TY - THES A1 - Kober, Christina T1 - Characterization of Murine GL261 Glioma Models for Oncolytic Vaccinia Virus Therapy T1 - Charakterisierung onkolytischer Vaccinia Virus Therapie in murinen Gliommodellen N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) is one of the most frequent and malignant forms of brain cancer in adults. The prognosis is poor with a median survival time of 12-15 months. There is a broad range of alternative treatment options studied in preclinical and clinical trials for GBM. One alternative treatment option is oncolytic virotherapy, defined as the use of replication‐competent viruses that selectively infect and destroy cancer cells while leaving, non‐transformed cells unharmed. Vaccinia virus (VACV) is one favorable candidate. Although oncolytic viruses can kill tumor cells grown in vitro with high efficiency, they often exhibit reduced replication capacity in vivo suggesting that physiological aspects of the tumor microenvironment decrease the virus’ therapeutic potential. The percentage and composition of immune cells varies between cancer types and patients and is investigated as a biomarker in several studies. Making oncolytic virotherapy successful for GBM, it is necessary to understand the individual tumor biology, the interaction with the microenvironment and immune system. It was demonstrated that the attenuated VACV wild-type (wt) isolate LIVP 1.1.1 replicate and lyse the murine GL261 glioma cell line in vitro. In the following, the replication efficacy was characterized in a comparative approach in vivo. Immunocompetent C57BL/6 (wt) mice and immunodeficient mouse strains of different genetic background C57BL/6 athymic and Balb/c athymic mice were used. In addition, subcutaneous and intracranial locations were compared. The results revealed viral replication exclusively in Balb/c athymic mice with subcutaneous tumors but in none of the other models. In the following, the tumor microenvironment of the subcutaneous tumor models at the time of infection was performed. The study showed that implantation of the same tumor cells in different mouse strains resulted in a different tumor microenvironment with a distinct composition of immune cells. Highest differences were detected between immunodeficient and immunocompetent mice. The study showed major differences in the expression of MHCII with strongest expression in C57BL/6 wt and weakest in Balb/c athymic tumors. In the following, the influence of the phenotypic change associated with the upregulation of MHCII on GL261 tumor cells on viral replication was analyzed. Comparison of C57BL/6 wt and C57BL/6 IFN-γ knockout mice revealed endogenous IFN-γ levels to upregulate MHCII on GL261 tumor cells and to reduce viral replication in C57BL/6 wt mice. Analysis of single cell suspensions of tumor homogenates of C57BL/6 and Balb/c athymic mice showed that the IFN-γ-mediated anti-tumor effect was a reversible effect. Furthermore, reasons for inhibition of virus replication in orthotopic glioma models were elucidated. By immunohistochemical analysis it was shown that intratumoral amounts of Iba1+ microglia and GFAP+ astrocytes in Gl261 gliomas was independent from intratumoral VACV injection. Based on these findings virus infection in glioma, microglia and astrocytes was compared and analyzed in cell culture. In contrast to the GL261 glioma cells, replication was barely detectable in BV-2 microglia and IMA2.1 astrocytic cells. Co-culture experiments revealed that microglia compete for virus uptake in cell culture. It was further shown that BV-2 cells showed apoptotic characteristics after VACV infection while GL261 cells showed signs of necrotic cell death. Additionally, in BV-2 cells with M1-phenotype a further reduction of viral replication and inhibition of cell lysis was detected. Infection of IMA 2.1 cells was independent of the M1/M2-phenotype. Application of BV-2 microglia with M1-phenotype onto organotypic slice cultures with implanted GL261 tumors resulted in reduced infection of BV-2 cells with LIVP 1.1.1, whereas GL261 cells were significantly infected. Taken together, the analyzed GL261 tumors were imprinted by the immunologic and genetic background in which they grow. The experimental approach applied in this thesis can be used as suitable model which reflects the principles of personalized medicine In an additional project, based on gene expression data and bioinformatic analyses, the biological role and function of the anti-apoptotic factor AVEN was analyzed with regard to oncolytic VACV therapy. Besides a comparison of the replication efficacy of GLV-1h68 and VACV-mediated cell killing of four human tumor cell lines, it was shown that AVEN was expressed in all analyzed cells. Further, shown for HT-29 and 1936-MEL, the knockdown of AVEN by siRNA in cell culture resulted in an increase of apoptotic characteristics and a decrease of VACV infection. These findings provide essential insights for future virus development. N2 - Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der häufigsten und bösartigsten Hirntumoren im Erwachsenenalter. Die Prognose für GBM ist mit einer Überlebenszeit von 12-15 Monaten sehr schlecht. Eine alternative Behandlungsmöglichkeit stellt die onkolytische Virustherapie dar. Ein vielversprechender Kandidat ist das Vaccinia-Virus. Die große Diskrepanz zwischen der onkolytischen Effektivität in Zellkultur und den Ergebnissen im Mausmodell ist oftmals auf physiologische Komponenten im Tumor-Mikromilieu zurückzuführen. Die Zusammensetzung von Immunzellen im Mikromilieu variiert zwischen verschiedenen Krebsarten und Patienten und wird als Biomarker angewendet. Um eine erfolgreiche Virustherapie für GBM zu etablieren, wird ein umfangreiches Verständnis der Tumorbiologie, des Tumormikromilieus und des Immunsystems vorausgesetzt. Es wurde gezeigt, dass LIVP 1.1.1, ein attenuiertes wildtypisches VACV-Isolat, in der murinen GL261 Gliom-Zelllinie repliziert und zum Absterben der Zellen führt. Daraufhin wurde die Replikationseffizienz von LIVP 1.1.1 durch einen vergleichenden Ansatz in murinen GL261-Gliomen im Mausmodell untersucht. Es wurden immunkompetente C57BL/6-wildtypische (wt) Mäuse und immundefiziente Mausstämme mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund, C57BL/6 athymisch und Balb/c athymisch, verwendet. Zudem wurden unterschiedliche Tumor-Lokalisationen, subkutan und intrakranial analysiert. Ausschließlich im subkutanen Tumormodell der Balb/c athymischen Mäuse fand eine effektive Replikation der Viren statt. Eine detaillierte Charakterisierung des Mikromilieus zum Zeitpunkt der Infektion zeigte, dass die Implantation derselben Tumorzellen in unterschiedliche Mausstämme zur Entwicklung eines unterschiedlichen Tumormikromilieus und einer variierenden Zusammensetzung von Immunzellen führt. Die C57BL/6-wt-Mäuse wiesen eine starke proinflammatorische Signatur auf. Des Weiteren zeigte die Studie signifikante Unterschiede in der MHCII-Expression: Die prominenteste Expression wurde in C57BL/6-wt-Mäusen detektiert. Im weiteren Verlauf wurde analysiert, wodurch die phänotypischen Veränderungen in den GL261-Zellen, verbunden mit der Hochregulierung von MHCII ausgelöst wurden und welche Konsequenzen dies für die virale Infektion dieser Zellen hat. Durch einen direkten Vergleich von C57BL/6-wt-Mäusen