun Selenoproteine in THP1-Zellen detektiert werden, von denen fünf sezerniert werden. Ein weiteres, in monozytären Zellen charakterisiertes Selenoprotein ist die zelluläre Glutathionperoxidase. Ihre Aktivität konnte in Selenit-supplementierten Zellen um das 70fache gesteigert werden. Die Kultivierung monozytärer Zellen unter Selenit-Supplementation beeinflusst die Funktion dieser Zellen wesentlich. So konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an phagozytierenden, zu Makrophagen differenzierten THP1-Zellen nach Selenit-Supplementation abnahm, während die Phagozytoserate der einzelnen Zellen anstieg. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass monozytäre Zellen mit Komponenten des 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon produzieren, sezernieren und inaktivieren können. Die lokale Kontrolle der 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsiver Gene, wie die Expression des Selenoproteins TR1, das einen direkten Einfluss auf den Redoxstatus und den Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen in diesen und Nachbarzellen ausübt.
N2  - The secosteroid 1,25(OH)2 vitamin D3 is either taken up by our daily diet or it is formed by a photochemical prosess in the skin. In liver and kidney vitamin D3 is hydroxylated in two steps to 25(OH) vitamin D3 and the active hormone 1,25(OH)2 vitamin D3. 1,25(OH)2 vitamin D3 plays an important role in bone metabolism. It is a key regulatorof the resorption of Ca2+ in the intestine. In the kidney 1,25(OH)2 vitamin D3 synthesis is controlled by parathyroid hormone (PTH). When the concentration of serum Ca2+ is low, PTH is secreted and 1a-hydroxylase, the 25(OH) vitamin D3 activating enzyme is induced in kidney. The picture of (seco)steroid activation and inactivation in glandular organs, like the liver and kidney, and the release and transport of the activated hormone to the target tissues has been modified recently. Single cells are also able to express steroid-modifying enzymes like hydroxylases and dehydrogenases. Monocytes express the 1,25(OH)2 vitamin D3-activating and the inactivating enzyme, i.e. the 1a-hydroxylase and the 24-hydroxylase. Thus they are able to build and secrete 1,25(OH)2 vitamin D3 which can act on neighbouring cells in a paracrine way. In this context the expression and regulation of the 1a-hydroxylase in peripheral blood monocytes (PBM) and THP1 cells was investigated. By supplementation of cells with the substrate 25(OH) vitamin D3 the production of active 1,25(OH)2 vitamin D3 hormone could be enhanced significantly in PBM. In PBM only a slight influence of PTH on 1a-hydroxylase activity could be observed, in contrast to the regulation in systemic Ca2+-metabolism. An expression of PTH receptor type 1 (PTHR1) could be verified by RT-PCR from whole RNA isolated from PBM and dendritic cells. A further ligand of PTHR1 is PTH related protein (PTHrP), a factor which propagates the humoral hypercalcemia of malignancy. Labeling experiments with a fluorescently marked PTHrP showed clustered membrane staining of PBM and dendritic cells and a transport to the nucleus of dendritic cells. The expression of 1,25(OH)2 vitamin D3-responsive genes in monocytes/macrophages was investigated. 24-hydroxylase is induced transiently during the differentiation of myeloid THP1 cells to macrophages and osteoclast-like cells, respectively. Next, the expression of osteopontin (OPN), a further 1,25(OH)2 vitamin D3 responsive gene was studied. OPN is a matrix protein that is mainly found in bone, it carries a RGD-motive in its aminoacid sequence which can bind to integrins and is involved in cell adhesion. The expression of OPN is increased during differentiation of THP1 cells. By immunohistochemistry OPN could be detected in Crohn's disease and liver granulomas where it also plays an important role in granuloma formation. The thioredoxin reductase 1 (TR1) is a selenoenzyme that is mainly involved in the reduction of disulfide bonds of proteins. It modulates protein/protein and protein/DNA interactions like the binding of the transkription factors AP1 and NFkB to DNA-responsive elements. The expression of TR1 mRNA is induced during differentiation and is maximal in differentiated cells. Activity measurments parallel these observations. In PBM TR-activity is increased by the event of adhesion of cells to the culture dish and after treatment with 1,25(OH)2 vitamin D3. A dependence of TR-activity on the degree of differentiation of cells and the supplementation of the medium with the trace element selenium was observed. The expression of further selenoproteins in monocytic cells was investigated. In THP1 cells nine selenoproteins could be detected By labeling experiments with 75selenite. Five were found as secreted proteins in the culture supernatant. In monocytes cellular glutathione peroxidase (cGPx) is a well characterized selenoprotein. Activity could be increased 70fold by selenit supplementation. Under selenite supplementation the number of differentiated THP1 cells capable of phagocytosis was diminished while the rate of phagocytosis of single cells was enhanced. Taken together, the experiments clearly indicate that monocytic cells are equipped with the components of 1,25(OH)2 vitamin D3 metabolism and thus are capable of 1,25(OH)2 vitamin D3 hormone synthesis, secretion and turnover. Moreover, local control of 1,25(OH)2 vitamin D3 synthesis and inactivation directly regulates the expression of 1,25(OH)2 vitamin D3-responsive genes like the selenoprotein TR and thus even impacts on the cellular redox-status and defense against reactive oxygen species in these and neighbouring cells.