und C57BL/6-IFN-γ-Knockout Mäusen konnte IFN-γ als verantwortlicher Faktor im Tumormikromilieu identifiziert werden, welcher für die Reduktion des Virustiters und für die Hochregulierung von MHCII in den C57BL/6-wt-Mäusen verantwortlich ist. Der durch endogenes IFN-γ ausgelöste anti-virale Effekt war reversibel. Des Weiteren wurden Gründe für die Hemmung der viralen Replikation in den orthotopen Gliom-Modellen aufgeklärt. Durch immunhistochemische Analysen von Mikroglia und Astrozyten konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Menge und Verteilung der Gliazellen in diesen Tumoren unabhängig von der Virus-Applikation war. Gliomzellen, Mikroglia und Astrozyten, wurden daraufhin untersucht. Im Vergleich zur starken Replikation in GL261-Zellen, ließen BV-2-Mikroglia und IMA 2.1-Astrozyten, nur eine sehr schwache Replikation von LIVP 1.1.1 zu. Ko-Kultivierungsversuche wiesen darauf hin, dass Mikroglia um die Aufnahme der Viruspartikel mit den Tumorzellen konkurrieren. Es wurde gezeigt, dass das LIVP 1.1.1 unterschiedliche Eigenschaften des Zelltods in den Zellen auslösen kann. BV-2 wiesen verstärkte Charakteristika der Apoptose auf während in GL261-Zellen nekrotische Eigenschaften überwogen. In BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp wurde eine weitere Reduktion der viralen Infektion festgestellt. Die Infektion von IMA-2.1-Zellen war unabhängig vom induzierten M1/M2 Phänotyp. Die Applikation von BV-2-Zellen mit M1-Phänotyp auf organotypische Schnittkulturen mit implantierten GL261-Tumoren resultierte in einer reduzierten Infektion der BV-2-Zellen und einer verstärkten Infektion der GL261-Zellen. Es wurde gezeigt, dass GL261-Tumore durch den immunologischen und genetischen Hintergrund der Umgebung geprägt wurden. Es wurde ein Modell entwickelt, welches das Prinzip der personalisierten Medizin widerspiegelt. In einem zusätzlichen Projekt wurde, basierend auf Genexpressionsdaten und bioinformatischer Auswertung, die biologische Funktion des anti-apoptotischen Faktors AVEN hinsichtlich der onkolytischen Virustherapie mit dem VACV GLV-1h68 analysiert. Für diese Studie wurden vier humane Zelllinien untersucht. Neben einem Vergleich der Replikationseffizienz des VACV GLV-1h68 und der VACV-vermittelten Zelllyse wurde gezeigt, dass AVEN, in allen untersuchten Zellen exprimiert wird. Am Beispiel von HT-29 und 1936-MEL wurde gezeigt, dass die Herunterregulierung von AVEN durch siRNA zu einer Erhöhung der apoptotischen Eigenschaften und Abnahme der VACV Infektion führt. Die Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung zukünftiger genetisch veränderter VACV. KW - Krebs KW - Vaccinia-Virus KW - Glioblastom KW - Onkolytische Vaccinia Virustherapie KW - Mikroglia KW - Astrozyten KW - Oncolytic Vaccinia Virus Therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118556 ER - TY - THES A1 - Meir [geb. Rother], Juliane T1 - Influence of oncolytic vaccinia viruses on metastases of human and murine tumors T1 - Einfluss von onkolytischen Vaccinia Viren auf Metastasen von humanen und murinen Tumoren N2 - Cancer is one of the leading causes of death. 90% of all deaths are caused by the effects of metastases. It is of major importance to successfully treat the primary tumor and metastases. Tumors and metastases often differ in their properties and therefore, treatment is not always successful. In contrast, those therapeutic agents can even promote formation and growth of metastases. Hence, it is indispensable to find treatment options for metastatic disease. One promising candidate represents the oncolytic virus therapy with vaccinia viruses. The aim of this work was to analyze two cell lines regarding their metastatic abilities and to investigate whether oncolytic vaccinia viruses are useful therapy options. The cell lines used were the human cervical cancer cell line C33A implanted into immune-compromised mice and the murine melanoma cell line B16F10, implanted into immune-competent mice. The initial point of the investigations was the observation of enlarged lumbar und renal lymph nodes in C33A tumor-bearing mice 35 days post implantation of C33A cells subcutaneously into immune-compromised nude mice. Subsequently, the presence of human cells in enlarged lymph nodes was demonstrated by RT-PCR. To facilitate the monitoring of cancer cell spreading, the gene encoding for RFP was inserted into the genome of C33A cells. In cell culture experiments, it was possible to demonstrate that this insertion did not negatively affect the susceptibility of the cells to virus infection, replication and virus-mediated cell lysis. The analysis of the metastatic process in a xenografted mouse model revealed the continuous progression of lumbar (LN) and renal (RN) lymph node metastasis after C33A-RFP tumor cell implantation. The lymph node volume and the amount of RFP-positive LNs and RNs was increasing from week to week in accordance with the gain of the primary tumor volume. Moreover, the metastatic spread of cancer cells in lymph vessels between lumbar and renal lymph nodes was visualized. Additionally, the haematogenous way of cancer cell migration was demonstrated by RFP positive cancer cells in blood vessels. The haematogenous route of spreading was confirmed by detecting micrometastases in lungs of tumor bearing mice. The next step was to investigate whether the recombinant oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 is a suitable candidate to cure the primary tumor and metastases. Therefore, GLV-1h68 was systemically injected into C33A-RFP tumor bearing mice 21 days after tumor cell implantation. It was demonstrated that the volume of the primary tumor was drastically reduced, and the volume and the amount of RFP positive lumbar and renal lymph nodes were significantly decreasing compared to the untreated control group. Subsequently, this process was analyzed further by investigating the colonization pattern in the C33A-RFP model. It was shown that first the primary tumor was colonized with highest detectable virus levels, followed by LN and RN lymph nodes. Histological analyses revealed the proliferative status of tumor cells in the tumor and lymph nodes, the amount of different immune cell populations and the vascular permeability in primary tumors and lymph nodes having an influence on the colonization pattern of the virus. Whereby, the vascular permeability seems to have a crucial impact on the preferential colonization of tumors compared to lymph node metastases in this tumor model. C33A turned out to be a useful model to study the formation and therapy of metastases. However, a metastatic model in which the influence of the immune system on tumors and especially on tumor therapy can be analyzed would be preferable. Therefore, the aim of the second part was to establish a syngeneic metastatic mouse model. Accordingly, the murine melanoma cell line B16F10 was analyzed in immunocompetent mice. First, the highly attenuated GLV 1h68 virus was compared to its parental strain LIVP 1.1.1 concerning infection, replication and cell lysis efficacy in cell culture. LIVP 1.1.1 was more efficient than GLV-1h68 and was subsequently used for following mouse studies. Comparative studies were performed, comparing two different implantation sites of the tumor cells, subcutaneously and footpad, and two different