KW  - Vitamin D3
KW  - Stoffwechsel
KW  - Zelldifferenzierung
KW  - Molekulargenetik
KW  - 1
KW  - 25 Dihydroxyvitamin D3
KW  - Monozyten
KW  - Selenit
KW  - Selenoprotein
KW  - 1
KW  - 25 dihydroxyvitamin D3
KW  - monocyte
KW  - selenite
KW  - selenoprotein
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1101
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bausenwein, Burkhard
T1  - Funktionelle Charakterisierung von Daughter of Sevenless
T1  - Functional characterisation of Daughter of Sevenless
N2  - Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse.
N2  - One mechanism used by receptor tyrosine kinases to relay a signal to different downstream effector molecules is to use adaptor proteins that provide docking sites for a variety of proteins. The daughter of sevenless (dos) gene was isolated in a genetic screen for components acting downstream of the Sevenless (Sev) receptor tyrosine kinase. Dos contains a N-terminally located PH domain and several tyrosine residues within consensus binding sites for a number of SH2 domain containing proteins. The structural features of Dos and experiments demonstrating tyrosine phosphorylation of Dos upon Sev activation suggested that Dos belongs to the family of multisite adaptor proteins that include the Insulin Receptor Substrate (IRS) proteins, Gab1, and Gab2. In this work, a monoclonal mouse anti-Dos antibody was generated. The epitope of this antibody lies within the C-terminal 416 amino acids of the Dos Protein. Western Blot analyses of the Dos protein revealed a molecular mass of 115 kD. The staining of eye imaginal discs from wildtype third instar larvae with the monoclonal antibody showed that the Dos protein is expressed in cells in and posterior to the morphogenetic furrow. In this cells Dos localizes to the apical region. For the molecular characterisation of the homozygous lethal dosR31 allele, genomic sequence analysis were performed and the sequences compared to the dos cDNA sequence. The established amino acid sequence of the DosR31 protein showed six amino acid substitutions that potentially influence the tertiary structure of the protein. In addition, a stop codon in position 463 of the amino acid sequence was found. These results confirm that dosR31 is a loss-of-function allele which does not provide normal Dos function. To study the functional requirements of the potential SH2 domain binding sites for the Dos function in receptor tyrosine kinase mediated signaling processes, mutated dos transgenes were expressed in flies. The putative binding sites for the SH2 domains of the SH2/SH3 adaptor protein Shc, PhospholipaseC-g (PLCg), the regulatory subunit of Phosphatidylinositol-3-kinase (PI3kinase) and the Corkscrew (Csw) tyrosine phosphatase were mutated by changing the invariant tyrosine within the consensus sites into phenylalanine. Ectopic expression of the mutated constructs lacking the binding sites for the Shc, PLCg, and PI3kinase SH2 domains can substitute the loss of endogenous Dos function during development. In contrast, tyrosine 801, corresponding to a Corkscrew (Csw) SH2 domain binding site, is essential for Dos function. Ectopic expression of transgenes upon heat shock induction may lead to phenotypic effects not caused by the transgene. To circumvent this problem, the endogenous dos enhancer/promotor element was cloned to study the function of the mutated transgenes expressed in a wildtype pattern. The cloned genE-dos minigene was able to fully substitute the loss of endogenous Dos function in dosR31 and dosP115 animals and shows wildtype like expression in eye imaginal discs. To study the role of the mutated SH2 domain binding sites for Dos function in eye development, a new in vivo test system based on the Flp/FRT flipase recombinase system was established. This clonal assay system allows the expression of the mutated transgenes under the control of the dos enhancer/promotor in clones of cells lacking endogenous Dos function. Expression of mutated transgenes in clones of cells lacking endogenous Dos function provided evidence that tyrosine residue Y801 that has been shown to bind a Csw SH2 domain is critical for Dos function. The tyrosine residues within the potential SH2 domain binding sites for Shc, PLCg and PI3kinase do not play an essential role for the Dos function during eye development. The established clonal test system is of general use for assaying the in vivo function of putative protein-protein interaction regions within the Dos protein for eye development irrespective of their requirement in other developmental processes.