mouse strains, FoxN1 nude and C57BL/6 mice. Implantation into the footpad led to a higher metastatic burden in lymph nodes compared to the subcutaneous implantation site. Finally, the model of choice was the implantation of B16F10 into the footpad of immune-competent C57BL/6 mice. Furthermore, it was inevitable to deliver the virus as efficient as possible to the tumor and metastases. Comparison of two different injection routes, intravenously and intratumorally, revealed, that the optimal injection route was intratumorally. In summary, the murine B16F10 model is a promising model to study the effects of the immune system on vaccinia virus mediated therapy of primary tumors and metastases. N2 - Weltweit ist Krebs eine der häufigsten Todesursachen des Menschen. Allerdings wird angenommen, dass ca. 90 % dieser Todesfälle nicht auf den Primärtumor zurückzuführen sind, sondern durch den direkten und indirekten Einfluss von Metastasen verursacht werden. Deshalb ist es wichtig, eine Therapieform zu wählen, die sowohl den Primärtumor als auch Metastasen bekämpft. Bei den derzeit eingesetzten Behandlungsmethoden für Metastasen handelt es sich weitestgehend um die gleichen Therapieformen die auch zur Bekämpfung des Primärtumors eingesetzt werden. Allerdings unterscheiden sich Primärtumor und Metastasen häufig in ihren Eigenschaften, weshalb die Therapie oft keinen Erfolg bei Metastasen zeigt und im schlimmsten Fall sogar deren Neubildung und Wachstum fördern kann. Deswegen ist es von immenser Bedeutung, neue Therapieformen zu entwickeln, die speziell auch auf die Wirksamkeit gegen Metastasen zugeschnitten sind. Eine vielversprechende Möglichkeit hierfür stellt die onkolytische Virustherapie dar. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, zwei verschiedene Tumorzelllinien hinsichtlich ihrer metastatischen Fähigkeiten zu untersuchen und anschließend zu überprüfen, ob onkolytische Vaccinia Viren zur Therapie dieser Metastasen beitragen können. Bei den hierfür untersuchten Zelllinien handelte es sich um die menschliche Zervixkarzinomzelllinie C33A, implantiert in immunsupprimierte Mäuse und um die murine Melanomzelllinie B16F10, implantiert in immunkompetente Mäuse. Ausgangspunkt der Untersuchungen im ersten Teil der Arbeit, bildete die Beobachtung, dass nach der subkutanen Implantation von C33A-Zellen in die abdominale Flanke von immunsupprimierten Nacktmäusen die lumbalen und renalen Lymphknoten der tumortragenden Mäuse vergrößert waren. Die Untersuchung dieser vergrößerten Lymphknoten mittels RT-PCR, unter zu Hilfenahme von spezifischen Primern für humanes β-Aktin, wies tatsächlich humane Zellen in allen lumbalen und der Hälfte der renalen Lymphknoten nach. Darum sollte im nächsten Schritt das metastatische Verhalten dieser Zellen genauer untersucht werden. Hierfür wurde mittels lentiviraler Transduktion, das für das rotfluoreszierende Protein kodierende Gen in C33A-Zellen integriert. In Zellkulturexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass die Insertion sich nicht negativ auf die Infektion, Replikation und Zelllyse der Viren auswirkte. Anschließende Mausexperimente zeigten den Verlauf der Metastasierung der lumbalen und renalen Lymphknoten. Sowohl das Volumen als auch die Anzahl an RFP positiven Lymphknoten nahm nach Implantation von Woche zu Woche zu und korrelierte mit der Zunahme des Primärtumorvolumens. Darüber hinaus konnte die Migration der Tumorzellen in Lymphgefäßen zwischen dem lumbalen und renalem Lymphknotenpaar mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht werden. Zusätzlich konnte die Metastasierung über die Blutbahn nachgewiesen werden, da sich RFP positive Zellen in dem Blutgefäß neben dem Lymphgefäß, das die lumbalen und renalen Lymphknoten miteinander verbindet, befanden. Die hämatogene Verbreitung wurde auch dadurch bestätigt, dass in den Lungen der tumortragenden Mäuse Mikrometastasen detektiert werden konnten. Im nächsten Schritt wurde untersucht, ob das rekombinante Vaccinia Virus GLV-1h68 in der Lage ist, nicht nur den primären Tumor zu bekämpfen, sondern auch Metastasen. Dafür wurde tumortragenden Mäusen systemisch eine einzelne Dosis GLV-1h68 21 Tage nach Tumorzellimplantation injiziert. Daraufhin reduzierte sich nicht nur das Volumen des Primärtumors innerhalb von weiteren 21 Tagen auf die Ausgangsgröße, sondern auch das Volumen und die Anzahl der RFP positiven lumbalen und renalen Lymphknoten nahm ab, im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Analyse der Kolonisierungsdynamik von Primärtumor und Metastasen durch GLV 1h68 zeigte, dass zuerst der Primärtumor kolonisiert wurde, gefolgt von LN und RN. Des Weiteren war der virale Titer in Tumoren zu jedem Zeitpunkt höher als in den metastasierten Lymphknoten. Histologische Untersuchungen des tumorösen Gewebes zeigten, dass der proliferative Status der Tumorzellen, die Menge verschiedener Immunzellpopulationen und die vaskuläre Permeabilität einen Einfluss auf die Kolonisierung durch GLV-1h68 haben. Dabei wird angenommen, dass vor allem die vaskuläre Permeabilität den größten Einfluss auf die Kolonisierungsreihenfolge hat. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass C33A ein hilfreiches Model ist, um die Bildung von Metastasen sowie die onkolytische Virustherapie dieser in einem immunsupprimierten Model zu untersuchen. Aus klinischer Sicht allerdings wäre es wünschenswert, ein Model zu haben, in dem auch der Einfluss des Immunsystems auf die Tumortherapie untersucht werden kann. Deswegen war das Ziel im zweiten Teil der Arbeit die murine Melanomazelllinie B16F10 im immunkompetenten Mausmodell als metastatisches System zu etablieren. Als erstes wurde in Zellkulturexperimenten überprüft, wie geeignet GLV-1h68 ist, um die murinen Zellen zu infizieren, in ihnen zu replizieren und sie anschließend zu lysieren und mit dem parentalen Virus LIVP 1.1.1 verglichen. Dabei stellte sich heraus, dass LIVP 1.1.1 effizienter und geeigneter ist als GLV-1h68. Deswegen wurde in weiteren Versuchen das parentale Virus LIVP 1.1.1 verwendet. Bevor diese Experimente durchgeführt wurden, wurden Studien durchgeführt, bei denen 2 verschiedene Implantationsstellen, subkutan und in die Fußsohle, und 2 verschiedene Mausstämme, FoxN1 nude und C57BL/6, verglichen wurden. Dabei stellte sich heraus, dass nach Implantation in die Fußsohle mehr Lymphknotenmetastasen entstanden als nach subkutaner Implantation. Im weiteren Verlauf wurde die Implantation von B16F10 Zellen in die Fußsohle von C57BL/6 Mäusen bevorzugt, um eine verlässliches Metastasenmodel zu generieren. Im Folgenden wurden zwei verschiedene Injektionswege untersucht, intravenös und intratumoral, wobei sich die intratumoral Injektion als geeigneter erwies, um effizient so viel Virus wie möglich in Tumore und Metastasen zu bringen. Generell handelt es sich hierbei um ein geeignetes Model, um die Wirkungen des Immunsystems auf Vaccinia Virus vermittelte Therapie von Primärtumor und Lymphknotenmetastasen zu untersuchen. KW - Krebs KW - Metastase KW - Vaccinia-Virus KW - onkolytische Virustherapie KW - oncolytic virus therapy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118530 ER - TY - THES A1 - Simann, Meike T1 - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen T1 - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells N2 - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach. This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect. The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature. Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis. N2 - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden. Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte. Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung. Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst. Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind. KW - Mesenchymzelle KW - Genexpression KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Osteoporose KW - Fettzelle KW - Bone marrow stromal cell (BMSC) KW - Osteogenesis KW - Adipogenesis KW - Differentiation KW - adipocytes KW - Mesenchymale Stammzelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322 ER - TY - JOUR A1 - Stejskal, Kerstin A1 - Streinzer, Martin A1 - Dyer, Adrian A1 - Paulus, Hannes F. A1 - Spaethe, Johannes T1 - Functional Significance of Labellum Pattern Variation in a Sexually Deceptive Orchid (Ophrys heldreichii): Evidence of Individual Signature Learning Effects JF - PLoS One N2 - Mimicking female insects to attract male pollinators is an important strategy in sexually deceptive orchids of the genus Ophrys, and some species possess flowers with conspicuous labellum patterns. The function of the variation of the patterns remains unresolved, with suggestions that these enhance pollinator communication. We investigated the possible function of the labellum pattern in Ophrys heldreichii, an orchid species in which the conspicuous and complex labellum pattern contrasts with a dark background. The orchid is pollinated exclusively by males of the solitary bee, Eucera berlandi. Comparisons of labellum patterns revealed that patterns within inflorescences are more similar than those of other conspecific plants. Field observations showed that the males approach at a great speed and directly land on flowers, but after an unsuccessful copulation attempt, bees hover close and visually scan the labellum pattern for up to a minute. Learning experiments conducted with honeybees as an accessible model of bee vision demonstrated that labellum patterns of different plants can be reliably learnt; in contrast, patterns of flowers from the same inflorescence could not be discriminated. These results support the hypothesis that variable labellum patterns in O. heldreichii are involved in flower-pollinator communication which would likely help these plants to avoid geitonogamy. KW - nectar KW - color discrimination KW - bees KW - vision KW - evolution KW - pollination KW - guides KW - honeybee KW - apis mellifera KW - insects KW - signals KW - recognize images Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137582 VL - 10 IS - 11 ER - TY - JOUR A1 - Basset, Yves A1 - Cizek, Lukas A1 - Cuénoud, Philippe A1 - Didham, Raphael K. A1 - Novotny, Vojtech A1 - Ødegaard, Frode A1 - Roslin, Tomas A1 - Tishechkin, Alexey K. A1 - Schmidl, Jürgen A1 - Winchester, Neville N. A1 - Roubik, David W. A1 - Aberlenc, Henri-Pierre A1 - Bail, Johannes A1 - Barrios, Hector A1 - Bridle, Jonathan R. A1 - Castaño-Meneses, Gabriela A1 - Corbara, Bruno A1 - Curletti, Gianfranco A1 - da Rocha, Wesley Duarte A1 - De Bakker, Domir A1 - Delabie, Jacques H. C. A1 - Dejean, Alain A1 - Fagan, Laura L. A1 - Floren, Andreas A1 - Kitching, Roger L. A1 - Medianero, Enrique A1 - de Oliveira, Evandro Gama A1 - Orivel, Jerome A1 - Pollet, Marc A1 - Rapp, Mathieu A1 - Ribeiro, Servio P. A1 - Roisin, Yves A1 - Schmidt, Jesper B. A1 - Sørensen, Line A1 - Lewinsohn, Thomas M. A1 - Leponce, Maurice T1 - Arthropod Distribution in a Tropical Rainforest: Tackling a Four Dimensional Puzzle JF - PLoS ONE N2 - Quantifying the spatio-temporal distribution of arthropods in tropical rainforests represents a first step towards scrutinizing the global distribution of biodiversity on Earth. To date most studies have focused on narrow taxonomic groups or lack a design that allows partitioning of the components of diversity. Here, we consider an exceptionally large dataset (113,952 individuals representing 5,858 species), obtained from the San Lorenzo forest in Panama, where the phylogenetic breadth of arthropod taxa was surveyed using 14 protocols targeting the soil, litter, understory, lower and upper canopy habitats, replicated across seasons in 2003 and 2004. This dataset is used to explore the relative influence of horizontal, vertical and seasonal drivers of arthropod distribution in this forest. We considered arthropod abundance, observed and estimated species richness, additive decomposition of species richness, multiplicative partitioning of species diversity, variation in species composition, species turnover and guild structure as components of diversity. At the scale of our study (2km of distance, 40m in height and 400 days), the effects related to the vertical and seasonal dimensions were most important. Most adult arthropods were collected from the soil/litter or the upper canopy and species richness was highest in the canopy. We compared the distribution of arthropods and trees within our study system. Effects related to the seasonal dimension were stronger for arthropods than for trees. We conclude that: (1) models of beta diversity developed for tropical trees are unlikely to be applicable to tropical arthropods; (2) it is imperative that estimates of global biodiversity derived from mass collecting of arthropods in tropical rainforests embrace the strong vertical and seasonal partitioning observed here; and (3) given the high species turnover observed between seasons, global climate change may have severe consequences for rainforest arthropods. KW - trees KW - species richness KW - beta-diveristy KW - strategy KW - turnover KW - similarity KW - biodiversity KW - specialization KW - herbivorous insects KW - assemblages Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136393 VL - 10 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Kuhn [geb. Bach], Julia Elisa T1 - Design und Etablierung von Next Generation Sequencing-Methoden zur Diagnostik verschiedener Erbkrankheiten T1 - Design and establishment of next-generation sequencing methods for diagnostics of different hereditary diseases N2 - Innerhalb des letzten Jahrzehnts entstanden zahlreiche neue Anreicherungs- und Sequenzier-technologien der zweiten (und dritten) Generation, die in rasantem Tempo weiterentwickelt und schon jetzt in vielen Bereichen als neuer Goldstandard für molekulargenetische For-schung und Diagnostik angesehen werden. Als Hochdurchsatz-Verfahren ermöglichen diese Next Generation Sequencing-Methoden (NGS) in immer kürzerer Zeit die parallele Analyse zahlreicher Proben und immer größerer Zielregionen bis hin zum ganzen Genom und führten in der Humangenetik dadurch zu Forschungsansätzen in neuen Dimensionen. In dieser Doktorarbeit, die im molekulargenetischen Diagnostik-Labor der Humangenetik Würzburg durchgeführt wurde, wurden in fünf Projekten NGS-Ansätze unterschiedlicher Stufen bzw. Größenordnungen für verschiedene erblich bedingte Erkrankungen konzipiert und etabliert und in Forschungsprojekten sowie der Routinediagnostik eingesetzt. Dabei wurden verschiedene Methoden zur Anreicherung der Zielsequenzen und zur NGS-Sequenzierung erprobt und auf ihre Effizienz beurteilt. Die