KW  - Taufliege
KW  - Auge
KW  - Ontogenie
KW  - Signaltransduktion
KW  - Genregulation
KW  - Daughter of Sevenless
KW  - Multi-Adaptor-Protein
KW  - PH-Domäne
KW  - SH2-Domänen Bindungsstelle
KW  - Rezeptor-Tyrosin-Kinase
KW  - Signaltransduktion
KW  - Daughter of Sevenless
KW  - multi-adaptor-protein
KW  - PH-domain
KW  - SH2-domain binding site
KW  - receptor tyrosin kinase
KW  - signal transduction
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-814
ER  - 
TY  - THES
A1  - Albers, Christine
T1  - Reinigung und Charakterisierung der alpha-Methylacyl-CoA-Racemase aus menschlicher Leber
T1  - Purification and characterisation of alpha-Methylacyl-CoA-Racemase from human liver
N2  - Im Katabolismus methylverzweigter Fettsäuren spielt die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase eine wichtige Rolle, indem sie die (R)- und (S)-Isomere von alpha-methylverzweigten Fettsäuren als Coenzym A Thioester racemisiert. Methylverzweigte Fettsäuren entstehen beim Abbau von Isoprenoiden und werden darüber hinaus auch von vielen Organismen, wie z.B. Mycobakterien, synthetisiert. Die Hauptaufgabe der Racemase ist aber vermutlich in der Biosynthese von Gallensäuren zu sehen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase aus humanem Gewebe zu reinigen und zu charakterisieren sowie ihre physiologische Rolle im Katabolismus verzweigtkettiger Fettsäuren und der Gallensäurebiosynthese zu untersuchen. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase wurde aus humanem Gewebe zur Homogenität gereinigt, umfassend biochemisch charakterisiert und zur genauen molekularbiologischen Analyse in E.coli kloniert. Die Aktivität der Racemase wurde anhand der [³H]H2O-Freisetzung aus [alpha-³H]-a-Methylacyl-CoAs bestimmt. Die humane Racemase ist in der aktiven Form ein monomeres Protein und besteht aus 382 Aminosäuren. Als Substrate akzeptiert das Enzym ein breites Spektrum von alpha-Methylacyl-CoAs. Neben den Coenzym A-Thioestern alpha-methylverzweigter Fettsäuren, wie Pristansäure, werden auch CoA-Ester von Steroidderivaten, z.B. des Gallensäureintermediats Trihydroxycoprostansäure, und aromatischen Phenylpropionsäuren, wie dem Analgetikum Ibuprofen, umgesetzt. Freie Fettsäuren, geradkettige oder beta-methylverzweigte Acyl-CoAs werden nicht racemisiert. Die alpha-Methylacyl-CoA-Racemase ist im Menschen zu ca. 80 Prozent auf die Peroxisomen und ca. 20 Prozent auf die Mitochondrien verteilt, wobei entsprechende peroxisomale (PTS 1) und mitochondriale (MTS) Transportsignale die Lokalisation bestimmen. Die vollständige cDNA-Sequenz der humanen a-Methylacyl-CoA-Racemase hat eine Gesamtlänge von 2039 Basenpaaren mit einem offenen Leseraster von 89 - 1237 bp. Das Startcodon ATG ist in eine klassische Kozak-Sequenz zum Translationsstart eingebettet. Die Protein endet am C-Terminus mit dem Sequenzmotiv –KASL, das dem peroxisomalen Transportsignal (PTS I) einiger Säugetierkatalasen entspricht. Aufgrund alternativer Polyadenylierung sind in allen untersuchten menschlichen Geweben Transkripte von 1,6 kb bzw. 2,0 kb zu finden. Es liegt keine gewebsabhängige Polyadenylierung vor, die Racemase wird aber gewebsspezifisch exprimiert (besonders stark in Leber und Niere). Das humane Racemasegen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosoms 5 nahe am Centromer (5p1.3), im Intervall von D5S651 (46,6 cM) und D5S634 (59.9 cM).
N2  - Racemization is an essential step for bile acid synthesis and it is important for degradation of alpha-methyl branched-chain fatty acids. The (R)- and (S)-isomers of alpha-methyl-branched chain fatty acids were shown to be interconverted as coenzyme A thioesters by an alpha-methylacyl-CoA racemase. Various branched-chain fatty acids arise in the catabolism of isoprenoids and are also synthesized by a variety of organisms, particularly mycobacteria. The aim of this work was to purify and to characterize the racemase from human tissue and to analyse the physiological role in the degradation of branched-chain fatty acids and the bile acid synthesis. The alpha-methylacyl-CoA racemase was purified from human liver to apparent homogeneity. The enzyme was exhaustively characterized by methods of biochemistry and protein chemistry. The cDNA coding for human racemase was cloned in E. coli and sequenced. A radiometric assay with 2-methyl[2-³H]acyl-CoAs as substrates was used routinely for monitoring purification procedure. The active form of the enzyme is a monomeric protein comprising 382 amino acids. The enzyme accepts a wide range of alpha-methylacyl-CoAs, including pristanoyl-CoA, trihydroxycoprostanoyl-CoA (an intermediate in bile acid synthesis) as substrates. Also arylpropionyl-CoAs such as the anti-inflammatory drug ibuprofen are accepted, but neither free fatty acids, beta-methyl-branched nor linear-chain acyl-CoAs. In human tissues 80 - 90 Prozent of the racemase activity is found in peroxisomes and 10 - 20 Prozent in mitochondria. Degradation of branched chain fatty acids is located in both compartments, so the enzyme has to be distributed between peroxisomes and mitochondria. No evidence was found for the existence of isoenzymes or different transcription products. It appears that only one mRNA is transcribed from one gene and that also only one protein is synthesized. The different recognition of peroxisomal (PTS 1) and mitochondrial targeting signals (MTS) may determine the subcellular distribution. The complete cDNA sequence has an overall length of 2039 base pairs, with a open reading frame between 89 - 1237 bp. The ATG start codon is embedded in a classical Kozak sequence for translation start. The C-Terminus of the protein is –KASL, which is very similar to the peroxisomal targeting signals (PTS 1) of many mammalian catalases. In all human tissues analysed in this work two different transcripts of racemase with sizes of 1,6 kb and 2,0 kb have been found and show alternate polyadenylation. Polyadenylation of racemase is not tissue-dependent but its expression is tissue-specific (strong activity is found in liver and kidney). The human racemase gene is localized on the short arm of chromosome 5, near the centromer (region 5p1.3) and between the markers D5S651 (46,6 cM) and D5S634 (59.9 cM).