Ergebnisse des NGS und darauf basierender Nachweis-Experimente wurden in sieben Veröffentlichungen dokumentiert, auf denen diese Dissertation aufbaut. In den drei ersten Projekten wurden das Access Array-System (Fluidigm) zur Anreicherung der Zielsequenzen und der GS Junior (Roche) zur Erzeugung der Sequenzen verwendet. In Projekt 1 wurde COL4A6 als neues Kandidatengen für nicht-syndromale Hörstörungen identifiziert. Um mögliche weitere Mutationsträger zu detektieren, wurde erfolgreich ein kleiner NGS-Ansatz für das zügige Screening dieses Gens bei knapp 100 weiteren Patienten etabliert. Diese und weitere Ergebnisse bestätigten die Kausalität der COL4A6-Mutation eines Index-Patienten mit schwerer, X-chromosomal-rezessiver Hörstörung. Ein geeigneter NGS-Ansatz für die Analyse des großen RYR1-Gens wurde in Projekt 2 ge-sucht. Der erste Ansatz mit Access Array-System und GS Junior führte zwar bei 39 von 87 Patienten mit Maligner Hyperthermie und/oder Central Core Disease zu dem Auffinden einer (potentiell) pathogenen Variante, allerdings mit hohen Ausfallquoten. Mit der zweiten Methode (Anreicherung: SureSelect-System custom design, Agilent; Sequenzierung: HiSeq, Illumina) wurden neben RYR1 noch 63 weitere Gene analysiert, was zu deutlich besseren Ergebnissen und vier Mutationsfunden führte. Projekt 3 beinhaltete die Etablierung zwei kleiner Panels für Muskelkrankheiten. Ein Panel für drei Gene für Gliedergürteldystrophien wurde sogar erfolgreich in die akkreditierte Rou-tinediagnostik übernommen. Mit dem zweiten Panel für acht Kandidatengene myofibrillärer Myopathien (MFM) wurde u.a. eine neue Mutation im BAG3-Gen identifiziert. Das Exom eines MFM-Patienten wurde in Projekt 4 nach Anreicherung mit dem SureSelect-System (Agilent) auf dem HiSeq (Illumina) sequenziert. Nach Auswertung und Beurteilung der identifizierten Varianten wurde ein neuer Erbgang für Myotilinopathien entdeckt. Verschiedene Nachweisexperimente bestätigten die Kausalität der Mutation im Myotilin-Gen. In Projekt 5 wurde die komplette genomische Sequenz des F8-Gens nach tiefen intronischen Mutationen bei Hämophilie-Patienten abgesucht (Anreicherung SureSelect custom design, Agilent; Sequenzierung MiSeq, Illumina). Bei jedem der analysierten Patienten konnte min-destens eine verdächtige Variante identifiziert werden, die zu verändertem Spleißverhalten führen könnte. Drei Mutationen waren schon durch Publikationen bekannt, bei einer weite-ren konnten in vitro-Spleißanalysen die Kausalität bestätigen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die zur Verfügung stehenden Methoden zur An-reicherung von Zielsequenzen aus dem menschlichen Genom und zu deren Sequenzierung je nach Komplexität der Fragestellung, d.h. der Anzahl und Größe der Gene sowie der Anzahl der zu untersuchenden Proben, sinnvoll und effizient kombiniert werden können. Im Verlauf der Arbeit haben sich die NGS-Techniken rasant weiterentwickelt. So sind PCR-basierte Ansätze zur Anreicherung der Zielsequenzen für die meisten Anwendungen von hybridisierungs-basierten Methoden verdrängt worden. Von den ursprünglich drei konkur-rierenden Verfahren zur Hochdurchsatzsequenzierung hat sich die Methode des „sequen-cing-by-synthesis“ (Illumina) weitgehend durchgesetzt. Diese Entwicklung spiegelt sich auch in den während dieser Arbeit erhobenen Daten wider. N2 - Several enrichment and sequencing technologies of the second (and third) generation have been developed in the past decade, were rapidly refined and are already considered as new state of the art method in several fields of molecular genetic research and diagnostics. Con-sidered as high-throughput technologies, these next-generation sequencing methods (NGS) allow the parallel analysis of several samples and regions of interests up to whole genomes in decreasing time and thus permitted research projects with novel dimensions in human genetics. This doctoral thesis was performed at the molecular genetic laboratory at the Department of Human Genetics in Würzburg. In five projects, NGS approaches of variable scale and for different hereditary diseases were designed, established and applied in research and routine diagnostics. Different methods for target enrichment and NGS analysis were tested and evaluated concerning their efficiency. The results of NGS and subsequent verification ex-periments were documented in seven publications forming the basis of this dissertation. In project 1 - 3, the Access Array system (Fluidigm) was used for target enrichment and the GS Junior (Roche) for sequence generation. COL4A6 has been identified as novel candidate gene for non-syndromic hereditary hearing loss in project 1. A small NGS approach was established to screen this gene in approx. 100 patients with hearing loss in order to search for additional carriers of COL4A6 mutations. The results of this and further experiments confirmed the causality of the COL4A6 mutation found in the index patient with severe X-linked hearing loss. Project 2 aimed at finding a convenient NGS method for the analysis of the large RYR1 gene. A first approach with the Access Array system and the GS Junior lead to the identifi-cation of a (potential) pathogenic mutation in 39 out of 87 patients with malignant hyper-thermia and / or central core disease, but with high failure rates. RYR1 and 63 further genes were then analyzed in a second approach (target enrichment with SureSelect custom design, Agilent; sequence analysis on a HiSeq, Illumina) providing considerably improved results and the identification of four mutations in five patients. Two small panels for muscular diseases were established in project 3. A panel for three genes associated with limb-girdle muscular dystrophies were even successfully applied in accredited routine diagnostics. A novel mutation in the BAG3 gene could be identified using the second panel established for eight candidate genes of myofibrillar myopathies (MFMs). The exome of a patient with MFM was analyzed in project 4 after target enrichment with the SureSelect system (Agilent) and sequence analysis on a HiSeq (Illumina). A novel in-heritance pattern of myotilinopathy was identified after analysis and evaluation of the de-tected variants. Several experiments confirmed the causality of the mutation in the myotilin gene. In project 5, the whole genomic sequence of the F8 gene was analyzed for deep intronic mutations in haemophilic patients (target enrichment with SureSelect custom design, Ag-ilent; sequence analysis on a MiSeq, Illumina). In each of the patients at least one conspicu-ous variant was identified probably leading to alternative splicing. Three mutations were known by publications and for another one causality could be proven by an in vitro splicing assay. The results of this doctoral thesis show that the available methods for target enrichment and sequence analysis of specific targets of the human genome can be combined in a reasonable and efficient way considering the number and size of the targeted genes and probes. During the course of this doctoral thesis, NGS technologies have been further developed in a rapid way. For most applications, PCR-based technologies for target enrichment have been dis-placed by hybridization-based methods. Of the originally three competing techniques of high-throughput sequencing the “sequencing-by-synthesis” method (Illumina) has become the widely accepted standard. This development is reflected in the data generated in this doctoral thesis. KW - Diagnostik KW - DNA-Sequenz KW - Erbkrankheit KW - Next Generation Sequencing KW - Mutation KW - Humangenetik Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116854 ER - TY - JOUR A1 - Singh, Amit K. A1 - Kingston, Joseph J. A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Batra, Harsh V. T1 - Recombinant Bivalent Fusion Protein rVE Induces CD4+ and CD8+ T-Cell Mediated Memory Immune Response for Protection Against Yersinia enterocolitica Infection JF - Frontiers in Microbiology N2 - Studies investigating the correlates of immune protection against Yersinia infection have established that both humoral and cell mediated immune responses are required for the comprehensive protection. In our previous study, we established that the bivalent fusion protein (rVE) comprising immunologically active regions of Y pestis LcrV (100-270 aa) and YopE (50-213 aa) proteins conferred complete passive and active protection against lethal Y enterocolitica 8081 challenge. In the present study, cohort of BALB/c mice immunized with rVE or its component proteins rV, rE were assessed for cell mediated immune responses and memory immune protection against Y enterocolitica 8081 rVE immunization resulted in extensive proliferation of both CD4 and CD8 T cell subsets; significantly high antibody titer with balanced IgG1: IgG2a/IgG2b isotypes (1:1 ratio) and up regulation of both Th1 (INF-\(\alpha\), IFN-\(\gamma\), IL 2, and IL 12) and Th2 (IL 4) cytokines. On the other hand, rV immunization resulted in Th2 biased IgG response (11:1 ratio) and proliferation of CD4+ T-cell; rE group of mice exhibited considerably lower serum antibody titer with predominant Th1 response (1:3 ratio) and CD8+ T-cell proliferation. Comprehensive protection with superior survival (100%) was observed among rVE immunized mice when compared to the significantly lower survival rates among rE (37.5%) and rV (25%) groups when IP challenged with Y enterocolitica 8081 after 120 days of immunization. Findings in this and our earlier studies define the bivalent fusion protein rVE as a potent candidate vaccine molecule with the capability to concurrently stimulate humoral and cell mediated immune responses and a proof of concept for developing efficient subunit vaccines against Gram negative facultative intracellular bacterial pathogens. KW - I-tasser KW - Yersinia enterocolitica KW - memory immune responses KW - cytokine profiling KW - CD8+T cells KW - CD4+T cells KW - recombinant protein rVE KW - resistance KW - pneumonic plague KW - pestis infection KW - nonhuman-primates KW - III secretion KW - V-antigen KW - mice KW - vaccine Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136114 VL - 6 IS - 1407 ER - TY - THES A1 - Schneider, Gudrun T1 - Effects of adjacent habitats and landscape composition on biodiversity in semi-natural grasslands and biological pest control in oilseed rape fields T1 - Effekte von Nachbarhabitaten und der Landschaftkomposition auf die Biodiversität in halb-natürlichen Grasländern und auf die biologische Schädlicngskontrolle in Rapsfeldern N2 - 1) Modern European agricultural landscapes form a patchy mosaic of highly fragmented natural and semi-natural habitat remnants embedded in a matrix of intensively managed agricultural land. In those landscapes many organism frequently cross habitat borders including the crop – non-crop boundary, hereby connecting the biotic interactions of multiple habitat types. Therefore biodiversity and ecosystem functions within habitats are expected to depend on adjacent habitat types and the surrounding landscape matrix. In this thesis the biodiversity of non-crop habitats, and ecosystem services and disservices in crop habitats were studied in the human-dominated agricultural landscape in the district Lower Franconia, Bavaria, Germany. First we examined the effect of adjacent habitat type on species composition, diversity and ecosystem functions in semi-natural calcareous grasslands, a biodiversity-rich habitat of high conservation value (chapter 2 and 3). Second we studied the effect of habitat composition in the landscape on herbivory, biological pest control and yield in oilseed rape fields (chapter 4). 2) We examined the effect of adjacent habitat type on the diversity of carabid beetles in 20 calcareous grasslands using pitfall traps. Half of the grasslands were adjacent to a coniferous forest and half to a cereal crop field. We found different species compositions of carabid beetles depending on adjacent habitat type. In addition calcareous grasslands adjacent to crop fields harboured a higher species richness and activity density but a lower evenness of carabid beetles than calcareous grasslands adjacent to forests. These differences can be explained by the spillover of carabid beetles from the adjacent habitats. After crop harvest carabid beetle activity density in crop fields decreased while in parallel the activity density in the calcareous grasslands adjacent to the crop fields increased, indicating an unidirectional carabid beetle spillover. Our results underline that type and management of adjacent habitats affect community composition and diversity in calcareous grasslands. Therefore nature conservation measures, which focused on the improvement of local habitat quality so far, additionally need to consider adjacent habitat type. 3) In addition to carabid beetle communities we also surveyed predation rates of ground-dwelling predators on the same calcareous grasslands in two study periods (June and late August). As ground-dwelling predators of forests or crop fields can move into adjacent calcareous grasslands we expected different predation rates depending on adjacent habitat type. We exposed in total 32.000 lady bird eggs as prey items on the calcareous grasslands in distances of 5 and 20m from the habitat border. We found higher predation rates on calcareous grasslands adjacent to forests than on calcareous grasslands adjacent to crop fields, but only on cool days. On warm days a very high extent (often 100%) of the exposed prey items were consumed adjacent to both habitat types, which did not allow the detection of possible differences between the adjacent habitat types. Predation rates differed not between the two study periods or the two distances to the habitat edge. The higher predation rates adjacent to forests can be explained by the spillover of ground-dwelling predators from forests into calcareous grasslands. Our results show, that spillover into semi-natural habitats affects ecosystem functioning in addition to species composition and diversity. 4) In chapter 4 of this thesis we examined the effect of spatiotemporal changes in crop cover on pest - natural enemy interactions and crop yields. During two study years we surveyed the abundance of adult and larval pollen beetles, parasitism of pollen beetle larvae by a hymenopteran parasitoid and oilseed rape yields of 36 oilseed rape fields. The surrounding landscape of the fields (1 km radius) differed in the oilseed rape proportion and in the inter-annual change in the oilseed rape proportion since the previous year. We found a dilution effect, i.e. a decreasing abundance with increasing oilseed rape proportions, for pollen beetle larvae and parasitoids in both study years and for adult pollen beetles in one study year. Oilseed rape yields increased with increasing oilseed rape proportions. Inter-annual changes in oilseed rape proportions led to inter-annual crowding and dilution effects for pollen beetles, but had no effect on parasitism or yield. Our results indicate the potential to reduce pest loads and increase yields in intensively managed oilseed rape fields by a coordinated management of the spatiotemporal oilseed rape cover in the landscape. 