KW  - Alpha-Methylacyl-CoA racemase
KW  - Mensch
KW  - Leber
KW  - Molekularbiologie
KW  - Racemase
KW  - human
KW  - Enzym
KW  - Reinigung
KW  - Charakterisierung
KW  - Peroxisom
KW  - alpha-Methylacyl-CoA
KW  - Racemase
KW  - human
KW  - enzyme
KW  - purification
KW  - characterisation
KW  - peroxisome
KW  - alpha-Methylacyl-CoA
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-770
ER  - 
TY  - THES
A1  - Chaidir, 
T1  - Insektizide Rocaglamid-Derivate und Verwandte Verbindungen aus Aglaia-Arten (Meliaceae)
T1  - Insecticidal rocaglamide derivatives and related compounds from Aglaia species (Meliaceae)
N2  - Auf der Suche nach neuen biologisch aktiven Naturstoffe aus der Gattung Aglaia(Meliaceae) wurde die insektizide Wirkung von Methanol-Extrakten verschiedener Aglaia-Arten gegenüber frisch geschlüpften Raupen des Schadinsektes Spodoptera littoralis (Noctuidae) untersucht. Die getesteten Proben stammen aus Vietnam und Südchina. Aus den in diesem Bioscreening aufgefallenen Extrakten wurden mit Hilfe von durch Biotests begleiteter Fraktionierung sowie parallel durchgeführten chemisch-physikalischen Analysen insgesamt 29 Naturstoffe isoliert und charakterisiert. Darunter befinden sich sechs bisher nicht beschriebene Benzofurane (Rocaglamide), zwei Benzopyrane (je ein Aglain und ein Aglaforbesin), zwei Benzoxepine (Forbagline) sowie ein Zimtsäure-Putrescin-Bisamid. Die Strukturaufklärung erfolgte vor allem durch NMR-Spektroskopie (darunter 2D-Experimente wie H-H-COSY, HMQC, HMBC und ROESY) sowie durch Massenspektrometrie. Die Untersuchungen zur Struktur-Wirkungs-Beziehung ergaben für die Rocaglamide V, Z und AA eine starke insektizide Aktivität gegenüber Raupen von S. littoralis mit LC50- und EC50-Werten von 2.0 bis 6.6 ppm bzw. 0.1 bis 1.0 ppm, während die Rocaglamide X und Y überraschenderweise keine Aktivität zeigten. Letztere stellen bisher die ersten Beispiele für biologisch inaktive Rocaglamid-Derivate überhaupt dar. Dieser Befund weist darauf hin, daß für die insektizide Aktivität dieser Verbindungs-Klasse der Hydroxyl-Substituent am C-8b neben dem Benzofuran-Grundkörper eine entscheidende Rolle spielt, da eine Alkoxylierung an C-8b zum vollständigen Verlust der Aktivität führt. In einem Screening mit drei verschiedenen basalen Medien, die mit unterschiedlichen Phytohormonen und organischen Zusätzen versetzt worden waren, erwies sich das RW-(Risser und White) Medium mit 1 mg/l 2.4-D, 0.2 mg/l BAP, 0.1 g/l Ascorbinsäure und 0.5 g/l Caseinhydrolysat als geeignetstes Kulturmedium zur Kalusbildung bei Aglaia-Arten. Die Vorversuche zeigten darüber hinaus deutlich, daß Kalluskulturen von Aglaia elliptica in der Lage sind, relevante Inhaltsstoffe wie das Zimtsäure-Pyrrolidin-Bisamid- Derivat zu bilden.
N2  - In search for novel naturally bioactive compounds, a screening program was performed on ten methanol extracts from different organs of six Aglaia spp, namely, odorata, tsangii, polystachia, taiwanensis, duperreana and dasyclada, collected in Vietnam and China, using a well established insecticide-bioassay system with the polyphagous pest insect Spodoptera littoralis (Noctuidae). Bioassay-guided fractionation of those extracts using the same bioassay system, led to the isolation of twenty-nine natural compounds, eleven of which are new natural products. Six new rocaglamide derivatives along with another twelve congeners were isolated and identified. Three cinammoyl bisamide derivatives, possessing either a 2-aminopyrrolidine ring or a putrescine moeity, were obtained together with four rocaglamide-related compounds (aglain-, aglaforbesin- and forbaglin type compounds) which also possess putrescine. In addition, A. dasyclada also yielded two interesting flavonoid derivatives, flavanocoumarine and a phenylpropanoid derivative of catechin, together with catechin and scopoletine (coumarin). The structures were established on the basis of 1H, 13C and 2D (H-H-COSY, HMQC, HMBC, ROESY) NMR spectroscopic methods and mass spectrometry. The insecticidal activities of the new rocaglamide derivatives against the larvae of S. littoralis in a chronic feeding assay were calculated as LC50 and EC50-values and exhibited values ranging from 2.0 - 6.6 ppm and 0.1 - 1.0 ppm, respectively. An interesting finding however showed that two rocaglamide derivatives, both with ethyloxy-substituent at C-8b of the furan ring instead of the usual hydroxy group, were devoid of insecticidal activity. In the course of the preliminary study to establish a callus culture of Aglaia sp., Risser and White medium supplemented with 1.0 mg/l 2,4-D, 0.2 mg/l BAP, 0.5 g/l casein hydrolysate and 0.1 g/l ascorbic acid was found as the best medium for induction of callus. In this study through LC-MS experiment, the present of odorinol was also observed in the callus of A. elliptica.
KW  - Aglaia
KW  - Pflanzeninhaltsstoff
KW  - Pflanzliches Insektizid
KW  - Agalia duperreana
KW  - Aglaia dasyclada
KW  - Meliaceae
KW  - Rocaglamid
KW  - Isolierung
KW  - Strukturauklärung
KW  - NMR
KW  - spodoptera littoralis
KW  - Aglaia duperreana
KW  - Aglaia dasyclada
KW  - Meliaceae
KW  - rocaglamide
KW  - isolation
KW  - structure elucidation
KW  - NMR
KW  - spodoptera littoralis
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-647
ER  - 
TY  - THES
A1  - Große-Wilde, Anne
T1  - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R)
T1  - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R)
N2  - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden.
N2  - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy.
KW  - Maus
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor
KW  - Apoptosis
KW  - TRAIL
KW  - Rezeptor
KW  - Apoptose
KW  - Klonierung
KW  - 2D-Gel-Analyse
KW  - konditionale Knockout-Maus
KW  - TRAIL
KW  - receptor
KW  - apoptosis
KW  - cloning
KW  - 2D gel analysis
KW  - conditional knockout mouse
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559
ER  - 
TY  - THES
A1  - Marquardt, Andreas
T1  - Positionsklonierung des Morbus Best-Gens VMD2
T1  - Positional cloning of the Best's Disease gene VMD2
N2  - Die Dissertation beschreibt die Positionsklonierung von VMD2, einem Krankheitsgen des Menschen, dass der dominant vererbten vitelliformen Makuladystrophie Typ 2 (VMD2) zugrundeliegt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein etwa 1.4 Mbp großer Klon-'Contig' aus artifiziellen Phagenchromosomen ('phage artificial chromosomes', PAC) erstellt, der die VMD2-Kandidatengenregion auf Chromosom 11q12-q13.1 physikalisch repräsentiert. Durch die Identifizierung polymorpher (CA)n-Dinukleotidmarker aus dem kritschen Intervall und anschließender Kopplungsanalyse gelang es, die Kandidatengenregion auf ca. 500 kbp zu reduzieren. In der öffentlichen Datenbank (GenBank) bereitgestellte Nukleinsäuresequenzen zweier genomischer Klone aus dem Kern des relevanten chromosomalen Bereichs von zusammen etwa 290 kbp wurden dazu genutzt, über eine Kombination aus computergestützter Vorhersagen kodierender Sequenzen, Kartierung von EST-Klonen ('expressed sequence tags'), RT-PCR-Analysen und, wenn erforderlich, 5'-RACE-Experimenten, acht neue Gene des Menschen zu isolieren. Von den charakterisierten Genen erwiesen sich mehrere als potentielle Kandidaten für VMD2. Ein Gen, provisorisch als Transkriptionseinheit TU15B bezeichnet, konnte durch eine Mutationsanalyse schließlich eindeutig mit der Erkrankung assoziiert werden und wurde 1998 als VMD2 publiziert. Drei Gene aus der untersuchten Region kodieren Mitglieder einer Familie von Fettsäuredesaturasen (FADS1, FADS2 und FADS3), während ein anderes Gen ('Rabin3 interacting protein-like 1'; RAB3IL1) signifikante Sequenzidentität zu einem Transkript der Ratte besitzt, welches das GTPase-interagierende Protein Rabin3 kodiert. Den putativen Translationsprodukten drei weiterer Gene (C11orf9, C11orf10 und C11orf11) konnte bislang keine präzise Funktion zugeschrieben werden. Mit FTH1 ('ferritin heavy chain 1') und FEN1 ('flap endonuclease 1') liegen zudem zwei bekannte Gene im analysierten Intervall, deren cDNA-Sequenzen bereits 1984 bzw. 1995 von anderen Forschungsgruppen isoliert und publiziert wurden. Zweifellos kann die Region als sehr genreicher Abschnitt des menschlichen Genoms bezeichnet werden. Neben der Erstellung des PAC-'Contigs', der Einengung der VMD2-Kandidatenregion und der Klonierung von VMD2 war die vollständige genetische Charakterisierung der genannten Fettsäuredesaturase-Gene ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit. Unabhängig von der Klonierung und Charakterisierung des VMD2-Gens sowie der chromosomal eng benachbarten Gene, richtete sich mein Interesse schließlich noch auf drei Gene des Menschen, provisorisch als TU51, TU52 und TU53 bezeichnet, die gemeinsam mit VMD2 eine Genfamilie bilden und auf den Chromosomen 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) und 1p32.3-p33 (TU53) lokalisiert werden konnten. Durch die Aufklärung der kodierenden Nukleinsäuresequenzen der Gene wurden konservierte Sequenzabschnitte innerhalb der Genfamilie erkennbar, die auf wichtige funktionelle Abschnitte der Translationsprodukte schließen lassen.
N2  - This work describes the positional cloning of the VMD2 gene responsible for vitelliform macular dystrophy type 2 (VMD2), a dominantly inherited eye disorder in human. A physical contig of phage artificial chromosomes (PAC clones) covering 1.4 Mbp of genomic sequence was established, representing the entire VMD2 candidate region on chromosome 11q12-q13.1. Identification and subsequently linkage analysis of polymorphic (CA)n-dinucleotide repeats was performed to refine the critical interval to approximately 500 kbp. Genomic sequences of approximately 290 kbp from the central part of the VMD2 candidate region, available at the public database (GenBank), were helpful to reveal the structure of eight novel genes by using computational exon prediction, comprehensive mapping and assembling of expressed sequence tags (ESTs), RT-PCR and 5'-RACE analysis. Some of the identified genes were found to represent excellent candidates for VMD2. One gene, provisionally designated 'transcription unit 15B' (TU15B) has been shown to be associated with the disease and was published as VMD2 in 1998, according to the official gene nomenclature. Three genes encode family members of the human fatty acid desaturases (FADS1, FADS2 and FADS3), one gene (rab interacting protein like 1, RAB3IL1) shows high sequence identity to Rabin3, an GTPase-interacting protein first described in rat and another three genes encode proteins of unknown function (C11orf9, C11orf10, C11orf11). Additional two genes localized in the same region, FTH1 (ferritin heavy chain 1) and FEN1 (flap endonuclease 1), have been characterized previously by other research groups. The analyzed interval represents a gene-rich segment of the human genome. In addition to the assembly of PAC clones from the VMD2 candidate region, the refinement of the critical interval using polymorphic dinucleotide repeats and the cloning of VMD2, this work also includes the complete characterization of the three fatty acid desaturase genes. Finally, three genes, provisionally termed TU51, TU52 and TU53 showed high sequence identity to VMD2 and were characterized as paralogous members of the VMD2 gene family. The corresponding gene loci were assigned to chromosome 19p13.2-p13.12 (TU51), 12q14.2-q15 (TU52) and 1p32.3-p33 (TU53), respectively. By determining the coding nucleic acid sequences of the genes conserved sequence elements in the gene family were identified, possibly representing functional important protein domains.
KW  - Makuladystrophie
KW  - Genort
KW  - VMD2
KW  - Morbus Best
KW  - Makuladystrophie
KW  - Makuladegeneration
KW  - Positionsklonierung
KW  - Fettsäuredesaturasen
KW  - FADS1
KW  - FADS2
KW  - FADS3
KW  - VMD2
KW  - Best's Disease
KW  - macula dystrophy
KW  - macular degeneration
KW  - positional cloning
KW  - fatty acid desaturases
KW  - FADS1
KW  - FADS2
KW  - FADS3
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-414
ER  -