5) In summary, we showed in this thesis that the biodiversity and functioning of crop and non-crop habitats within agricultural landscapes is affected by the spillover of organisms and thus by the habitat composition in the close surrounding and in the broader landscape context. Spillover affects also ecosystem services and disservices and therefore crop productivity. Thereby the spatial and temporal variation of specific crop types in the landscape can be of particular importance for crop yields. Thus a coordinated landscape wide management can help to optimize both biodiversity conservation and the delivery of ecosystem services and thus crop yields. Future studies integrating landscape effects across several ecosystem functions, multiple taxonomic groups and different crop types are necessary to develop definite landscape management schemes. N2 - 1) Heutige europäische Agrarlandschaften bestehen aus einem Mosaik stark fragmentierter natürlicher und halbnatürlicher Habitate, die in eine Matrix aus intensiv bewirtschafteten Agrarflächen eingebettet sind. In solchen Landschaften überqueren Organismen häufig Habitatgrenzen, einschließlich der Grenze zwischen Agrar- und Nichtagrarhabitaten. Dabei verknüpfen sie die biotischen Interaktionen der verschiedenen Habitate miteinander. Deshalb ist zu erwarten, dass die Diversität und die Ökosystemfunktionen in Habitaten auch von den Nachbarhabitaten und der umgebenden Landschaft beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir die Diversität halbnatürlicher Habitate sowie die Ökosystemdienstleistungen in Agrarhabitaten im Bezirk Unterfranken in Bayern, Deutschland. Zum einen untersuchten wir den Einfluss von zwei verschiedenen Nachbarhabitattypen auf die Artenzusammensetzung, die Diversität und die Ökosystemfunktionen in halbnatürlichen Kalkmagerrasen, einem sehr artenreichen Habitat mit hohem Naturschutzwert (Kapitel 2 und 3). Zum anderen untersuchten wir den Einfluss der Habitatzusammensetzung in der Landschaft auf die Herbivorie, die biologische Schädlingskontrolle und den Ertrag in Rapsfeldern (Kapitel 4). 2) Mit Hilfe von Barberfallen untersuchten wir den Einfluss von zwei benachbarten Habitattypen auf die Diversität von Laufkäfern in 20 Kalkmagerrasen. Die Hälfte der Kalkmagerrasen grenzte an einen Nadelwald, die andere Hälfte an einen Getreideacker. Wir fanden unterschiedliche Artenzusammensetzungen der Laufkäfer in Abhängigkeit vom Nachbarhabitat. Außerdem fanden wir auf den Kalkmagerrasen neben Getreideäckern einen höheren Artenreichtum und eine höhere Aktivitätsdichte sowie eine geringere Evenness der Laufkäfer als auf den Kalkmagerrasen neben Nadelwäldern. Diese Unterschiede können durch den spillover von Laufkäfern aus den zwei unterschiedlichen Nachbarhabitaten erklärt werden. Nach der Getreideernte sank die Aktivitätsdichte der Laufkäfer auf den Getreideäckern und stieg parallel in den benachbarten Kalkmagerrasen an. Das weist auf einen einseitig gerichteten Spillover der Laufkäfer vom Acker auf die Kalkmagerrasen nach der Getreideernte hin. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl der Habitattyp als auch das Management benachbarter Habitate die Artenzusammensetzung und die Diversität auf Kalkmagerrasen beeinflusst. Daher sollten Naturschutzmaßnahmen, welche sich bisher nur auf die Verbesserung der lokalen Habitatqualität konzentrierten, zusätzlich den Habitattyp und das Management benachbarter Habitate berücksichtigen. 3) Neben der Zusammensetzung der Laufkäfergemeinschaften untersuchten wir auf den gleichen Kalkmagerrasen die Prädationsraten von auf dem Boden lebenden Prädatoren in zwei Untersuchungszeiträumen (Juni und Ende August). Da Prädatoren benachbarter Wälder oder Äcker auch in Kalkmagerrasen eindringen können, erwarteten wir unterschiedliche Prädationsraten in Abhängigkeit vom Nachbarhabitat. Wir brachten insgesamt 32.000 Marienkäfereier als Beute auf den Kalkmagerrasen aus. Die Eier wurden in Distanzen von 5 m und 20 m zur Habitatgrenze exponiert. Wir fanden höhere Prädationsraten auf den Kalkmagerrasen neben Wäldern als auf denen neben Äckern, allerdings nur an kühlen Tagen. An warmen Tagen wurden die exponierten Eier neben beiden Nachbarhabitaten zu sehr hohen Anteilen (oft zu 100%) konsumiert, was es nicht ermöglichte potentielle Unterschiede zwischen den beiden Nachbarhabitattypen zu ermitteln. Wir fanden keine Unterschiede in den Prädationsraten zwischen den beiden Untersuchungszeiträumen oder zwischen den zwei Distanzen zur Habitatgrenze. Die höheren Prädationsraten auf Kalkmagerrasen neben Wäldern an kühlen Tagen können durch den spillover von am Boden lebenden Prädatoren aus den Wäldern in die Kalkmagerrasen erklärt werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Spillover in halbnatürliche Habitate neben der Zusammensetzung der Lebensgemeinschaft auch Ökosystemfunktionen beeinflussen kann. 4) In Kapitel 4 dieser Arbeit untersuchten wir den Einfluss von räumlichen und zeitlichen Änderungen in der Rapsanbaufläche auf die Interaktionen zwischen Schädlingen und natürlichen Gegenspielern sowie auf Erträge. Dazu untersuchten wir in zwei Jahren auf insgesamt 36 Rapsfeldern die Abundanz adulter und larvaler Rapsglanzkäfer, Parasitierungsraten von Rapsglanzkäferlarven durch eine Schlupfwespe und Rapserträge. Die Landschaften im 1km Radius um die Rapsfelder unterschieden sich im Rapsanteil und in der Änderung des Rapsanteils seit dem Vorjahr. Wir fanden Verdünnungseffekte, d.h. eine sinkende Abundanz mit zunehmendem Rapsanteil, für Rapsglanzkäferlarven und Parasitoide in beiden Untersuchungsjahren und für adulte Rapsglanzkäfer in einem Untersuchungsjahr. Rapserträge stiegen mit höheren Rapsanteilen in der Landschaft. Eine Vergrößerung des Rapsanteils seit dem Vorjahr führte zu einer Verdünnung der Rapsglanzkäferpopulationen auf der vergrößerten Rapsfläche und eine Verringerung des Rapsanteils zur Konzentration auf der verkleinerten Rapsfläche. Die zeitliche Änderung des Rapsanteils hatte aber keinen Einfluss auf die Parasitierungsrate oder den Ertrag. Unsere Ergebnisse unterstreichen das Potential durch Management der räumlichen und zeitlichen Verteilung der Rapsanbaufläche Schädlingsdichten verringern und Rapserträge erhöhen zu können. 5) Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit, dass die Biodiversität und die Funktionen von Agrar- und Nichtagrarhabitaten in Agrarlandschaften durch den Spillover von Organismen und folglich durch die Habitatzusammensetzung in der unmittelbaren und weiteren Umgebung bestimmt werden. Spillover beeinflusst dabei auch Ökosystemdienstleistungen und daher die Produktivität in der Landwirtschaft. Die räumliche und zeitliche Variation der Anbaufläche einzelner Anbaufrüchte hat dabei eine besondere Bedeutung für landwirtschaftliche Erträge. Daher kann ein koordiniertes Landschaftsmanagement helfen, sowohl die Biodiversität in der Landschaft als auch die Produktivität von Agrarhabitaten zu optimieren. Um konkrete Landschaftsmanagementpläne entwickeln zu können, sind weitere Studien, die gleichzeitig mehrere Ökosystemfunktionen, verschiedene taxonomische Gruppen und unterschiedliche Anbaufrüchte untersuchen, nötig. KW - Landschaftsökologie KW - spillover KW - biological pest control KW - oilseed rape KW - calcareous grassland KW - crop harvest KW - community composition KW - landscape ecology KW - ecosystem services KW - Magerrasen KW - Rapsanbau KW - Laufkäfer Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113549 ER - TY - JOUR A1 - Kuhn, Joachim A1 - Gripp, Tatjana A1 - Flieder, Tobias A1 - Dittrich, Marcus A1 - Hendig, Doris A1 - Busse, Jessica A1 - Knabbe, Cornelius A1 - Birschmann, Ingvild T1 - UPLC-MRM Mass Spectrometry Method for Measurement of the Coagulation Inhibitors Dabigatran and Rivaroxaban in Human Plasma and Its Comparison with Functional Assays JF - PLOS ONE N2 - Introduction The fast, precise, and accurate measurement of the new generation of oral anticoagulants such as dabigatran and rivaroxaban in patients' plasma my provide important information in different clinical circumstances such as in the case of suspicion of overdose, when patients switch from existing oral anticoagulant, in patients with hepatic or renal impairment, by concomitant use of interaction drugs, or to assess anticoagulant concentration in patients' blood before major surgery. Methods Here, we describe a quick and precise method to measure the coagulation inhibitors dabigatran and rivaroxaban using ultra-performance liquid chromatography electrospray ionization-tandem mass spectrometry in multiple reactions monitoring (MRM) mode (UPLC-MRM MS). Internal standards (ISs) were added to the sample and after protein precipitation; the sample was separated on a reverse phase column. After ionization of the analytes the ions were detected using electrospray ionization-tandem mass spectrometry. Run time was 2.5 minutes per injection. Ion suppression was characterized by means of post-column infusion. Results The calibration curves of dabigatran and rivaroxaban were linear over the working range between 0.8 and 800 mu g/L (r > 0.99). Limits of detection (LOD) in the plasma matrix were 0.21 mu g/L for dabigatran and 0.34 mu g/L for rivaroxaban, and lower limits of quantification (LLOQ) in the plasma matrix were 0.46 mu g/L for dabigatran and 0.54 mu g/L for rivaroxaban. The intraassay coefficients of variation (CVs) for dabigatran and rivaroxaban were < 4% and 6%; respectively, the interassay CVs were < 6% for dabigatran and < 9% for rivaroxaban. Inaccuracy was < 5% for both substances. The mean recovery was 104.5% (range 83.8-113.0%) for dabigatran and 87.0%(range 73.6-105.4%) for rivaroxaban. No significant ion suppressions were detected at the elution times of dabigatran or rivaroxaban. Both coagulation inhibitors were stable in citrate plasma at -20 degrees C, 4 degrees C and even at RT for at least one week. A method comparison between our UPLC-MRM MS method, the commercially available automated Direct Thrombin Inhibitor assay (DTI assay) for dabigatran measurement from CoaChrom Diagnostica, as well as the automated anti-Xa assay for rivaroxaban measurement from Chromogenix both performed by ACL-TOP showed a high degree of correlation. However, UPLC-MRM MS measurement of dabigatran and rivaroxaban has a much better selectivity than classical functional assays measuring activities of various coagulation factors which are susceptible to interference by other coagulant drugs. Conclusions Overall, we developed and validated a sensitive and specific UPLC-MRM MS assay for the quick and specific measurement of dabigatran and rivaroxaban in human plasma. KW - LC-MS/MS KW - validation KW - serum KW - quantification KW - apixaban KW - diagnostic accuracy KW - performance liquid chromatography KW - factor XA inhibitor KW - direct oral anticoagulants KW - direct thrombin inhibitor Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-136023 VL - 10 IS - 12 ER - TY - THES A1 - Brockmann, Markus T1 - Inhibition von Aurora-A als neue Therapiestrategie gegen MYCN-amplifizierte Neuroblastome T1 - Inhibition of Aurora-A as a novel therapeutic strategy against MYCN-amplified Neuroblastoma N2 - Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen. In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung. In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen. Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle. Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden. Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen. N2 - Amplification of MYCN, encoding the transcription factor N-Myc, is one of the strongest clinical predictors of poor prognosis in neuroblastoma. As a member of the oncogenic Myc family, N-Myc activates genes that are involved in several biological processes like metabolism, cell cycle progression, cell growth and apoptosis. Deregulation of MYCN expression leads to a distinct gene expression profile and an aggressive phenotype in neuroblastoma cells. In normal neuronal progenitor cells, N-Myc is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. N-Myc degradation is controlled by two phospho-sites. During mitosis, Cyclin B/Cdk1 phosphorylates N-Myc at serine 62, which primes the protein for a second phosphorylation at threonine 58 via GSK3β. This phospho-degron provides a recognition site for Fbxw7, an F-box protein of the E3-Ligase complex SCFFbxw7, leading to destabilisation of the N-Myc protein. Mitotic degradation of the N-Myc protein allows progenitor cells to exit the cell cycle and enables terminal differentiation. Our group had previously identified AURKA as a gene that is required for cell growth in MYCN-amplified neuroblastoma cells but not essential for cells lacking MYCN. Here, we show that Aurora-A counteracts the Fbxw7-mediated degradation, and that the interaction between Aurora-A and N-Myc is cruical for N-Myc stabilization. Surprisingly, Aurora-A stabilizes the transcription factor in a kinase-independent manner. Interestingly, two Aurora-A-Inhibitors, MLN8054 and MLN8237, inhibit the kinase activity but also destabilize the N-Myc protein. These inhibitors induce an unusual conformation of the kinase domain and resulting in the dissociation of the N-Myc/Aurora-A complex. We demonstrate that the disruption of the complex promotes Fbxw7-mediated degradation of N-Myc. Inhibitor treatment in neuroblastoma cells leads to a cell cycle arrest in G1-phase. In a transgenic mouse model of MYCN-driven neuroblastoma, treatment causes downregulation of N-Myc protein levels, differentiation of the tumor cells and complete tumor regression in the majority of tumors. Consistent with the tumor reduction, treatment with MLN8054 and MLN8234 results in an extension of survival of the transgenic mice. Collectively, these results demonstrate that the Aurora-A–Inhibitors MLN8054 and MLN8237 are potential therapeutics against MYCN-amplified Neuroblastoma. KW - N-Myc KW - Neuroblastoma KW - Therapie KW - Neuroblastom KW - MYCN-amplified KW - Therapy KW - Aurora-A Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135951 ER -